Questa ricerca è stata sostenuta da borse-in-Aid per giovani scienziati (A) (# 16680015), Grant-in-Aid per la ricerca esplorativa (# 16653065), Grant-in-Aid per la ricerca scientifica sui settori prioritari (# 18023022, # # 18016012 e 18053015) dal Ministero della Pubblica Istruzione, Cultura, Sport, Scienza e Tecnologia in Giappone, Grant-in-Aid di promozione di studi fondamentali in Scienze della Salute dell &#39;Istituto Nazionale per l&#39;Innovazione Biomedica (NIBIO), Grant-in- aiuto Neuroinformatica Giappone Center (NIJC), RIKEN

<ol><li> L&#39;apparecchio utilizzato per la luce / buio transizione prova consisteva in una gabbia (21x42x25 cm) diviso in due sezioni di uguale misura da un tramezzo con porta (Ohara &amp; Co., Tokyo). </li><li> I topi sono alloggiati 3-4 per gabbia in una stanza con una 12 ore ciclo luce / buio (le luci alle 7:00) con accesso ad libitum a cibo e acqua. Idealmente, due controlli e due mutanti sono alloggiati insieme, riorganizzando i topi non appena sono genotipizzati al momento dello svezzamento. Test del comportamento è effettuata 9:00-6:00 Tutte le gabbie contenenti i topi vengono trasferiti nella sala prove comportamento 30 minuti prima che il primo processo ha inizio. </li><li> Una camera è illuminata da diodi bianchi (390 lux), mentre l&#39;altra camera è scuro (2 lux). I topi sono posti nel lato oscuro e la porta si apre automaticamente 3 secondi dopo che il mouse viene rilevato dalla telecamera a raggi infrarossi. La porta è utilizzato in modo che i topi non entrano nel camera luce subito dopo il rilascio con la loro motivazione a fuggire da sperimentatore, poiché la latenza per accedere alla camera luce può servire come indice di ansia comportamento simile. </li><li> I topi possono circolare liberamente tra le due camere con porta aperta per 10 minuti. L&#39;applicazione utilizzata per l&#39;acquisizione e l&#39;analisi dei dati comportamentali (immagine LD4) si basa sul pubblico del programma J Immagine di dominio (sviluppato byWayne Rasband presso l&#39;Istituto Nazionale di Salute Mentale e disponibile http://rsb.info.nih.gov/ij /), che è stato modificato da Tsuyoshi Miyakawa (disponibile tramite O&#39;Hara &amp; Co., Tokyo, Giappone). </li><li> La distanza percorsa in ciascuna camera, il numero totale di transizioni, il tempo trascorso in ciascuna camera, e la latenza per entrare nella luce chamberare registrati da Image LD4 programma. </li><li> Dopo ogni prova, tutte le camere sono pulite con acqua eccellente ipocloroso per evitare un pregiudizio basato su stimoli olfattivi. </li></ol>

<ol>
	<li>Austin, C. P., Aiba, A., Takao, K., Miyakawa, T., Takao, K., Yamasaki, N., Miyakawa, T., Crawley, J. N., Crawley, J. N., Crawley, J., Goodwin, F. K., Miyakawa, T., Crabbe, J. C., Wahlsten, D., Dudek, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+knockout+mouse+project.">The knockout mouse project.</a> Nat Genet. 36, 921-924 (2004).</li></ol>

Tutte le procedure sono state approvate con l&#39;uso degli animali e del Comitato cura dell&#39;Università di Kyoto. Tsuyoshi Miyakawa è associato con BIRD, Giappone Scienza e della Tecnologia Agenzia, Saitama, Giappone.

