Questo protocollo aiuterà gli utenti e insegnerà agli studenti i passaggi corretti nell'estrazione di BMA, AEG e 2, 4-DAB. Riducendo così al minimo le possibilità di errore e producendo risultati coerenti. Questo metodo è un metodo comunemente usato e validato per l'estrazione di BMA e dei suoi isomeri, AEG e 2, 4-DAB in una matrice batterica sauna.
Questo metodo può essere utilizzato per ulteriori ricerche sulla tossicità dei BMA e fornire una maggiore comprensione della BMA e dei suoi effetti sulla salute associati. Iniziare per centrare il campione di cianobatteri a 3.500 G per 10 minuti a 25 gradi Celsius. E scartare il surnatante nei rifiuti biologici.
Coprire il tubo della centrifuga contenente il pellet con una pellicola sigillante e forare alcuni fori nel film usando una pinzetta affilata a naso lungo. Quindi conservare il tubo in posizione verticale a meno 80 gradi Celsius. Dopo 30 minuti, posizionare il tubo in posizione verticale in un contenitore di vetro liofilizzante e posizionare il contenitore all'interno del congelatore a meno 80 gradi Celsius per cinque minuti per il raffreddamento.
Rimuovere il contenitore di vetro dal congelatore e attaccare il coperchio di gomma. Assicurarsi che la maniglia sull'uscita della valvola in gomma del liofilizzatore sia rivolta verso l'alto e ventilata verso l'atmosfera. Attaccare saldamente il contenitore di vetro.
Ruotare lentamente la maniglia dell'uscita della valvola in gomma per puntarla in posizione verso il basso per esporre il barattolo al vuoto. E consentire fino a 24 ore di liofilizzazione per sublimare tutto il liquido. Al termine, pesare da 15 a 50 milligrammi di pellet di campione congelati in una provetta da centrifuga da 15 millilitri.
Utilizzando una bilancia analitica. Al campione, aggiungere da 300 a 600 microlitri di acido tricloroacetico acquoso al 10% o TCA. Mettere le provette in un contenitore pieno di ghiaccio tritato.
Pulire la sonda del sonicatore con una salvietta di carta priva di lanugine spruzzata con etanolo al 70% prima di immergere completamente l'estremità della sonda nel campione e premere start. Una volta fatto, posizionare il campione contenente la provetta da centrifuga su ghiaccio per un minuto. E ripetere il processo di sonicazione per garantire la lisi cellulare.
Dopo aver raffreddato il campione a quattro gradi Celsius per 24 ore. Centrifugare a 3.500 g per 15 minuti a otto gradi Celsius. Quindi, utilizzando una micro pipetta, trasferire il surnatante in un tubo da due millilitri etichettato come frazione libera.
Aggiungere 400 microlitri di TCA acquoso al 10% nel pellet campione e rompere il pellet mediante agitazione a vortice o con la punta della micro pipetta. Centrifugare e trasferire il surnatante nello stesso tubo di frazione libera da due millilitri. Ripetere questo passaggio una terza volta utilizzando acetone TCA al 10%.
Posizionare il tubo della frazione libera con il coperchio aperto in un evaporatore centrifugo fino a quando tutto il liquido volatile non viene rimosso. Una volta che il campione è privo di liquidi volatili, coprire saldamente il tubo con la pellicola del soffitto e forare il film con alcuni fori usando una pinzetta affilata a naso lungo. Dopo la liofilizzazione dimostrata in precedenza, ricostituire il campione con 200 microlitri di acido cloridrico 20 millimolare e metterlo in un congelatore a meno 80 gradi Celsius.
Aggiungere 400 microlitri di acetone al 100% sul pellet campione utilizzando una micropipetta e rompere il pellet utilizzando l'agitazione del vortice o la punta della micro pipetta. Trasferire quantitativamente il pellet lavato e risospeso nel flaconcino di vetro corrispondente. Utilizzando una micro pipetta da un millilitro.
