저자는 동물 실험에 그의 도움을 축적 테프론 금형 및 박사 G. Prevost에서의 위해 제조 티타늄 임플란트 박사 앙드레 왈더와 니콜라스 페린, K. Benmlih에게 감사의 말씀을 전합니다. 우리는 또한 재정적 기여 지역 알자스와 PMNA (폴 MATERIAUX 등 Nanosciences 달자)을 인정합니다.

1. 기공 금속 임플란트의 세공 그라디언트의 준비 <ol><li> 에탄올 임플란트 (예 : 400 ~ 500 μm의, Neyco SAS, 프랑스의 크기 범위와 의학 급료 티타늄 구슬으로 만들어진 임플란트)를 청소 한 후 15 분 동안 아세톤에서 초음파 처리. </li><li> 임플란트의 크기와 모양 (표준 실험 2 cm의 높이 1.5 cm 직경의 원통형 몰드를 사용하는)에 따라 설계 및 제조 테프론 몰드. 금형 특정 부분을 추출하는 동안 제거 할 수 있도록 모듈 형이어야한다. 이러한 금형 설계는 감독 방식으로 추출 유체의 움직임을 강제로 추출 프로세스에 대한 제어를 보장합니다. </li><li> I) 임플란트의 크기, II를 결정하는 바닥 부분) 굴대 및 이동할 수 ⅲ) 외부 코어 : 기관을 대체하기 위하여 디자인 관 임플란트의 경우, 구조는 세 가지로 구성되어야한다. 이 방법은 기공 크기 구배가 안쪽으로 외부에서 형성 될 수있다. </li> &lt;리&gt; 합성 고분자 (PLLA) 솔루션을 준비 : 동결 / 추출 PLLA 솔루션은 디 옥산과 물 (: V 87:13 %, V)의 바이너리 혼합물에서 준비해야합니다. </li><li> 균일 한 용액을 얻기 위해 ° C 순서로 60 혼합물을 가열한다. 60 ° 그것은 임플란트에 솔루션의 도입에 사용할 수있는 정밀 유리 주사기의 온도 저항의 높은 한계로 C를 선택. </li><li> 높은 농도 (≥ 6 %), 고 분자량 PLLA 솔루션을 사용하는 경우, 즉시 가열 후 임플란트에 솔루션을 소개합니다. 그렇지 않으면 용액의 겔화 전체 침수없이 발생합니다. </li><li> 임플란트의 기공에 관하여 필요한 고분자 용액의 부피를 계산 냉동 용액의 부피의 정확도 변화를 고려 할 수 있습니다. </li><li> 0.1 ㎕의 정확도로 정밀 유리 주사기와 임플란트에 솔루션을 소개합니다. 고분자 농도의 하한은재생 기공 기울기 형성을위한 3 %는 6 % 이상 두께의 샘플에서 균일 한 분포를 얻기 어렵게되어 반면. 그러나 특정 응용 프로그램에 대해 다른 농도를 사용할 수 있습니다. </li><li> 샘플을 직접 -80 ° C의 실온에서 30 분간의 이전 배양 기간 중 하나를 고정합니다. 냉동 상태가 부분적으로 기공 형성을 결정, 따라서 동결 조건은 목표 다공성에 따라 조정될 수있다. -80 샘플 하룻밤 유지 ° C. </li><li> 추출 : 미리 냉장 에탄올 80 %에 임플란트를 담가. 하룻밤 -20 ° C에서 추출을 수행하십시오. 다공성 그라디언트를 얻으려면, 디스크 모양의 임플란트를위한 바닥 부분을 제외 관 임플란트와 모든 부품 굴대 제외한 모든 금형 부품을 제거합니다. 곰팡이 쉽게 분리 미리 냉장 메스를 사용합니다. </li><li> 에서 추출 후 -20 ° C 야간 19, 나머지 금형 부품을 제거하고 공기가 임플란트를 건조. 특성화를위한구조 수은 porosimeter 분석의 전체 다공성이 필요합니다. 수은 Porosimeter 측정은 임플란트와 작은 interdispersed 모공의 양쪽에있는 구멍에 해당하는 뚜렷한 피크를 보였다. 그러나 더 중요한 데이터는 주사 전자 현미경 (SEM) 20와 기공 크기 분포에 대한 이미지 J에 의해 분석 할 수 강내 및 extraluminal 표면의 기공 사이의 차이입니다. 기공 그라디언트의 확인을 위해 샘플을 동결 분쇄 및 SEM과 단면을 관찰합니다. </li><li> 사용 된 임플란트의 오픈 다공성 자연, 그리고 티타늄의 빛을 반사 능력으로 인해, 그것은 다공성 임플란트 내에 표시된 세포의 Z-스택을 수행 할 수 있습니다. PKH26 또는 Calcein-AM으로 세포를 라벨과 공 초점 레이저 현미경 임플란트 시각화. </li></ol> 2. 콜라겐 / 알긴산 다층 다공성 금속 임플란트의 표면 코팅 <ol><li> 빌드 - 최대다층의 가장 높은 재현성을 찍기 로봇 얻을 수 있습니다. 찍기 로봇을 사용할 수없는 경우 다음 단계를 수동으로 수행 할 수 있습니다. </li><li> 의료용 콜라겐 유형 I 및 알긴산 나트륨을 사용합니다. 최적화 된 농도는 pH가 3.8에서 구연산 버퍼의 NaCl 150 mM의 각 0.5 g / L이다. </li><li> 용액의 균일 성을 보장하기 위해 하룻밤 콜라겐 솔루션을 녹입니다. 3.8의 산성 pH는 필요한 구조는 중성 pH에서 가교 이전 불안정으로 층의 안정적인 빌드 - 업합니다. </li><li> 또는 콜라겐과 알긴산 솔루션에 임플란트를 침지하여 침지 로봇 시스템에 의해 계층을 입금. 증착 시간은 이후의 각 레이어에 대해 15 분입니다. 5 분 pH가 3.8에서 150 mM의 NaCl을 가진 증착 단계 사이의 구조를 씻어. </li><li> 고분자 전해질 다층 생산에 사용 찍기 로봇 임플란트의 활용을위한 디자인 특정 홀더. 