Anche se tutte le sequenze del genoma del topo sono stati determinati, le funzioni della maggior parte di questi geni non sono noti. Gene-targeting tecniche, tuttavia, può essere utilizzato per cancellare o manipolare uno specifico gene nei topi (Aiba et al, 2007;. Austin et al, 2004).. L&#39;influenza di un dato gene in un comportamento specifico può essere determinato da condurre analisi del comportamento dei topi mutanti (Takao e Miyakawa, 2006;. Takao et al, 2007). Come test di fenotipizzazione comportamentale di topi mutanti, la luce / buio test di transizione è uno dei test più comunemente utilizzato per misurare l&#39;ansia comportamento simile nei topi (Crawley, 2000). Il test si basa sulla naturale avversione dei topi in modo vivace le zone illuminate e sul loro comportamento spontaneo di esplorazione in ambienti romanzo (Crawley, 1985). Il test è sensibile al trattamento con farmaci ansiolitici (Crawley, 1985). L&#39;apparecchio è costituito da una camera oscura e una camera illuminato. Un&#39;apertura limitata, 3 cm per 5 cm di larghezza, collega le due camere. I topi possono circolare liberamente tra le due camere. Il numero di voci nella camera luminosa e la durata del tempo trascorso lì vengono utilizzati come indici di luminoso spazio-ansia nei topi. La luce / buio prova di transizione è stato originariamente sviluppato da Crawley e colleghi (Crawley e Goodwin, 1980). Ci sono due differenze tra la loro versione originale ed il nostro test. In primo luogo, la camera di luce è più grande della camera oscura nella versione originale, mentre le dimensioni delle due camere è lo stesso nella nostra versione del test. In secondo luogo, nella versione originale, la camera di luce non ha soffitto e le pareti della camera di luce erano trasparenti (Crawley e Goodwin, 1980), mentre l&#39;uso di plastica opaca bianca per il soffitto e le pareti della camera di luce. Queste differenze, in particolare le dimensioni e l&#39;apertura della camera di luce, consentono la rilevazione simultanea di brillanti spazio ansia così come open-space ansia nella versione originale del test. Nel nostro laboratorio, invece, open-space ansia comportamento simile nei topi è stato testato in un labirinto, più elevata. Le pareti opache e il soffitto, le dimensioni della camera di luce, e la nostra specifica alla luce / buio protocollo di prova transizione è più specializzato per la rilevazione luminoso spazio-ansia rispetto alla versione originale. Anche se la luce / buio di transizione e di prova più elevata labirinto sono entrambi utilizzati per valutare l&#39;ansia, come il comportamento, i risultati non sono sempre coerenti. Per esempio, proencefalo specifiche topi knockout calcineurina trascorrere una diminuzione della quantità di tempo nella camera di luce nella luce / buio prova di transizione, ma una maggiore quantità di tempo tra le braccia aperte nel labirinto più elevata (Miyakawa et al., 2003) . Abbiamo ipotizzato che la nostra luce / buio e test di transizione test più elevata labirinto valutare diversi aspetti di ansia comportamento simile, come ad esempio luminoso spazio-ansia e open-space ansia comportamento simile. Per verificare questa ipotesi, abbiamo utilizzato un set di dati di grandi dimensioni raccolti con i topi stessi in entrambe le prove. Nel nostro laboratorio, abbiamo condotta batterie di test comportamentali che copre molti campi per lo screening per il significato del comportamento dei geni. La batteria di test richiede diverse settimane per essere completato. Durante il periodo di prova, le gabbie del mouse sono conservati in un rack nella nostra struttura. Se i topi sono trasportati al nostro laboratorio da altre istituzioni, che sono abituati all&#39;ambiente della nostra struttura per almeno 1 settimana. Dopo il periodo di assuefazione, i topi sono sottoposti a un controllo sanitario generale e di screening neurologico (Miyakawa et al., 2003), e dopo questi esami semplici, i topi sono soggetti alla luce / buio prova di transizione. Il test viene condotto in una stanza insonorizzata sperimentale dopo 30 minuti di assuefazione alla sala sperimentale, come mostrato nel film. Abbiamo valutato più di 60 ceppi di topi mutanti geneticamente modificati utilizzando il protocollo mostrato nel film e hanno un grande insieme di dati grezzi per più di 3000 topi (compresi wild-type e topi mutanti). Abbiamo condotto analisi fattore da sfruttare la grande insieme di dati grezzi. In effetti, abbiamo rilevato diversi fattori da ogni prova (dati non pubblicati), anche se ci sono state alcune correlazioni significative tra gli indici (dati non pubblicati) .. Tali dati saranno comunicati nell&#39;ambito di un database pubblico che stiamo costruendo. Nella nostra batteria di test, wild-type fratellini sono di solito usati come controllo. Come un ceppo di fondo, i topi C57BL/6J sono comunemente usati. Abbiamo raccolto i dati di topi C57BL/6J utilizzato come controllo di topi mutanti nella batteria di test. Gli indici ottenuti da topi C57BL/6J nel nostro chiaro / scuro test di transizione sono stati i seguenti (n = 795; media ± SEM); distanza percorsa: 846,5 8,88 centimetri nella camera di luce, 1478,5 9,53 centimetri nella camera oscura, la durata del tempo trascorso : 215,8 1,85 s nella luce, 395,8 1,86 s al buio; numero di transizioni tra i compartimenti: 30,52 0,43; latenza per entrare nella camera luce: 64,94 2,40 s. Movimento dei topi intorno agli ingressi alle camere viene rilevato dalla telecamera e viene conteggiato come tempo trascorso in entrambi cHambers. A causa di questo, la somma della durata media del tempo trascorso in luce e che in compartimenti buio era più grande di quella di tutta la durata del test (600 s). Nel nostro protocollo, un mouse è la prima volta immessi nella camera oscura. Tre secondi dopo aver posizionato il mouse nella camera oscura, la porta tra le camere si apre automaticamente e il mouse possono muoversi liberamente tra le due camere. Topi C57BL/6J passare meno tempo nella camera di luce che in camera oscura (p &lt;0,0001, la durata se il tempo trascorso in luce: 215,8 1,85 s, la durata del tempo trascorso nel buio: 316,3 2,11 s [il tempo trascorso al buio fa non comprende il tempo trascorso prima al buio prima di entrare nella camera di luce per la prima volta], n = 795, accoppiato t-test). Questo indica che i topi C57BL/6J tendono ad evitare la camera di luce, e che il tempo trascorso in luce è un buon indice di ansia comportamento simile. I risultati ottenuti da vari ceppi di topi mutanti sono facilmente rispetto, perché tutti i dati sono ottenuti utilizzando lo stesso protocollo. Per ottenere risultati fenotipizzazione di un ceppo di topi mutanti che possono essere facilmente riprodotti e confrontati con i dati di altri mutanti, i metodi di prova comportamentale dovrebbe essere quanto più possibile identico tra laboratori. Tiger e colleghi hanno testato l&#39;interazione tra il comportamento del mouse e ambiente di laboratorio usando esattamente gli stessi ceppi inbred e un ceppo mutante nullo. Nel loro studio, l&#39;apparato, i protocolli di prova, e molte variabili ambientali sono state rigorosamente standardizzati. Nonostante la standardizzazione, hanno trovato differenze sistematiche nel comportamento tra laboratori, anche se anche rilevato differenze ceppo in tutti i comportamenti (Crabbe et al., 1999). Essi hanno riferito che le variabili incontrollabili e sperimentazioni che caratterizzano i mutanti possono dare risultati che sono idiosincratiche di un laboratorio di particolare. Le differenze procedurali che esistono tra i laboratori rendono difficile da replicare o confrontare i risultati tra laboratori. Qui vi presentiamo il nostro protocollo per il chiaro / scuro prova transizione come un filmato in modo che i dettagli del protocollo può essere dimostrata. Stabilire documentazione visiva del protocollo faciliterà una migliore comprensione dei dettagli di procedure sperimentali, permettendo per la standardizzazione dei protocolli utilizzati in laboratori e confronti tra i fenotipi comportamentali dei vari ceppi di topi mutanti valutata usando questo test. Film di altri protocolli, come per il labirinto più elevato, test a campo aperto, test di nuoto porsolt forzata, condizionamento alla paura, che utilizziamo nel nostro batteria di test comportamentali sono attualmente in corso per la pubblicazione di articoli futuri Video Journal.

