Questo lavoro è stato sostenuto da NIH NRSA 1F32CA14208701 (SXA) e le sovvenzioni NIH AR052785 e AR046786 (AEO e W.-MW).

1. Preparare 0 a 2 giorni topi appena nati vecchi per dissezione pelle <ol><li> Eutanasia cuccioli di topo con un CO 2 da camera per almeno 20 min. Lascia cuccioli sul ghiaccio fino a un&#39;ora fino dissezione. P0-P2 topi sono altamente raccomandati come cellule preparate da topi più anziani hanno ridotto la capacità di cellule progenitrici che si traduce in rendimenti inferiori ad innesto. Preparare un piatto di etanolo al 70% (per il passo 1.3) e tre piatti di soluzione di lavaggio (per la fase 3) quando è pronto per eseguire la dissezione la pelle. Scongelare Soluzione dispasi e lasciarlo a 4 ° C. Cervicale dislocate cuccioli dopo CO 2 sovraesposizione per garantire l&#39;eutanasia. </li><li> Mettere cuccioli eutanasia in una piastra di coltura su ghiaccio e trasferimento in una cappa a flusso sterile. </li><li> Lavare cuccioli con una breve immersione in etanolo al 70% e il luogo sul piatto di coltura sterile. </li></ol> 2. Staccare la pelle del mouse <ol><li> Tagliare ogni arto e coda, alla base del tronco con forbici sterili. </li><li> Afferrare il corpo saldamente tra una coppia di cupinze restano riservati e fa un incisione lungo la pelle dorsale dalla testa alla coda con un bisturi senza penetrare la fascia sottostante. </li><li> Attentamente staccare la pelle lontano dalla linea mediana del mouse. </li><li> Afferrare il mouse esposto saldamente con il lato lungo delle pinze curve e inserire un altro paio di pinze curve sotto la pelle all&#39;estremità posteriore del mouse e tirare delicatamente sulla pelle anche verso la metà ventrale del mouse. </li><li> Cura pelle a buccia completamente fuori il mouse con un movimento uniforme ed eliminare la carcassa. </li></ol> 3. Lavare la pelle e Incubare con la soluzione dispasi <ol><li> Posizionare la pelle nel primo piatto di soluzione di lavaggio con derma rivolto verso il basso. Stendere la pelle fuori e agitare con una pinza. Lascia la pelle nel primo piatto di soluzione di lavaggio, mentre la dissezione la pelle successivo. </li><li> Dopo aver posizionato la pelle successivo sezionato nel piatto prima soluzione di lavaggio, trasferire la pelle prima del secondo piatto di soluzione di lavaggio. Tenere pelli in the seconda soluzione di lavaggio fino a quando tutte le pelli sono raccolti. Trasferire tutte le pelli per il lavaggio finale, agitare brevemente. </li><li> Aggiungere 10 ml dispasi ghiacciata a una sterile da 10 centimetri piatto di cultura. Trasferire la pelle alla Soluzione dispasi e appiattire la pelle derma rivolto verso il basso. </li><li> Galleggiare pelle per 8-16 ore a 4 ° C (opzione alternativa: 1 ora a 37 ° C). </li></ol> 4. Derma separata Epidermide <ol><li> Trasferimento pelle per un nuovo piatto cultura sterile e appiattire la pelle derma rivolto verso il basso. Attentamente tenere premuto il derma da un angolo con un bisturi. </li><li> Afferrare l&#39;epidermide con una pinza e lentamente staccarsi dal derma. Dell&#39;epidermide deve staccarsi come un unico pezzo. L&#39;epidermide sarà bianca e finissima e il derma deve essere marrone, più spessa e gelatinosa. </li><li> Separare i due tessuti in tre diverse capsule di coltura sterili. <ol class="lalpha"><li> Per effettuare una dermico specifico gene knockdown / iperespressione innesto, prendere derma e tritare in pezzi molto piccoli con two bisturi. Eliminare epidermide. Il giorno di infezione (passo 7), sezionare un altro insieme di pelli di topo per preparare freschi, cellule non trattate epidermiche di combinare con le cellule dermiche lentivirale-infetti. </li><li> Per effettuare una epidermica specifico gene knockdown / iperespressione innesto, tagliare ogni epidermide in 6 - 8 pezzi più piccoli. Eliminare derma. Il giorno di infezione (passo 7), sezionare un altro insieme di pelli di topo per preparare freschi, cellule non trattate dermiche di combinare con cellule epidermiche lentivirale-infetti. </li></ol></li></ol> 5. Separa celle principale del mouse cutanee (MDC) dal tessuto macinate <ol><li> Dissociare MDCS incubando pezzi dermici con una soluzione di collagenasi appena fatta a 37 ° C per 1 ora. Utilizzare 10 ml di soluzione di collagenasi per topo cucciolo. </li><li> Mescolare delicatamente derma soluzione contenente ogni 10 min. Controllare il grado di dissociazione sotto un microscopio, la sospensione cellulare digerito deve essere principalmente cellule singole. La soluzione dovrebbe cambiare da chiaro a nuvoloso comecellule dermiche sono dissociate dal derma. </li><li> Aggiungere alla soluzione di collagenasi FBS contenente derma ad un volume finale di 10% per ridurre l&#39;attività della collagenasi. </li><li> Passare la sospensione cellulare attraverso un colino 70 micron cella in un nuovo tubo da 50 ml per la rimozione di grandi grumi non digeriti e follicoli interi. Aggiungere 10 ml di DMEM/10% FBS a 30 ml del flusso passante per diluire ulteriormente la collagenasi. </li><li> Provette contenenti derma digerito a 30 xg in una centrifuga da tavolo per 5 minuti per rimuovere ulteriormente follicoli interi. </li><li> Cura trasferire il supernatante in una nuova tubo da 50 ml. Pellet di cellule per centrifugazione a 200 xg in una centrifuga da tavolo per 5 min. </li><li> Risospendere le cellule con DMEM/10% FBS (1 ml per pup) e contare le cellule. Celle a piastre con Amniomax C-100 supporti per l&#39;infezione (punto 7), o da abbinare a lentivirus con infezione da KC per l&#39;innesto (punto 9). Rendimento tipico è di 20 x 10 6 cellule per cucciolo. </li></ol> 6. Dissociate cheratinociti primarias (KC) dal tessuto macinate <ol><li> Dissociare KC incubando pezzi epidermici con appena scongelati 0,05% tripsina-EDTA a 37 ° C per 15 min. Uso 7 ml di Tripsina-EDTA per topo cucciolo. </li><li> Delicatamente soluzione turbinio contenente epidermide ogni 5 min. </li><li> Aggiungere uguale volume di soluzione neutralizzante per Tripsina-EDTA contenente epidermide per ridurre l&#39;attività della tripsina. </li><li> Pellet di cellule per centrifugazione a 200 xg in una centrifuga da tavolo per 5 min. Rimanente tessuto non digerito deve galleggiare sulla parte superiore. </li><li> Versare con cautela fuori la maggior parte del surnatante con il tessuto non digerito. Rimuovere il surnatante rimanente con una pipetta 10 ml senza pellet inquietante. Risospendere il pellet di cellule con PBS. In KCs caso non sono completamente pellettizzati, travasare la maggior parte del surnatante e ripetere la centrifugazione fino maggior parte delle cellule sono in pellet. </li><li> Strain sospensione cellulare a 70 micron filtro cella in un nuovo tubo per rimuovere il tessuto rimanente o grumi. </li><li> Cellule pellet di centrifugazionea 200 xg in una centrifuga da tavolo per 5 min. </li><li> Risospendere le cellule in CnT-07 mezzi o PBS (1 ml per pup) e le cellule di conteggio. Utilizzare CNT-07 per le celle galvaniche per l&#39;infezione (punto 7), utilizzare PBS da abbinare a lentivirus-infetti MDCS per l&#39;innesto (punto 9). Rendimento tipico è di 3-10 x 10 6 cellule per cucciolo. </li></ol> 7. Infettare le cellule primarie con Lentivirus contenenti shRNA o cDNA Il giorno di infezione sezionare un altro set di pelli del mouse per preparare freschi, non trattati KC primarie o MDCS di combinare con cellule infettate da virus del giorno di innesto (punto 9). <ol><li><ol class="lalpha"><li> Per MDCS, piastra 4 x 10 6 MDCS per 10 cm di piastra con AmnioMAX-C100 media e incubare a 37 ° C + 5% di CO 2 per l&#39;infezione del giorno dopo alla