Ringraziamo M. Boysen per i commenti sul manoscritto. Questo progetto è stato finanziato dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB638 e MA 1278/4-1 di MPM e Cluster di Eccellenza: CellNetworks EXC 81/1). MPM è ricercatore del Cluster di Eccellenza: CellNetworks.

1. Preparazione di tamponi e di proteine ​​Campioni <ol><li> Preparare H 2 O buffer. Tampone standard uso Hsp90 (40 mM HEPES / KOH, pH 7.5, 50 mM KCl, 5 mM MgCl 2, 10% glicerolo) e H 2 O buffer. Nota: Se il campione è stato dializzato prima dell&#39;analisi, utilizzare il buffer di dialisi come H 2 O buffer. È essenziale che l&#39;O tampone D 2 differisce dalla H 2 O tampone solo in isotopo dell&#39;idrogeno. Tamponi volatili come NH 4 CO 3 o NH componenti 4 acetato o tampone non sono adatti! </li><li> Preparare D 2 O tampone mediante liofilizzazione di tampone standard Hsp90 usando un concentratore a vuoto. Dopo completa evaporazione di H 2 O aggiungere puro D 2 O al tubo per raggiungere il volume totale iniziale (ad esempio, 1 ml di tampone con 15% glicerolo richiede l&#39;aggiunta di 850 microlitri D 2 O). Ripetere la completa evaporazione del buffer e ridisciogliere il com buffer / salecomponenti in D 2 O 2x. </li><li> Preparare tampone di quench (0,4 M KH 2 PO 4 / H 3 PO 4 pH 2,2). Nota: Per migliorare l&#39;efficienza della peptica digest di proteine ​​molto stabili possono essere aggiunti 4 M guanidina cloridrato e 0,5 M Tris (2-carbossietil) fosfina (TCEP-HCl). </li><li> Preparare campione di controllo di 100% (6 M guanidina cloridrato, D 2 O). Aggiungere guanidina cloridrato di un&#39;aliquota Hsp90 per raggiungere una concentrazione finale di 6 M. completamente evaporare H 2 O dal campione e aggiungere D 2 O al tubo per raggiungere il volume totale iniziale (ad esempio 100 microlitri del campione con il 10% glicerolo richiedono l&#39;aggiunta 90 microlitri di D 2 O). Ripetere la completa evaporazione del buffer e riportare in soluzione i componenti tampone / sale di D 2 O. Nota: 20-100 pmol di campione sono necessari per ogni iniezione. Preparare abbastanza esempio per avere un controllo al 100% per ogni giorno di esperimenti HX-MS. </li><li> Preparare 50 pmol Hsp90 in 5 microlitri tampone standard Hsp90. Nota: è necessaria una quantità di 20-100 pmol di campione per ciascun punto di dati grezzi. Il volume di campione nella reazione è 1-5 microlitri ideale. Regolare la concentrazione per soddisfare queste esigenze. Ogni buffer può essere utilizzato fintanto che non contiene detergenti o componenti volatili. </li></ol> 2. Preparazione di immobilizzato pepsina sulla aldeidi Beads Attivato <ol><li> Disciogliere 80 mg pepsina fresco in 2 ml di citrato di sodio 50 mM (pH 5). </li><li> Sciogliere 20 mg di sodiocianoboroidruro, maneggiare con cura (molto tossico!) In 1 ml 2 M Na 2 SO 4 e aggiungere alla soluzione di pepsina. </li><li> Incubare la miscela per 10 minuti a temperatura ambiente mentre delicatamente agitando (shaker es dall&#39;alto). </li><li> Aggiungere 600 mg perline con gruppi aldeidici immobilizzati alla miscela e incubare per 5-10 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Aggiungere 2.2 ml di 2 M Na 2 SO4 (pH 5) in aliquote di 100 microlitri ogni 3 min oltre un&#39;ora di sale lentamente la pepsina. Mescolare delicatamente il campione tra le aggiunte in un agitatore in testa a temperatura ambiente. </li><li> Incubare le perline pepsina a 4 ° C per 14-16 ore / notte in un agitatore in testa. </li><li> Estinguere la reazione aggiungendo 1 ml di 1 M etanolammina e incubazione a temperatura ambiente per 2 ore. </li><li> Spin giù le perline in un tubo falcon da 50 ml a 500 rpm, scartare il surnatante e risospendere le sfere nello 0,1% di acido formico. Ripetere questo passaggio 2x. Dopo l&#39;ultima fase di centrifugazione, scartare il surnatante e il volume stima di perline. Aggiungere un volume equivalente di 0,1% di acido formico e conservare a 4 ° C. </li></ol> 3. Preparazione delle Colonne per Ammide Idrogeno-scambio <ol><li> Utilizzare le colonne di guardia con un diametro interno di 1 mm per intrappolare le colonne e di 2 mm per colonne pepsina. </li><li> Svitare un lato della colonna di guardia e rimuovere il filtro. Avvitare funn imballaggioel sull&#39;estremità aperta della colonna. Utilizzare un adattatore 1/16 di pollice e tubi per collegare una siringa vuota (5 ml) all&#39;uscita inferiore della colonna. Assicurati di risolvere il problema a tenuta di gas alla colonna di guardia. </li><li> Applicare alcune gocce di slurry materiale tallone sulla parte superiore dell&#39;imbuto. Tirare lo stantuffo della siringa per aspirare il liquame attraverso l&#39;imbuto nella colonna di guardia. Applicare più slurry materiale tallone sul imbuto e continuare la procedura fino a quando la colonna di guardia è completamente riempito con materiale tallone. Rimuovere l&#39;imbuto e posizionare filtro e portafiltro sull&#39;estremità aperta. Fissare la calotta colonna sulla colonna di guardia e rimuovere la siringa dall&#39;altro lato. Chiudere entrambe le estremità delle colonne guardia con tappi per evitare l&#39;essiccamento di materiale colonna. </li></ol> 4. Configurazione del sistema per l&#39;idrogeno di Exchange Spettrometria di Massa (HX-MS) <ol><li> Collegare colonna trappola con il sistema HPLC (Figura 1). Equilibrare la colonna impostando la portata diUna pompa a 0,4 ml / min con 0,1% di acido formico come solvente. Non collegare la colonna pepsina, né la colonna analitica ancora. </li><li> Calibrare lo spettrometro di massa e collegare l&#39;uscita del HPLC alla sorgente dello spettrometro di massa. </li></ol> 5. Determinazione della gamma dinamica di scambio <ol><li> Preparare ultrapura solvente A (0,1% di acido formico in acqua) e ultrapura solvente B (0,1% di acido formico in acetonitrile); solventi premiscelati sono disponibili in commercio. Spurgare le pompe HPLC. Impostare la cromatografia e metodi di spettrometria di massa nel software di controllo, scegliendo un programma con un gradiente passo dopo passo è breve dissalazione. Per tutta lunghezza Hsp90 utilizzare un desalificazione 1-2 min passo seguito commutando la valvola a 6 porte da desalt / LOAD per eluire e un gradiente passo dal 90% di solvente A/10% di solvente B al 5% di solvente A/95% solvente B. Prima dell&#39;iniezione impostare la valvola di iniezione di carico e la valvola a 6 porte per desalt / posizione di carico. Appunto: Non utilizzare un pepsina o colonna analitica durante questo esperimento. </li><li> Preparare 100-200 pmol di Hsp90 in 1-10 ml H 2 O buffer e incubare per 10 min a 30 ° C. Aggiungi la temperatura regolata D 2 O tampone per portare il volume del campione fino a 100 ml e incubare esattamente per un determinato periodo di tempo (ad esempio 10 sec, 100 sec, 1.000 sec). Aggiungere 100 microlitri di buffer tempra e mescolare pipettando su e giù. Iniettare il campione 200 microlitri nella porta di iniezione della valvola di iniezione con una siringa Hamilton. Avviare il programma cromatografia e commutare la valvola di iniezione in posizione di iniezione. Dopo 2 min commutare la valvola a 6 porte da desalt / CARICAMENTO eluire. Ripetere questo per almeno tre punti temporali. </li><li> Ripetere il punto 5.2 ma add 2-3x eccesso di Sti1 al campione Hsp90 prima dell&#39;incubazione per 10 min a 30 ° C. </li><li> Determinare le masse proteina intera per deconvoluzione degli spettri nel software spettrometria di massa. Calcolare il numero di IncorporatEd deuteroni confrontando il peso molecolare di full-length Hsp90 con la massa osservata dopo ogni corsa (ad esempio 10 sec, 100 sec, 1.000 sec). </li><li> Tracciare i deuteroni incorporati per Hsp90 in assenza e presenza di Sti1 (asse y) in funzione del tempo (asse x). Determinare il tempo-punto della gamma dinamica in cui la differenza tra le due curve è massima. Utilizzare