Noi riconosciamo sostegno di NIH borse di studio P30ES013508 e di 5T32GM008076. Ringraziamo anche Thermo Scientific per l&#39;l&#39;accesso a SIEVE 2.0 e di Drs. Eugene Ciccimaro e Mark Sanders di Thermo Scientific per le discussioni utili.

1. Estrazione del campione da cellule <ol><li> Per un piatto di cm 10 celle: raccogliere 1,5 ml di sospensione cellulare sollevato dai media in un pre-etichettata 10 ml provetta di vetro. Per le linee aderenti, le cellule devono essere sollevati con scraping delicato in 1,5 ml di mezzo di tenuta in ghiaccio. Facoltativo: Se si usano gli standard interni, aggiungere un&#39;aliquota appropriata in questo passaggio. Commento: Estinzione del metabolismo cellulare è fondamentale per alcuni metaboliti. Per l&#39;analisi dei metaboliti time-sensitive, devono essere considerati come le procedure di estrazione metanolo freddo. 17 </li><li> Aggiungere 6 ml di cloroformio (CHCl 3) / metanolo (CH 3 OH) (2:1, v / v) a ciascuno dei tubi di vetro da 10 ml contenenti i campioni. Impostare i campioni in uno shaker o multi-vortex a bassa velocità per 30 min. Dopo agitazione, i campioni vengono centrifugati con un ambiente a bassa accelerazione / decelerazione a 1935 xg per 10 min a 4 ° C per separare completamente le fasi. Opzionale </em&gt;: Per evitare di utilizzare CHCl3, estrazioni può essere condotta con diclorometano (CH 2 Cl 2) 18,12. </li><li> Utilizzando un gambo lungo pipetta Pasteur, trasferire lo strato organico (basso) per un nuovo pre-etichettato 10 ml provetta da centrifuga di vetro. Continuare a 4.1. </li><li> Trasferire la soluzione acquosa superiore successivamente in una plastica pulito 2 ml provetta Eppendorf. Evaporare il campione sotto gas azoto. Continuare a 2.6.2 per la dissalazione fase acquosa o continuare a 4.1 per l&#39;analisi diretta. </li></ol> 2. Estrazione del campione di siero <ol><li> Trasferire 20 ml di siero in una plastica 2 ml provetta Eppendorf. Facoltativo: Se si usano gli standard interni, aggiungere un&#39;aliquota appropriata in questo passaggio. </li><li> Aggiungere 190 ml di CH 3 OH e vortex per 10 sec. </li><li> Aggiungere 380 ml ​​di CHCl3 e vortex per 10 sec. </li><li> Aggiungere 120 ml di H 2 O per indurre la separazione di fase. Vortex i campioni per 10 sec e Lasciare equilibrare a temperatura ambiente per 10min. </li><li> Centrifugare i campioni a 8.000 xg per 10 min a 4 ° C per separare le fasi. </li><li> Trasferire la fase organica inferiore in plastica pulito 2 ml provetta Eppendorf. Continuare a 4.1. </li><li> Trasferire la soluzione acquosa superiore successivamente in una plastica pulito 2 ml provetta Eppendorf. Evaporare il campione sotto gas azoto. </li><li> Risospendere il campione in 200 ml di H 2 O. Reagenti acido o base (0,1% di acido acetico, acido formico o 0,1% di idrossido di ammonio) possono essere utilizzati per estrarre preferenzialmente pH metaboliti sensibili. Ultrasuoni per 20 min in ghiaccio per risospendere completamente il campione. </li><li> Attivare le colonne di spin C18 con 500 microlitri CH 3 OH. </li><li> Equilibrare la colonna con due lavaggi di 500 microlitri H 2 O e quindi caricare il campione. Se si utilizzano reagenti acido / base mantenere questa concentrazione nelle fasi di lavaggio. </li><li> Lavare con 500 ml H 2 O per desalinizzare l&#39;esempio. Ancora, se si utilizzano reagenti acido / base mantenere questa concentrazione nel lavaggiopassaggi. </li><li> Eluire con due volumi di 200 ml 80% CH 3 OH in H 2 O in un pre-etichettato clean 2 ml provetta Eppendorf. Ancora, se si utilizzano reagenti acido / base mantenere questa concentrazione nelle fasi di lavaggio. Continuare a 4.1. </li></ol> 3. Estrazione del campione di tessuto <ol><li> A seconda del tessuto, utilizzare tra 10-100 mg di tessuto congelato. Aggiungere tutto il pezzo di tessuto di un pre-etichettati 2 ml provetta Eppendorf bassa ritenzione con 1 ml di PBS (1 M, pH 6,8) in un bagno di ghiaccio. Facoltativo: Se si utilizzano standard interni, inserirlo nel buffer, prima di aggiungere il tessuto. </li><li> Omogeneizzare il tessuto in ghiaccio con una smerigliatrice tessuto elettrico per 30 sec in ogni Eppendorf. Tra i campioni, pulire il macinino tessuto in due provette separate contenenti CH 3 OH e H 2 O, rispettivamente. </li><li> Trasferire il tessuto omogenato con una pipetta di plastica in un pre-etichettata 10 ml provetta di vetro. Dopo