densità cellulare del 50%. Piastre di solito 3-4 MDCS sono utilizzati per generare un innesto, e un totale di 10-12 piastre sono necessarie per generare tre innesti in un esperimento. In alternativa, lascia MDCS collegare e diffondere fo un minimo di 2 ore a 37 ° C + 5% di CO 2 ed eseguire infezione stesso giorno della placcatura cella. MDCS avrà fibroblasto-come morfologia. </li><li> Per KC, piastra 12 x 10 6 KC per 10 cm di piastra con CNT-07 media e incubare a 37 ° C + 5% di CO 2 per il giorno dopo l&#39;infezione. In alternativa, lasciate KC collegare e diffondere per un minimo di 2 ore a 37 ° C + 5% di CO 2 ed eseguire infezione nello stesso giorno. Piastre solitamente 3-4 di KC sono utilizzati per generare un innesto. Un totale di 10-12 piastre sono necessarie per generare tre innesti per un esperimento. KC avrà morfologia ciottoli. </li></ol></li><li> Preincubare cellule per 5-10 min con 8 mg / ml Polybrene soluzione a 37 ° C + 5% di CO 2. </li><li> Borsa media e aggiungere lentivirus + 8 mg / ml Soluzione Polybrene. Titolo lentivirale varierà a seconda del costrutto usato e deve essere determinato prima dell&#39;infezione. </li><li> Centrifugare le piastre a 200 xg in una centrifuga da tavolo per 1 ora a 32 °, C per infettare le cellule con lentivirus. </li><li> Rimuovere lentivirus contenenti media e aggiungere mezzi freschi. Per KC, lavare le cellule una volta con PBS prima di aggiungere indietro mezzi freschi. Cellule infettate solito recuperare notte a 37 ° C + 5% di CO 2. In alternativa, consentire almeno due ore di recupero a 37 ° C + 5% CO 2 prima trypsinizing le cellule per innesti. Continuano a cultura una piccola porzione di cellule infette per controllare l&#39;efficienza dell&#39;infezione come descritto nella sezione rappresentativa Risultati. </li></ol> 8. Preparare cellule infette per l&#39;innesto <ol><li> Isolare freschi MDCS primari o KCS da pelle con passi 4-6. Risospendere le cellule in ghiaccio freddo PBS sterile. Contare le cellule. </li><li><ol class="lalpha"><li> Per dermico specifico gene knockdown / iperespressione graft, dissociare MDCS infetti da lastre con 0,05% tripsina-EDTA a 37 ° C per 8 min. </li><li> Per epidermica specifico gene knockdown / iperespressione del trapianto, si dissociano KC infetti da piastre USIng 0,125% tripsina-EDTA a 37 ° C per 15 min. </li></ol></li><li> Neutralizzare attività tripsina con FBS DMEM + 10% (MDC) o una soluzione neutralizzante (KC). Trasferire le cellule tripsinizzate una provetta da 50 ml. </li><li> Pellet di cellule per centrifugazione a 200 xg in una centrifuga da tavolo per 5 min. </li><li> Risospendere le cellule in ghiaccio freddo PBS sterile. Contare le cellule. </li><li> Combinare le cellule infettate dal virus, con il tipo di cellule non trattate appena preparata controparte. Per un innesto, combinare 7-10 x 10 6 MDCS con 7-10 x 10 6 KCs in PBS sterile ghiacciata e il pellet cellulare slurry in una centrifuga da tavolo a 4 ° C. Risospendere le cellule in 50 microlitri ghiacciata -100 PBS sterile. Mantenere le cellule in ghiaccio fino al nu / nu camere del mouse sono pronti. </li></ol> 9. Creare letto della ferita e della Camera Fix su &#39;Indietro&#39; del nu / nu mouse Un giorno prima dell&#39;innesto, sterilizzare strumenti chirurgici con le camere di silicio autoclave e sterile da immersione in etanolo al 70%. Sostituire il etano 70%nol con PBS sterile prima di utilizzare le camere. <ol><li> Anesthetize nu / nu topo (7-12 settimane di età femmine) con ketamina (8 mg / ml) / xilazina (1,6 mg / ml) mediante iniezione intraperitoneale (100 μl/10 g di peso corporeo) o altro metodo preferito. Applicare lubrificante occhio. Luogo piastra elettrica sotto il mouse. </li><li> Disinfettare nuda pelle di nuovo mouse con iodio e pulire con salviettine imbevute di alcool. </li><li> Aggiungere 1-3 gocce di 0,25% Bupivicaine al sito di incisione per via topica. Stringere la nuda pelle indietro del mouse alla base del collo con una pinza. </li><li> Tagliare un piccolo foro circolare (~ 1 cm di diametro) in pelle sollevata con le forbici sterili. </li><li> Posizionare camera sterile sul letto della ferita e coprire i bordi da camera con cute circostante. </li><li> Camera di sicuro in posizione con suture lungo spigoli camera (6 punti per camera) come mostrato nella Figura 2A. </li><li> Quando le camere sono pronte, delicatamente cellule liquami turbinio e redige in 23 ago attaccato ad una siringa da 1 ml. Se slurry cella è condensata in basso, delicatamenterisospendere con 1 ml di punta della pipetta prima di disegnare nell&#39;ago. </li><li> Camera di puntura con l&#39;ago e lentamente gocciolare cellule su ferita. </li><li> Luogo topi in gabbie pulite, autoclave. Casa 2 topi per gabbia e aggiungere antibiotici e Tylenol (3 mg / ml) per le acque potabili. Nella nostra esperienza, due topi femmina per gabbia non hanno portato a un trauma negativo alla camera, innesto, o animali. </li><li> Mettere pad riscaldamento meno della metà della gabbia e osservare topi fino anestesia svanisce. </li></ol> 10. Rimuovere Camera dopo 7-9 giorni <ol><li> Anestetizzare chambered nu / nu topo come al punto 9.1. Applicare lubrificante occhio. </li><li> Disinfettare la pelle intorno a camera con iodio e pulire con salviettine imbevute di alcool. </li><li> Tagliare con cautela punti e rimuovere dalla camera. </li><li> Rimuovere delicatamente da camera del mouse. Se i nuovi bastoni trapianto cutaneo alla camera, sollevare una parte della camera e innesto delicatamente separato dalla camera con l&#39;pinze. Tenere premuto innesto durante la rimozione della camera. Graft dovrebbe look noioso e opaco come nella figura 2B. </li><li> Applicare un non aderente pad con un sottile strato di antibiotici sulla ferita aperta e sutura in posizione (2 punti). </li><li> Avvolgere benda intorno mouse per fissare il pad e proteggere la ferita. Suturare fasciatura in posizione. </li><li> Le camere vengono pulite di silicio con il lavaggio con sapone neutro e risciacquate con acqua deionizzata. Mettere a bagno le camere in etanolo 70% durante la notte, aria secca, e conservare. </li></ol> 11. Esaminare il mouse per la crescita dei capelli <ol><li> Rimuovere bende e pad dopo 3 giorni di camera di rimozione. Innesto deve essere asciutto e opaco a marrone. </li><li> Controllare periodicamente i topi per la crescita dei capelli. Capelli dovrebbe iniziare a mostrare a 16 giorni dopo l&#39;innesto. </li></ol> Procedura Outline 1 ° giorno (2-3 ore): Sacrificio cuccioli appena nati, togliere la pelle, e lasciare in posa dispasi a 4 ° C per una notte. 2 ° giorno (2-3 ore): Isolare cellule primarie da pelle epiastra a densità raccomandata. 3 ° giorno (3-4 ore): infettare le cellule con lentivirus. Togliere la pelle di un altro gruppo di cuccioli appena nati e lasciare in posa dispasi a 4 ° C per una notte. 4 ° giorno (6-8 ore): Isolare cellule primarie di pelle, contare, e lasciare sul ghiaccio. Recuperare lentivirus cellule infettate da tripsinizzazione e centrifugazione, contare, e combinare 7-10 x 10 6 cellule del derma e cheratinociti in 50-100 ml di PBS per trapianto. Crea letto della ferita al passaggio del mouse, collegare da camera, e si applicano miscela cellulare al letto della ferita. Procedura alternativa Contorni Contorni procedura alternativa si riduce la procedura da quattro giorni a tre. <ol><li> Combinare giorni 1 e 2 trattando pelli topo in dispasi a 37 ° C per un&#39;ora (hr tempo stimato 5-7). </li><li> Combina il Day 2 e Day 3 infettando le cellule con lentivirus dopo che le cellule placcatura per due ore (h tempo stimato 5-7). </li></ol>