light/dark transition test for mice

Anche se tutte le sequenze del genoma del topo sono stati determinati, noi non sappiamo ancora le funzioni della maggior parte di questi geni. Gene-targeting tecniche, tuttavia, può essere utilizzato per cancellare o manipolare uno specifico gene nei topi. L&#39;influenza di un dato gene in un comportamento specifico può essere determinato da condurre analisi del comportamento dei topi mutanti. Come test di fenotipizzazione comportamentale di topi mutanti, la luce / buio test di transizione è uno dei test più comunemente utilizzato per misurare l&#39;ansia comportamento simile nei topi. Il test si basa sulla naturale avversione dei topi in modo vivace le zone illuminate e sul loro comportamento spontaneo di esplorazione in ambienti romanzo. Il test è sensibile al trattamento farmacologico ansiolitici. L&#39;apparecchio è costituito da una camera oscura e una camera illuminato. I topi possono circolare liberamente tra le due camere. Il numero di voci nella camera luminosa e la durata del tempo trascorso ci sono indici di brillanti spazio ansia nei topi. Per ottenere risultati fenotipizzazione di un ceppo di topi mutanti che possono essere facilmente riprodotti e confrontati con quelli di altri mutanti, i metodi di prova comportamentale dovrebbe essere quanto più possibile identico tra laboratori. Le differenze procedurali che esistono tra i laboratori, tuttavia, rende difficile replicare o confrontare i risultati tra laboratori. Qui vi presentiamo il nostro protocollo per il chiaro / scuro prova transizione come un filmato in modo che i dettagli del protocollo può essere dimostrata. Nel nostro laboratorio, abbiamo valutato più di 60 ceppi di topi mutanti utilizzando il protocollo mostrato nel film. Tali dati saranno comunicati come parte di un database pubblico che stiamo costruendo. Visualizzazione del protocollo faciliterà la comprensione dei dettagli di tutta la procedura sperimentale, che consente per la standardizzazione dei protocolli utilizzati in laboratori e confronti dei fenotipi comportamentali dei vari ceppi di topi mutanti valutata usando questo test.

