Gli autori desiderano ringraziare Julia Hatler e Martin Ramsden (R &amp; D Systems) per l&#39;utile discussione e revisione del manoscritto.

1. L&#39;induzione di EMT <ol><li> Terreni di coltura riscaldare a 37 ° C in un bagno d&#39;acqua. I terreni di coltura utilizzato è lo stesso che i supporti utilizzati per la coltura standard le cellule di interesse. Ad esempio, la linea cellulare di carcinoma polmonare umano A549 è coltivato in F12 di Kaighn supplementato con 10% di siero bovino fetale e glutammina 2 mM. </li><li> Celle di raccolta di interesse utilizzando una soluzione di dissociazione (es. TrypLE Express). </li><li> Sospendere le cellule in terreni di coltura pre-riscaldato in una provetta da 15 ml. </li><li> Centrifugare la sospensione cellulare a 400 xg per 5 min. </li><li> Rimuovere con attenzione il surnatante da versare in un contenitore per rifiuti. </li><li> Sospendere il pellet cellulare in mezzi di coltura pre-riscaldato. </li><li> Contare le cellule vitali utilizzando Trypan Blue. Rimuovere un campione della sospensione cellulare e diluire nel 0,4% soluzione Trypan Blue. Mettere 10 ml di campione diluito su un emocitometro e contare le cellule vitali (cellule che non diventano blu). Utilizzare conta delle cellule per determinare la cella densità nella soluzione. </li><li> Cellule piatto sulla coltura di tessuto trattati piastre o fiasche a 0,9-1,0 x 10 4 cellule per cm 2. Ad esempio, 0,5 x 10 6 cellule piastrate in una piastra a 100 mm in terreni di coltura contenente Supplemento 1X EMT Induzione supporti (6 ml supporti per mm piastra 100). </li><li> Cultura cellule placcato in C / 5% CO 2 incubatore 37 °. Controllo morfologia cellulare ogni giorno. </li><li> Tre giorni dopo la placcatura, rimuovere il supporto e sostituirlo con fresco terreni di coltura pre-riscaldato contenente Supplemento 1X EMT Indurre media. Continuare a cultura in un C / 5% CO 2 incubatore 37 °. </li><li> Cinque giorni dopo la placcatura, le cellule sono pronte per l&#39;analisi. Morfologia cellulare viene visualizzato al microscopio ottico invertito. </li></ol> 2. Analisi delle proteine ​​Expression da Immunocytochemistry <ol><li> Preparare sterili 12 millimetri coprioggetto per una piastra da 24 pozzetti mettendo coprioggetto in una capsula di Petri contenente il 95% di etanolo. Rimuovere delicatamente coprioggetto da etanolo noizione di un ago e pinze curve e fiamme sterilizzare. Mettere vetrino sterile in un pozzetto di una piastra da 24 pozzetti. Ripetere con rimanenti lamelle. </li><li> Preparare la sospensione cellulare come descritto nella sezione 1,1-1,7. </li><li> Piatto 1,6 x 10 4 cellule / pozzetto in 0,5 ml di media cultura pre-riscaldato contenente Supplemento 1X EMT Indurre media. </li><li> Crescere e nutrire le cellule, come descritto nelle sezioni 1,9-1,11. </li><li> Cinque giorni dopo la placcatura, rimuovere i supporti e fissare le cellule con 300 microlitri / pozzetto di 4% paraformaldeide in 1X tampone fosfato (PBS) per 20 min a temperatura ambiente. </li><li> Rimuovere fissativo e lavare le cellule 2x con PBS 1X, 500 microlitri / pozzetto. </li><li> Incubare le cellule in 400 microlitri / pozzetto di tampone di bloccaggio (1X PBS contenente 1% di albumina sierica bovina (BSA), siero asino normale 10%, e 0,3% Triton X-100) per 1 ora a temperatura ambiente. </li><li> Incubare in anticorpo primario a costruttori consigliano di concentrazione in 400 microlitri / pozzetto di tampone di bloccaggio per 3 ore a temperatura ambiente temperaturE o la notte a 4 ° C. Quando si utilizza un anticorpo primario direttamente coniugato ad un fluorocromo, incubare campioni al buio. </li><li> Lavare le cellule tre volte in 500 microlitri / pozzetto di 1X PBS contenente 0,1% BSA per 5 minuti ogni lavaggio. Quando si utilizza un anticorpo primario direttamente coniugato ad un fluorocromo, passare direttamente al punto 2.12. </li><li> Incubare le cellule in anticorpo secondario a concentrazione raccomandata dal produttore in 400 pl / pozzetto di 1X PBS contenente 1% BSA per 1 ora a temperatura ambiente al buio. </li><li> Lavare le cellule tre volte in 500 microlitri / pozzetto di 1X PBS contenente 0,1% BSA per 5 minuti ogni lavaggio. </li><li> Se lo si desidera, nuclei con soluzione colorante di contrasto DAPI. </li><li> Lavare le cellule in acqua deionizzata e montare vetrini a faccia in giù su un vetrino utilizzando supporti di montaggio. </li></ol>