<ol>
	<li>Bershteyn, M., Atwood, S. X., Woo, W. M., Li, M., Oro, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MIM+and+cortactin+antagonism+regulates+ciliogenesis+and+hedgehog+signaling.">MIM and cortactin antagonism regulates ciliogenesis and hedgehog signaling.</a> Dev Cell. 19, 270-283 (2010).</li><li>Driskell, R. R., Juneja, V. R., Connelly, J. T., Kretzschmar, K., Tan, D. W., Watt, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+growth+of+dermal+papilla+cells+in+hydrogels+reveals+intrinsic+differences+between+Sox2-positive+and+-negative+cells+in+vitro+and+in+vivo.">Clonal growth of dermal papilla cells in hydrogels reveals intrinsic differences between Sox2-positive and -negative cells in vitro and in vivo.</a> J. Invest. Dermatol. 132, 1084-1093 (2012).</li><li>Lee, L. F., Jiang, T. X., Garner, W., Chuong, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+procedure+to+reconstitute+hair-producing+skin.">A simplified procedure to reconstitute hair-producing skin.</a> Tissue Eng. Part C Methods. 17, 391-400 (2011).</li><li>Liang, Y., Silva, K. A., Kennedy, V., Sundberg, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparisons+of+mouse+models+for+hair+follicle+reconstitution.">Comparisons of mouse models for hair follicle reconstitution.</a> Exp. Dermatol. 20, 1011-1015 (2011).</li><li>Lichti, U., Anders, J., Yuspa, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+short-term+culture+of+primary+keratinocytes,+hair+follicle+populations+and+dermal+cells+from+newborn+mice+and+keratinocytes+from+adult+mice+for+in+vitro+analysis+and+for+grafting+to+immunodeficient+mice.">Isolation and short-term culture of primary keratinocytes, hair follicle populations and dermal cells from newborn mice and keratinocytes from adult mice for in vitro analysis and for grafting to immunodeficient mice.</a> Nat. Protoc. 3, 799-810 (2008).</li><li>Lichti, U., Weinberg, W. C., Goodman, L., Ledbetter, S., Dooley, T., Morgan, D., Yuspa, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+regulation+of+murine+hair+growth:+insights+from+grafting+defined+cell+populations+onto+nude+mice.">In vivo regulation of murine hair growth: insights from grafting defined cell populations onto nude mice.</a> J. Invest. Dermatol. 101, 124S-129S (1993).</li><li>Lutolf, M. P., Gilbert, P. M., Blau, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+materials+to+direct+stem-cell+fate.">Designing materials to direct stem-cell fate.</a> Nature. 462, 433-441 (2009).</li><li>Osada, A., Iwabuchi, T., Kishimoto, J., Hamazaki, T. S., Okochi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+culture+of+mouse+vibrissal+dermal+papilla+cells+and+de+novo+hair+follicle+induction.">Long-term culture of mouse vibrissal dermal papilla cells and de novo hair follicle induction.</a> Tissue Eng. 13, 975-982 (2007).</li><li>Rendl, M., Polak, L., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP+signaling+in+dermal+papilla+cells+is+required+for+their+hair+follicle-inductive+properties.">BMP signaling in dermal papilla cells is required for their hair follicle-inductive properties.</a> Genes Dev. 22, 543-557 (2008).</li><li>Ventura, A., Meissner, A., Dillon, C. P., McManus, M., Sharp, P. A., Van Parijs, L., Jaenisch, R., Jacks, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cre-lox-regulated+conditional+RNA+interference+from+transgenes.">Cre-lox-regulated conditional RNA interference from transgenes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 10380-10385 (2004).</li><li>Weinberg, W. C., Goodman, L. V., George, C., Morgan, D. L., Ledbetter, S., Yuspa, S. H., Lichti, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+hair+follicle+development+in+vivo:+determination+of+follicle+formation,+hair+growth,+and+hair+quality+by+dermal+cells.">Reconstitution of hair follicle development in vivo: determination of follicle formation, hair growth, and hair quality by dermal cells.</a> J. Invest. Dermatol. 100, 229-236 (1993).</li><li>Woo, W. -. M., Zhen, H. H., Oro, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shh+maintains+dermal+papilla+identity+and+hair+morphogenesis+via+a+Noggin-Shh+regulatory+loop.">Shh maintains dermal papilla identity and hair morphogenesis via a Noggin-Shh regulatory loop.</a> Genes Dev. 26, 1235-1246 (2012).</li><li>Young, T. H., Lee, C. Y., Chiu, H. C., Hsu, C. J., Lin, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembly+of+dermal+papilla+cells+into+inductive+spheroidal+microtissues+on+poly(ethylene-co-vinyl+alcohol)+membranes+for+hair+follicle+regeneration.">Self-assembly of dermal papilla cells into inductive spheroidal microtissues on poly(ethylene-co-vinyl alcohol) membranes for hair follicle regeneration.</a> Biomaterials. 29, 3521-3530 (2008).</li><li>Zheng, Y., Du, X., Wang, W., Boucher, M., Parimoo, S., Stenn, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organogenesis+from+dissociated+cells:+generation+of+mature+cycling+hair+follicles+from+skin-derived+cells.">Organogenesis from dissociated cells: generation of mature cycling hair follicles from skin-derived cells.</a> J. Invest. Dermatol. 124, 867-876 (2005).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Saggi di ricostituzione dei capelli fornire un unico modello di rigenerazione degli organi per l&#39;esame il meccanismo di formazione de novo follicolo pilifero. Qui, descriviamo una versione modificata del test di capelli camera utile per determinare la funzione dei geni nella formazione del follicolo pilifero. La nostra analisi si basa sul dosaggio riportato ricostituzione capelli camera 5, 6,11, che abbiamo modificato per introdurre una tecnica per ottenere un&#39;espressione lentivirale sovraespressione del gene knockdown o in entrambi i tipi di cellule dermiche o epidermica. Il nostro saggio fornisce una rapida alternativa a generare tessuto-specifica knockout genetico. Questa analisi ci permette di dimostrare la funzione dei geni nella formazione del follicolo dei capelli in meno di tre settimane dalla infettare le cellule primarie con lentivirus alla raccolta