어느 티타늄의 표면 만 impla에 레이어를 입금수정 국세청이나 임플란트는 제 1에서 설명했다. </li><li> 기저막의 안정화 genipin과 모방 : V 비율 : 1시 4분 V에서 디메틸 설폭 사이드 (DMSO) / 구연산 버퍼 (150 mM의 NaCl을, 산도 3.8)의 가교 솔루션을 준비합니다. 농도의 광범위한 사용, 100 MM은 가교에 적합 할 수 있습니다. DMSO 구성 요소의 첫 번째 genipin 및 응집 방지하기 위해 나중에 물에 구성 요소를 추가 녹인다. </li><li> 12-24 시간 사이의 가교 용액에 침지하여 샘플을 가교. 그 후 구연산 버퍼의 풍부한 양의 (산도 3.8)로 씻어. </li><li> 세척 단계 후, UV 처리 (30 분) 또는 항생제 / 항진균제 목욕 (페니실린 / 스트렙토 마이신, Fungizone)와 하나 샘플을 살균. </li><li> 모방 기저막의 품질을 결정하는 주요 변수는 두께와 섬유의 직경입니다. 접촉 모드에서 얻은 원자 힘 현미경 (AFM) 이미지를 사용하여 섬유 직경을 계산합니다. 로 샘플을 건조이미징 전에 질소 흐름. 이미지 J 소프트웨어를 사용하여 평균 근모의 두께를 결정하기 위해 이미지 당 적어도 10 섬유의 두께를 정량화. </li><li> 필름의 두께는 AFM을 사용하여 처음 테스트에 의해 결정하실 수 있습니다. 건조 (COL / ALG) 24 / COL 다층 필름. 필름 스크래치 주사기 바늘을 사용합니다. 광학 현미경과 처음 국산화 한 후, 처음의 경계에서 10 × 10 ㎛ 2 표면 AFM와 이미지를 얻을 수 있습니다. 필름 층의 두께를 제공하는 AFM 소프트웨어로 얻은 프로파일에서 높이를 계산합니다. </li></ol> 3. 혈액 플라즈마의 분석에 의해 생체 임플란트 통합의 간접 모니터링 <ol><li> 필요한 모든위원회의 승인은 각 국가 21 지배 규칙에 따라 동물 실험에 대해주의해야한다. 우리의 경우 실험 동물의 관리 및 사용 (국가 연구위원회, 2010)에 대한 안내는 다음과 일합니다스트라스부르 윤리위원회의 대학의 전자 승인을 얻을 수 있습니다. </li><li> 대상 사이트에서 주입을 수행하십시오. 여기에 주어진 혈액 모니터링 프로토콜은 15mm 기관 절제술의 뉴질랜드 흰 토끼의 기관 교체를 위해 사용되었다. </li><li> 주입 다음 후속 매일은 그들의 무게의 기록 일반적인 동물 복지 (수술 사이트, 호흡 속도의 주위에 치유를) montioring 필요합니다. </li><li> 혈액 검사의 유효성을 검사하려면 혈액 CRP 수준에 대한 ELISA 검사와 같은 잘 확립 된 방법을 사용합니다. 많은 동물 CRP 검사가 가능하며, 토끼에 사용되는 특정 테스트는 표 1에 나열되어 있습니다. 마찬가지로, 서쪽은 CGA 수준의 결정에 더럽히는 사용합니다. 단클론 항-CGA 항체 (항-CGA 47-68)은이 프로토콜에 사용되었다. </li><li> 플라즈마 특성에 대해, 토끼의 귀 정맥에서 혈액 샘플을 얻을 수 있습니다. 4 20 분 5,000 rpm으로 원심 분리기 °; C. 분석을 위해 얻은 상등액을 사용한다. 우리의 절차에서 이러한 테스트는 주간 단위로 수행하지만, 더 자주 검사도 가능합니다. </li><li> 플라즈마 단백질 함량의 위상 HPLC 정화를 반대 : 트리 플루오로 아세트산의 0.1 % (1:1, V : V)와 토끼 혈장을 추출합니다. DIONEX HPLC 시스템 (궁극의 3000, 서니 베일, CA USA)를 사용하여 추출물을 정제 300-5C18 열 역상 nucleosil에 (4 × 250mm, 입자 크기가 5 μm의, 다공성, 300 Å). </li><li> 214 280 nm에서 흡광도를 기록합니다. 사용되는 용매 시스템) 나 용제 : 물과 II에서 0.1 % (v / v)의 트리 플루오르 산 (TFA)) 용매 B : 0.09 % (v / v)의 70 %의 TFA (v / v)의 아세토 니트릴 - 물. </li><li> 700 μL / elutions에 대한 그라디언트를 사용 min의 유량을 사용합니다. 피크 분수를 수집합니다. 속도 진공 응용 프로그램에 의해 증발 분수를 집중한다. 그것은 완전히 건조되기 전에 속도 진공을 중지하는 것이 중요합니다. </li><li> 공동을 통해 서로 다른 시간 지점에서 얻은 피크의 상관 관계주입 기간 URSE. 자동 Edman 순서에 의해 식별 이식의 과정에서 일관된 경향을 보이고있다 정제 된 펩타이드를 사용합니다. </li><li> 펩티드의 자동 Edman 순서 : Procise microsequencer를 사용하여 자동 Edman 분해하여 정화 펩타이드의 N-말단 서열을 결정합니다. 의 polybrene 처리 유리 섬유 필터에 샘플을로드합니다. 다음 단계는 C 18 열 (PTH C-18, 2.1 X 200mm) 22 크로마토 그래피 Phenylthiohydantoin-아미노산 (Pth를-XAA)의 식별이다. 순서가 얻은 후에, 그것은 스위스 보호 해주는 데이터베이스를 사용하여 폭발의 소프트웨어 식별 할 수 있습니다. </li></ol>

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NE 브라는 Protip SAS의 직원입니다.