<ol>
	<li>Kalluri, R., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+basics+of+epithelial-mesenchymal+transition.">The basics of epithelial-mesenchymal transition.</a> Journal of Clinical Investigation. 119, 1420-1428 (2009).</li><li>Thiery, J. 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H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Core+epithelial-to-mesenchymal+transition+interactome+gene-expression+signature+is+associated+with+claudin-low+and+metaplastic+breast+cancer+subtypes.">Core epithelial-to-mesenchymal transition interactome gene-expression signature is associated with claudin-low and metaplastic breast cancer subtypes.</a> PNAS. 107, 15449-15454 (2010).</li><li>Roussos, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AACR+special+conference+on+epithelial-mesenchymal+transition+and+cancer+progression+and+treatment.">AACR special conference on epithelial-mesenchymal transition and cancer progression and treatment.</a> Cancer Research. 70, 7360-7364 (2010).</li><li>Polyak, K., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transitions+between+epithelial+and+mesenchymal+states:+acquisition+of+malignant+and+stem+cell+traits.">Transitions between epithelial and mesenchymal states: acquisition of malignant and stem cell traits.</a> Nature Reviews Cancer. 9, 265-273 (2009).</li><li>Brown, K. 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E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycogen+synthase+kinase-3+is+an+endogenous+inhibitor+of+Snail+transcription:+implication+for+the+epithelial-mesenchymal+transition.">Glycogen synthase kinase-3 is an endogenous inhibitor of Snail transcription: implication for the epithelial-mesenchymal transition.</a> Journal of Cell Biology. 168, 29-33 (2005).</li><li>Pon, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p70+S6+kinase+promotes+epithelial+to+mesenchymal+transition+through+Snail+induction+in+ovarian+cancer+cells.">p70 S6 kinase promotes epithelial to mesenchymal transition through Snail induction in ovarian cancer cells.</a> Cancer Research. 68, 6524-6532 (2008).</li><li>Wegner, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+changes+in+receptor+tyrosine+kinase+phosphorylation+using+antibody+arrays.">Profiling changes in receptor tyrosine kinase phosphorylation using antibody arrays.</a> J. Vis. Exp. , (2012).</li></ol>

R &amp; D Systems, Inc. è una società pubblica a scopo di lucro. Produzione e accesso gratuito a questo articolo è sponsorizzato da R &amp; D Systems, Inc.

I metodi precedenti per l&#39;induzione EMT sono generalmente utilizzati TGF-β stimolazione o modificazione genetica. Sebbene TGF-β da solo ha mostrato di indurre EMT in alcuni tipi di cellule, è stato ora dimostrato che TGF-β è necessaria per EMT, ma non è sufficiente in tutti i tipi di cellule 6,14. Utilizzo di modificazione genetica per l&#39;induzione EMT è in termini di tempo e manodopera. Il metodo qui descritto utilizza una combinazione di fattori, tra cui, E-caderina anti-umano, sFRP-1 anti-umano, Dkk-1 anti-umano, ricombinante umano Wnt-5a e ricombinante TGF-β1 umano per indurre affidabile EMT. Questa combinazione di fattori è progettata per bloccare E-base-caderina adesione, un passaggio critico per l&#39;induzione EMT 4, e migliorare Wnt aggiungendo la proteina Wnt-5a nonché utilizzando anticorpi bloccanti agli inibitori di Wnt, sFRP-1 e Dkk -1. Wnt e TGF-β hanno dimostrato di agire in un loop autocrino per indurre e mantenere la stat cellule mesenchimalie 6. Questo metodo di induzione evita la manipolazione genetica ed è più efficace rispetto all&#39;utilizzo di TGF-β alone. Importante, siamo in grado di osservare l&#39;induzione di EMT in tipi cellulari, comprese MCF7 e PANC-1 le cellule, che sono stati precedentemente mostrato di non rispondere esclusivamente alla stimolazione TGF-β (figura 5) 14. Le cellule trattate con supplemento spettacolo EMT Indurre media morfologia fusiforme meno compatto e aumentata (Figura 1). Inoltre, vi è una riduzione della superficie E-caderina espressione concomitante con un aumento della fibronectina, che sono caratteristiche di EMT (figure 2 e 3). Altri marcatori mesenchimali quali Vimentin e la lumaca sono anche sovraregolati nelle EMT cellule indotte, rispetto ai controlli non indotte (Figura 4). Aumento capacità di migrazione e di invasione sono le principali caratteristiche funzionali delle cellule mesenchimali. In in vitro </em&gt; Migrazione e l&#39;invasione saggi, cellule trattate con supplemento EMT Induzione supporti dimostrato un significativo aumento di capacità di migrare e invadere (Figura 6). Questo semplice metodo per l&#39;induzione EMT è utile per lo studio di segnalazione EMT come dimostrato utilizzando i dati di espressione di matrice anticorpo mostrati nella Figura 7. Diversi tipi di cellule possono essere confrontati pre-e post-induzione EMT avere profili di espressione comuni associati con EMT, come l&#39;aumento della CREB fosforilato e ERK1 / 2 risulta sia MCF7 e cellule EMT indotta A549. S133 fosforilazione di CREB stimola legame al DNA ed è stato dimostrato di agire a valle di TGF-β1-indotta EMT 15. ERK1 / 2 fosforilazione è stato anche dimostrato di agire a valle di TGF-β1-indotta EMT 16. Le differenze a vie di segnalazione tra tipi cellule possono anche essere chiariti come visto con l&#39;aumento della GSK-3β fosforilazione in cellule A549 rispetto p70S6K fosforilazione in MCF7. GSK-3β fosforilazione della serina 9 diminuisce funzione, e GSK-3β ha dimostrato di inibire il fattore di trascrizione pro-EMT, lumaca 17. Al contrario, p70S6K induce l&#39;attività della lumaca e la sua fosforilazione è associata con l&#39;attivazione di questa proteina 18. Nel complesso, l&#39;induzione semplice e affidabile di EMT, in particolare nelle cellule precedentemente indicate non rispondere unicamente a TGF-β, è utile per comprendere la biologia di EMT, identificando firme espressione comune per l&#39;uso come marcatori prognostici, e sviluppare e valutare nuove terapie per il cancro e la malattia fibrotica.