il trasferimento, risciacquare ogni provetta Eppendorf2x con 1 ml di CH 3 OH e aggiungere i lavaggi al tessuto omogenato nei tubi di vetro. </li><li> Aggiungere 4 ml di CHCl3 a ciascuno dei tubi di vetro 10 ml contenenti l&#39;omogenato tissutale e CH 3 OH lavaggi. Impostare i campioni in uno shaker o multi-vortex a bassa velocità per 30 min. </li><li> Dopo aver agitato, centrifugare i campioni con un livello basso di accelerazione / decelerazione a 1935 xg per 10 minuti a separare completamente le fasi. Facoltativo: Per evitare di utilizzare il cloroformio, estrazioni sono stati sviluppati con CH 2 Cl 2. </li><li> Utilizzando un gambo lungo pipetta Pasteur, trasferire lo strato organico (basso) per un nuovo pre-etichettato 10 ml provetta da centrifuga di vetro. Continuare a 4.1. </li><li> Utilizzando un gambo lungo pipetta Pasteur, trasferire lo strato acquoso in un pre-etichettato 10 ml provetta di vetro. Vai a 2.6.2 per la dissalazione o continuare a 4.1. </li></ol> 4. Risospensione e la filtrazione di campioni per UPLC <ol><li> Far evaporare la samples sotto gas azoto. </li><li> Ricostituire asciugata giù i campioni in un volume appropriato di soluzione di partenza per il metodo UPLC desiderata (vedi Tabella 1). 50-100 microlitri è solitamente un volume risospensione desiderabile. Delicatamente vortice e / o dispensare il campione su e giù per aiutare a sciogliere gli analiti. </li><li> Trasferire il campione in una provetta 0,22 micron filtro di nylon e centrifuga fino a 14.000 xg finché il campione è completamente passata attraverso il filtro (~ 5 min). Assicurarsi che non ci siano precipitati visibili rimanendo nel campione. </li><li> Trasferire il surnatante del campione filtrato in una fiala UPLC pre-etichettati con inserto. Fiala Cap, poi scorri il flaconcino per rimuovere eventuali bolle dal fondo della fiala del campione. Mettere il campione nel campionatore automatico refrigerato (4-5 ° C). </li></ol> 5. Setup UPLC <ol><li> Utilizzando il software di controllo per il cromatografo liquido, creare una corsa per il campione biologico in base al largo delle condizioni elencate in <strong&gt; Tabella 1. Quindi creare un metodo per la fase acquosa fuori le condizioni elencate nella Tabella 1. Facoltativo: Se una serie nota di analiti sono di grande interesse, ottimizzare le condizioni UPLC utilizzando la pesante analogico etichetta di questi composti, e generare un metodo che utilizza queste condizioni . </li><li> Lasciare che il UPLC per equilibrare adeguatamente. Ciò dovrebbe includere un adescamento pieno di solventi prima di collegare una colonna, e seguendo le indicazioni del produttore per il volume di equilibrio di una nuova colonna (solitamente 3-5 volumi di colonna). Mantenere un registro di partenza indietro pressioni per diagnosticare eventuali problemi futuri. </li></ol> 6. Setup spettrometro di massa <ol><li> Utilizzando il software di controllo per lo spettrometro di massa ad alta risoluzione, creare un metodo modalità positiva usando le condizioni elencate nella Tabella 2. Poi utilizzando le stesse condizioni, creare un metodo modalità negativa facoltativa:. Se una serie nota di analiti sono di alta interest, ottimizzare le condizioni ottici utilizzando la pesante etichetta analogico di questi composti e fonte, e generare un metodo che utilizza queste condizioni. </li><li> Pulire e calibrare lo strumento, di stabilire uno spruzzo stabile nello spettrometro, e dare il tempo per la soluzione di calibrazione per dissipare adeguatamente dalla fonte e l&#39;ottica. Stabilità accettabile di spruzzo dovrebbe dare un 3-5% di RSD intensità su almeno 100 scansioni con l&#39;iniezione di soluzione di calibrazione alla stessa portata come utilizzarlo metodo LC. </li><li> Impostare la sequenza per tutti i campioni, impostare il volume di iniezione del caso, ed eseguire un vuoto prima che il primo campione. Se si sospetta di riporto o di matrice effetti tra i campioni, eseguire spazi / lavaggi adeguati. I campioni devono essere impostati in modo randomizzato utilizzando un generatore di numeri casuali e un tasto per evitare effetti lotti introdotti da analisi. Commento: campioni di controllo di qualità, tra cui norme isotopi stabili o norme di analisi dei possibili obiettivi possono essereestremamente prezioso in la risoluzione dei problemi ed assicurando risultati affidabili, riproducibili, e di