기공 그라디언트 인터페이스 조직 공학에 중요한 도구이며, 여기에 설명 된 시스템은 세포 이동을 연구하기 위해 기공 그라데이션을 형성 혼자 또는 금속 임플란트와 함께 사용할 수 있습니다. 이 시스템은 유기 용매를 처리하는 화학 물질 흄 후드를 제외한 모든 추가 설정 또는 추가 장비를 필요로하지 않습니다, 따라서 그것은 생물학 실험실에서 적용 할 수 있습니다. 같은 폴리 (글리콜 산) (PGA...

현재 금속 임플란트는 하중 어플리케이션에 적합하지만, 자신의 비 분해성 그들에게 1 주변 조직과 함께 강력한 인터페이스를 보장 설계를 필요로한다. 생체과 식민지 성장의 세포 촉진 구조를 제공함으로써, 금속 임플란트의 수명은 2 연장 할 수 있습니다. 공개적으로 다공성 금속 임플란트는 또한 임플란트의 좋은 식민지를 보장하기위한 조직 인터페이스 기술에 대한 자료를 약속합니다. 그들은 적극적으로 정형 외과 임플란트로 또한 기관 이식 3-5 사용되었습니다. 그러나, 기공 분야에서 세포의 움직임을 통해 정확한 컨트롤로 해결해야 할 문제가 여전히있다. 이 프로세스를 제어하지 않으면 한쪽 끝과 다른 쪽 재 협착의 불완전 식민지로 이어질 수 있습니다. 이러한 임플란트의 추가 작용과 같은 성장 인자의 전달과 같은 높은 기능을 달성하기 위해 필요한 것은,감독 혈관 및 다른 세포 유형 6-8의 동시 이동합니다. 혈관 조직에 의한 임플란트의 식민지가 바람직과 기관 이식의 경우, 이것은 매우 중요합니다. 그것은 임플란트 개통을 감소하기 때문에, 기관의 루멘을 성장의 통제 조직은 바람직하지 않다. 세포의 움직임을 제어 할 수있는 하나의 가능성은 크기 배제됩니다. 표적 세포 및 특정 합성 고분자와 상호 작용하는 능력의 크기를 알면 그것은 효과적으로 세포 운동의 깊이를 확인할 수 있습니다 기공 그라디언트를 개발할 수 있습니다. 결합 조직 extraluminally 등의 섬유 아세포와 같은 세포하지만, intraluminally 관 임플란트의 정착에 효과적인 통제를 자신의 움직임을 방지하기 위해 (이하 10 ㎛) 정도로 작은 항목에 대해 수행 할 수있는 충분한 크기의 기공 구조를 만들어 예를 들면 다음과 같습니다. 이러한 동결 dryi으로 사용할 기공 생성 방법에서NG, 입자 침출, 9,10 발포 가스, 필요한 장비의 최소 금액과 기공 그라디언트의 빠른 형성 방법을 적용하는 가장 쉬운 방법은 동결 추출 11이다. 이 방법에서는, 고분자 용액은 유기 용매와 물 바이너리 혼합물에 고정되어 있습니다. 그 후, 용매를 에탄올로 혼합이 미리 냉장 액체에 의해 추출을 통해 교환됩니다. 냉동 및 추출 조건은 모공의 모양과 크기를 확인하고 추출이 추출 용액의 움직임을 제어 할 수있는 방식으로 수행하는 경우, 기공 크기와 모양은 방향성을 변조 할 수 있습니다. 다세포 조직을위한 두 번째 단계는 상호 작용을 제어하는​​ 다른 세포 유형 간의 다공성 장벽의 형성이다. 또한이 요구 사항 12,13에 따라 서로 다른 세포 유형에 대해 서로 다른 미세 환경의 가용성 여부에 대해 필요합니다. 기관은 bronch와 후두를 연결하는 관 기관이다전. 그것은 점액을 생산 interdispersed 받침 달린 컵 셀 내부 pseudostratified 모양체 상피 안감이 있습니다. 기관의 3 차원 구조와 안정성은 C-링 모양의 연골에 의해 유지된다. 따라서, 인공 기관의 결합 조직과 섬모 상피 층 사이에 정의 된 접합이 있어야합니다. 3D 구조는 결합 조직 부분에 필요하지만, 상피 세포의 이동은 기저막을 같이 필요로 표면 상처의 방향 이동 및 마감을 달성 할 수 있습니다. 고분자 전해질 다층 필름 (PEM이) 기저막 모방을 얻을 수있는 하나의 가능한 옵션입니다. 레이어로 레이어 방식 (LBL)는 얇은 기능성 표면 코팅을 얻기 위해 다양한 과정입니다. 그것은 그 같은 속성 고분자 전해질 종, 산도 단순히 변경 변수에 의해 변화 될 수 나노 표면 코팅을 얻기 위해 순차적으로 두 개의 반대로 대전 된 고분자 전해질과 빌드 - 업의 정전기 상호 작용에 근거층 수, 상한 레이어의 추가, LBL 방법의 주요 장점 중 가교 등 하나는 기본 기판의 지형을 준수 할 수있는 기능입니다. 따라서, 통제 된 상황에서이 방법은 또한 다공성 구조의 표면 범위를 얻기 위해 사용할 수 있습니다. 콜라겐은 고분자 전해질의 하나로서 사용되는 경우는 기저막의 표면을 모방 할 수 나노 섬유 구조를 얻을 수있다. 티타늄의 소수성은 구조의 개발을 가능하게하고 fibrillarity 두꺼운 코팅 14에 보존 할 수 있습니다. 이 방법은 표면에 세포 부착 및 이동도 제어 할 수 있습니다. 순차적으로 동결 추출 및 LBL 필름 코팅을 사용하여, 세포의 움직임이 길이 방향과 원주 방향, 횡 방향 제어 할 수있는 구조가 15를 얻을 수 있습니다. 여기에 우리가 할 수있는 자신의 소수성 동작을 사용하여 티타늄 임플란트에 대한 두 개의 새로운 수정 방법을 설명합니다소수성 합성 고분자 II) 세포 성장과 고분자 전해질 다층으로 안감 형성을 지원하는 임플란트 표면에 두꺼운 고분자 필름 층의 형성 거대 티타늄 임플란트에서 미세 기공의 그라디언트 I) 생성 : 다양한 다공성 임플란트의 수정을 연장했다. 이 방법은 순차적으로 또는 개별적으로 사용할 수 있습니다. 그들은 통제 마이그레이션 및 다세포 조직 16,17에있는 다른 세포 유형의 공간적 조직을 위해 구조를 제공합니다. 기관의 특별한 경우를 위해, 임플란트에 대해 원하는 결과는 재 협착 및 고분자 전해질 다층의 섬모 상피 세포의 내부 안감의 형성없이 미세 그라데이션 내에서 섬유 혈관 조직에 의해 식민지화 될 것이다. 임플란트의 통합을 제어하는 방법 중 하나는 현장에서 호스트와의 통합 기간 동안 작은 수술 개입을 할 수 있습니다. 수 t를 위하여개입의 타이밍을 결정 O를, 그것은 임플란트의 전신 효과에 대한 정보를 가지고하는 것이 중요합니다. C-반응성 단백질 (CRP) 감염 감시 및 임상 설정에서 염증 반응에 사용되고 있습니다. Chromogranin은 (CGA)도 비슷한 방식으로 사용할 수 있으며, 염증 18의 수준을 관찰하는 더 정확한 결과를 제공 할 수 있습니다. 생체 내 금속 임플란트의 통합을 관찰 가능한 방법으로, 우리는 고압 액체 크로마토 그래피 (HPLC) 및 후속 단백질 시퀀싱 동물의 혈액 샘플의 특성에 의해 임플란트 전신 효과의 지속적인 모니터링 절차를 제시한다. 