questo valore per il tempo di incubazione in D 2 O quando si identifica l&#39;interfaccia Hsp90-Sti1 e le dinamiche a livello di peptide. </li></ol> 6. Determinazione del peptica Peptidi Utilizzando MS / MS Spectra <ol><li> Collegare la colonnina pepsina e la colonna analitica al sistema. </li><li> Impostare i parametri per la cromatografia e spettrometria di massa nel software di controllo scegliendo il tipo di gradiente e metodo di spettrometria di massa. Scegli una lunga discesa (ad esempio, più di 90 min) per assicurare una buona risoluzione cromatografica. Attiva MS / MS spettri dello spettrometro di massa. Nota: Buona risoluzionezione sul HPLC e l&#39;alta accuratezza di massa hanno la massima priorità in questa fase. </li><li> Preparare 100-200 pmol di Hsp90 in 100 ml H 2 O buffer. Aggiungere 100 microlitri di buffer tempra e mescolare pipettando su e giù. Iniettare il campione 200 microlitri nella porta di iniezione della valvola di iniezione con una siringa Hamilton. Avviare il programma cromatografia e commutare la valvola di iniezione in posizione di iniezione. Dopo 2 min commutare la valvola a 6 porte da desalt / CARICAMENTO eluire posizione. Nota: Se più di una proteina deve essere analizzato in HX-MS (ossia le interfacce di interazione proteina-proteina) i peptidi per ogni proteina devono essere determinati individualmente. </li><li> Identificare peptidi peptiche di Hsp90 con la ricerca di un database (cioè mascotte) per i peptidi risultanti. Nota: E &#39;possibile utilizzare un database personalizzato come scopo è determinare quante peptidi peptiche possibile e analisi viene fatta con proteina purificata. Purezza campione have essere preso in considerazione. </li><li> Ripetere questo passo senza MS / MS e con il gradiente che verrà utilizzata per l&#39;esperimento vero HX. Per Hsp90 e Sti1 usano un 10 min pendenza dal 90% di solvente A/10% di solvente B al 45% di solvente A/55% di solvente B. Nota: Le sfumature sono normalmente compresi tra 5-15 min e molto dipenderà dalla complessità del campione e specifiche di sistema HX. </li><li> Determinare i tempi di ritenzione dei peptidi peptiche identificati nella 6.4 in sfumatura utilizzata in 6.5 e creare un elenco comprendente 1.) Sequenza peptidica 2.) Peptide stato di carica e 3.) Tempo di ritenzione. Questo verrà utilizzato per identificare ciascun peptide dopo esperimenti HX. Nota: Tenere presente che i peptidi con differenze piccola m / z, stato di carica identica e tempo di ritenzione identico possono essere una fonte di ambiguità. </li></ol> 7. Identificazione delle proteina-proteina di interazione Interfacce <ol><li> Impostare il gradiente e metodo di spettrometria di massa nel softwar controlloe. Utilizzare un gradiente lineare a 10 min dal 90% di solvente A/10% di solvente B al 45% di solvente A/55% B. solvente Caricare un metodo di spettrometria di massa che è ottimizzato per il rilevamento delle masse tra 300-1,500 m / z, sebbene la maggior parte di i peptidi saranno inferiori a 1.000 m / z. Impostare la valvola di iniezione in posizione di carico, la valvola a 6 porte in CARICO / dissalazione posizione. Impostare la portata della pompa di carico a 0,4 ml / min. Nota: La lunghezza e tipo di sfumatura sono dipendenti del campione e possono essere ottimizzati. Gradienti più lunghe migliorano la risoluzione della cromatografia, ma diminuiscono l&#39;incorporazione di deutoni in proteine ​​a causa di back-scambio. I metodi scelti devono essere la stessa per tutti gli esperimenti da confrontare. </li><li> Per il riferimento unexchanged preparare 20-100 pmol di Hsp90 in 100 ml H 2 O buffer. Aggiungere 100 microlitri di buffer quench ghiacciata, pipetta su e giù due volte e iniettare campione nella valvola di iniezione del HPLC. Avviare immediatamente il programma di cromatografia e swprudere la valvola di iniezione in posizione di iniezione. Dopo 2 min commutare la valvola a 6 porte da desalt / CARICAMENTO eluire posizione. Fate questo per Hsp90 e Sti1 individualmente e per la miscela di proteine. </li><li> Preparare 20-100 pmol di Hsp90 in un volume di 1-5 ml. Aggiungi la temperatura regolata D 2 O tampone per portare il volume del campione fino a 100 ml e incubare esattamente per un determinato periodo di tempo (ad esempio 30 sec, per dinamica conformazionale vedi Nota). Aggiungere 100 ml di tampone quench ghiacciato, pipetta su e giù due volte e rapidamente iniettare 200 microlitri nella valvola di iniezione del HPLC. Avviare immediatamente il programma di cromatografia e commutare la valvola di iniezione in posizione di iniezione. Dopo 2 min commutare la valvola a 6 porte da desalt / CARICAMENTO eluire posizione. Fate questo per ogni proteina singolarmente, per determinare l&#39;incorporazione deuterone in ciascun peptide in assenza della proteina interagente. Nota: Quando si studiano le dinamiche di conformational modifiche, ripetere l&#39;esperimento con diversi tempi di incubazione di Hsp90 in D 2 O buffer. Cercare di coprire un ampio lasso di tempo, scegliendo i tempi di incubazione logaritmica (ad esempio 10 sec, 30 sec, 100 sec, 300 sec, 1.000 sec, ecc.) D 2 O tampone e campione buffer deve essere esattamente identico tranne per l&#39;isotopo dell&#39;idrogeno. </li><li> Preparare una pari quantità di campione di controllo 100% (20-100 pmol) e aggiungere D 2 O tampone per portare il volume del campione fino a 100 microlitri. Aggiungere 100 ml di tampone quench ghiacciato, pipetta su e giù due volte e rapidamente iniettare 200 microlitri nella valvola di iniezione del HPLC. Avviare immediatamente il programma di cromatografia e commutare la valvola di iniezione in posizione di iniezione. Dopo 2 min commutare la valvola a 6 porte da desalt / CARICAMENTO eluire posizione. </li><li> Per determinare la superficie di interazione mescolare Hsp90 con un eccesso di almeno 2 volte di Sti1 di spostare l&#39;equilibrio verso lo stato legato (vedi nota) e incubarealla temperatura desiderata fino alla formazione del complesso è in equilibrio. Aggiungere temperatura regolata D 2 O tampone per portare il volume del campione fino a 100 microlitri e incubare esattamente per un determinato periodo di tempo (ad esempio 30 secondi). Aggiungere 100 microlitri di tampone quench ghiacciata, pipetta su e giù due volte e iniettare nella valvola di iniezione del HPLC rapidamente. Dopo 2 min commutare la valvola a 6 porte da desalt / CARICAMENTO eluire posizione. Ripetere questo esperimento con 20-100 pmol di Sti1 ed eccesso di Hsp90. Nota: Le concentrazioni assolute dipendono dalla costante di equilibrio di dissociazione dell&#39;interazione. Idealmente, dopo diluizione in D 2 O la concentrazione della proteina aggiunta in eccesso deve essere almeno 10 volte il K D (corrispondente a&gt; 85% delle proteine ​​inferiore concentrato vincolato). </li><li> Analizzare i dati acquisiti con software adatto e utilizzare i tempi di ritenzione determinati nella fase 6.5 di trovare ogni peptide nell&#39;analisi. CalculaTE il baricentro della distribuzione isotopo per la proteina unexchanged (passo 7.2) e per gli esperimenti HX (passo 7.3). Nota: Anche se i modelli di isotopi di peptidi scambiati aspetto diverso dalle loro controparti unexchanged, sia la conoscenza sullo stato di carica del peptide e l&#39;elevata accuratezza di massa dello spettrometro di massa permette una facile determinazione dei centroidi. </li><li> Confronta incorporazione di deutoni di proteine ​​bersaglio solo e con eccesso di partner di legame. Questo può essere fatto automaticamente con software commerciale o manualmente con un programma di foglio. I valori dei campioni di controllo 100% indicano il cambio massimo per ciascun peptide e possono essere utilizzati per determinare la quantità di D 2 O etichetta perso durante l&#39;esperimento a causa di scambio indietro. </li></ol>