valido. Una replicato tecnico di una soli campione standard seguito da uno solvente in bianco può essere usato per accessi deviazione del intensità del segnale e tempo di ritenzione, così come carryover porta al run blank. </li><li> Begin sequenza e monitorare periodicamente per i problemi tra cui fluttuazioni di a pressione, o la perdita di intensità segnale di in tutto il run. Se vengono rilevati problemi di gravi, fermare la corsa, e ripetere dal 6,2. </li></ol> 7. Analisi Differenziale <ol><li> Due flussi di lavoro di vengono presentati per questo protocollo. Il primo è attraverso SIEVE 2.0, proprietarie software di etichetta di-libero analisi di differenziale venduta da Thermo Fisher. Il secondo flusso di lavoro di è attraverso XCMS online, in una piattaforma gratuita attraverso Scripps Research Institute. 11 Prima di intraprendere analisi di differenziale, controllare manualmente gli IAT o di guardare al cromatogrammi filtrati per qualsiasi composto noto nel campione di al fine di garantire riproducibilità di pistee iniezione / UPLC / spruzzo la stabilità in tutta tutti i campioni. </li><li> SETACCIO <ol><li> Trasferire i file di dati. Prime provenienti da il spettrometro di massa per il disco rigido della il stazione di lavoro in cui è installato SIEVE. (Nota: in esecuzione SIEVE con i dati memorizzati su un disco collegato in rete o la porta USB non è consigliabile in quanto può limitare la velocità di analisi.) </li><li> Aperto SIEVE, e iniziare un nuovo esperimento. </li><li> Caricare i file appropriati in SIEVE. </li><li> Assegnare gruppi di confronto e selezionare un singolo file di riferimento per consentire SIEVE per generare i parametri di per l&#39;analisi. </li><li> Seguire il prompt e regolare eventuali parametri di per ogni requisiti della qualsiasi esperimento individuo. E &#39;spesso consigliabile di iniziare con i parametri di stringenti e di poi tornare indietro e allentare i parametri come di impostazioni meno generosi possono allungare tempo di analisi. </li><li> Caricare l&#39;elenco Addotto corretta per modalità positiva o negativa nei parametri. </li></ol></li><li> XCMS in linea <ol><li> Convertire i filein un formato accettabile per i XCMS on-line. Nel nostro caso, convertiamo a mzXML formato di. 19 </li><li> Aperte XCMS online, in e Crea Giobbe. </li><li> Upload e assegnare un nome set di dati. Solo due set di dati (ad es di Controllo vs Il trattamento) possono essere caricati come XCMS stand-alone è limitata a i confronti testa-a-head. </li><li> Selezionare impostazioni desiderate provenienti da la lista drop-verso il basso. Parametri di Pre-popolate sono disponibili per diversi messe a punto di strumentazione, e questi possono essere ulteriormente modificati per le esigenze di sperimentali. Nel nostro caso, noi usiamo le impostazioni di HPLC-Orbi2. </li><li> Submit e confermare di posti di lavoro. </li></ol></li><li> Analisi dei dati <ol><li> Per i SIEVE e di XCMS un elenco di fotogrammi e le caratteristiche, rispettivamente, verrà popolato una volta che la analisi di è finito. Assicurarsi che il allineamento LC si sovrappone a eventuali picchi di punto di riferimento. Se uno qualsiasi dei non allineati tirature LC Far vedere deviazione di grandi dimensioni in picchi di punto di riferimento questo può indicare un problema con il campione. Opzionale: Per SIEVE, se sono utilizzati standard interni, individuareil gruppo picco corrispondente e normalizzare al fotogramma selezionato. Per i XCMS On-linea di, la normalizzazione può essere fatto in un foglio di calcolo dopo l&#39;esportazione. </li><li> Tracciare i dati by coefficiente di variazione (CV) all&#39;interno di una popolazione campionaria come le (ad es campioni di controllo). Eventuali di grandi dimensioni valori di CV possono indicare un problema con uno o più campione. Ordinare l&#39;elenco in base a caratteristiche desiderate (ad esempio p-value &lt;0.05, Fold Change&gt; 1.5, bassa deviazione standard all&#39;interno di un gruppo, ecc.) </li><li> Esaminare ogni picco per l&#39;allineamento appropriata di picco attraverso i gruppi, l&#39;integrazione di picco, gaussiano di picco forma, la intensità del segnale, isotopi, e l&#39;assegnazione addotto di. </li><li> Di dati Esportare, se lo desideri per ulteriori analisi o di per generare le liste di massa mirati per la conferma e di di MS n esperimenti di. </li></ol></li></ol>