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Light/dark Transition Test for Mice

La luce / buio prova di transizione è uno dei test più usato per misurare l&#39;ansia comportamento simile nei topi. Qui, vi presentiamo un film che mostra le procedure dettagliate su come condurre il test.

Luce / buio test di transizione per i Topi

Although all of the mouse genome sequences have been determined, we do not yet know the functions of most of these genes. Gene-targeting techniques, ...

Research

JoVE Journal

Biology

51.7K Views.  Graduate School of Medicine, Kyoto University. La luce / buio prova di transizione è uno dei test più usato per misurare l'ansia comportamento simile nei topi. Qui, vi presentiamo un film che mostra le procedure dettagliate su come condurre il test.

Video: Light/dark Transition Test for Mice

Elevated Plus Maze for Mice

Although the mouse genome is now completely sequenced, the functions of most of the genes expressed in the brain are not known. The influence of a given gene on a specific behavior can be determined by behavioral analysis of mutant mice. If a target gene is expressed in the brain, behavioral phenotype of the mutant mice could elucidate the genetic mechanism of normal behaviors. The elevated plus maze test is one of the most widely used tests for measuring anxiety-like behavior. The test is based on the natural aversion of mice for open and elevated areas, as well as on their natural spontaneous exploratory behavior in novel environments. The apparatus consists of open arms and closed arms, crossed in the middle perpendicularly to each other, and a center area. Mice are given access to all of the arms and are allowed to move freely between them. The number of entries into the open arms and the time spent in the open arms are used as indices of open space-induced anxiety in mice. Unfortunately, the procedural differences that exist between laboratories make it difficult to duplicate and compare results among laboratories. Here, we present a detailed movie demonstrating our protocol for the elevated plus maze test. In our laboratory, we have assessed more than 90 strains of mutant mice using the protocol shown in the movie. These data will be disclosed as a part of a public database that we are now constructing.
Visualization of the protocol will promote better understanding of the details of the entire experimental procedure, allowing for standardization of the protocols used in different laboratories and comparisons of the behavioral phenotypes of various strains of mutant mice assessed using this test. 


The elevated plus maze test is one of the most widely used tests for measuring anxiety-like behavior in mice. Here, we present a movie showing the detailed procedures for conducting the test.

Elevata Maze Plus per topi

Although the mouse genome is now completely sequenced, the functions of most of the genes expressed in the brain are not known. The influence of a given ...

Ricerca

Biologia

Murine Model for Parkinson's Disease: from 6-OH Dopamine Lesion to Behavioral Test