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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+the+regulation+of+Hsp90+by+the+co-chaperone+Sti1.">Dynamics of the regulation of Hsp90 by the co-chaperone Sti1.</a> EMBO J. 31 (6), 1518-1528 (2012).</li><li>Lou, X., Kirchner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deuteration+distribution+estimation+with+improved+sequence+coverage+for+HX/MS+experiments.">Deuteration distribution estimation with improved sequence coverage for HX/MS experiments.</a> Bioinformatics. 26 (12), 1535-1541 (2010).</li><li>Kreshuk, A., Stankiewicz, M., Lou, X., Kirchner, M., Hamprecht, F. A., Mayer, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+detection+and+analysis+of+bimodal+isotope+peak+distributions+in+H/D+exchange+mass+spectrometry+using+HeXicon.">Automated detection and analysis of bimodal isotope peak distributions in H/D exchange mass spectrometry using HeXicon.</a> Intl. J. mass spectrom. 302 (1-3), 125-131 (2011).</li><li>Walters, B. T., Ricciuti, A., Mayne, L., Englander, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimizing+back+exchange+in+the+hydrogen+exchange-mass+spectrometry+experiment.">Minimizing back exchange in the hydrogen exchange-mass spectrometry experiment.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 23 (12), 2132-2139 (2012).</li><li>Weis, D. D., Wales, T. E., Engen, J. R., Hotchko, M., Ten Eyck, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+EX1+kinetics+in+H/D+exchange+mass+spectrometry+by+peak+width+analysis.">Identification and characterization of EX1 kinetics in H/D exchange mass spectrometry by peak width analysis.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 17 (11), 1498-1509 (2006).</li><li>Fang, J., Rand, K. D., Beuning, P. J., Engen, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=False+EX1+signatures+caused+by+sample+carryover+during+HX+MS+analyses.">False EX1 signatures caused by sample carryover during HX MS analyses.</a> Intl. J. Mass Spectrom. 302 (1-3), 19-25 (2011).</li><li>Deng, Y., Smith, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+unfolding+domains+in+large+proteins+by+their+unfolding+rates.">Identification of unfolding domains in large proteins by their unfolding rates.</a> Biochem. 37 (18), 6256-6262 (1998).</li><li>Wales, T. E., Engen, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+unfolding+of+diverse+SH3+domains+on+a+wide+timescale.">Partial unfolding of diverse SH3 domains on a wide timescale.</a> J. Mol. Biol. 357 (5), 1592-1604 (2006).</li><li>Pan, Y., Piyadasa, H., O'Neil, J. D., Konermann, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+dynamics+of+a+membrane+transport+protein+probed+by+h/d+exchange+and+covalent+labeling:+the+glycerol+facilitator.">Conformational dynamics of a membrane transport protein probed by h/d exchange and covalent labeling: the glycerol facilitator.</a> J. Mol. Biol. 416 (3), 400-413 (2012).</li><li>Hebling, C. M., Morgan, C. R., Stafford, D. W., Jorgenson, J. W., Rand, K. D., Engen, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+analysis+of+membrane+proteins+in+phospholipid+bilayer+nanodiscs+by+hydrogen+exchange+mass+spectrometry.">Conformational analysis of membrane proteins in phospholipid bilayer nanodiscs by hydrogen exchange mass spectrometry.</a> Anal chem. 82 (13), 5415-5419 (2010).</li><li>Abzalimov, R. R., Kaplan, D. A., Easterling, M. L., Kaltashov, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+conformations+can+be+probed+in+top-down+HDX+MS+experiments+utilizing+electron+transfer+dissociation+of+protein+ions+without+hydrogen+scrambling.">Protein conformations can be probed in top-down HDX MS experiments utilizing electron transfer dissociation of protein ions without hydrogen scrambling.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 20 (8), 1514-1517 (2009).</li></ol>