La transizione epitelio mesenchimale (EMT) è il processo mediante il quale una cellula epiteliale polarizzata subisce vari cambiamenti risultanti in una cella mesenchimali fibroblasto-come altamente mobili. Questo processo avviene, in parte, attraverso cambiamenti di espressione genica e della degradazione delle giunzioni adherens, con un conseguente aumento della capacità di migrare e invadere. Fisiologicamente, EMT svolge un ruolo importante durante lo sviluppo embrionale e la guarigione delle ferite. Perdita di controllo adeguato su EMT può portare a fibrosi e metastasi dei carcinomi 1,2. La riduzione di E-caderina sulla superficie delle cellule epiteliali è una fase critica nella progressione di una cellula attraverso EMT 3,4. E-caderina è una proteina transmembrana a passaggio singolo che interagisce direttamente con le proteine ​​caderina sulle cellule adiacenti. Oltre al suo ruolo nella adesione cellulare, segnalazione E-caderina influenze cellulare tramite interazioni tra la coda citoplasmatica di E-caderina unda varietà di proteine ​​regolatrici, in particolare β-catenina. β-catenina gioca un ruolo nella stabilizzazione adherens giunzioni. Durante segnalazione canonica Wnt, β-catenina viene rilasciato da E-caderina e traslocato nel nucleo dove agisce come un fattore di trascrizione a valle nel pathway Wnt 3,4,5. Nel nucleo, β-catenina ha dimostrato di aumentare la trascrizione di numerosi fattori EMT-relativi compreso Twist, Slug, fibronectina, e una varietà di metalloproteasi della matrice 3,6. Oltre a Wnts, segnalazione del TGF-β ha dimostrato di giocare un ruolo significativo nella induzione EMT sia durante lo sviluppo normale e in stati malati 7,8,9. TGF-β è coinvolto nella EMT che si verifica durante la formazione palato e nel cuore di sviluppo 10. E &#39;stato anche implicato nella fibrosi e nella progressione del cancro alla metastasi 7. La procedura qui descritta provides induzione di EMT consistente in una varietà di tipi di cellule senza la necessità di manipolazione genetica. Questa procedura utilizza un cocktail di E-caderina, sFRP-1, e Dkk-1 bloccanti anticorpi e Wnt-5a e proteine ​​ricombinanti TGF-β1. Questo cocktail è stato progettato per bloccare E-caderina base di aderenza, migliorando Wnt e TGF-β. La possibilità per l&#39;induzione EMT robusto è fondamentale per la comprensione della biologia di questo processo e come manipolare per scopi terapeutici. Indicatori comuni correnti di EMT, E-caderina (inibiti in EMT) e Vimentin (sovraregolata in EMT), si possono trovare co-espressi nei tumori e quindi non forniscono le migliori marcatori diagnostici di potenziali cellule metastatiche 12. È importante sottolineare che l&#39;analisi di una varietà di tipi di cellule che hanno subito EMT è utile sviluppare firme espressione genica comuni che possono essere utilizzati per scopi diagnostici in cancro e fibrosi 11. Inoltre, recenti studi hanno dimostrato che EMT può giocare un ruolo nella formazione di cellule staminali tumorali, suggerendo che le cellule che hanno subito EMT possono essere utili per lo screening di farmaci per identificare composti che possono indirizzare queste cellule 13.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Epithelial cells of interest</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>We have tested: A431, A549, HT29, T98G, MCF10A, MCF7, and PANC1</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>EMT Inducing Media Supplement</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>CCM017</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Recombinant Human TGF-&beta;1</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>240-B</td>
			<td>Used at 10ng/ml</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Anti-E-Cadherin NL557 conjugated antibody</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>NL648R</td>
			<td>Used at a 1:10 dilution for immunocytochemistry</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Anti-E-Cadherin </td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>MAB1838</td>
			<td>Used at 0.1 &mu;g/ml for western blotting</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Anti-Fibronectin</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>MAB1918</td>
			<td>Used at 10 &mu;g/ml for immunocytochemistry; Used at 0.5 &mu;g/ml for western blotting</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Anti-GAPDH</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>AF5718</td>
			<td>Used at 0.2 &mu;g/ml for western blotting</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Goat Anti-Mouse NL493 Secondary Antibody</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>NL009</td>
			<td>Used at a 1:200 dilution for immunocytochemistry</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Donkey Anti-Goat HRP Secondary Antibody</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>HAF109</td>
			<td>Used at 1:2000 for western blotting</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Goat Anti-Mouse HRP Secondary Antibody</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>HAF007</td>
			<td>Used at 1:2000 for western blotting</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>EMT 3-Color Immunocytochemistry Kit</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>SC026</td>
			<td>Used according to the manufacturer's instructions. This kit contains directly conjugated antibodies against E-cadherin, Vimentin, and Snail.</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>96 Well BME Cell Invasion Assay</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>3455-096-K</td>
			<td>This kit was used according to the manufacturer's recommendations.</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Proteome Profiler Human Phospho-MAPK Array Kit</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>ARY002B</td>
			<td>This kit was used according to the manufacturer's recommendations19.</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Mounting Media</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>CTS011</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>0.4% Trypan Blue Solution</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15350-061</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>1X Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>95% Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3311</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Normal Donkey Serum</td>
			<td>Jackson Labs</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Triton-X-100</td>
			<td>Roche Molecular Biochemicals</td>
			<td>789-704</td>
			<td>Dilute in 1X PBS to make a 10% stock solution</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148</td>
			<td>Dilute in 1X PBS to a 4% working concentration.</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DAPI Solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542</td>
			<td>Make stock solution at 14.3mM by dissolving in water. Working solution is a 1:5000 dilution of the stock solution in 1X PBS.</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Fine pointed curved forceps</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>08-875</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>12 mm coverslips</td>
			<td>Carolina Biological</td>
			<td>633009</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Nonfat dry milk</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used at 5% in TBST for blocking in western blotting</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>TBST [25mM Tris, pH 7.4, 0.15M NaCl, 0.1% Tween 20]</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For western blotting blocking and washing</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>PVDF Membrane</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For western blotting </td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>4-20% SDS-page gel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For western blotting</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>ECL substrate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For western blotting</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>15 ml conical tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Plates/flasks, tissue culture treated</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>24-well plates, tissue culture treated</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Pipettes / pipette tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Pipet Aid / pipets</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>37 &deg;C Water Bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>37 &deg;C/5%CO2 Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Inverted light microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