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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+characterization+of+differential+ion+suppression+on+liquid+chromatography/atmospheric+pressure+ionization+mass+spectrometric+bioanalytical+methods.">Quantitative characterization of differential ion suppression on liquid chromatography/atmospheric pressure ionization mass spectrometric bioanalytical methods.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 17 (3), 197-201 (2003).</li></ol>

Autori non hanno nulla di rivelare.

Non mirati metabolomica offre un potente strumento per indagare biotrasformazioni endogeni o xenobiotic, o di catturando un profilo di metabolico da un campione di interesse. L&#39;output di i scale di di tecnica con la risoluzione e la sensibilità del la tecnologia utilizzata per separare e analizzare il campione di, la capacità di affrontare con le grandi serie di dati generate, e la capacità a mine il set di dati per informazioni utili (ad es accurata ricerca in basi dati di massa). Recentemente, questo ?...

A causa di recenti progressi tecnologici nel campo della HRMS, non mirati, ipotesi generatrici metabolomica approcci sono diventati un approccio possibile per l&#39;analisi di campioni complessi. 1 spettrometri di massa in grado di facilitare la risoluzione 100.000 di routine parte bassa per milione (ppm) di accuratezza di massa sono diventati ampiamente disponibile da fornitori diversi. 2,3 Questa accuratezza di massa consente una maggiore specificità e la fiducia in una assegnazione preliminare di identità dell&#39;analita, pattern recognition isotopica, e l&#39;identificazione addotto. 4 Quando accoppiato con una procedura di estrazione appropriato e LC o UPLC, miscele complesse ad alte prestazioni possono essere analizzati con specificità ulteriore derivato da dati di tempo di ritenzione. 5 UPLC possiede una maggiore efficienza cromatografica e permette una maggiore sensibilità, risoluzione e analisi in tempo facendo una maggiore copertura del metabolome possibile. 6 Le grandi serie di dati risultanti possono essere integrati in qualsiasidi molteplici software di analisi differenziale e estratti di modelli utili o di singoli analiti di interesse. 7,8,9,10,11 colpi putativi possono essere inizialmente identificati utilizzando una combinazione di algoritmi di rilevamento di picco, massa accurata predizione basata formula chimica, la previsione di frammentazione, e chimico ricerca del database. Questo approccio consente di priorità di obiettivi per il tempo completa identificazione strutturale o per lo sviluppo di diluizione degli isotopi stabili più sensibile e più specifico monitoraggio UPLC / selezionato o multiplo reazione / studi di MS che sono gli attuali metodi standard d&#39;oro per la quantificazione. 12 Diversa natura dei campioni biologici ha portato ad ottimizzare protocolli di estrazione per l&#39;urina 13, 14 cellule, siero 15, o il tessuto 16. Questo protocollo caratteristiche estrazioni per le cellule, siero e tessuto. Se del caso, i commenti ei riferimenti aggiuntivi sono stati inclusi per la modificazione della procedura per tener conto dell&#39;inclusione di isotopi stabili, o per l&#39;inserimento di metaboliti particolarmente instabili.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Mediatech</td>
			<td>21-031-CM</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water (H2O)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W7-4</td>
			<td>(optima)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile (CH3CN)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A996-4</td>
			<td>(optima)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (CH3OH)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A454-4</td>
			<td>(optima)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A464-4</td>
			<td>(optima)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform (CH3Cl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>366927</td>
			<td>Hazard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane (CH2Cl2)</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>61030-1000</td>
			<td>To replace chloroform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyl Ether</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>346136</td>
			<td>To replace chloroform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic Acid (FA)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>(optima)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4OH</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A470-250</td>
			<td>(optima)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium formate (HCOONH4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>78314</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroSpin C18 Columns</td>
			<td>Nest Group Inc</td>
			<td>SS18V</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur Pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-200</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ml Glass Centrifuge Tubes</td>
			<td>Kimble Chase</td>
			<td>73785-10</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ml Plastic Centrifuge Tubes</td>
			<td>CellTreat</td>
			<td>CLS-4301-015</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC Vials (glass)</td>
			<td>Waters</td>
			<td>60000751CV</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC Inserts (glass)</td>
			<td>Waters</td>
			<td>WAT094171</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC Vials (plastic)</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186002640</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &mu;m Filters</td>
			<td>Corning</td>
			<td>8169</td>
			<td>nylon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 ml Eppendorf Tubes</td>
			<td>BioExpress</td>
			<td>C-3229-1</td>
			<td>Low Retention</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Resolution Mass Spectrometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>LTQ XL-Orbitrap</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC/UPLC</td>
			<td>Waters</td>
			<td>nanoACQUITY UPLC</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Source</td>
			<td>Michrom</td>
			<td>Thermo Advance Source</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Differential Analysis Software</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SIEVE 2.0</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nanoACQUITY C18 BEH130</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186003546</td>
			<td>1.7 &mu;m particle size, 150 mm x 100 &mu;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acentis Express C8</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>54262</td>
			<td>2.7 &mu;m particle size, 15 cm x 200 &mu;m</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

untargeted metabolomics from biological sources using ultraperformance liquid chromatography-high resolution mass spectrometry (uplc-hrms)