Non abbiamo nulla da rivelare.

Il legame di un partner di interazione di una proteina provoca inevitabilmente variazioni di accessibilità al solvente sul sito di legame. Inoltre, molte proteine ​​subiscono cambiamenti conformazionali dinamici su vincolante, che colpiscono altre regioni oltre l&#39;interfaccia reale di rilegatura. HX-MS è un metodo affidabile per monitorare questi cambiamenti ed è ancora capace di rivelare cambiamenti conformazionali nelle proteine ​​in tempi che gli altri metodi non possono coprire. <p class="jove_cont...

Il numero di strutture cristalline di proteine ​​e complessi proteici aumentato rapidamente negli ultimi anni. Essi presentano inestimabili istantanee della organizzazione strutturale di queste proteine ​​e forniscono una base per l&#39;analisi struttura-funzione. Tuttavia, la dinamica delle proteine ​​e dei cambiamenti conformazionali, che sono essenziali per le loro funzioni, sono raramente rivelate da cristallografia a raggi X. Crio-electronmicroscopy, invece, è in grado di catturare proteina e proteina complessi in differenti conformazioni ma generalmente non possono risolvere cambiamenti conformazionali fino a livello di struttura secondaria 1. Dinamica conformazionale delle proteine ​​in soluzione a dettagli atomiche possono essere risolti solo da NMR, ma questo metodo è ancora limitato alle proteine ​​di relativamente piccole dimensioni (generalmente ≤ 30 kDa) e ha bisogno di alte concentrazioni di proteine ​​(≥ 100 micron), che ostacola gli esperimenti con oligomerizzazione o aggregazione di proteine ​​incline 2. Un metodo cheè in grado di colmare tra l&#39;alta risoluzione cristallografia a raggi X e crio-electronmicroscopy e che non è limitata dalla dimensione proteine ​​o concentrazione è ammide idrogeno-1 H / 2 H-scambio (HX) in combinazione con spettrometria di massa (MS). Negli ultimi anni questo metodo è sviluppata per uno strumento analitico che per l&#39;analisi della dinamica delle proteine, folding, la stabilità della proteina e cambiamenti conformazionali 3-5. La base molecolare di questo metodo è la natura labile di backbone idrogeni ammidici in proteine, che si scambieranno con atomi di deuterio quando la proteina viene posto in un D 2 O soluzione. Il conseguente aumento della massa proteica nel tempo viene misurata con alta risoluzione MS. In brevi peptidi strutturati HX dipende solo dalla temperatura, concentrazione di catalizzatore (OH -, H 3 O + pH, vedi Figura 3) e catene laterali di aminoacidi residui adiacenti a causa induttiva, gattoeffetti alytic e sterici. Questi effetti sul intrinseca scambio chimico tasso k ch sono state elegantemente quantificata Bai et al. 6 e un programma è disponibile (cortesia Z. Zhang), che calcola k ch per ogni amminoacido in un polipeptide dipende dal pH e temperatura. A pH neutro e temperature ambiente k ch è dell&#39;ordine di 10 1 -10 3 sec -1. Nelle proteine ​​ripiegate HX può essere 2-9 ordini di grandezza più lento dovuto principalmente legame idrogeno nella struttura secondaria e in misura minore a causa di accesso ristretto di idrati ioni OH - all&#39;interno di una proteina strettamente ripiegata. HX in proteine ​​native implica quindi dispiegarsi, a scambio chimico parziale o globale e ripiegamento allo stato nativo secondo l&#39;equazione (1) e ai tassi di cambio osservati k obs dipendono op tasso di apertura k, il tasso di chiusura k cl e lo scambio chimico intrinseco raTE k ch secondo l&#39;equazione (2). <img alt="Equazioni 1-2" src="/files/ftp_upload/50839/50839eq1-2.jpg" /> In condizioni di stato nativo k op è molto più piccolo di k ch e può essere trascurato nel denominatore. Ci sono due regimi di cambio estreme chiamati EX1 ed EX2. Se k cl è molto più piccolo k ch (EX1) il tasso osservato è praticamente uguale al tasso di apertura e HX permette l&#39;osservazione immediato dello svolgimento di un elemento strutturale. Un tale regime di scambio, dove ogni scambio contemporaneamente protoni ammidici all&#39;apertura dell&#39;elemento strutturale, è facilmente osservabile in MS da una distribuzione bimodale dei picchi isotopici 7. Se k cl è molto maggiore di k ch (EX2) il tasso osservato è proporzionale k ch cui la costante di proporzionalità è uguale equilibri-piegatori dispiegarsi costante K u = k op </sub&gt; / K cl. In queste condizioni, molti eventi di apertura e chiusura sono necessarie prima di effettuare cambi protoni ammidici per deuteroni, portando ad un graduale aumento della massa media mentre la distribuzione isotopica rimane sostanzialmente identico. Il regime EX2 consente la determinazione dell&#39;energia libera di dispiegarsi ΔG u e quindi la stabilità di un elemento strutturale. In condizioni stato nativo il regime EX2 è più comune. Aumento del pH e aggiunta di agenti caotropici può spostare il meccanismo di scambio di EX1. Pertanto, HX-MS può essere utilizzato per esplorare termodinamico e parametri cinetici di folding e cambiamenti conformazionali. Come accennato in precedenza HX è intrinsecamente pH e temperatura dipendente e lo scambio emivita di un protone completamente solvente esposta del gruppo ammidico backbone è tra 5-400 msec a pH fisiologico (pH 7,6) e 30 ° C, ma 10 min a&gt; 15 ore con una media di&gt; 2 ore a pH 2,9 e 0 °C (tranne per il protone del primo backbone ammide legame di un polipeptide, che scambia con un&#39;emivita di ca. 1-2 min). In tali condizioni lento scambio è possibile digerire l&#39;esempio utilizzando proteasi (ad esempio pepsina) che sono attivi in queste condizioni, con fuori perdere tutte le informazioni contenute nei deuteroni incorporati. Dopo