Parkinson's disease (PD) affects at least 6.5 million people worldwide, irrespective of gender, social, ethnic, economic, or geographic boundaries. Key symptoms, such as tremor, rigidity and bradikinesia, develop when about 3/4 of dopaminergic cells are lost in the substantia nigra, and fail to provide for the smooth, coordinated regulation of striatal motor circuits. Depression and hallucinations are common, and dementia eventually occurs in 20% of patients. At this time, there is no treatment to delay or stop the progression of PD. Rather, the medications currently available aim more towards the alleviation of these symptoms. New surgical strategies may reversibly switch on the functionally damaged circuits through the electrical stimulation of deep brain structures, but although deep brain stimulation is a major advance, it is not suitable for all patients. It remains therefore necessary to test new cell therapy approaches in preclinical models.
Selective neurotoxic disruption of dopaminergic pathways can be reproduced by injection of 6-hydroxydopamine (6-OHDA) or MPTP (1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tertahydropyridine) whereas depleting drugs and oxidative-damaging chemicals may also reproduce specific features of PD in rodents. Unlike MPTP, 6-OHDA lesions cause massive irreversible neuronal loss, and can be uni- or bilateral. The 6-OHDA lesion model is reliable, leads to robust motor deficits, and is the most widely used after 40 years of research in rats1. As interactions between grafted cells and host can now be studied more thoroughly in mice rather than in rats, the model has been transposed to mice2,3, where it has been recently characterized4.
In this video, we demonstrate how to lesion the left nigro-striatal pathway of anesthetized mice by slowly delivering 2.0 &mu;L of 6-OHDA through a stereotaxically inserted micro-syringe needle. The loss of dopaminergic input occurs within days, and the functional impairments can be monitored over post-operative weeks and months by rating animal rotations induced by dopaminergic agents5. Here, we show full-body contralateral rotations occurring 10 minutes after a single subcutaneous administration of apomorphine, measured one month after the lesion. Outcomes and drawbacks are discussed below.

Murine Model for Parkinson&#039;s Disease: from 6-OH Dopamine Lesion to Behavioral Test

Parkinson disease is caused by loss of dopaminergic innervation to the striatum, which can be experimentally induced by 6-OH-dopamine. We describe how to perform a stereotaxic lesion and to monitor apomorphine-induced rotational behavior in mice. This model is useful and reliable for testing new therapies for Parkinson disease.

Modello murino per la malattia di Parkinson: da 6-OH lesione dopamina a test comportamentali

Parkinson's disease (PD) affects at least 6.5 million people worldwide, irrespective of gender, social, ethnic, economic, or geographic boundaries. Key ...

An Allele-specific Gene Expression Assay to Test the Functional Basis of Genetic Associations

The number of significant genetic associations with common complex traits is constantly increasing. However, most of these associations have not been understood at molecular level. One of the mechanisms mediating the effect of DNA variants on phenotypes is gene expression, which has been shown to be particularly relevant for complex traits1.
This method tests in a cellular context the effect of specific DNA sequences on gene expression. The principle is to measure the relative abundance of transcripts arising from the two alleles of a gene, analysing cells which carry one copy of the DNA sequences associated with disease (the risk variants)2,3. Therefore, the cells used for this method should meet two fundamental genotypic requirements: they have to be heterozygous both for DNA risk variants and for DNA markers, typically coding polymorphisms, which can distinguish transcripts based on their chromosomal origin (Figure 1). DNA risk variants and DNA markers do not need to have the same allele frequency but the phase (haplotypic) relationship of the genetic markers needs to be understood. It is also important to choose cell types which express the gene of interest. This protocol refers specifically to the procedure adopted to extract nucleic acids from fibroblasts but the method is equally applicable to other cells types including primary cells.
DNA and RNA are extracted from the selected cell lines and cDNA is generated. DNA and cDNA are analysed with a primer extension assay, designed to target the coding DNA markers4. The primer extension assay is carried out using the MassARRAY (Sequenom)5 platform according to the manufacturer's specifications. Primer extension products are then analysed by matrix-assisted laser desorption/ionization time of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF/MS). Because the selected markers are heterozygous they will generate two peaks on the MS profiles. The area of each peak is proportional to the transcript abundance and can be measured with a function of the MassARRAY Typer software to generate an allelic ratio (allele 1: allele 2) calculation. The allelic ratio obtained for cDNA is normalized using that measured from genomic DNA, where the allelic ratio is expected to be 1:1 to correct for technical artifacts. Markers with a normalised allelic ratio significantly different to 1 indicate that the amount of transcript generated from the two chromosomes in the same cell is different, suggesting that the DNA variants associated with the phenotype have an effect on gene expression. Experimental controls should be used to confirm the results.

Genetic associations often remain unexplained at a functional level. This method aims to assess the effect of phenotype-associated genetic markers on gene expression by analyzing cells heterozygous for transcribed SNPs. The technology allows accurate measurement by MALDI-TOF mass spectrometry to quantify allele-specific primer extension products.

Una allele-specifica espressione genica saggio per testare la base funzionale delle Associazioni di genetica

The number of significant genetic associations with common complex traits is constantly increasing. However, most of these associations have not been ...