Qui vi presentiamo un flusso di lavoro per analizzare i profili metabolici per i campioni biologici di interesse, tra cui: le cellule, siero o tessuto. Il campione viene prima separato in frazioni polari e non polari da una fase di estrazione liquido-liquido, e parzialmente purificato per facilitare l&#39;analisi a valle. Entrambi acquose (metaboliti polari) e biologici (metaboliti non polari) fasi di estrazione iniziale vengono elaborati per rilevare una vasta gamma di metaboliti. Metaboliti sono separati da diversi metodi di cromatografia liquida in base alla loro proprietà di partizione. In questo metodo, vi presentiamo microflow ultra-prestazioni (UP) i metodi LC, ma il protocollo è scalabile per i flussi più elevati e pressioni più basse. Introduzione nello spettrometro di massa può essere attraverso sia le condizioni generali o di composti di origine ottimizzati. Rilevamento di una vasta gamma di ioni viene eseguito in modalità di scansione completa in modalità sia positivi che negativi su un&#39;ampia m / z gamma utilizzando ad alta risoluzione su un recente calibrated strumento. Analisi differenziale senza etichetta viene eseguita su piattaforme bioinformatiche. Le applicazioni di questo approccio includono lo screening metabolico percorso, scoperta di biomarcatori, e lo sviluppo di farmaci.

I risultati presentati mostrano i dati selezionati provenienti da un trattamento di 6-hr di cellule di glioblastoma SH-SY5Y con il pesticida e la complesso I mitocondriale inibitore di rotenone. Per brevità, solo i i di fase dati in modalità positivi organici è presentato. I campioni sono stati elaborati ed analizzati come descritto sopra (Figura 1, tabella 1, Tabella 2) e di caricate su due piattaforme di analisi differenziali per i etichetta di-gratuitamente quantificazione, SETACCIO e di XCMS on-l...

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Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry UPLC-HRMS

Non mirati metabolomica fornisce una ipotesi la generazione di un&#39;istantanea di un profilo di metabolico. Questo protocollo dimostrerà la estrazione e l&#39;analisi delle metaboliti provenienti da cellule, siero, o tessuto. Una gamma di metaboliti vengono intervistati usando l&#39;estrazione in fase liquido-liquido, microflusso UltraPerformance liquida cromatografia in fase / ad alta-risoluzione di massa spettrometria di (UPLC-HRMS) accoppiato ad software di analisi differenziale di.

Metabolomica non mirati da fonti biologiche Uso UltraPerformance cromatografia liquida-spettrometria di massa ad alta risoluzione (UPLC-HRMS)

Here we present a workflow to analyze the metabolic profiles for biological samples of interest including; cells, serum, or tissue. The sample is first ...

untargeted-metabolomics-from-biological-sources-using

Research

JoVE Journal

Chemistry

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry (UPLC-HRMS)

22.2K Views.  University of Pennsylvania. Non mirati metabolomica fornisce una ipotesi la generazione di un'istantanea di un profilo di metabolico. Questo protocollo dimostrerà la estrazione e l'analisi delle metaboliti provenienti da cellule, siero, o tessuto. Una gamma di metaboliti vengono intervistati usando l'estrazione in fase liquido-liquido, microflusso UltraPerformance liquida cromatografia in fase / ad alta-risoluzione di massa spettrometria di (UPLC-HRMS) accoppiato ad software di analisi ...

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Large Scale Non-targeted Metabolomic Profiling of Serum by Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (UPLC-MS)

Non-targeted metabolite profiling by ultra performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry (UPLC-MS) is a powerful technique to investigate metabolism. The approach offers an unbiased and in-depth analysis that can enable the development of diagnostic tests, novel therapies, and further our understanding of disease processes. The inherent chemical diversity of the metabolome creates significant analytical challenges and there is no single experimental approach that can detect all metabolites. Additionally, the biological variation in individual metabolism and the dependence of metabolism on environmental factors necessitates large sample numbers to achieve the appropriate statistical power required for meaningful biological interpretation. To address these challenges, this tutorial outlines an analytical workflow for large scale non-targeted metabolite profiling of serum by UPLC-MS. The procedure includes guidelines for sample organization and preparation, data acquisition, quality control, and metabolite identification and will enable reliable acquisition of data for large experiments and provide a starting point for laboratories new to non-targeted metabolite profiling by UPLC-MS.

Large Scale Non-targeted Metabolomic Profiling of Serum by Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry UPLC-MS

Non-targeted metabolite profiling by ultra performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry (UPLC-MS) is a powerful technique to investigate metabolism. This article outlines a typical workflow utilized for non-targeted metabolite profiling of serum including sample organization and preparation, data acquisition, data analysis, quality control, and metabolite identification.

Su larga scala e non mirato Profiling Metabolomica di siero da Ultra Performance Liquid Chromatography-Spettrometria di Massa (UPLC-MS)

Non-targeted metabolite profiling by ultra performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry (UPLC-MS) is a powerful technique to ...