l&#39;introduzione di digestione peptica in condizioni scambio lento, non solo la cinetica complessiva HX di proteine ​​integrali possono essere analizzati ma HX possono essere localizzati alle regioni specifiche 8,9. Risoluzione spaziale è attualmente limitata alle dimensioni dei frammenti generati peptiche, che è in generale tra 10-30 residui. Tuttavia, frammenti sovrapposti creati a causa della natura non specifica di clivaggio con la pepsina potrebbe portare ad un aumento della risoluzione spaziale. Inoltre, diverse altre proteasi sono risultati essere attiva in condizioni di tempra, tuttavia, molto meno efficiente rispetto pepsina 10. Ulteriore Increase di risoluzione spaziale può essere raggiunto con la frammentazione dei peptidi in fase gassosa con metodi che conservano il modello deuterazione come cattura di elettroni dissociazione (ECD), il trasferimento di elettroni dissociazione (ETD) e infrarossi multiphoton dissociazione (IRMPD) 11-13. Queste tecniche prevenire la perdita di risoluzione spaziale dovuta alla migrazione intramolecolare protone (&quot;scrambling&quot;), che si osserva per dissociazione indotta da collisione (CID) la frammentazione tecnica più comunemente usata. Tuttavia, questi metodi richiedono l&#39;ottimizzazione per ogni singolo peptide ed è quindi ancora molto impegnativo. HX-MS è stato utilizzato per analizzare proteina-ligando e proteina-proteina interazioni compresi l&#39;assemblaggio del capside virale 14-17. Proteine ​​dispiegamento e ripiegamento, nonché di temperatura indotti cambiamenti conformazionali sono stati studiati 7,18,19. Fosforilazione e singolo aminoacido mutazione legata conformazionale cambiamenti 16,20 e nucleotcambiamenti ide-indotti sono stati analizzati 21,22. Pertanto, questo metodo sembra idealmente adatto per analizzare il montaggio e dinamica di macchine molecolari. Un candidato attraente, il cui meccanismo è di grande interesse generale, è il complesso chaperone Hsp90.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagent/Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>maXis QTOF</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nanoAcquity UPLC</td>
			<td>Waters Corp.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shimadzu 10AD-VP</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-port Valve EPC6W with microelectric actuator</td>
			<td>Valco</td>
			<td>#EPC6W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection valve (manual)</td>
			<td>Rheodyne</td>
			<td>#7725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poros AL20 media</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>#1-6029-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poros R2</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>#1-1118-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pepsin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#P6887</td>
			<td>use fresh pepsin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbore (1 mm)</td>
			<td>IDEX</td>
			<td>#C-128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbore (2 mm)</td>
			<td>IDEX</td>
			<td>#C-130B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acquity UPLC BEH C8 Column</td>
			<td>Waters Corp.</td>
			<td>#186002876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>#5355000.011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing (various diameters)</td>
			<td>IDEX</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fittings</td>
			<td>IDEX</td>
			<td>#PK-110 with PK-100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing protein dynamics using hydrogen exchange mass spectrometry

Tutti i processi cellulari dipendono dalla funzionalità delle proteine. Sebbene la funzionalità di una data proteina è la diretta conseguenza della sua sequenza amminoacidica unico, si realizza solo dal ripiegamento della catena polipeptidica in un&#39;unica disposizione tridimensionale definito o più comunemente in un insieme di conformazioni interconversione. Indagare il rapporto tra proteine ​​conformazione e la sua funzione è quindi essenziale per una comprensione completa di come le proteine ​​sono in grado di adempiere al loro grande varietà di compiti. Una possibilità per studiare i cambiamenti conformazionali una proteina subisce mentre procede attraverso il suo ciclo funzionale è idrogeno H-1/2 H-scambio in combinazione con spettrometria di massa ad alta risoluzione (HX-MS). HX-MS è un metodo versatile e robusto che aggiunge una nuova dimensione alle informazioni sulla struttura ottenuta per esempio cristallografia. E &#39;utilizzato per lo studio delle proteine ​​piegatura e dispiegamento, legame di piccole molligandi ecule, interazioni proteina-proteina, cambiamenti conformazionali legati alla catalisi enzimatica, e allosteria. Inoltre, HX-MS è spesso utilizzato quando la quantità di proteina è molto limitata o cristallizzazione della proteina non è fattibile. Qui forniamo un protocollo generale per studiare la dinamica delle proteine ​​con HX-MS e descriviamo un esempio di come rivelare l&#39;interfaccia interazione di due proteine ​​in un complesso.

Hsp90 è un chaperon molecolare nel lievito e membro della famiglia chaperone Hsp90. Passando attraverso un ciclo di ATPasi complesso si assiste fasi tardive di piegatura di molti clienti di proteine. Pieghevole efficiente richiede il trasferimento di clienti da Hsp70 e l&#39;interazione del Sti1/Hop co-chaperone. Sti1 lega direttamente alla Hsp90 e facilita client vincolante inibizione della ATPasi attività di Hsp90. L&#39;interazione di Hsp90 con Sti1 è stata recentemente studiata utilizzando HX-MS 23. Pr...