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish water and sediment. The choice of biological indicators must be based on reliable scientific knowledge and, possibly, on the availability of standardized procedures. In this article, we present a standardized protocol that used the marine crustacean Artemia to evaluate the toxicity of chemicals and/or of marine environmental matrices. Scientists propose that the brine shrimp (Artemia) is a suitable candidate for the development of a standard bioassay for worldwide utilization. A number of papers have been published on the toxic effects of various chemicals and toxicants on brine shrimp (Artemia). The major advantage of this crustacean for toxicity studies is the overall availability of the dry cysts; these can be immediately used in testing and difficult cultivation is not demanded1,2. Cyst-based toxicity assays are cheap, continuously available, simple and reliable and are thus an important answer to routine needs of toxicity screening, for industrial monitoring requirements or for regulatory purposes3. The proposed method involves the mortality as an endpoint. The numbers of survivors were counted and percentage of deaths were calculated. Larvae were considered dead if they did not exhibit any internal or external movement during several seconds of observation4. This procedure was standardized testing a reference substance (Sodium Dodecyl Sulfate); some results are reported in this work. This article accompanies a video that describes the performance of procedural toxicity testing, showing all the steps related to the protocol.

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

This study concerns the development and standardization of a valuable methodological protocol to determine long-term (14 days) lethal toxicity exerted by chemical substances, industrial wastewater or sewage and liquid environmental samples on the saltwater crustacean, Artemia franciscana.

A lungo termine del test di tossicità letale con il crostaceo Artemia franciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

Multi-parameter Measurement of the Permeability Transition Pore Opening in Isolated Mouse Heart Mitochondria

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with a molecular mass smaller than 1.5 kDa. Although the definitive molecular identity of the pore is still under debate, proteins such as cyclophilin D, VDAC and ANT contribute to mtPTP formation. While the involvement of mtPTP opening in cell death is well established1, accumulating evidence indicates that the mtPTP serves a physiologic role during mitochondrial Ca2+ homeostasis2, bioenergetics and redox signaling 3.
mtPTP opening is triggered by matrix Ca2+ but its activity can be modulated by several other factors such as oxidative stress, adenine nucleotide depletion, high concentrations of Pi, mitochondrial membrane depolarization or uncoupling, and long chain fatty acids4. In vitro, mtPTP opening can be achieved by increasing Ca2+ concentration inside the mitochondrial matrix through exogenous additions of Ca2+ (calcium retention capacity). When Ca2+ levels inside mitochondria reach a certain threshold, the mtPTP opens and facilitates Ca2+ release, dissipation of the proton motive force, membrane potential collapse and an increase in mitochondrial matrix volume (swelling) that ultimately leads to the rupture of the outer mitochondrial membrane and irreversible loss of organelle function.
Here we describe a fluorometric assay that allows for a comprehensive characterization of mtPTP opening in isolated mouse heart mitochondria. The assay involves the simultaneous measurement of 3 mitochondrial parameters that are altered when mtPTP opening occurs: mitochondrial Ca2+ handling (uptake and release, as measured by Ca2+ concentration in the assay medium), mitochondrial membrane potential, and mitochondrial volume. The dyes employed for Ca2+ measurement in the assay medium and mitochondrial membrane potential are Fura FF, a membrane impermeant, ratiometric indicator which undergoes a shift in the excitation wavelength in the presence of Ca2+, and JC-1, a cationic, ratiometric indicator which forms green monomers or red aggregates at low and high membrane potential, respectively. Changes in mitochondrial volume are measured by recording light scattering by the mitochondrial suspension. Since high-quality, functional mitochondria are required for the mtPTP opening assay, we also describe the steps necessary to obtain intact, highly coupled and functional isolated heart mitochondria.

A spectrofluorometric protocol for the measurement of the mitochondrial permeability transition pore opening in isolated mouse heart mitochondria is presented here. The assay involves the simultaneous measurement of mitochondria Ca2+ handling, mitochondrial membrane potential and mitochondrial volume. The procedure for obtaining high-quality and functional heart mitochondria is also described.

Multi-parametro di misura della apertura dei pori di transizione di permeabilità nel Cuore mouse mitocondri isolati

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with ...