Ricerca

Chimica

Analyzing Protein Dynamics Using Hydrogen Exchange Mass Spectrometry

All cellular processes depend on the functionality of proteins. Although the functionality of a given protein is the direct consequence of its unique amino acid sequence, it is only realized by the folding of the polypeptide chain into a single defined three-dimensional arrangement or more commonly into an ensemble of interconverting conformations. Investigating the connection between protein conformation and its function is therefore essential for a complete understanding of how proteins are able to fulfill their great variety of tasks. One possibility to study conformational changes a protein undergoes while progressing through its functional cycle is hydrogen-1H/2H-exchange in combination with high-resolution mass spectrometry (HX-MS). HX-MS is a versatile and robust method that adds a new dimension to structural information obtained by e.g. crystallography. It is used to study protein folding and unfolding, binding of small molecule ligands, protein-protein interactions, conformational changes linked to enzyme catalysis, and allostery. In addition, HX-MS is often used when the amount of protein is very limited or crystallization of the protein is not feasible. Here we provide a general protocol for studying protein dynamics with HX-MS and describe as an example how to reveal the interaction interface of two proteins in a complex. &#160;&#160;

Protein conformation and dynamics are key to understanding the relationship between protein structure and function. Hydrogen exchange coupled with high-resolution mass spectrometry is a versatile method to study the conformational dynamics of proteins as well as characterizing protein-ligand and protein-protein interactions, including contact interfaces and allosteric effects.

Analizzando la dinamica delle proteine ​​che utilizzano l&#39;idrogeno Scambio Spettrometria di Massa

All cellular processes depend on the functionality of proteins. Although the functionality of a given protein is the direct consequence of its unique ...

Rapid High-throughput Species Identification of Botanical Material Using Direct Analysis in Real Time High Resolution Mass Spectrometry

We demonstrate that direct analysis in real time-high resolution mass spectrometry can be used to produce mass spectral profiles of botanical material, and that these chemical fingerprints can be used for plant species identification. The mass spectral data can be acquired rapidly and in a high throughput manner without the need for sample extraction, derivatization or pH adjustment steps. The use of this technique bypasses challenges presented by more conventional techniques including lengthy chromatography analysis times and resource intensive methods. The high throughput capabilities of the direct analysis in real time-high resolution mass spectrometry protocol, coupled with multivariate statistical analysis processing of the data, provide not only class characterization of plants, but also yield species and varietal information. Here, the technique is demonstrated with two psychoactive plant products, Mitragyna speciosa (Kratom) and Datura (Jimsonweed), which were subjected to direct analysis in real time-high resolution mass spectrometry followed by statistical analysis processing of the mass spectral data. The application of these tools in tandem enabled the plant materials to be rapidly identified at the level of variety and species.

A method for species identification of botanical material by direct analysis in real time-high resolution mass spectrometry and multivariate statistical analysis is presented.

Rapid high-throughput Specie Identificazione del materiale botanico Utilizzando l&#39;analisi diretta in tempo reale ad alta risoluzione Spettrometria di Massa

We demonstrate that direct analysis in real time-high resolution mass spectrometry can be used to produce mass spectral profiles of botanical material, ...

Real-time Breath Analysis by Using Secondary Nanoelectrospray Ionization Coupled to High Resolution Mass Spectrometry

Exhaled volatile organic compounds (VOCs) have aroused considerable interest, since they can serve as biomarkers for disease diagnosis and environmental exposure in a non-invasive manner. In this work, we present a protocol to characterize the exhaled VOCs in real time by using secondary nanoelectrospray ionization coupled to high resolution mass spectrometry (Sec-nanoESI-HRMS). The homemade Sec-nanoESI source was readily set up based on a commercial nanoESI source. Hundreds of peaks were observed in the background-subtracted mass spectra of exhaled breath, and the mass accuracy values are -4.0-13.5 ppm and -20.3-1.3 ppm in the positive and negative ion detection modes, respectively. The peaks were assigned with accurate elemental composition according to the accurate mass and isotopic pattern. Less than 30 s is used for one exhalation measurement, and it takes approximately 7 min for six replicated measurements.

A protocol for characterizing chemical composition of exhaled breath in real time by using secondary nanoelectrospray ionization coupled to high resolution mass spectrometry is demonstrated.

Analisi dell'espirato in tempo reale tramite ionizzazione secondaria Nanoelectrospray accoppiata alla spettrometria di massa ad alta risoluzione

Exhaled volatile organic compounds (VOCs) have aroused considerable interest, since they can serve as biomarkers for disease diagnosis and environmental ...