innesto. La nostra analisi può essere estesa ad affrontare interazioni genetiche usando combinazione shRNA / consegna cDNA da lentivirus in un tipo cellulare 12, nonché permette di esaminare segnalazione tra il tip cellula epidermica e dermicaes. La nostra analisi dei capelli è più adatto per la rilevazione di forti fenotipi-guadagno o la perdita di funzione nella rigenerazione del follicolo, mentre i difetti sottili sono più difficili da osservare. Abbiamo dimostrato con successo per via cutanea specifica funzione genica di alcuni geni che utilizzano il nostro saggio rigenerazione dei capelli 1,12. Basato sul marcatore GFP co-espressa dal vettore lentivirus esprimere shRNA 10, abbiamo dimostrato che la esprimono shRNA cellule donatrici dermiche persistito negli innesti capelli rigenerati. GFP-positive cellule erano presenti nella papilla dermica (DP) dei follicoli piliferi rigenerate (Figura 3). Le cellule DP probabilmente costituito da diversi livelli di knockdown gene come cellule espresso diversi livelli di GFP, quindi il fenotipo osservato follicolo pilifero è una gamma di genetica hypomorph a null. Un miglioramento di questo saggio sarà quello di stabilire una selezione veloce ed efficiente per le cellule che esprimono alti shRNA prima Grafting come usando FACS per purificare forti GFP-esprimenti cellule. Un&#39;alternativa è quella di sostituire le cellule knockout mutante o condizionato in questo dosaggio 9. D&#39;altra parte, un sistema di coltura che può preservare la funzione delle cellule DP è molto utile come potenza DP è gradualmente persa una volta che le cellule dermiche primarie sono diversi passaggi. Sistemi di coltura potenziali includono l&#39;uso di biomateriali derivati ​​da colture di nicchia artificiale o di aggregazione 2,7,8,13. Un altro miglioramento sarà generare un affidabile epidermica metodo di congelamento delle cellule con un alto tasso di recupero delle cellule, che riducono l&#39;uso della seconda serie di cuccioli di topo (passo 7) per generare cheratinociti freschi in dermico specifico perdita o guadagno di funzione studi. Questo saggio camera capelli follicolo produce densità dei capelli e di qualità simile alla pelle normale mouse, anche se la crescita dei capelli è un po &#39;meno sincronizzato e l&#39;orientamento follicolo è più casuale. A poche limitazioni del saggio rigenerazione dei capelli genetica come il requisito della grande quantità di lentivirus e numero di cellule, ed è molto laboriosa in termini di metodi chirurgici rispetto ad altre forme di saggi capelli ricostituzione come il cerotto e saggi patta 3,4,14. Tuttavia, la qualità dei follicoli piliferi e calendario per rilevare la crescita dei capelli è superiore ad altri test 4. Il nostro obiettivo saggio rigenerazione dei capelli fornisce un compagno veloce e conveniente esistenti modelli genetici.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome </td><td> Azienda </td><td> Catalogare # </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Invitrogen </td><td> 14190-144 </td><td></td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Invitrogen </td><td> 14170-122 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11995-065 </td><td></td></tr><tr><td> 0,25% tripsina-EDTA </td><td> Invitrogen </td><td> 25200-056 </td><td></td></tr><tr><td> Cnt-07 </td><td> Cella N Tec </td><td> CnT-07 </td><td></td></tr><tr><td> AminoMAX-C100 </td><td> Invitrogen </td><td> 17001-074 </td><td></td></tr><tr><td> AminoMAX-C100 Supplemento </td><td> Invitrogen </td><td> 12556-015 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Invitrogen </td><td> 26140-079 </td><td></td></tr><tr><td> Penicillina / streptomicina </td><td> Invitrogen </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> Fungizone </td><td> Invitrogen </td><td> 15290-018 </td><td></td></tr><tr><td> Gentamicina </td><td> Invitrogen </td><td> 15710-064 </td><td></td></tr><tr><td> Dispasi </td><td> Roche </td><td> 4942078001 </td><td></td></tr><tr><td> Collagenasi, tipo 1 </td><td> Sigma </td><td> C-0130 </td><td></td></tr><tr><td> Polibrene </td><td> Sigma </td><td> 107689-10G </td><td></td></tr><tr><td> Tissue cultura piatto </td><td> Fisher Scientific </td><td> 08-772E </td><td></td></tr><tr><td> Forbici per dissezione </td><td> Fisher Scientific </td><td> 11-999 </td><td></td></tr><tr><td> Forcipe </td><td> Fisher Scientific </td><td> 10-275 </td><td> curvo </td></tr><tr><td> Scalpal </td><td> Medex alimentazione </td><td> GRF-2975 # 10 </td><td> Dimensione n. 10 </td></tr><tr><td> 70 pm coloratore cella </td><td> VWR </td><td> 21008-952 </td><td></td></tr><tr><td> 15 ml tubo da centrifuga conica </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-959-49D </td><td></td></tr><tr><td> Tamponi imbevuti di alcool </td><td> Fisher Scientific </td><td> 1368063 </td><td></td></tr><tr><td> 23 gauge </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-821-13F </td><td></td></tr><tr><td> Eye lubrificante </td><td> CVS </td><td> 8883660 </td><td></td></tr><tr><td> Providone-Lodine tamponi </td><td> Fisher Scientific </td><td> NC0116841 </td><td></td></tr><tr><td> Silicon Chambers </td><td> Renner GmbH </td><td> F2U, 30268 </td><td></td></tr><tr><td> Suture </td><td> Acuderm </td><td> SUP3524 </td><td></td></tr><tr><td> Fasciatura flessibile </td><td> Fisher Scientific </td><html><td> 22-363-100 </td><td></td></tr><tr><td> Medicazione non aderente </td><td> Telfa </td><td> 1050 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Materiale </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Soluzione di lavaggio PBS 500 pg / ml di penicillina / streptomicina 12,5 ug / ml Fungizone 100 pg / ml di gentamicina Dispasi soluzione HBSS 2,5 mg / ml finale dispasi 100 pg / ml di gentamicina Supporti neutralizzanti HBSS 15% (v / v) FBS Collagenasi soluzione 0,25% (w / v) Collagenase, Tipo 1 ONTENUTO &quot;&gt; 100 pg / ml di penicillina / streptomicina 2,5 mcg / ml Fungizone 50 ug / ml di gentamicina Polibrene soluzione HBSS 8 mg / mL (w / v) Polybrene </td></tr></tbody></table>