induction and analysis of epithelial to mesenchymal transition

La transizione epitelio mesenchimale (EMT) è essenziale per il corretto morfogenesi durante lo sviluppo. Una cattiva regolazione di questo processo è stato implicato come un evento chiave nella fibrosi e la progressione dei carcinomi a uno stato metastatico. Comprendere i processi che sono alla base EMT è indispensabile per la diagnosi precoce e il controllo clinico di questi stati patologici. Induzione affidabile di EMT in vitro è un utile strumento per la scoperta di farmaci e di identificare firme comuni espressione genica per scopi diagnostici. Qui mostriamo un metodo semplice per l&#39;induzione di EMT in una varietà di tipi cellulari. Sono inclusi anche i metodi per l&#39;analisi di cellule pre-e post-induzione EMT immunocitochimica. Inoltre, abbiamo dimostrato l&#39;efficacia di questo metodo attraverso l&#39;analisi di matrice a base di anticorpi e saggi di migrazione / invasione.

. EMT inducono condizioni di coltura qui descritti forniscono un metodo robusto per l&#39;induzione di EMT in una varietà di tipi cellulari Figure 1 e 2 dimostrano la morfologia e livelli di espressione marcatore per 4 diverse linee cellulari umane: cellule di glioblastoma T98G, cellule HT29 colon adenocarcinoma , cellule di carcinoma del polmone A549, e cellule epiteliali mammarie MCF10A. Le cellule che sono stati trattati con supplemento EMT Indurre media modificate da una morfologia classica epiteliale (Figure 1A - 1D) per un mesenchimale, morfologia fusiforme (Figure 1E - 1H). Cellule EMT-indotte sono apparsi meno densamente in colonie stretti rispetto alle cellule non indotte. Campioni uninduced MCF10A contenute cluster serrato circondate da cellule più liberamente al sacco. Questi cluster serrato erano E-caderina positivi (Figura 2D) e scomparvero in seguito al trattamento con l&#39;EMT Indurre media Supplement (Figura 2H). EMT è stata anche valutata la down-regulation dei marcatori epiteliali e up-regulation dei marcatori mesenchimali. Il downregulation di E-caderina è tipicamente osservata in seguito all&#39;induzione EMT in diversi tipi cellulari 3,4 Figura 2 dimostra superficie espressione di E-caderina nella maggior parte delle cellule non trattate (Figure 2A - 2D, rosso). Rispetto alla sua assenza dopo induzione di EMT (Figure 2E - 2H, rosso). Una linea cellulare, T98G, è stato trovato per avere un bassissimo livello basale di E-caderina prima dell&#39;induzione EMT, che precludeva la sua analisi. Upregulation del marker mesenchimale, fibronectina, era visibile anche dopo induzione con supplemento EMT Indurre media (Figure 2A - 2D contro Cifre 2E - 2H, verde). I livelli di espressione di E-caderina e fibronectina visti da immunocitochimicasono state ulteriormente confermate attraverso western blotting di lisati cellulari totali (Figura 3). Il Western Blot ha confermato down-regulation di E-caderina e aumenta i fibronectina visto da immunocitochimica. Le bande sono state quantificate mediante densitometria e normalizzati per GAPDH per determinare il cambiamento volte rispetto dopo induzione EMT. Livelli di E-caderina sono stati ridotti del 6,4 e 3,4 volte in A549 e cellule MCF10A, rispettivamente. Livelli di fibronectina sono stati aumentati 4.6, 4.1, e 2.3 volte nei T98G, A549, e le cellule MCF10A, rispettivamente. Sebbene il western blot non mostra una significativa riduzione dei livelli della proteina E-caderina in cellule HT29 induzione post-EMT, i risultati immunocitochimica dimostrano una riduzione della superficie espressione di E-caderina (Figura 2B contro 2F), che non può essere distinto in western blotting dei lisati cellulari totali. Per valutare ulteriormente lo stato EMT, ulteriore indicatore di notas per EMT sono stati analizzati pre-e post-induzione di EMT. Coerentemente con i risultati precedenti, E-caderina è stato downregulated in tutte le linee cellulari esaminati, indicando che EMT è stata indotta. Inoltre, i marcatori mesenchimali, vimentina e lumaca, sono stati upregulated in A549, T98G, e cellule MCF10A dopo il trattamento con supplemento EMT Induzione media (Figura 4). La linea cellulare HT29 non ha mostrato espressione di questi marcatori mesenchimali con o senza induzione EMT (dati non mostrati), che può indicare che queste cellule utilizzano percorsi alternativi per induzione EMT. Sebbene TGF-β è sufficiente per indurre EMT in certa cella contesti 7,8,9, altri tipi di cellule non rispondono alla sola aggiunta di TGF-β 14. Materno umano le cellule tumorali MCF7 e PANC-1 le cellule di carcinoma pancreatico umano sono entrambi segnalati non rispondere a del TGF-β segnalazione solo il 14. Per determinare se entrambe le linee potrebbero subire EMT in VitrO, le cellule sono state coltivate in presenza del Supplemento EMT Indurre multimediale. Le cellule sono state stimolate con ricombinante TGF-β1 da solo, alla concentrazione nel Supplemento EMT Indurre media. Queste cellule mantengono la loro morfologia epiteliale, costituito da colonie serrato di cellule (dati non riportati) e livelli di E-caderina superficie sono stati simili a quelli osservati in cellule di controllo (Figure 5C e 5D contro Figure 5A e 5B). Al contrario, cellule stimolate con supplemento EMT Induzione media hanno mostrato una drastica riduzione dei livelli di E-caderina superficiali (Figure 5E e 5F). Queste cellule ottenuti anche una più mesenchimale morfologia, come cellule divennero meno compatta e più mandrino-like (dati non mostrati). Questi risultati dimostrano che il metodo EMT inducendo qui descritta è in grado di promuovere EMT morfologia e marcatori cambiamenti di espressione in cellule tipicamente resistenti al TGF-β-iEMT nduced. In aggiunta ai cambiamenti nell&#39;espressione di servirlo, un altro segno distintivo di cellule mesenchimali è la loro capacità di migrare e invadere. La migrazione e l&#39;invasione delle cellule in coltura con o senza supplemento EMT Indurre media sono stati analizzati utilizzando il 96 e BME cellulare Invasion test secondo le istruzioni del produttore. Brevemente, le cellule sono state seminate su piastre da 96 pozzetti (50.000 