이 방법의 구체화는 정기적으로 엔드 포인트 학적 분석을 회피 할 수 있습니다. 금속 임플란트의 조직 학적 절단 길고 복잡하고 비싼 절차이며 특정 시점에 수행 할 수 있습니다. 이런 이유 때문에, 임플란트 건강에 대해 강력한 정보를 제공하는 혈액 검사를 할 잘 설계동물 실험에 관한 최근의 EU 규정에 의해 위임으로 동물 실험을 줄일 수 라우트합니다. 여기에 제시된 방법은 기능화를 통한 금속성 임플란트의 성능을 향상시키기 위해 또는 기존의 임플란트를 모니터링하는 다른 방법을 사용할 수 있습니다.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Reagent</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dioxane</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>360481</td>
 <td>Toxic material, Strictly under chemical hood</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PLLA 
 i. Poly(L-lactide) inherent viscosity ~0.5 dl/g 
 ii. Poly(L-lactide) inherent viscosity ~2.0 dl/g 
 </td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>94829, 81273</td>
 <td>The choice of molecular weight and inherent viscosity is application dependent.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PRONOVA UP LVG (Sodium Alginate)</td>
 <td>Novamatrix</td>
 <td>4200006</td>
 <td>Low viscosity(20-200 mPa.s)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Collagen type I (Bovine)</td>
 <td>Symatese</td>
 <td>CBPE2US100</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pen/Strep, Fungizone </td>
 <td>Promocell</td>
 <td>C42020</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Genipin</td>
 <td>Wako</td>
 <td>0703021</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Silicon nitride probes with aspring constant of 0.03 N.m-1. </td>
 <td>Bruker </td>
 <td>MSCT </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Trifluoroacetic acid for HPLC ,&ge;99.0% </td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>302031</td>
 <td>Hazardous Material, Please follow MSDS carefully</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Acetonitrile, for HPLC ,&ge;99.9% </td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>34998</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Calcein-AM</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>C3100MP </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling </td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>PKH26GL</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Rabbit C-Reactive Protein (CRP) ELISA kit</td>
 <td>Genway Bio</td>
 <td>GWB-9BF960 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DMSO, Bioreagent, &ge;99.7% </td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>D2650</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Equipment</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Multimode Nanoscope IV Atomic Force microscope</td>
 <td>Bruker</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Procise microsequencer </td>
 <td>Applied Biosystems </td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ultima 3000 HPLC system </td>
 <td>Dionex</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Scanning Electron Microscope Hitachi TM 100</td>
 <td>Hitachi </td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Confocal Scanning Laser Microscope Zeiss LSM 510 </td>
 <td>Zeiss </td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>
Table 1. List of Materials and Reagents.