rapid genetic analysis of epithelial-mesenchymal signaling during hair regeneration

Morfogenesi follicolo dei capelli, un processo complesso che richiede l&#39;interazione tra epiteli derivati ​​cheratinociti e il mesenchima sottostante, è un sistema interessante modello per studiare lo sviluppo di organi e tessuto-specifica segnalazione. Anche se lo sviluppo del follicolo dei capelli è geneticamente trattabile, l&#39;analisi rapida e riproducibile di fattori essenziali per questo processo rimane una sfida. Qui si descrive una procedura per generare sovraespressione mirati o shRNA-mediata knockdown di fattori usando lentivirus in un tessuto-specifica. Utilizzando una versione modificata di un modello di rigenerazione dei capelli 5, 6, 11, possiamo ottenere robusta guadagno o perdita di funzione di analisi in cheratinociti primari di topo o cellule dermiche di facilitare lo studio delle vie di segnalazione epiteliali mesenchimali che portano alla morfogenesi follicolo pilifero . Si descrive come isolare nuovi cheratinociti primari di topo e cellule cutanee, che contengono cellule della papilla dermica e dei loro precursori, consegnare lentivirus conteNing sia shRNA cDNA o ad una delle popolazioni cellulari, e combinare le cellule per generare follicoli piliferi completamente formate sul dorso dei topi nudi. Questo approccio permette l&#39;analisi del tessuto-specifici fattori necessari per generare follicoli dei capelli entro tre settimane e fornisce un compagno veloce e conveniente alle esistenti modelli genetici.

Nella figura 1 si mostra il risultato di dermo-specifica knockdown shRNA particelle lentivirali di levigato (Smo), un componente critico Shh di segnalazione, in un innesto di 3 settimana fa i capelli rigenerativa. Innesti di controllo che utilizzano vettori lentivirali da solo mostra una forte crescita dei capelli (Figura 1A). Per contro, dermo-specifica knockdown dei risultati SMO nella perdita della crescita (figura 1B). Ematossilina ed eosina raffigura la fase di follicoli piliferi di controllo e le condizioni sperimentali (Figura 1C, D). Il fenotipo crescita dei capelli da trattamenti simili può essere variabile tra esperimenti, tra cui il controllo positivo con l&#39;infezione da vettori lentivirali da solo. Innesti di controllo positivi pertanto devono sempre essere inclusi in ogni esperimento come riferimento il 30% di innesti può fallire a causa di cicatrici o fissaggio di innesti incompleta. In caso di verifica un&#39;interazione tra due fattori come overexpressing cDNA di un fattore di riSCUE shRNA-mediata knockdown di un altro fattore, si dovrebbe sempre includere innesti atterramento solo per manifestare la perdita-di-funzione di risultato in ogni esperimento. Ciò fornirà la copertura necessaria per determinare come un particolare gene perturba il follicolo dei capelli percorso di rigenerazione e di come due geni interagiscono. La rimozione della camera (Figura 2A) deve essere fatto con cura. L&#39;innesto di nuova formazione dovrebbe essere leggermente opaco con una superficie opaca (Figura 2B). L&#39;innesto può aderire alla camera, così sollevando delicatamente un lato è importante assicurarsi che l&#39;innesto rimane attaccata al letto della ferita. L&#39;innesto è abbastanza stabile dopo tre giorni e dovrebbe presentare poche difficoltà quando si rimuove la medicazione. La crescita dei capelli robusta deve osservare dopo tre settimane (Figura 2C). Omettendo sia MDCS o KCS si tradurrà in un sito di ferita recuperato senza capelli (Figura 2D) 11. Cellule morte o perdita di cellule in uno deitipi cellulari comporta anche senza capelli, in contrasto con la rigenerazione dei capelli ridotta in dermo-Smo knockdown come mostrato in figura 1B. Per assicurare un dosaggio efficace, è fondamentale per ottenere maggiore del 90% infezione virale delle cellule con sovraespressione appropriato o efficienza knockdown prima dell&#39;innesto. A causa dei limiti di tempo della procedura di innesto, si consiglia di problemi di efficienza di scatto infezioni virali prima di iniziare un esperimento di innesto, e salvare sempre una piccola porzione di cellule il giorno di un innesto procedura per verificare la perdita o il guadagno-di-espressione. Titolo lentivirale varierà a seconda del costrutto usato e deve essere determinato prima dell&#39;infezione a raggiungere 90-100% di efficienza. Monitoriamo efficienza infezione virale con GFP coexpressed dal vettori lentivirali. Abbiamo routine effettuare PCR quantitativa e / o Western blot per determinare l&#39;entità del knockdown o sovraespressione. Utilizzando dual-vettori di espressione con tag fluorescenti di etichettarecellule infettate da virus fornisce un modo per segnalare perdurance di segnale e il numero di cellule che esprimono costrutti in nostri innesti maturi. Usiamo GFP guidata da un promotore CMV dal vettore lentivirale pSicoR-CMV-GFP 10 in combinazione con Smo shRNA. In figura 3, si mostra a 3 settimana fa dermo-specifico innesto in cui GFP è lentivirally-espresso in papilla dermica di un follicolo pilifero rappresentante. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4344/4344fig1.jpg" /> Figura 1. L&#39;analisi istologica di crescita dei capelli follicolo. (A) Veduta di rigenerazione dei capelli trapianto di controllo con cellule del derma infettate con vettori lentivirali vuoto e cheratinociti non trattati. (B) atterramento Smoothened con shRNA particelle lentivirali in cellule del derma in combinazione con cheratinociti non trattati risultati in perdita di follicoli piliferi. (C) e la colorazione ematossilina eosina mostra f capelli anagenollicles in innesti di controllo si estendono verso il basso nel derma e (D) levigato follicoli piliferi atterramento rimangono stentata e in gran parte assente. Tutte le immagini sono tre settimane dopo l&#39;innesto. Bar Scala denota 100 micron. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4344/4344fig2.jpg" /> Figura 2. Innesto cellule primarie. (A) nu / nu mouse con suturate camera di alloggiamento pile derma e cheratinociti. (B) la rimozione della camera espone neonata pelle che è noioso e opaco nel carattere. (C) peli completamente coltivati ​​a innesto con wild- tipo primario cellule del derma e cheratinociti a tre settimane dopo l&#39;innesto. (D) aggiunta di primarie cellule del derma senza cheratinociti porta a senza capelli dopo tre settimane. Risultati simili sono visti con aggiunta di cheratinociti primari senza cellule dermiche. Figura 3. Manutenzione di espressione GFP in papilla dermica. Immagini confocali di papilla dermica da un 3 settimane innesto vecchio rigenerato. GFP è stato espresso nella popolazione cellulare dermica da un vettore lentivirale e rilevato nella papilla dermica (verde). Versicano (rosso) delimita la papilla dermica e nuclei erano etichetta con Hoechst (blu). GFP nota è espressa specificamente in cellule dermiche, ma non nei cheratinociti circostanti. Bar Scala denota 20 pm.