cellule / pozzetto) contenente inserti del filtro con pori 8,0 micron. Dopo 48 ore, la migrazione è stata valutata mediante calceina AM colorazione di cellule che erano migrate attraverso il filtro. Ciascun campione è stato testato in triplicato due volte con risultati simili. Risultati rappresentativi di un esperimento sono mostrati in Figura 6A. Aumenti statisticamente significativi (p-value &lt;0.003) nella migrazione delle cellule sono stati osservati sia con A549 e PANC-1 le cellule dopo induzione EMT. Per valutare la capacità di queste cellule di invadere (cioè migrare attraverso la matrice extracellulare), la stessa analisi è stataeseguito con un filtro estratto rivestite membrana basale. Cellule EMT indotta hanno mostrato un aumento statisticamente significativo (P-value &lt;0.001) aumento della capacità di invasione rispetto alle cellule non trattate, come mostrato nella Figura 6B. Il robusto induzione di EMT è utile per l&#39;analisi dei cambiamenti di espressione genica e di segnalazione che si svolgono in queste cellule. Analisi matrice a base di anticorpi utilizzando lisati da cellule sia trattati e non è un metodo per analizzare i livelli di espressione di una varietà di molecole in un singolo campione. Come esempio, abbiamo analizzato i livelli di fosforilazione di MAPK familiari in lisati da un-indotta e EMT indotta MCF7 e cellule A549 utilizzando il Kit Array proteoma Profiler umano fosfo-MAPK. L&#39;array è stato eseguito due volte da trattamenti EMT-induzione indipendenti con risultati simili. Figura 7 mostra i dati rappresentativi di una matrice. Entrambi i tipi di cellule hanno mostrato un aumento della fosforilazione di CREB (S133), ERK1 (T2<html> 02/Y204), e ERK2 (T185/Y187) in cellule EMT-indotte rispetto ai controlli. Differenze negli eventi di segnalazione sono stati osservati tra i due tipi di cellule pure. Cellule A549 hanno mostrato un aumento di GSK-3 β (S9) fosforilazione, mentre le cellule MCF7 hanno mostrato un aumento p70S6K (T421/S424) fosforilazione. <img src="/files/ftp_upload/50478/50478fig1.jpg" alt="Figura 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50478/50478fig1highres.jpg" fo:width="6in"/> Figura 1. Induzione morfologia mesenchimali dopo stimolazione con supplemento EMT Indurre Media (A - D). Morfologia epiteliale nei quattro tipi di cellule indicato di seguito coltura per 5 giorni in terreni di coltura standard senza supplemento EMT Indurre media (E - H). Morfologia mesenchimali nel quattro tipi di cellule indicati coltivate con supplemento EMT Indurre media per 5 giorni. nt &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/50478/50478fig2.jpg" alt="Figura 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50478/50478fig2highres.jpg" fo:width="6in"/> Figura 2. Downregulation di espressione marcatore epiteliale e upregulation di espressione marcatore mesenchimali in cellule EMT-indotte. Cellule sono state colorate mediante immunofluorescenza per rilevare l&#39;espressione del marcatore epiteliale, E-caderina (rosso), e il marker mesenchimale, fibronectina (verde). (A - D) Le cellule di controllo in coltura, senza supplemento EMT Indurre media per 5 giorni (E -. H) cellule in coltura con supplemento EMT Indurre media per 5 giorni. Tutte le cellule sono di contrasto con DAPI (blu). <img src="/files/ftp_upload/50478/50478fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. Conferma di espressione marcatore epiteliale e mesenchimale con la macchia di un occidentale<html> . ALISI Western blot di lisati cellulari totali dei quattro tipi di cellule indicato, trattati con (EMT) o senza (-) supplemento EMT Induzione media per 5 giorni. Bande di E-caderina, fibronectina e il controllo GAPDH carico sono quelle indicate sulla sinistra. L&#39;indicatore di dimensione è indicata sulla destra. <img src="/files/ftp_upload/50478/50478fig4.jpg" alt="Figura 4"/> Figura 4. Sovraregolazione dei marcatori mesenchimali, vimentina e lumaca in cellule EMT-indotte. Cellule sono state colorate mediante immunofluorescenza multicolore a rilevare l&#39;espressione del marcatore epiteliale, E-caderina (grigio), ei marcatori mesenchimali, vimentina (verde) e lumaca (rosso) Le cellule di controllo coltivate senza il supplemento EMT Indurre media per 5 giorni. - (C A). (D - F) cellule in coltura con supplemento EMT Indurre media per 5 giorni. lways &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/50478/50478fig5.jpg" alt="Figura 5" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50478/50478fig5highres.jpg" fo:width="6in"/> Figura 5. Induzione di EMT in cellule non responsive TGF-β1. (A e B) Le cellule coltivate con supporti solo per 5 giorni. (C e D) cellule coltivate in terreni contenenti 10 ng / ml di TGF-β1 per 5 giorni. (E e F) cellule coltivate in Supplemento EMT Indurre media per 5 giorni. Tutte le cellule sono colorate per l&#39;espressione di E-caderina (rosso) e di contrasto con DAPI (blu). <img src="/files/ftp_upload/50478/50478fig6.jpg" alt="Figura 6"/> Figura 6. Cellule EMT-indotta sono aumentate le capacità di migrazione e l&#39;invasione. A. Numero medio di cellule che migrarono attraverso un filtro a pori 8 micron dopo incubazione per 48 ore. B. Numero medio dicellule che erano in grado di invadere attraverso un filtro a pori 8 micron rivestita con estratto di membrana basale dopo incubazione per 48 ore. Le barre di errore indicano la deviazione standard su 3 pozzetti. <img src="/files/ftp_upload/50478/50478fig7.jpg" alt="Figura 7"/> Analisi di espressione di matrice a base di anticorpi Figura 7. Dell&#39;induzione EMT. I lisati da A549 (A e C) e MCF7 (B e D), le cellule in coltura con o senza supplemento EMT Indurre mezzi sono stati utilizzati per l&#39;analisi array utilizzando il kit Array Proteome Profiler umano fosfo-MAPK. Spot evidenziati in A e B sono state poi quantificate utilizzando densitometria. Confronti di non-indotte lisati di EMT-indotti sono riportati nei corrispondenti grafici a barre qui sotto (C e D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50478/50478fig7large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura &lt;</a>/ A&gt;.