Microprobe Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry for Single-cell Metabolomics in Live Frog (Xenopus laevis) Embryos

The quantification of small molecules in single cells raises new potentials for better understanding the basic processes that underlie embryonic development. To enable single-cell investigations directly in live embryos, new analytical approaches are needed, particularly those that are sensitive, selective, quantitative, robust, and scalable to different cell sizes. Here, we present a protocol that enables the in situ analysis of metabolism in single cells in freely developing embryos of the South African clawed frog (Xenopus laevis), a powerful model in cell and developmental biology. This approach uses a capillary microprobe to aspirate a defined portion from single identified cells in the embryo, leaving neighboring cells intact for subsequent analysis. The collected cell content is analyzed by a microscale capillary electrophoresis electrospray ionization (CE-ESI) interface coupled to a high-resolution tandem mass spectrometer. This approach is scalable to various cell sizes and compatible with the complex three-dimensional structure of the developing embryo. As an example, we demonstrate that microprobe single-cell CE-ESI-MS enables the elucidation of metabolic cell heterogeneity that unfolds as a progenitor cell gives rise to descendants during development of the embryo. Besides cell and developmental biology, the single-cell analysis protocols described here are amenable to other cell sizes, cell types, or animal models.

Microprobe Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry for Single-cell Metabolomics in Live Frog Xenopus laevis Embryos

We describe steps that enable fast in situ sampling of a small portion of an individual cell with high precision and minimal invasion using capillary-based micro-sampling, to facilitate chemical characterization of a snapshot of metabolic activity in live embryos using a custom-built single cell capillary electrophoresis and mass spectrometry platform.

Spettrometria di massa di elettroforesi capillare di microsonda per cella singola metabolomica in embrioni di rana Live (Xenopus laevis)

The quantification of small molecules in single cells raises new potentials for better understanding the basic processes that underlie embryonic ...

High-throughput and Comprehensive Drug Surveillance Using Multisegment Injection-Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry

New analytical methods are urgently needed to enable high-throughput, yet comprehensive drug screening, given an alarming opioid and prescription drug crisis in public health. Conventional urine drug testing based on a two-tier immunoassay screen followed by a gas chromatography-tandem mass spectrometry (GC-MS/MS) or liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) method are expensive and prone to bias while being limited to targeted panels of known drugs of abuse (DoA). Herein, we outline an improved method for drug surveillance that allows for the resolution and detection of an expanded panel of DoA and their metabolites when using multisegment injection-capillary electrophoresis-mass spectrometry (MSI-CE-MS). Multiplexed separations of ten urine samples with a quality control by CE (&lt; 3 min/sample) in conjunction with full-scan data acquisition using a time-of-flight mass spectrometer (TOF-MS) under positive ion mode detection allows for the identification and quantification of DoA above recommended cut-off levels. An excellent resolution of drug isomers and isobars, including background interferences, are achieved when using MSI-CE-MS with an electrokinetic spacer between sample segments, where accurate mass/molecular formula together with the comigration of a matching deuterated internal standard and the detection of one or more bio-transformed metabolites facilitate DoA identification over a wider detection window. Additionally, urine samples can be analyzed directly without enzyme deconjugation for the rapid screening without complicated sample workup. MSI-CE-MS enables the surveillance of a broad spectrum of DoA that is required for the treatment monitoring of high-risk patients, including confirming prescribed drug adherence, revealing illicit drug use/substitution, and evaluating optimal dosage regimes as required for new advances in precision medicine.

Here we describe a high-throughput method for comprehensive drug surveillance that allows for the improved resolution and detection of large panels of drugs of abuse and their metabolites, with quality control based on multisegment injection-capillary electrophoresis-mass spectrometry.

Sorveglianza dei medicinali ad alta produttività e completa usando la spettrometria totale multisegmento elettroforesi di iniezione-capillare

New analytical methods are urgently needed to enable high-throughput, yet comprehensive drug screening, given an alarming opioid and prescription drug ...

Imaging Corrosion at the Metal-Paint Interface Using Time-of-Flight Secondary Ion Mass Spectrometry

Corrosion developed at the paint and aluminum (Al) metal-paint interface of an aluminum alloy is analyzed using time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS), illustrating that SIMS is a suitable technique to study the chemical distribution at a metal-paint interface. The painted Al alloy coupons are immersed in a salt solution or exposed to air only. SIMS provides chemical mapping and 2D molecular imaging of the interface, allowing direct visualization of the morphology of the corrosion products formed at the metal-paint interface and mapping of the chemical after corrosion occurs. The experimental procedure of this method is presented to provide technical details to facilitate similar research and highlight pitfalls that may be encountered during such experiments.

Time-of-flight secondary ion mass spectrometry is applied to demonstrate the chemical mapping and corrosion morphology at the metal-paint interface of an aluminum alloy after being exposed to a salt solution compared with a specimen exposed to air.

Corrosione dell'imaging nell'interfaccia Metal-Paint con spettrometria di massa ionica secondaria a tempo di volo

Corrosion developed at the paint and aluminum (Al) metal-paint interface of an aluminum alloy is analyzed using time-of-flight secondary ion mass ...