Watch this Scientific Journal Video about Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration at JoVE.com

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Tessuto-specifica analisi di un modello di rigenerazione del follicolo usando lentivirus mediare guadagno o perdita di funzione.

Rapida analisi genetica di epitelio-mesenchimale segnalazione durante la rigenerazione dei capelli

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

rapid-genetic-analysis-epithelial-mesenchymal-signaling-during-hair

Research

JoVE Journal

Biology

13.6K Views.  Stanford University School of Medicine. Tessuto-specifica analisi di un modello di rigenerazione del follicolo usando lentivirus mediare guadagno o perdita di funzione.

Video: Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Dissection of Hippocampal Dentate Gyrus from Adult Mouse

The hippocampus is one of the most widely studied areas in the brain because of its important functional role in memory processing and learning, its remarkable neuronal cell plasticity, and its involvement in epilepsy, neurodegenerative diseases, and psychiatric disorders. The hippocampus is composed of distinct regions; the dentate gyrus, which comprises mainly granule neurons, and Ammon's horn, which comprises mainly pyramidal neurons, and the two regions are connected by both anatomic and functional circuits. Many different mRNAs and proteins are selectively expressed in the dentate gyrus, and the dentate gyrus is a site of adult neurogenesis; that is, new neurons are continually generated in the adult dentate gyrus. To investigate mRNA and protein expression specific to the dentate gyrus, laser capture microdissection is often used. This method has some limitations, however, such as the need for special apparatuses and complicated handling procedures. In this video-recorded protocol, we demonstrate a dissection technique for removing the dentate gyrus from adult mouse under a stereomicroscope. Dentate gyrus samples prepared using this technique are suitable for any assay, including transcriptomic, proteomic, and cell biology analyses. We confirmed that the dissected tissue is dentate gyrus by conducting real-time PCR of dentate gyrus-specific genes, tryptophan 2,3-dioxygenase (TDO2) and desmoplakin (Dsp), and Ammon's horn enriched genes, Meis-related gene 1b (Mrg1b) and TYRO3 protein tyrosine kinase 3 (Tyro3). The mRNA expressions of TDO2 and Dsp in the dentate gyrus samples were detected at obviously higher levels, whereas Mrg1b and Tyro3 were lower levels, than those in the Ammon's horn samples. To demonstrate the advantage of this method, we performed DNA microarray analysis using samples of whole hippocampus and dentate gyrus. The mRNA expression of TDO2 and Dsp, which are expressed selectively in the dentate gyrus, in the whole hippocampus of alpha-CaMKII+/- mice, exhibited 0.037 and 0.10-fold changes compared to that of wild-type mice, respectively. In the isolated dentate gyrus, however, these expressions exhibited 0.011 and 0.021-fold changes compared to that of wild-type mice, demonstrating that gene expression changes in dentate gyrus can be detected with greater sensitivity. Taken together, this convenient and accurate dissection technique can be reliably used for studies focused on the dentate gyrus.

A dissection technique for removal of the dentate gyrus from adult mouse under a stereomicroscope was demonstrated in this video-recorded protocol.

Dissezione di giro dentato ippocampale di topo adulto

The hippocampus is one of the most widely studied areas in the brain because of its important functional role in memory processing and learning, its ...

Ricerca

Biologia

A Reverse Genetic Approach to Test Functional Redundancy During Embryogenesis

Gene function during embryogenesis is typically defined by loss-of-function experiments, for example by targeted mutagenesis (knockout) in the mouse. In the zebrafish model, effective reverse genetic techniques have been developed using microinjection of gene-specific antisense morpholinos. Morpholinos target an mRNA through specific base-pairing and block gene function transiently by inhibiting translation or splicing for several days during embryogenesis (knockdown). However, in vertebrates such as mouse or zebrafish, some gene functions can be obscured by these approaches due to the presence of another gene that compensates for the loss. This is especially true for gene families containing sister genes that are co-expressed in the same developing tissues. In zebrafish, functional compensation can be tested in a relatively high-throughput manner, by co-injection of morpholinos that target knockdown of both genes simultaneously. Likewise, using morpholinos, a genetic interaction between any two genes can be demonstrated by knockdown of both genes together at sub-threshold levels. For example, morpholinos can be titrated such that neither individual knockdown generates a phenotype. If, under these conditions, co-injection of both morpholinos causes a phenotype, a genetic interaction is shown. Here we demonstrate how to show functional redundancy in the context of two related GATA transcription factors. GATA factors are essential for specification of cardiac progenitors, but this is revealed only by the loss of both Gata5 and Gata6. We show how to carry out microinjection experiments, validate the morpholinos, and evaluate the compensated phenotype for cardiogenesis.

Gene function can be obscured in loss-of-function experiments if there is compensation by another gene. The zebrafish model provides a relatively high-throughput means to reveal such functional redundancy in living embryos.

Un approccio inverso di test genetici per ridondanza funzionale durante l&#39;embriogenesi

Gene function during embryogenesis is typically defined by loss-of-function experiments, for example by targeted mutagenesis (knockout) in the mouse. In ...