multi-scale modification of metallic implants with pore gradients, polyelectrolytes and their indirect monitoring in vivo

특히 금속 임플란트 티타늄 임플란트가 널리 임상 응용에 사용됩니다. 조직에서 이러한 임플란트 및 통합 성장의 조직이 성공적으로 임상 결과에 중요한 매개 변수입니다. 조직 통합을 개선하기 위해, 다공성 금속 임플란트가 개발되고있다. 기공 영역이 전체 구조의 기계적 특성을 손상시키지 않고 기능화 할 수 있기 때문에 금속 폼의 오픈 기공은 매우 유익합니다. 여기에서 우리는 티타늄 마이크로 비드에 따라 다공성 티타늄 임플란트를 사용하여 이러한 수정 사항을 설명합니다. 티타늄의 소수성과 같은 고유의 물리적 속성을 사용하여, 그것은 지하실 멤브레인은 친수성, 천연 고분자를 기반으로 모방하도록 마이크로 비드 기반의 금속 임플란트에서 동시에 소수성 기공 그라디언트를 얻을 수있다. 3D 기공 그라디언트 등의 동결 추출 방법으로 폴리-L-락트산 (PLLA)와 같은 합성 고분자에 의해 형성된다. 2D 나노 섬유 쉬르얼굴은 천연 가교제 (genipin)와 가교 단계에서 다음에 콜라겐 / 알지네이트를 사용하여 형성된다. 이 나노 섬유 필름 층 (LBL) 두 개의 반대로 대전 된 분자 콜라겐과 알긴산의 증착 방법에 의해 계층에 의해 지어졌다. 마지막으로,이 많은 다세포 조직에 필요한대로 다른 지역, 다른 세포 유형을 수용 할 수있는 임플란트를 얻을 수있다. 에 의해 다른 세포 유형에 의해 다른 방향에서이 방법은 세포의 움직임을 제어 할 수 있습니다. 이러한 시스템은 기관 재생의 특정 경우에 대한 설명하지만, 다른 대상 기관에 대해 수정할 수 있습니다. 세포 이동 및 다른 기공 그라디언트를 만들기위한 가능한 방법의 분석은 정교합니다. 이러한 임플란트의 분석의 다음 단계는 이식 후 자신의 특성이다. 그러나 금속 임플란트의 조직 학적 분석은 생체 내에서 금속 임플란트 모니터링 호스트 반응에 따라서 길고 번거로운 과정CGA 및 다른 혈액 단백질을 모니터에 따라 lternative 방법도 설명합니다. 이 방법은 체외 주문품 마이그레이션 및 식민지 테스트에서 개발에 사용될 수 있으며, 조직학없이 생체 기능화 된 금속 임플란트의 분석에 이용된다.

기공 그라디언트의 형성 PLLA 용액의 농도를 변경함으로써, 임플란트의 extraluminal 측면에 구멍의 크기를 제어 할 수 있습니다. 기공 크기와 모양이 크게 티타늄 임플란트 (그림의 1A와 1B)의 존재에 의해 영향을 받았다. 40-100 μm의 낮은 농도의 사용률이 작은 모공의 결과에서 기공 크기였다. 강내 측면 기공 크기에 제한 추출에 의해 규율되고 섬유 아세포의 평균 크기?...

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Multi-Scale Modification of Metallic Implants With Pore Gradients, Polyelectrolytes and Their Indirect Monitoring In vivo

이 비디오에서는, 우리는 그들의 기능을 개선하고 세포의 이동을 제어하는​​ 다공성 금속 임플란트에 대한 수정 방법을 보여줍니다. 기술은 3D 및 기저막의 생산은 2-D에서 세포의 움직임을 제어하는​​ 모방에서 세포의 움직임을 제어하는​​ 기공 그라디언트의 개발을 포함한다. 또한, 혈액 단백질의 분석을 통해 생체의 모니터링 임플란트 통합을위한 HPLC 기반 방법이 설명되어 있습니다.

모공 그라디언트, 고분자 전해질 및 그들의 간접적 인 모니터링과 금속 임플란트의 멀티 스케일 변경<em&gt; 생체 내</em

Metallic implants, especially titanium implants, are widely used in  clinical applications. Tissue in-growth and integration to these implants in  the ...

multi-scale-modification-metallic-implants-with-pore-gradients

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Multi-Scale Modification of Metallic Implants With Pore Gradients, Polyelectrolytes and Their Indirect Monitoring In vivo

10.8K 조회수.  INSERM. 이 비디오에서는, 우리는 그들의 기능을 개선하고 세포의 이동을 제어하는​​ 다공성 금속 임플란트에 대한 수정 방법을 보여줍니다. 기술은 3D 및 기저막의 생산은 2-D에서 세포의 움직임을 제어하는​​ 모방에서 세포의 움직임을 제어하는​​ 기공 그라디언트의 개발을 포함한다. 또한, 혈액 단백질의 분석을 통해 생체의 모니터링 임플란트 통합을위한 HP...

비디오: Multi-Scale Modification of Metallic Implants With Pore Gradients, Polyelectrolytes and Their Indirect Monitoring In vivo

Monitoring Protein Adsorption with Solid-state Nanopores

Solid-state nanopores have been used to perform measurements at the single-molecule level to examine the local structure and flexibility of nucleic acids 1-6, the unfolding of proteins 7, and binding affinity of different ligands 8. By coupling these nanopores to the resistive-pulse technique 9-12, such measurements can be done under a wide variety of conditions and without the need for labeling 3. In the resistive-pulse technique, an ionic salt solution is introduced on both sides of the nanopore. Therefore, ions are driven from one side of the chamber to the other by an applied transmembrane potential, resulting in a steady current. The partitioning of an analyte into the nanopore causes a well-defined deflection in this current, which can be analyzed to extract single-molecule information. Using this technique, the adsorption of single proteins to the nanopore walls can be monitored under a wide range of conditions 13. Protein adsorption is growing in importance, because as microfluidic devices shrink in size, the interaction of these systems with single proteins becomes a concern. This protocol describes a rapid assay for protein binding to nitride films, which can readily be extended to other thin films amenable to nanopore drilling, or to functionalized nitride surfaces. A variety of proteins may be explored under a wide range of solutions and denaturing conditions. Additionally, this protocol may be used to explore more basic problems using nanopore spectroscopy.