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Analyzing Protein Dynamics Using Hydrogen Exchange Mass Spectrometry

Proteine ​​conformazione e la dinamica sono la chiave per comprendere il rapporto tra struttura e funzione delle proteine. Scambio idrogeno accoppiata alla spettrometria di massa ad alta risoluzione è un metodo versatile per studiare le dinamiche conformazionali di proteine ​​e caratterizzazione della proteina-ligando e proteina-proteina interazioni, comprese le interfacce di contatto ed effetti allosterici.

Analizzando la dinamica delle proteine ​​che utilizzano l&#39;idrogeno Scambio Spettrometria di Massa

All cellular processes depend on the functionality of proteins. Although the functionality of a given protein is the direct consequence of its unique ...

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18.3K Views.  University of Heidelberg.  Proteine ​​conformazione e la dinamica sono la chiave per comprendere il rapporto tra struttura e funzione delle proteine. Scambio idrogeno accoppiata alla spettrometria di massa ad alta risoluzione è un metodo versatile per studiare le dinamiche conformazionali di proteine ​​e caratterizzazione della proteina-ligando e proteina-proteina interazioni, comprese le interfacce di contatto ed effetti allosterici. 

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Real-time Breath Analysis by Using Secondary Nanoelectrospray Ionization Coupled to High Resolution Mass Spectrometry

Exhaled volatile organic compounds (VOCs) have aroused considerable interest, since they can serve as biomarkers for disease diagnosis and environmental exposure in a non-invasive manner. In this work, we present a protocol to characterize the exhaled VOCs in real time by using secondary nanoelectrospray ionization coupled to high resolution mass spectrometry (Sec-nanoESI-HRMS). The homemade Sec-nanoESI source was readily set up based on a commercial nanoESI source. Hundreds of peaks were observed in the background-subtracted mass spectra of exhaled breath, and the mass accuracy values are -4.0-13.5 ppm and -20.3-1.3 ppm in the positive and negative ion detection modes, respectively. The peaks were assigned with accurate elemental composition according to the accurate mass and isotopic pattern. Less than 30 s is used for one exhalation measurement, and it takes approximately 7 min for six replicated measurements.

A protocol for characterizing chemical composition of exhaled breath in real time by using secondary nanoelectrospray ionization coupled to high resolution mass spectrometry is demonstrated.

Analisi dell'espirato in tempo reale tramite ionizzazione secondaria Nanoelectrospray accoppiata alla spettrometria di massa ad alta risoluzione

Exhaled volatile organic compounds (VOCs) have aroused considerable interest, since they can serve as biomarkers for disease diagnosis and environmental ...

Ricerca

Chimica

Synthesis and Mass Spectrometry Analysis of Oligo-peptoids

Peptoids are sequence-controlled peptide-mimicking oligomers consisting of N-alkylated glycine units. Among many potential applications, peptoids have been thought of as a type of molecular information storage. Mass spectrometry analysis has been considered the method of choice for sequencing peptoids. Peptoids can be synthesized via solid phase chemistry using a repeating two-step reaction cycle. Here we present a method to manually synthesize oligo-peptoids and to analyze the sequence of the peptoids using tandem mass spectrometry (MS/MS) techniques. The sample peptoid is a nonamer consisting of alternating N-(2-methyloxyethyl)glycine (Nme) and N-(2-phenylethyl)glycine (Npe), as well as an N-(2-aminoethyl)glycine (Nae) at the N-terminus. The sequence formula of the peptoid is Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2, where Ac is the acetyl group. The synthesis takes place in a commercially available solid-phase reaction vessel. The rink amide resin is used as the solid support to yield the peptoid with an amide group at the C-terminus. The resulting peptoid product is subjected to sequence analysis using a triple-quadrupole mass spectrometer coupled to an electrospray ionization source. The MS/MS measurement produces a spectrum of fragment ions resulting from the dissociation of charged peptoid. The fragment ions are sorted out based on the values of their mass-to-charge ratio (m/z). The m/z values of the fragment ions are compared against the nominal masses of theoretically predicted fragment ions, according to the scheme of peptoid fragmentation. The analysis generates a fragmentation pattern of the charged peptoid. The fragmentation pattern is correlated to the monomer sequence of the neutral peptoid. In this regard, MS analysis reads out the sequence information of the peptoids.

A protocol is described for the manual synthesis of oligo-peptoids followed by sequence analysis by mass spectrometry.

Sintesi e analisi di spettrometria di massa di Oligo-peptoids

Peptoids are sequence-controlled peptide-mimicking oligomers consisting of N-alkylated glycine units. Among many potential applications, peptoids have ...

Analyzing Protein Architectures and Protein-Ligand Complexes by Integrative Structural Mass Spectrometry

Proteins are an important class of biological macromolecules that play many key roles in cellular functions including gene expression, catalyzing metabolic reactions, DNA repair and replication. Therefore, a detailed understanding of these processes provides critical information on how cells function. Integrative structural MS methods offer structural and dynamical information on protein complex assembly, complex connectivity, subunit stoichiometry, protein oligomerization and ligand binding. Recent advances in integrative structural MS have allowed for the characterization of challenging biological systems including large DNA binding proteins and membrane proteins. This protocol describes how to integrate diverse MS data such as native MS and ion mobility-mass spectrometry (IM-MS) with molecular dynamics simulations to gain insights into a helicase-nuclease DNA repair protein complex. The resulting approach provides a framework for detailed studies of ligand binding to other protein complexes involved in important biological processes.

Mass spectrometry (MS) has emerged as an important tool for the investigation of structure and dynamics of macromolecular assemblies. Here, we integrate MS-based approaches to interrogate protein complex formation and ligand binding.

Analisi di architetture di proteine e complessi proteina-ligando mediante spettrometria di massa strutturale integrativa

Proteins are an important class of biological macromolecules that play many key roles in cellular functions including gene expression, catalyzing ...