Adenovirus-mediated Genetic Removal of Signaling Molecules in Cultured Primary Mouse Embryonic Fibroblasts

The ability to genetically remove specific components of various cell signalling cascades has been an integral tool in modern signal transduction analysis. One particular method to achieve this conditional deletion is via the use of the Cre-loxP system. This method involves flanking the gene of interest with loxP sites, which are specific recognition sequences for the Cre recombinase protein. Exposure of the so-called floxed (flanked by loxP site) DNA to this enzyme results in a Cre-mediated recombination event at the loxP sites, and subsequent excision of the intervening gene3. Several different methods exist to administer Cre recombinase to the site of interest. In this video, we demonstrate the use of an adenovirus containing the Cre recombinase gene to infect primary mouse embryonic fibroblasts (MEFs) obtained from embryos containing a floxed Rac1 allele1. Our rationale for selecting Rac1 MEFs for our experiments is that clear morphological changes can be seen upon deletion of Rac1, due to alterations in the actin cytoskeleton2,5. 72 hours following viral transduction and Cre expression, cells were stained using the actin dye phalloidin and imaged using confocal laser scanning microscopy. It was observed that MEFs which had been exposed to the adeno-Cre virus appeared contracted and elongated in morphology compared to uninfected cells, consistent with previous reports2,5. The adenovirus method of Cre recombinase delivery is advantageous as the adeno-Cre virus is easily available, and gene deletion via Cre in nearly 100% of the cells can be achieved with optimized adenoviral infection.

In this video we use an adenovirus carrying the Cre recombinase gene to infect primary mouse embryonic fibroblasts carrying a floxed Rac1 allele.

Adenovirus-mediata rimozione genetica di molecole di segnalazione in fibroblasti di topo coltivate primarie embrionali

The ability to genetically remove specific components of various cell signalling cascades has been an integral tool in modern signal transduction ...

Assessing Signaling Properties of Ectodermal Epithelia During Craniofacial Development

The accessibility of avian embryos has helped experimental embryologists understand the fates of cells during development and the role of tissue interactions that regulate patterning and morphogenesis of vertebrates (e.g., 1, 2, 3, 4). Here, we illustrate a method that exploits this accessibility to test the signaling and patterning properties of ectodermal tissues during facial development. In these experiments, we create quail-chick 5 or mouse-chick 6 chimeras by transplanting the surface cephalic ectoderm that covers the upper jaw from quail or mouse onto either the same region or an ectopic region of chick embryos. The use of quail as donor tissue for transplantation into chicks was developed to take advantage of a nucleolar marker present in quail but not chick cells, thus allowing investigators to distinguish host and donor tissues 7. Similarly, a repetitive element is present in the mouse genome and is expressed ubiquitously, which allows us to distinguish host and donor tissues in mouse-chick chimeras 8. The use of mouse ectoderm as donor tissue will greatly extend our understanding of these tissue interactions, because this will allow us to test the signaling properties of ectoderm derived from various mutant embryos.

This article describes a tissue transplantation technique that was designed to test the signaling and patterning properties of surface cephalic ectoderm during craniofacial development.

La valutazione delle proprietà di segnalazione di ectodermica epiteli durante lo sviluppo craniofacciale

The accessibility of avian embryos has helped experimental embryologists understand the fates of cells during development and the role of tissue ...

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

Free-living planarian flatworms have a long history of experimental usage owing to their remarkable regenerative abilities1. Small fragments excised from these animals reform the original body plan following regeneration of missing body structures. For example if a 'trunk' fragment is cut from an intact worm, a new 'head' will regenerate anteriorly and a 'tail' will regenerate posteriorly restoring the original 'head-to-tail' polarity of body structures prior to amputation (Figure 1A).
Regeneration is driven by planarian stem cells, known as 'neoblasts' which differentiate into ~30 different cell types during normal body homeostasis and enforced tissue regeneration. This regenerative process is robust and easy to demonstrate. Owing to the dedication of several pioneering labs, many tools and functional genetic methods have now been optimized for this model system. Consequently, considerable recent progress has been made in understanding and manipulating the molecular events underpinning planarian developmental plasticity2-9.
The planarian model system will be of interest to a broad range of scientists. For neuroscientists, the model affords the opportunity to study the regeneration of an entire nervous system, rather than simply the regrowth/repair of single nerve cell process that typically are the focus of study in many established models. Planarians express a plethora of neurotransmitters10, represent an important system for studying evolution of the central nervous system11, 12 and have behavioral screening potential13, 14. 
Regenerative outcomes are amenable to manipulation by pharmacological and genetic apparoaches. For example, drugs can be screened for effects on regeneration simply by placing body fragments in drug-containing solutions at different time points after amputation. The role of individual genes can be studied using knockdown methods (in vivo RNAi), which can be achieved either through cycles of microinjection or by feeding bacterially-expressed dsRNA constructs8, 9, 15. Both approaches can produce visually striking phenotypes at high penetrance- for example, regeneration of bipolar animals16-21. To facilitate adoption of this model and implementation of such methods, we showcase in this video article protocols for pharmacological and genetic assays (in vivo RNAi by feeding) using the planarian Dugesia japonica.

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

An attractive model for studying stem cell differentiation within a live animal is the planarian flatworm. Regeneration is studied by simple amputation experiments that are easily performed in a basic laboratory and are amenable to pharmacological and genetic (in vivo RNAi) manipulation as detailed by protocols in this article.

I dosaggi farmacologici genetica e funzionale di manipolare Rigenerazione del Planaria Japonica Dugesia</em

Free-living planarian flatworms have a long history of experimental usage owing to their remarkable regenerative abilities1. Small fragments excised from ...

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling processes. Extracting sterol-enriched membrane microdomains from plant cells for proteomic analysis is a difficult task mainly due to multiple preparation steps and sources for contaminations from other cellular compartments. The plasma membrane constitutes only about 5-20% of all the membranes in a plant cell, and therefore isolation of highly purified plasma membrane fraction is challenging. A frequently used method involves aqueous two-phase partitioning in polyethylene glycol and dextran, which yields plasma membrane vesicles with a purity of 95% 1. Sterol-rich membrane microdomains within the plasma membrane are insoluble upon treatment with cold nonionic detergents at alkaline pH. This detergent-resistant membrane fraction can be separated from the bulk plasma membrane by ultracentrifugation in a sucrose gradient 2. Subsequently, proteins can be extracted from the low density band of the sucrose gradient by methanol/chloroform precipitation. Extracted protein will then be trypsin digested, desalted and finally analyzed by LC-MS/MS. Our extraction protocol for sterol-rich microdomains is optimized for the preparation of clean detergent-resistant membrane fractions from Arabidopsis thaliana cell cultures.
We use full metabolic labeling of Arabidopsis thaliana suspension cell cultures with K15NO3 as the only nitrogen source for quantitative comparative proteomic studies following biological treatment of interest 3. By mixing equal ratios of labeled and unlabeled cell cultures for joint protein extraction the influence of preparation steps on final quantitative result is kept at a minimum. Also loss of material during extraction will affect both control and treatment samples in the same way, and therefore the ratio of light and heave peptide will remain constant. In the proposed method either labeled or unlabeled cell culture undergoes a biological treatment, while the other serves as control 4.