3D Depth Profile Reconstruction of Segregated Impurities Using Secondary Ion Mass Spectrometry

The presented protocol combines excellent detection limits (1 ppm to 1 ppb) using secondary ion mass spectrometry (SIMS) with reasonable spatial resolution (~1 &#181;m). Furthermore, it describes how to obtain realistic three-dimensional (3D) distributions of segregated impurities/dopants in solid state materials. Direct 3D depth profile reconstruction is often difficult to achieve due to SIMS-related measurement artifacts. Presented here is a method to identify and solve this challenge. Three major issues are discussed, including the i) nonuniformity of the detector being compensated by flat-field correction; ii) vacuum background contribution (parasitic oxygen counts from residual gases present in the analysis chamber) being estimated and subtracted; and iii)&#160;performance of all steps within a stable timespan of the primary ion source. Wet chemical etching is used to reveal the position and types of dislocation in a material, then the SIMS result is superimposed on images obtained via scanning electron microscopy (SEM). Thus, the position of agglomerated impurities can be related to the position of certain defects. The method is fast and does not require sophisticated sample preparation stage; however, it requires a high-quality, stable ion source, and the entire measurement must be performed quickly to avoid deterioration of the primary beam parameters.

The presented method describes how to identify and solve measurement artifacts related to secondary ion mass spectrometry as well as obtain realistic 3D distributions of impurities/dopants in solid state materials.

Ricostruzione del profilo di profondità 3D di impurità segregate utilizzando la spettrometria di massa a ioni secondari

The presented protocol combines excellent detection limits (1 ppm to 1 ppb) using secondary ion mass spectrometry (SIMS) with reasonable spatial ...

Characterizing RNA Modifications in Single Neurons Using Mass Spectrometry

Post-transcriptional modifications (PTMs) of RNA represent an understudied mechanism involved in the regulation of translation in the central nervous system (CNS). Recent evidence has linked specific neuronal RNA modifications to learning and memory paradigms. Unfortunately, conventional methods for the detection of these epitranscriptomic features are only capable of characterizing highly abundant RNA modifications in bulk tissues, precluding the assessment of unique PTM profiles that may exist for individual neurons within the activated behavioral circuits. In this protocol, an approach is described&#8212;single-neuron RNA modification analysis by mass spectrometry (SNRMA-MS)&#8212;to simultaneously detect and quantify numerous modified ribonucleosides in single neurons. The approach is validated using individual neurons of the marine mollusk, Aplysia californica, beginning with surgical isolation and enzymatic treatment of major CNS ganglia to expose neuron cell bodies, followed by manual single-neuron isolation using sharp needles and a micropipette. Next, mechanical and thermal treatment of the sample in a small volume of buffer is done to liberate RNA from an individual cell for subsequent RNA digestion. Modified nucleosides are then identified and quantified using an optimized liquid chromatography-mass spectrometry method. SNRMA-MS is employed to establish RNA modification patterns for single, identified neurons from A. californica that have known morphologies and functions. Examples of qualitative and quantitative SNRMA-MS are presented that highlight the heterogeneous distribution of RNA modifications across individual neurons in neuronal networks.

Post-transcriptional modifications of RNA represent an understudied layer of translation regulation that has recently been linked to central nervous system plasticity. Here, sample preparation and liquid chromatography-tandem mass spectrometry approach is described for simultaneous characterization of numerous RNA modifications in single neurons.

Caratterizzazione delle modifiche dell'RNA in singoli neuroni utilizzando la spettrometria di massa

Post-transcriptional modifications (PTMs) of RNA represent an understudied mechanism involved in the regulation of translation in the central nervous ...

Extraction of Non-Protein Amino Acids from Cyanobacteria for Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry Analysis

Non-protein amino acids (NPAAs) are a large class of amino acids (AAs) that are not genetically encoded for translation into proteins. The analysis of NPAAs can provide crucial information about cellular uptake and/or function, metabolic pathways, and potential toxicity. &#946;-methylamino-L-alanine (BMAA) is a neurotoxic NPAA produced by various algae species and is associated with an increased risk for neurodegenerative diseases, which has led to significant research interest. There are numerous ways to extract AAs for analysis, with liquid chromatography-tandem mass spectrometry being the most common, requiring protein precipitation followed by acid hydrolysis of the protein pellet. Studies on the presence of BMAA in algal species provide contradictory results, with the use of unvalidated sample preparation/extraction and analysis a primary cause. Like most NPAAs, protein precipitation in 10% aqueous TCA and hydrolysis with fuming HCl is the most appropriate form of extraction for BMAA and its isomers aminoethylglycine (AEG) and 2,4-diaminobutyric acid (2,4-DAB). The present protocol describes the steps in a validated NPAA extraction method commonly used in research and teaching laboratories.

The present protocol describes the extraction of non-protein amino acids from biological matrices via trichloroacetic acid (TCA) protein precipitation and acid hydrolysis before analysis using liquid chromatography-tandem mass spectrometry.

Estrazione di aminoacidi non proteici da cianobatteri per cromatografia liquida-analisi di spettrometria di massa tandem

Non-protein amino acids (NPAAs) are a large class of amino acids (AAs) that are not genetically encoded for translation into proteins. The analysis of ...