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Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Un metodo semplice è descritto per l&#39;induzione della transizione epitelio mesenchimale (EMT) in una varietà di tipi cellulari. Metodi per l&#39;analisi di cellule in EMT stati di immunocitochimica sono inclusi.

Induzione e Analisi dei epiteliale a Mesenchymal Transizione

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

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35.5K Views.  R&D Systems, Inc..  Un metodo semplice è descritto per l'induzione della transizione epitelio mesenchimale (EMT) in una varietà di tipi cellulari. Metodi per l'analisi di cellule in EMT stati di immunocitochimica sono inclusi. 

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Light/dark Transition Test for Mice

Although all of the mouse genome sequences have been determined, we do not yet know the functions of most of these genes. Gene-targeting techniques, however, can be used to delete or manipulate a specific gene in mice. The influence of a given gene on a specific behavior can then be determined by conducting behavioral analyses of the mutant mice. As a test for behavioral phenotyping of mutant mice, the light/dark transition test is one of the most widely used tests to measure anxiety-like behavior in mice. The test is based on the natural aversion of mice to brightly illuminated areas and on their spontaneous exploratory behavior in novel environments. The test is sensitive to anxiolytic drug treatment. The apparatus consists of a dark chamber and a brightly illuminated chamber. Mice are allowed to move freely between the two chambers. The number of entries into the bright chamber and the duration of time spent there are indices of bright-space anxiety in mice. To obtain phenotyping results of a strain of mutant mice that can be readily reproduced and compared with those of other mutants, the behavioral test methods should be as identical as possible between laboratories. The procedural differences that exist between laboratories, however, make it difficult to replicate or compare the results among laboratories. Here, we present our protocol for the light/dark transition test as a movie so that the details of the protocol can be demonstrated. In our laboratory, we have assessed more than 60 strains of mutant mice using the protocol shown in the movie. Those data will be disclosed as a part of a public database that we are now constructing.

Visualization of the protocol will facilitate understanding of the details of the entire experimental procedure, allowing for standardization of the protocols used across laboratories and comparisons of the behavioral phenotypes of various strains of mutant mice assessed using this test.

The light/dark transition test is one of the most widely used tests to measure anxiety-like behavior in mice. Here, we present a movie that shows detailed procedures on how we conduct the test.