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Here we describe a robust method for the fractionation of plant plasma membranes into detergent resistant and detergent soluble membranes based on a mixture of unlabeled and in vivo fully 15N labeled Arabidopsis thaliana cell cultures. The procedure is applied for comparative proteomic studies to understand signaling processes.

Metabolic Etichettatura e con membrana frazionamento per proteomica comparativa Analisi del<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Culture sospensione cellulare

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling ...

Extraction and Analysis of Cortisol from Human and Monkey Hair

The stress hormone cortisol (CORT) is slowly incorporated into the growing hair shaft of humans, nonhuman primates, and other mammals. We developed and validated a method for CORT extraction and analysis from rhesus monkey hair and subsequently adapted this method for use with human scalp hair. In contrast to CORT &#34;point samples&#34; obtained from plasma or saliva, hair CORT provides an integrated measure of hypothalamic-pituitary-adrenocortical (HPA) system activity, and thus physiological stress, during the period of hormone incorporation. Because human scalp hair grows at an average rate of 1 cm/month, CORT levels obtained from hair segments several cm in length can potentially serve as a biomarker of stress experienced over a number of months.
In our method, each hair sample is first washed twice in isopropanol to remove any CORT from the outside of the hair shaft that has been deposited from sweat or sebum. After drying, the sample is ground to a fine powder to break up the hair&#39;s protein matrix and increase the surface area for extraction. CORT from the interior of the hair shaft is extracted into methanol, the methanol is evaporated, and the extract is reconstituted in assay buffer. Extracted CORT, along with standards and quality controls, is then analyzed by means of a sensitive and specific commercially available enzyme immunoassay (EIA) kit. Readout from the EIA is converted to pg CORT per mg powdered hair weight. This method has been used in our laboratory to analyze hair CORT in humans, several species of macaque monkeys, marmosets, dogs, and polar bears. Many studies both from our lab and from other research groups have demonstrated the broad applicability of hair CORT for assessing chronic stress exposure in natural as well as laboratory settings.

Cortisol (CORT) accumulates in the growing hair shaft of humans and nonhuman primates. We describe methods for extracting and analyzing hair CORT with high precision and sensitivity. Measurement of hair CORT is particularly well-suited for assessing chronic stress over periods of weeks to months.

Estrazione e analisi di cortisolo da umani e Monkey Capelli

The stress hormone cortisol (CORT) is slowly incorporated into the growing hair shaft of humans, nonhuman primates, and other mammals. We developed and ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized image analysis tools are available, most traditional image-analysis-based workflows have steep learning curves (for fine tuning of analysis parameters) and result in long turnaround times between imaging and analysis. In particular, cell segmentation, the process of identifying individual cells in an image, is a major bottleneck in this regard.
Here we present an alternate, cell-segmentation-free workflow based on PhenoRipper, an open-source software platform designed for the rapid analysis and exploration of microscopy images. The pipeline presented here is optimized for immunofluorescence microscopy images of cell cultures and requires minimal user intervention. Within half an hour, PhenoRipper can analyze data from a typical 96-well experiment and generate image profiles. Users can then visually explore their data, perform quality control on their experiment, ensure response to perturbations and check reproducibility of replicates. This facilitates a rapid feedback cycle between analysis and experiment, which is crucial during assay optimization. This protocol is useful not just as a first pass analysis for quality control, but also may be used as an end-to-end solution, especially for screening. The workflow described here scales to large data sets such as those generated by high-throughput screens, and has been shown to group experimental conditions by phenotype accurately over a wide range of biological systems. The PhenoBrowser interface provides an intuitive framework to explore the phenotypic space and relate image properties to biological annotations. Taken together, the protocol described here will lower the barriers to adopting quantitative analysis of image based screens.

Here we describe a workflow for rapidly analyzing and exploring collections of fluorescence microscopy images using PhenoRipper, a recently developed image-analysis platform.

Analisi rapida ed esplorazione di microscopia a fluorescenza Immagini

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

Detection of Alternative Splicing During Epithelial-Mesenchymal Transition

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various physiological and pathological processes. Here we describe a strategy to detect alternative splicing during EMT using an inducible EMT model by expressing the transcription repressor Twist. EMT is monitored by changes in cell morphology, loss of E-cadherin localization at cell-cell junctions, and the switched expression of EMT markers, such as loss of epithelial markers E-cadherin and &#947;-catenin and gain of mesenchymal markers N-cadherin and vimentin. Using isoform-specific primer sets, the alternative splicing of interested mRNAs are analyzed by quantitative RT-PCR. The production of corresponding protein isoforms is validated by immunoblotting assays. The method of detecting splice isoforms described here is also suitable for the study of alternative splicing in other biological processes.

Alternative splicing regulation has been shown to contribute to the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program in various physiological and pathological processes. Here we describe a method utilizing an inducible EMT model for the detection of alternative splicing during EMT.

Rilevamento di splicing alternativo Durante epiteliale-mesenchimale transizione

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various ...

A New Technique for Quantitative Analysis of Hair Loss in Mice Using Grayscale Analysis

Alopecia is a common form of hair loss which can occur in many different conditions, including male-pattern hair loss, polycystic ovarian syndrome, and alopecia areata. Alopecia can also occur as a side effect of chemotherapy in cancer patients. In this study, our goal was to develop a consistent and reliable method to quantify hair loss in mice, which will allow investigators to accurately assess and compare new therapeutic approaches for these various forms of alopecia. The method utilizes a standard gel imager to obtain and process images of mice, measuring the light absorption, which occurs in rough proportion to the amount of black (or gray) hair on the mouse. Data that has been quantified in this fashion can then be analyzed using standard statistical techniques (i.e., ANOVA, T-test). This methodology was tested in mouse models of chemotherapy-induced alopecia, alopecia areata and alopecia from waxing. In this report, the detailed protocol is presented for performing these measurements, including validation data from C57BL/6 and C3H/HeJ strains of mice. This new technique offers a number of advantages, including relative simplicity of application, reliance on equipment which is readily available in most research laboratories, and applying an objective, quantitative assessment which is more robust than subjective evaluations. Improvements in quantification of hair growth in mice will improve study of alopecia models and facilitate evaluation of promising new therapies in preclinical studies.

Alopecia is a common form of hair loss which can occur in many different conditions, including as a side-effect of chemotherapy. We have developed a method to quantify hair loss in mice, utilizing a standard gel imager to perform a grayscale analysis, to facilitate study of promising new alopecia therapies.

Una nuova tecnica di analisi quantitativa di perdita dei capelli nei topi mediante analisi in scala di grigi

Alopecia is a common form of hair loss which can occur in many different conditions, including male-pattern hair loss, polycystic ovarian syndrome, and ...