A method of using solid-state nanopores to monitor the non-specific adsorption of proteins onto an inorganic surface is described. The method employs the resistive-pulse principle, allowing for the adsorption to be probed in real-time and at the single-molecule level. Because the process of single protein adsorption is far from equilibrium, we propose the employment of parallel arrays of synthetic nanopores, enabling for the quantitative determination of the apparent first-order reaction rate constant of protein adsorption as well as and the Langmuir adsorption constant.

고체 Nanopores와 모니터링 단백질 흡착

Solid-state nanopores have been used to perform measurements at the single-molecule level to examine the local structure and flexibility of nucleic acids ...

연구

생체공학

Mass Cytometry: Protocol for Daily Tuning and Running Cell Samples on a CyTOF Mass Cytometer

In recent years, the rapid analysis of single cells has commonly been performed using flow cytometry and fluorescently-labeled antibodies. However, the issue of spectral overlap of fluorophore emissions has limited the number of simultaneous probes. In contrast, the new CyTOF mass cytometer by DVS Sciences couples a liquid single-cell introduction system to an ICP-MS.1 Rather than fluorophores, chelating polymers containing highly-enriched metal isotopes are coupled to antibodies or other specific probes.2-5 Because of the metal purity and mass resolution of the mass cytometer, there is no "spectral overlap" from neighboring isotopes, and therefore no need for compensation matrices. Additionally, due to the use of lanthanide metals, there is no biological background and therefore no equivalent of autofluorescence. With a mass window spanning atomic mass 103-203, theoretically up to 100 labels could be distinguished simultaneously. Currently, more than 35 channels are available using the chelating reagents available from DVS Sciences, allowing unprecedented dissection of the immunological profile of samples.6-7
Disadvantages to mass cytometry include the strict requirement for a separate metal isotope per probe (no equivalent of forward or side scatter), and the fact that it is a destructive technique (no possibility of sorting recovery). The current configuration of the mass cytometer also has a cell transmission rate of only ~25%, thus requiring a higher input number of cells.
Optimal daily performance of the mass cytometer requires several steps. The basic goal of the optimization is to maximize the measured signal intensity of the desired metal isotopes (M) while minimizing the formation of oxides (M+16) that will decrease the M signal intensity and interfere with any desired signal at M+16. The first step is to warm up the machine so a hot, stable ICP plasma has been established. Second, the settings for current and make-up gas flow rate must be optimized on a daily basis. During sample collection, the maximum cell event rate is limited by detector efficiency and processing speed to 1000 cells/sec. However, depending on the sample quality, a slower cell event rate (300-500 cells/sec) is usually desirable to allow better resolution between cells events and thus maximize intact singlets over doublets and debris. Finally, adequate cleaning of the machine at the end of the day helps minimize background signal due to free metal.

The steps necessary for daily tuning and optimization of the performance of a CyTOF mass cytometer are described. Comments on optimal sample preparation and flow rate are discussed

대량 세포 계측법 : CyTOF 질량 Cytometer에 매일 조정하고 실행 세포 샘플에 대한 프로토콜

In recent years, the rapid analysis of single cells has commonly been performed using flow cytometry and fluorescently-labeled antibodies. However, the ...

Graphene Coatings for Biomedical Implants

Atomically smooth graphene as a surface coating has potential to improve implant properties. This demonstrates a method for coating nitinol alloys with nanometer thick layers of graphene for applications as a stent material. Graphene was grown on copper substrates via chemical vapor deposition and then transferred onto nitinol substrates. In order to understand how the graphene coating could change biological response, cell viability of rat aortic endothelial cells and rat aortic smooth muscle cells was investigated. Moreover, the effect of graphene-coatings on cell adhesion and morphology was examined with fluorescent confocal microscopy. Cells were stained for actin and nuclei, and there were noticeable differences between pristine nitinol samples compared to graphene-coated samples. Total actin expression from rat aortic smooth muscle cells was found using western blot. Protein adsorption characteristics, an indicator for potential thrombogenicity, were determined for serum albumin and fibrinogen with gel electrophoresis. Moreover, the transfer of charge from fibrinogen to substrate was deduced using Raman spectroscopy. It was found that graphene coating on nitinol substrates met the functional requirements for a stent material and improved the biological response compared to uncoated nitinol. Thus, graphene-coated nitinol is a viable candidate for a stent material.

Graphene offers potential as a coating material for biomedical implants. In this study we demonstrate a method for coating nitinol alloys with nanometer thick layers of graphene and determine how graphene may influence implant response.

생명을 주입 Graphene 코팅

Atomically smooth graphene as a surface coating has potential to improve implant properties. This demonstrates a method for coating nitinol alloys with ...