Large-scale Top-down Proteomics Using Capillary Zone Electrophoresis Tandem Mass Spectrometry

Capillary zone electrophoresis-electrospray ionization-tandem mass spectrometry (CZE-ESI-MS/MS) has been recognized as a useful tool for top-down proteomics that aims to characterize proteoforms in complex proteomes. However, the application of CZE-MS/MS for large-scale top-down proteomics has been impeded by the low sample-loading capacity and narrow separation window of CZE. Here, a protocol is described using CZE-MS/MS with a microliter-scale sample-loading volume and a 90-min separation window for large-scale top-down proteomics. The CZE-MS/MS platform is based on a linear polyacrylamide (LPA)-coated separation capillary with extremely low electroosmotic flow, a dynamic pH-junction-based online sample concentration method with a high efficiency for protein stacking, an electro-kinetically pumped sheath flow CE-MS interface with extremely high sensitivity, and an ion trap mass spectrometer with high mass resolution and scan speed. The platform can be used for the high-resolution characterization of simple intact protein samples and the large-scale characterization of proteoforms in various complex proteomes. As an example, a highly efficient separation of a standard protein mixture and a highly sensitive detection of many impurities using the platform is demonstrated. As another example, this platform can produce over 500 proteoform and 190 protein identifications from an Escherichia coli proteome in a single CZE-MS/MS run.

A detailed protocol is described for the separation, identification, and characterization of proteoforms in protein samples using capillary zone electrophoresis-electrospray ionization-tandem mass spectrometry (CZE-ESI-MS/MS). The protocol can be used for the high-resolution characterization of proteoforms in simple protein samples and the large-scale identification of proteoforms in complex proteome samples.

Proteomica di Top-down su larga scala usando la spettrometria totale in Tandem elettroforesi capillare zona

Capillary zone electrophoresis-electrospray ionization-tandem mass spectrometry (CZE-ESI-MS/MS) has been recognized as a useful tool for top-down ...

High-throughput and Comprehensive Drug Surveillance Using Multisegment Injection-Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry

New analytical methods are urgently needed to enable high-throughput, yet comprehensive drug screening, given an alarming opioid and prescription drug crisis in public health. Conventional urine drug testing based on a two-tier immunoassay screen followed by a gas chromatography-tandem mass spectrometry (GC-MS/MS) or liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) method are expensive and prone to bias while being limited to targeted panels of known drugs of abuse (DoA). Herein, we outline an improved method for drug surveillance that allows for the resolution and detection of an expanded panel of DoA and their metabolites when using multisegment injection-capillary electrophoresis-mass spectrometry (MSI-CE-MS). Multiplexed separations of ten urine samples with a quality control by CE (&lt; 3 min/sample) in conjunction with full-scan data acquisition using a time-of-flight mass spectrometer (TOF-MS) under positive ion mode detection allows for the identification and quantification of DoA above recommended cut-off levels. An excellent resolution of drug isomers and isobars, including background interferences, are achieved when using MSI-CE-MS with an electrokinetic spacer between sample segments, where accurate mass/molecular formula together with the comigration of a matching deuterated internal standard and the detection of one or more bio-transformed metabolites facilitate DoA identification over a wider detection window. Additionally, urine samples can be analyzed directly without enzyme deconjugation for the rapid screening without complicated sample workup. MSI-CE-MS enables the surveillance of a broad spectrum of DoA that is required for the treatment monitoring of high-risk patients, including confirming prescribed drug adherence, revealing illicit drug use/substitution, and evaluating optimal dosage regimes as required for new advances in precision medicine.

Here we describe a high-throughput method for comprehensive drug surveillance that allows for the improved resolution and detection of large panels of drugs of abuse and their metabolites, with quality control based on multisegment injection-capillary electrophoresis-mass spectrometry.

Sorveglianza dei medicinali ad alta produttività e completa usando la spettrometria totale multisegmento elettroforesi di iniezione-capillare

New analytical methods are urgently needed to enable high-throughput, yet comprehensive drug screening, given an alarming opioid and prescription drug ...

Imaging Corrosion at the Metal-Paint Interface Using Time-of-Flight Secondary Ion Mass Spectrometry

Corrosion developed at the paint and aluminum (Al) metal-paint interface of an aluminum alloy is analyzed using time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS), illustrating that SIMS is a suitable technique to study the chemical distribution at a metal-paint interface. The painted Al alloy coupons are immersed in a salt solution or exposed to air only. SIMS provides chemical mapping and 2D molecular imaging of the interface, allowing direct visualization of the morphology of the corrosion products formed at the metal-paint interface and mapping of the chemical after corrosion occurs. The experimental procedure of this method is presented to provide technical details to facilitate similar research and highlight pitfalls that may be encountered during such experiments.

Time-of-flight secondary ion mass spectrometry is applied to demonstrate the chemical mapping and corrosion morphology at the metal-paint interface of an aluminum alloy after being exposed to a salt solution compared with a specimen exposed to air.

Corrosione dell'imaging nell'interfaccia Metal-Paint con spettrometria di massa ionica secondaria a tempo di volo

Corrosion developed at the paint and aluminum (Al) metal-paint interface of an aluminum alloy is analyzed using time-of-flight secondary ion mass ...

3D Depth Profile Reconstruction of Segregated Impurities Using Secondary Ion Mass Spectrometry

The presented protocol combines excellent detection limits (1 ppm to 1 ppb) using secondary ion mass spectrometry (SIMS) with reasonable spatial resolution (~1 &#181;m). Furthermore, it describes how to obtain realistic three-dimensional (3D) distributions of segregated impurities/dopants in solid state materials. Direct 3D depth profile reconstruction is often difficult to achieve due to SIMS-related measurement artifacts. Presented here is a method to identify and solve this challenge. Three major issues are discussed, including the i) nonuniformity of the detector being compensated by flat-field correction; ii) vacuum background contribution (parasitic oxygen counts from residual gases present in the analysis chamber) being estimated and subtracted; and iii)&#160;performance of all steps within a stable timespan of the primary ion source. Wet chemical etching is used to reveal the position and types of dislocation in a material, then the SIMS result is superimposed on images obtained via scanning electron microscopy (SEM). Thus, the position of agglomerated impurities can be related to the position of certain defects. The method is fast and does not require sophisticated sample preparation stage; however, it requires a high-quality, stable ion source, and the entire measurement must be performed quickly to avoid deterioration of the primary beam parameters.

The presented method describes how to identify and solve measurement artifacts related to secondary ion mass spectrometry as well as obtain realistic 3D distributions of impurities/dopants in solid state materials.

Ricostruzione del profilo di profondità 3D di impurità segregate utilizzando la spettrometria di massa a ioni secondari

The presented protocol combines excellent detection limits (1 ppm to 1 ppb) using secondary ion mass spectrometry (SIMS) with reasonable spatial ...

Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry Approaches for Characterization of the Protein and Metabolite Corona Acquired by Nanomaterials

The adsorption of biomolecules from surrounding biological matrices to the surface of nanomaterials (NMs) to form the corona has been of interest for the past decade. Interest in the bio-nano interface arises from the fact that the biomolecular corona confers a biological identity to NMs and thus causes the body to identify them as &#8220;self&#8221;. For example, previous studies have demonstrated that the proteins in the corona are capable of interacting with membrane receptors to influence cellular uptake and established that the corona is responsible for cellular trafficking of NMs and their eventual toxicity. To date, most research has focused upon the protein corona and overlooked the possible impacts of the metabolites included in the corona or synergistic effects between components in the complete biomolecular corona. As such, this work demonstrates methodologies to characterize both the protein and metabolite components of the biomolecular corona using bottom-up proteomics and metabolomics approaches in parallel. This includes an on-particle digest of the protein corona with a surfactant used to increase protein recovery, and a passive characterization of the metabolite corona by analyzing metabolite matrices before and after NM exposures. This work introduces capillary electrophoresis &#8211; mass spectrometry (CESI-MS) as a new technique for NM corona characterization. The protocols outlined here demonstrate how CESI-MS can be used for the reliable characterization of both the protein and metabolite corona acquired by NMs. The move to CESI-MS greatly decreases the volume of sample required (compared to traditional liquid chromatography &#8211; mass spectrometry (LC-MS) approaches) with multiple injections possible from as little as 5 &#181;L of sample, making it ideal for volume limited samples. Furthermore, the environmental consequences of analysis are reduced with respect to LC-MS due to the low flow rates (&#60;20 nL/min) in CESI-MS, and the use of aqueous electrolytes which eliminates the need for organic solvents.

Here we present a protocol to characterize the complete biomolecular corona, proteins, and metabolites, acquired by nanomaterials from biofluids using a capillary electrophoresis &#8211; mass spectrometry approach.

Approcci di spettrometria di massa per elettroforesi capillare per la caratterizzazione della proteina e del metabolita Corona acquisiti da nanomateriali

The adsorption of biomolecules from surrounding biological matrices to the surface of nanomaterials (NMs) to form the corona has been of interest for the ...

Covalent Labeling with Diethylpyrocarbonate for Studying Protein Higher-Order Structure by Mass Spectrometry

Characterizing a protein&#39;s higher-order structure is essential for understanding its function. Mass spectrometry (MS) has emerged as a powerful tool for this purpose, especially for protein systems that are difficult to study by traditional methods. To study a protein&#39;s structure by MS, specific chemical reactions are performed in solution that encode a protein&#39;s structural information into its mass. One particularly effective approach is to use reagents that covalently modify solvent accessible amino acid side chains. These reactions lead to mass increases that can be localized with residue-level resolution when combined with proteolytic digestion and tandem mass spectrometry. Here, we describe the protocols associated with use of diethylpyrocarbonate (DEPC) as a covalent labeling reagent together with MS detection. DEPC is a highly electrophilic molecule capable of labeling up to 30% of the residues in the average protein, thereby providing excellent structural resolution. DEPC has been successfully used together with MS to obtain structural information for small single-domain proteins, such as &#946;2-microglobulin, to large multi-domain proteins, such as monoclonal antibodies.

The experimental procedures for performing diethylpyrocarbonate-based covalent labeling with mass spectrometric detection are described. Diethylpyrocarbonate is simply mixed with the protein or protein complex of interest, leading to the modification of solvent accessible amino acid residues. The modified residues can be identified after proteolytic digestion and liquid chromatography/mass spectrometry analysis.

Etichettatura covalente con dietilpirocarbonato per lo studio della struttura proteica di ordine superiore mediante spettrometria di massa

Characterizing a protein&#39;s higher-order structure is essential for understanding its function. Mass spectrometry (MS) has emerged as a powerful tool ...

Capillary Electrophoresis-based Hydrogen/Deuterium Exchange for Conformational Characterization of Proteins with Top-down Mass Spectrometry

Resolving conformational heterogeneity of multiple protein states that coexist in solution remains one of the main obstacles in the characterization of protein therapeutics and the determination of the conformational transition pathways critical for biological functions, ranging from molecular recognition to enzymatic catalysis. Hydrogen/deuterium exchange (HDX) reaction coupled with top-down mass spectrometric (MS) analysis provides a means to characterize protein higher-order structures and dynamics in a conformer-specific manner. The conformational resolving power of this technique is highly dependent on the efficiencies of separating protein states at the intact protein level and minimizing the residual non-deuterated protic content during the HDX reactions. 
Here we describe a capillary electrophoresis (CE)-based variant of the HDX MS approach that aims to improve the conformational resolution. In this approach, proteins undergo HDX reactions while migrating through a deuterated background electrolyte solution (BGE) during the capillary electrophoretic separation. Different protein states or proteoforms that coexist in solution can be efficiently separated based on their differing charge-to-size ratios. The difference in electrophoretic mobility between proteins and protic solvent molecules minimizes the residual non-deuterated solvent, resulting in a nearly complete deuterating environment during the HDX process. The flow-through microvial CE-MS interface allows efficient electrospray ionization of the eluted protein species following a rapid mixing with the quenching and denaturing modifier solution at the outlet of the sprayer. The online top-down MS analysis measures the global deuteration level of the eluted intact protein species, and subsequently, the deuteration of their gas-phase fragments. This paper demonstrates this approach in differential HDX for systems, including the natural protein variants coexisting in milk.

Presented here is a protocol for a capillary electrophoresis-based hydrogen/deuterium exchange (HDX) approach coupled with top-down mass spectrometry. This approach characterizes the difference in higher-order structures between different protein species, including proteins in different states and different proteoforms, by conducting concurrent differential HDX and electrophoretic separation.

Scambio idrogeno/deuterio basato sull'elettroforesi capillare per la caratterizzazione conformazionale di proteine con spettrometria di massa top-down

Resolving conformational heterogeneity of multiple protein states that coexist in solution remains one of the main obstacles in the characterization of ...

Analizzando la dinamica delle proteine ​​che utilizzano l'idrogeno Scambio Spettrometria di Massa

Analizzando la dinamica delle proteine che utilizzano l'idrogeno Scambio Spettrometria di Massa