Luce / buio test di transizione per i Topi

Although all of the mouse genome sequences have been determined, we do not yet know the functions of most of these genes. Gene-targeting techniques, ...

Ricerca

Biologia

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

Un neuronale e astrociti Co-Cultura Assay per l&#39;analisi dei contenuti elevati di neurotossicità

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes in cell surface area and cell height, and where cells undergo mitosis and migrate. Furthermore, epithelial cells can also regulate morphogenetic movements in adjacent tissues1. A traditional method to study epithelial cells and tissues involve chemical fixation and histological methods to determine cell morphology or localization of particular proteins of interest. These approaches continue to be useful and provide "snapshots" of cell shapes and tissue architecture, however, much remains to be understood about how cells acquire specific shapes, how various proteins move or localize to specific positions, and what paths cells follow toward their final differentiated fate. High resolution live imaging complements traditional methods and also allows more direct investigation into the dynamic cellular processes involved in the formation, maintenance, and morphogenesis of multicellular epithelial sheets. Here we demonstrate experimental methods from the isolation of animal cap tissues from Xenopus laevis embryos to confocal imaging of epithelial cells and simple measurement approaches that together can augment molecular and cellular studies of epithelial morphogenesis.

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Xenopus embryonic epithelia are an ideal model system to study cell behaviors such as polarity development and shape change during epithelial morphogenesis. Traditional histology of fixed samples is increasingly being complemented by live-cell confocal imaging. Here we demonstrate methods to isolate frog tissues and visualize live epithelial cells and their cytoskeleton using live-cell confocal microscopy.

Live-cell imaging e analisi quantitativa della embrionali in cellule epiteliali Xenopus laevis</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental gene expression 1,2,3,4,5,6,7. The recent discovery of thousands of lncRNAs in association with specific chromatin modification complexes, such as Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2) that mediates histone H3 lysine 27 trimethylation (H3K27me3), suggests broad roles for numerous lncRNAs in managing chromatin states in a gene-specific fashion 8,9. While some lncRNAs are thought to work in cis on neighboring genes, other lncRNAs work in trans to regulate distantly located genes. For instance, Drosophila lncRNAs roX1 and roX2 bind numerous regions on the X chromosome of male cells, and are critical for dosage compensation 10,11. However, the exact locations of their binding sites are not known at high resolution. Similarly, human lncRNA HOTAIR can affect PRC2 occupancy on hundreds of genes genome-wide 3,12,13, but how specificity is achieved is unclear. LncRNAs can also serve as modular scaffolds to recruit the assembly of multiple protein complexes. The classic trans-acting RNA scaffold is the TERC RNA that serves as the template and scaffold for the telomerase complex 14; HOTAIR can also serve as a scaffold for PRC2 and a H3K4 demethylase complex 13.
Prior studies mapping RNA occupancy at chromatin have revealed substantial insights 15,16, but only at a single gene locus at a time. The occupancy sites of most lncRNAs are not known, and the roles of lncRNAs in chromatin regulation have been mostly inferred from the indirect effects of lncRNA perturbation. Just as chromatin immunoprecipitation followed by microarray or deep sequencing (ChIP-chip or ChIP-seq, respectively) has greatly improved our understanding of protein-DNA interactions on a genomic scale, here we illustrate a recently published strategy to map long RNA occupancy genome-wide at high resolution 17. This method, Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP) (Figure 1), is based on affinity capture of target lncRNA:chromatin complex by tiling antisense-oligos, which then generates a map of genomic binding sites at a resolution of several hundred bases with high sensitivity and low background. ChIRP is applicable to many lncRNAs because the design of affinity-probes is straightforward given the RNA sequence and requires no knowledge of the RNA's structure or functional domains.

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

ChIRP is a novel and rapid technique to map genomic binding sites of long noncoding RNAs (lncRNAs). The method takes advantage of the specificity of anti-sense tiling oligonucleotides to allow the enumeration of lncRNA-bound genomic sites.

Isolamento di cromatina Purificazione RNA (disturbo)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an attractive model system to study organ development and tissue-specific signaling. Although hair follicle development is genetically tractable, fast and reproducible analysis of factors essential for this process remains a challenge. Here we describe a procedure to generate targeted overexpression or shRNA-mediated knockdown of factors using lentivirus in a tissue-specific manner. Using a modified version of a hair regeneration model 5, 6, 11, we can achieve robust gain- or loss-of-function analysis in primary mouse keratinocytes or dermal cells to facilitate study of epithelial-mesenchymal signaling pathways that lead to hair follicle morphogenesis. We describe how to isolate fresh primary mouse keratinocytes and dermal cells, which contain dermal papilla cells and their precursors, deliver lentivirus containing either shRNA or cDNA to one of the cell populations, and combine the cells to generate fully formed hair follicles on the backs of nude mice. This approach allows analysis of tissue-specific factors required to generate hair follicles within three weeks and provides a fast and convenient companion to existing genetic models.

Tissue-specific analysis of a hair follicle regeneration model using lentivirus to mediate gain- or loss-of-function.

Rapida analisi genetica di epitelio-mesenchimale segnalazione durante la rigenerazione dei capelli

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse incisor provides a model for these processes. This remarkable organ grows continuously throughout the animal&#39;s life and generates all the necessary cell types from active pools of adult stem cells housed in the labial (toward the lip) and lingual (toward the tongue) cervical loop (CL) regions. Only the dental stem cells from the labial CL give rise to ameloblasts that generate enamel, the outer covering of teeth, on the labial surface. This asymmetric enamel formation allows abrasion at the incisor tip, and progenitors and stem cells in the proximal incisor ensure that the dental tissues are constantly replenished. The ability to isolate and grow these progenitor or stem cells in vitro allows their expansion and opens doors to numerous experiments not achievable in vivo, such as high throughput testing of potential stem cell regulatory factors. Here, we describe and demonstrate a reliable and consistent method to culture cells from the labial CL of the mouse incisor.