Blastomere Explants to Test for Cell Fate Commitment During Embryonic Development

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal which tissues descend from each cell of the embryo. Although fate maps are very useful for identifying the precursors of an organ and for elucidating the developmental path by which the descendant cells populate that organ in the normal embryo, they do not illustrate the full developmental potential of a precursor cell or identify the mechanisms by which its fate is determined. To test for cell fate commitment, one compares a cell's normal repertoire of descendants in the intact embryo (the fate map) with those expressed after an experimental manipulation. Is the cell's fate fixed (committed) regardless of the surrounding cellular environment, or is it influenced by external factors provided by its neighbors? Using the comprehensive fate maps of the Xenopus embryo, we describe how to identify, isolate and culture single cleavage stage precursors, called blastomeres. This approach allows one to assess whether these early cells are committed to the fate they acquire in their normal environment in the intact embryo, require interactions with their neighboring cells, or can be influenced to express alternate fates if exposed to other types of signals.

The fate of an individual embryonic cell can be influenced by inherited molecules and/or by signals from neighboring cells. Utilizing fate maps of the cleavage stage Xenopus embryo, single blastomeres can be identified for culture in isolation to assess the contributions of inherited molecules versus cell-cell interactions.

Espianti blastomero al test per l&#39;Impegno cellulare Fate durante lo sviluppo embrionale

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal  which tissues descend from each cell of the embryo.  Although fate maps ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

Induzione e Analisi dei epiteliale a Mesenchymal Transizione

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Test Samples for Optimizing STORM Super-Resolution Microscopy

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy techniques. However, as the image is acquired in a very different way than normal, by building up an image molecule-by-molecule, there are some significant challenges for users in trying to optimize their image acquisition. In order to aid this process and gain more insight into how STORM works we present the preparation of 3 test samples and the methodology of acquiring and processing STORM super-resolution images with typical resolutions of between 30-50 nm. By combining the test samples with the use of the freely available rainSTORM processing software it is possible to obtain a great deal of information about image quality and resolution. Using these metrics it is then possible to optimize the imaging procedure from the optics, to sample preparation, dye choice, buffer conditions, and image acquisition settings. We also show examples of some common problems that result in poor image quality, such as lateral drift, where the sample moves during image acquisition and density related problems resulting in the 'mislocalization' phenomenon.

We describe the preparation of three test samples and how they can be used to optimize and assess the performance of STORM microscopes. Using these examples we show how to acquire raw data and then process it to acquire super-resolution images in cells of approximately 30-50 nm resolution.

I campioni di prova per ottimizzare STORM Super-Resolution Microscopia

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy ...

Detection of Alternative Splicing During Epithelial-Mesenchymal Transition

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various physiological and pathological processes. Here we describe a strategy to detect alternative splicing during EMT using an inducible EMT model by expressing the transcription repressor Twist. EMT is monitored by changes in cell morphology, loss of E-cadherin localization at cell-cell junctions, and the switched expression of EMT markers, such as loss of epithelial markers E-cadherin and &#947;-catenin and gain of mesenchymal markers N-cadherin and vimentin. Using isoform-specific primer sets, the alternative splicing of interested mRNAs are analyzed by quantitative RT-PCR. The production of corresponding protein isoforms is validated by immunoblotting assays. The method of detecting splice isoforms described here is also suitable for the study of alternative splicing in other biological processes.

Alternative splicing regulation has been shown to contribute to the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program in various physiological and pathological processes. Here we describe a method utilizing an inducible EMT model for the detection of alternative splicing during EMT.

Rilevamento di splicing alternativo Durante epiteliale-mesenchimale transizione

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various ...

Intravenous Injections in Neonatal Mice

Intravenous injection is a clinically applicable manner to deliver therapeutics. For adult rodents and larger animals, intravenous injections are technically feasible and routine. However, some mouse models can have early onset of disease with a rapid progression that makes administration of potential therapies difficult. The temporal (or facial) vein is just anterior to the ear bud in mice and is clearly visible for the first two days after birth on either side of the head using a dissecting microscope. During this window, the temporal vein can be injected with volumes up to 50 &#956;l. The injection is safe and well tolerated by both the pups and the dams. A typical injection procedure is completed within 1-2 min, after which the pup is returned to the home cage. By the third postnatal day the vein is difficult to visualize and the injection procedure becomes technically unreliable. This technique has been used for delivery of adeno-associated virus (AAV) vectors, which in turn can provide almost body-wide, stable transgene expression for the life of the animal depending on the viral serotype chosen.

Animal models of pediatric disease can experience early onset and aggressive disease progression. Clinically relevant therapy delivery to young mouse models can be technically difficult. This protocol describes a non-invasive intravenous injection method for newborn mice within the first two postnatal days of life.