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as growth factors. Here, we outline a method to create opposing gradients of adhesive and soluble cues in a microfluidic chamber, which is compatible with live cell imaging. A copolymer of poly-L-lysine and polyethylene glycol (PLL-PEG) is employed to passivate glass coverslips and prevent non-specific adsorption of biomolecules and cells. Next, microcontact printing or dip pen lithography are used to create tracks of streptavidin on the passivated surfaces to serve as anchoring points for the biotinylated peptide arginine-glycine-aspartic acid (RGD) as the adhesive cue. A microfluidic device is placed onto the modified surface and used to create the gradient of adhesive cues (100% RGD to 0% RGD) on the streptavidin tracks. Finally, the same microfluidic device is used to create a gradient of a chemoattractant such as fetal bovine serum (FBS), as the soluble cue in the opposite direction of the gradient of adhesive cues.

A method for the assembly of adhesive and soluble gradients in a microscopy chamber for live cell migration studies is described. The engineered environment combines antifouling surfaces and adhesive tracks with solution gradients and therefore allows one to determine the relative importance of guidance cues.

형광 현미경과 영상 셀 마이그레이션을위한 접착제 및 가용성식이 그라디언트를 만들기

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

Surgical Technique for the Implantation of Tissue Engineered Vascular Grafts and Subsequent In Vivo Monitoring

The development of Tissue Engineered Vessels (TEVs) is advanced by the ability to routinely and effectively implant TEVs (4-5 mm in diameter) into a large animal model. A step by-step protocol for inter-positional placement of the TEV and real-time digital assessment of the TEV and native carotid arteries is described here. In vivo monitoring is made possible by the implantation of flow probes, catheters and ultrasonic crystals (capable of recording dynamic diameter changes of implanted TEVs and native carotid arteries) at the time of surgery. Once implanted, researchers can calculate arterial blood flow patterns, invasive blood pressure and artery diameter yielding parameters such as pulse wave velocity, augmentation index, pulse pressures and compliance. Data acquisition is accomplished using a single computer program for analysis throughout the duration of the experiment. Such invaluable data provides insight into TEV matrix remodeling, its resemblance to native/sham controls and overall TEV performance in vivo.

Surgical Technique for the Implantation of Tissue Engineered Vascular Grafts and Subsequent In Vivo Monitoring

A step-by-step protocol for the inter-positional placement of Tissue Engineered Vessels (TEVs) into the carotid artery of a sheep using end-to-end anastomosis and real-time digital assessment in vivo until animal sacrifice.

티슈 엔지니어링 혈관 이식 및 이후의 이식을위한 수술 기법<em&gt; 생체</em&gt; 모니터링

The development of Tissue Engineered Vessels (TEVs) is advanced by the ability to routinely and effectively implant TEVs (4-5 mm in diameter) into a large ...

Generation of Scalable, Metallic High-Aspect Ratio Nanocomposites in a Biological Liquid Medium

The goal of this protocol is to describe the synthesis of two novel biocomposites with high-aspect ratio structures. The biocomposites consist of copper and cystine, with either copper nanoparticles (CNPs) or copper sulfate contributing the metallic component. Synthesis is carried out in liquid under biological conditions (37 &#176;C) and the self-assembled composites form after 24 hr. Once formed, these composites are highly stable in both liquid media and in a dried form. The composites scale from the nano- to micro- range in length, and from a few microns to 25 nm in diameter. Field emission scanning electron microscopy with energy dispersive X-ray spectroscopy (EDX) demonstrated that sulfur was present in the NP-derived linear structures, while it was absent from the starting CNP material, thus confirming cystine as the source of sulfur in the final nanocomposites. During synthesis of these linear nano- and micro-composites, a diverse range of lengths of structures is formed in the synthesis vessel. Sonication of the liquid mixture after synthesis was demonstrated to assist in controlling average size of the structures by diminishing the average length with increased time of sonication. Since the formed structures are highly stable, do not agglomerate, and are formed in liquid phase, centrifugation may also be used to assist in concentrating and segregating formed composites.

Here we present a protocol to synthesize novel, high-aspect ratio biocomposites under biological conditions and in liquid media. The biocomposites scale from nanometers to micrometers in diameter and length, respectively. Copper nanoparticles (CNPs) and copper sulfate combined with cystine are the key components for the synthesis.

생물 액체 배지에서 확장 성, 금속 높은 가로 세로 비율 나노 복합 재료의 생성

The goal of this protocol is to describe the synthesis of two novel biocomposites with high-aspect ratio structures. The biocomposites consist of copper ...

Synthesis of Keratin-based Nanofiber for Biomedical Engineering

Electrospinning, due to its versatility and potential for applications in various fields, is being frequently used to fabricate nanofibers. Production of these porous nanofibers is of great interest due to their unique physiochemical properties. Here we elaborate on the fabrication of keratin containing poly (&#949;-caprolactone) (PCL) nanofibers (i.e., PCL/keratin composite fiber). Water soluble keratin was first extracted from human hair and mixed with PCL in different ratios. The blended solution of PCL/keratin was transformed into nanofibrous membranes using a laboratory designed electrospinning set up. Fiber morphology and mechanical properties of the obtained nanofiber were observed and measured using scanning electron microscopy and tensile tester. Furthermore, degradability and chemical properties of the nanofiber were studied by FTIR. SEM images showed uniform surface morphology for PCL/keratin fibers of different compositions. These PCL/keratin fibers also showed excellent mechanical properties such as Young&#39;s modulus and failure point. Fibroblast cells were able to attach and proliferate thus proving good cell viability. Based on the characteristics discussed above, we can strongly argue that the blended nanofibers of natural and synthetic polymers can represent an excellent development of composite materials that can be used for different biomedical applications.

Electrospun nanofibers have a high surface area to weight ratio, excellent mechanical integrity, and support cell growth and proliferation. These nanofibers have a wide range of biomedical applications. Here we fabricate keratin/ PCL nanofibers, using the electrospinning technique, and characterize the fibers for possible applications in tissue engineering.