The continuously growing mouse incisor provides a model for studying renewal of dental tissues from dental epithelial stem cells (DESCs). A robust system for consistently and reliably obtaining these cells from the incisor and expanding them in vitro is reported here.

Isolamento e Cultura della Dental epiteliali cellule staminali del topo adulto Incisor

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

Detection of Alternative Splicing During Epithelial-Mesenchymal Transition

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various physiological and pathological processes. Here we describe a strategy to detect alternative splicing during EMT using an inducible EMT model by expressing the transcription repressor Twist. EMT is monitored by changes in cell morphology, loss of E-cadherin localization at cell-cell junctions, and the switched expression of EMT markers, such as loss of epithelial markers E-cadherin and &#947;-catenin and gain of mesenchymal markers N-cadherin and vimentin. Using isoform-specific primer sets, the alternative splicing of interested mRNAs are analyzed by quantitative RT-PCR. The production of corresponding protein isoforms is validated by immunoblotting assays. The method of detecting splice isoforms described here is also suitable for the study of alternative splicing in other biological processes.

Alternative splicing regulation has been shown to contribute to the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program in various physiological and pathological processes. Here we describe a method utilizing an inducible EMT model for the detection of alternative splicing during EMT.

Rilevamento di splicing alternativo Durante epiteliale-mesenchimale transizione

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various ...

Manipulating the Murine Lacrimal Gland

The lacrimal gland (LG) secretes aqueous tears necessary for maintaining the structure and function of the cornea, a transparent tissue essential for vision. In the human a single LG resides in the orbit above the lateral end of each eye delivering tears to the ocular surface through 3 - 5 ducts. The mouse has three pairs of major ocular glands, the most studied of which is the exorbital lacrimal gland (LG) located anterior and ventral to the ear. Similar to other glandular organs, the LG develops through the process of epithelial branching morphogenesis in which a single epithelial bud within a condensed mesenchyme undergoes multiple rounds of bud and duct formation to form an intricate interconnected network of secretory acini and ducts. This elaborate process has been well documented in many other epithelial organs such as the pancreas and salivary gland. However, the LG has been much less explored and the mechanisms controlling morphogenesis are poorly understood. We suspect that this under-representation as a model system is a consequence of the difficulties associated with finding, dissecting and culturing the LG. Thus, here we describe dissection techniques for harvesting embryonic and post-natal LG and methods for ex vivo culture of the tissue.

The lacrimal gland (LG) is a branching organ that produces the aqueous components of tears necessary for maintaining vision and ocular health. Here we describe murine LG dissection and ex vivo culture techniques to decipher signaling pathways involved in LG development.

Manipolare il murino Ghiandola lacrimale

The lacrimal gland (LG) secretes aqueous tears necessary for maintaining the structure and function of the cornea, a transparent tissue essential for ...

Cryosectioning Method for Microdissection of Murine Colonic Mucosa

The colonic mucosal tissue provides a vital barrier to luminal antigens. This barrier is composed of a monolayer of simple columnar epithelial cells. The colonic epithelium is dynamically turned over and epithelial cells are generated in the stem cell containing crypts of Lieberk&#252;hn. Progenitor cells produced in the crypt-bases migrate toward the luminal surface, undergoing a process of cellular differentiation before being shed into the gut lumen. In order to study these processes at the molecular level, we have developed a simple method for the microdissection of two spatially distinct regions of the colonic mucosa; the proliferative crypt zone, and the differentiated surface epithelial cells. Our objective is to isolate specific crypt and surface epithelial cell populations from mouse colonic mucosa for the isolation of RNA and protein.

Here we describe a simple method for the isolation of spatially distinct murine colonic epithelial surface cells from the underlying crypt-base cells.

Metodo criosezionamento per Microdissezione di Murine colon mucosa

The colonic mucosal tissue provides a vital barrier to luminal antigens. This barrier is composed of a monolayer of simple columnar epithelial cells. The ...

Magnetic-Activated Cell Sorting Strategies to Isolate and Purify Synovial Fluid-Derived Mesenchymal Stem Cells from a Rabbit Model

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for cartilage tissue engineering. MSCs from synovial fluid (SF-MSCs) have been considered promising candidates for articular regeneration, and their potential therapeutic benefit has made them an important research topic of late. SF-MSCs from the knee cavity of the New Zealand white rabbit can be employed as an optimized translational model to assess human regenerative medicine. By means of CD90-based magnetic activated cell sorting (MACS) technologies, this protocol successfully obtains rabbit SF-MSCs (rbSF-MSCs) from this rabbit model and further fully demonstrates the MSC phenotype of these cells by inducing them to differentiate to osteoblasts, adipocytes, and chondrocytes. Therefore, this approach can be applied in cell biology research and tissue engineering using simple equipment and procedures.

This article presents a simple and economic protocol for the straightforward isolation and purification of mesenchymal stem cells from New Zealand white rabbit synovial fluid.

Magnetico-Activated Cell Sorting strategie per isolare e purificare Synovial cellule staminali mesenchimali liquido derivato da un modello di coniglio

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for ...