Aggiungere altri 400 microlitri di acetone alla provetta per aiutare a trasferire il pellet rimanente. Centrifugare e decantare il liquido surnatante in rifiuti biologici prima di essiccare il pellet in un evaporatore centrifugo fino a quando il liquido viene rimosso e il pellet è asciutto. Per preparare il file di idrolisi sotto vuoto aggiungere un millilitro di acido cloridrico a sei molari sul fondo del file di idrolisi.
Inserire con cautela i flaconcini di guscio etichettati con campioni essiccati nella lima di idrolisi utilizzando una pinzetta che garantisca una posizione stabile e verticale. Collegare il coperchio alla lima di idrolisi e spingere la manopola rossa sul coperchio per chiudere la valvola. Dopo aver acceso la pompa per vuoto, collegare il tubo del vuoto alla testa del coperchio del file di idrolisi e premere la manopola verde sul coperchio per aprire la valvola.
Quindi, lasciare che la pompa per vuoto rimuova l'aria dalla fiala per un minuto. Quindi chiudere il flaconcino premendo la manopola rossa sul coperchio del flaconcino di idrolisi. Spegnere la pompa per vuoto e rimuovere il tubo a vuoto.
Collegare un tubo di gomma al rubinetto del gas azoto sul banco del laboratorio. E apri leggermente il rubinetto. Posizionare il pollice all'estremità del tubo, sigillarlo e contare fino a quando il gas inizia a fuoriuscire mentre la pressione si accumula.
Quindi, attaccare l'altra estremità del tubo di gomma alla testa del coperchio del flaconcino di idrolisi. E spingere immediatamente la manopola verde del coperchio. Conta il tempo impiegato per la fuoriuscita del gas.
Spingere rapidamente la manopola rossa sul coperchio e rimuovere il tubo di gomma. Ripetere l'intero processo di trattamento sottovuoto due volte. Assicurarsi che il flaconcino di idrolisi di vetro sia privo di aria e riempito con azoto gassoso.
Mettere il flaconcino di idrolisi in un forno preriscaldato impostato a 110 gradi Celsius per 16-18 ore. Utilizzando i guanti da forno, rimuovere la fiala di idrolisi di vetro dal forno. Lasciare raffreddare il flaconcino all'interno della cappa aspirante per 10 minuti prima di spingere la manopola verde mentre la si rivolge per rilasciare pressione e gas.
Ricostituire i pellet campione idrolizzati con 200 microlitri di acido cloridrico 20 molari nel flaconcino del guscio e risospendere il pellet. Centrifugare i flaconcini contenenti i pellet campione ricostituiti per due minuti a 5, 300 G e 25 gradi Celsius. Trasferire i campioni di frazione libera ricostituita e la frazione proteica nei due tubi filtranti da millilitri contenenti filtri a membrana a poro da 0,2 micron ed etichettati come frazione libera e frazione proteica.
Posizionare i tubi per la centrifugazione per 30 minuti a 5.000 G e 25 gradi Celsius. Il cromatogramma di monitoraggio delle reazioni multiple di uno standard contenente beta-metilammino-L-alanina o BMAA e i suoi isomeri indicati dalle linee codificate a colori è mostrato qui. Un rilevamento positivo per tutti e tre gli isomeri, BMAA, DAB e AEG è stato osservato nella frazione libera delle specie di Merismopedia raccolte dal lago Liddel.
Mentre la frazione legata delle specie Microcystis flos-aquae raccolte da Waka Waterworks ha mostrato un risultato negativo per BMAA e i suoi isomeri. Il pellet risospeso deve essere trasferito quantitativamente nel flaconcino di guscio corrispondente per consentire un punto preciso di normalizzazione basato sulla massa di cianobatteri. I pazienti e la dovuta diligenza sono consigliati durante l'esecuzione di questo passaggio.
Seguendo questa procedura. Le frazioni estratte dovranno subire una fase di devitalizzazione per consentire la fase inversa. Cromatografia liquida, analisi di spettrometria di massa tandem.
L'applicazione di questa tecnica espande vari campi scientifici. Includere le scienze ambientali attraverso l'analisi delle cinotossine nei campioni ambientali. E campi come la tossicologia e la biochimica attraverso l'indagine della teoria della Misincorporation della BMA.