의 생명 공학에 대한 각질 기반의 나노 섬유의 합성

Electrospinning, due to its versatility and potential for applications in various fields, is being frequently used to fabricate nanofibers. Production of ...

A Facile and Eco-friendly Route to Fabricate Poly(Lactic Acid) Scaffolds with Graded Pore Size

Over the recent years, functionally graded scaffolds (FGS) gaineda crucial role for manufacturing of devices for tissue engineering. The importance of this new field of biomaterials research is due to the necessity to develop implants capable of mimicking the complex functionality of the various tissues, including a continuous change from one structure or composition to another. In this latter context, one topic of main interest concerns the design of appropriate scaffolds for bone-cartilage interface tissue. In this study, three-layered scaffolds with graded pore size were achieved by melt mixing poly(lactic acid) (PLA), sodium chloride (NaCl) and polyethylene glycol (PEG). Pore size distributions were controlled by NaCl granulometry and PEG solvation. Scaffolds were characterized from a morphological and mechanical point of view. A correlation between the preparation method, the pore architecture and compressive mechanical behavior was found. The interface adhesion strength was quantitatively evaluated by using a custom-designed interfacial strength test. Furthermore, in order to imitate the human physiology, mechanical tests were also performed in phosphate buffered saline (PBS) solution at 37 &#176;C. The method herein presented provides a high control of porosity, pore size distribution and mechanical performance, thus offering the possibility to fabricate three-layered scaffolds with tailored properties by following a simple and eco-friendly route.

A Facile and Eco-friendly Route to Fabricate PolyLactic Acid Scaffolds with Graded Pore Size

In this work, poly(lactic acid)/polyethylene glycol (PLA/PEG) scaffolds were prepared by using a combination of melt mixing and selective leaching. The method herein discussed permitted to develop three-layer scaffolds by highly controlling both porosity and pore size. The mechanical properties were also evaluated in a physiological environment.

손쉬운 및 환경 친화적 인 경로는 그레이드 기공 크기와 폴리 (젖산) 공사장 공중 발판을 제조

Over the recent years, functionally graded scaffolds (FGS) gaineda crucial role for manufacturing of devices for tissue engineering. The importance of ...

Synthesis of Multi-walled Carbon Nanotubes Modified with Silver Nanoparticles and Evaluation of Their Antibacterial Activities and Cytotoxic Properties

In this study, multi-walled carbon nanotubes (MWCNTs) were treated with an aqueous sulfuric acid solution to form an oxygen-based functional group. Silver MWCNTs were prepared by the reductive deposition of silver from an aqueous solution of AgNO3 on the oxidized MWCNTs. Given the unique color of the CNTs, it was not possible to apply them to the minimum inhibitory concentration or mitochondrial toxicity assays to evaluate the toxicity and antibacterial properties, since they would interfere with the assays. The inhibition zone and minimum bactericidal concentration for the Ag-MWCNTs were measured and Live/Dead and Trypan Blue assays were used to measure the toxicity and antibacterial properties without interfering with the color of the CNTs.

In this study, antimicrobial nanomaterials were synthesized by acidic oxidation of multiwalled carbon nanotubes and subsequent reductive deposition of silver nanoparticles. Antimicrobial activity and cytotoxicity tests were performed with the as-prepared nanomaterials.

나노 입자와 그들의 항균 활동 및 세포 독성 속성의 평가 수정 다중 벽 탄소 나노튜브의 합성

In this study, multi-walled carbon nanotubes (MWCNTs) were treated with an aqueous sulfuric acid solution to form an oxygen-based functional group. Silver ...

Rigid Embedding of Fixed and Stained, Whole, Millimeter-Scale Specimens for Section-free 3D Histology by Micro-Computed Tomography

For over a hundred years, the histological study of tissues has been the gold standard for medical diagnosis because histology allows all cell types in every tissue to be identified and characterized. Our laboratory is actively working to make technological advances in X-ray micro-computed tomography (micro-CT) that will bring the diagnostic power of histology to the study of full tissue volumes at cellular resolution (i.e., an X-ray Histo-tomography modality). Toward this end, we have made targeted improvements to the sample preparation pipeline. One key optimization, and the focus of the present work, is a straightforward method for rigid embedding of fixed and stained millimeter-scale samples. Many of the published methods for sample immobilization and correlative micro-CT imaging rely on placing the samples in paraffin wax, agarose, or liquids such as alcohol. Our approach extends this work with custom procedures and the design of a 3-dimensional printable apparatus to embed the samples in an acrylic resin directly into polyimide tubing, which is relatively transparent to X-rays. Herein, sample preparation procedures are described for the samples from 0.5 to 10 mm in diameter, which would be suitable for whole zebrafish larvae and juveniles, or other animals and tissue samples of similar dimensions. As proof of concept, we have embedded the specimens from Danio, Drosophila, Daphnia, and a mouse embryo; representative images from 3-dimensional scans for three of these samples are shown. Importantly, our methodology leads to multiple benefits including rigid immobilization, long-term preservation of laboriously-created resources, and the ability to re-interrogate samples.

We developed protocols and designed a custom apparatus to enable embedding of millimeter-scale specimens. We present sample preparation procedures with an emphasis on embedding in acrylic resin and polyimide tubing to achieve rigid immobilization and long-term storage of specimens for the interrogation of tissue architecture and cell morphology by micro-CT.

엄밀한 포함의 고정 및 스테인드, 전체, 마이크로 단층에 의해 섹션-무료 3D 조직학에 대 한 밀리미터 단위 표본

For over a hundred years, the histological study of tissues has been the gold standard for medical diagnosis because histology allows all cell types in ...