Gli autori ringraziano il Dott. Pooneh Bagher e il Dr. Erika Westcott per i commenti editoriali nella preparazione del manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto dal National Heart, Lung and Blood Institute dei National Institutes of Health ai numeri di aggiudicazione R37-R01-HL041026 e HL086483 alla SSS e F32-HL107050 a MJS. Questo contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale del National Institutes of Health.

1. Preparazione di apparecchiatura: camera di flusso, pipette, e soluzioni <ol><li> Flusso camera: utilizzare una camera di flusso con una x 50 mm coprioggetto di vetro 24 millimetri sul fondo per superfuse i tubi endoteliali isolate (vedi Figura 1A). Prima di montare la camera, lavare i vetrini con entrambi 3% HCl e il 70% di etanolo, sciacquare con acqua ultrapura, e asciugare con azoto. </li><li> Pipette: Tre diversi tipi di pipette vengono utilizzati durante il protocollo: incannulamento, triturazione, e pinning. Sia l&#39;incannulazione e pipette pinning possono essere effettuate prima del giorno dell&#39;esperimento, ma la pipetta triturazione dovrebbero essere il giorno di quanto richiede la conoscenza del diametro del vaso di dimensioni lume appropriato. <ol><li> Pipette incannulazione: Al fine di lavare i globuli rossi dal lume, tirare tubi capillari in vetro borosilicato con un estrattore micropipetta di avere le estremità lunghe, affusolate. Rompere le estremità con una pinza ad un diametro esterno ~ 30% less rispetto a quella delle arterie (~ 50-80 micron), e il fuoco lucidare la punta a essere liscia (vedi Figura 1B). E &#39;utile anche inclini le punte delle pipette a circa 45 °. </li><li> Pipette triturazione: dissociare meccanicamente le cellule muscolari lisce e avventizia dai tubi endoteliali, fare pipette triturazione da tubi capillari di vetro borosilicato. Preparare tubi capillari come sopra, e rompere l&#39;estremità con una pinza. Suggerimento: Utilizzare un dispositivo di punteggio vetro per rendere più facile rompere il muro più spessa del vetro triturazione pipetta pulito. Rompere la pipetta al diametro interno determinato il giorno dell&#39;esperimento, circa 10-20 micron maggiore di quella del diametro esterno della nave da cui saranno isolati tubi endoteliali. Fuoco lucidare le estremità rotte fino a che liscio (vedi Figura 1C). </li><li> Pinning pipette: Per stabilizzare il tubo endoteliale all&#39;interno della camera di flusso, fare pinning pipette per garantire la endoteliale tUBE contro il fondo vetrino della camera. Tirare tubi capillari di vetro nello stesso modo come le pipette di incannulazione. Poi rompere le estremità con pinza ad un diametro di ~ 100 micron, e il fuoco lucidare fino a quando le punte sono sigillate, arrotondati e lisci (vedi Figura 1D). Nota: Se la punta della pipetta pinning non è completamente sigillato, il fluido entra nel lume e può confondere risultati sperimentali. </li></ol></li><li> Soluzioni: Preparare tutte le soluzioni in ultrapura (18,2 mW) H 2 O e sterilizzarli attraverso un filtro 0,2 micron. Assicurarsi che l&#39;osmolalità delle soluzioni è compreso tra 285-300 mOsm. Soluzioni rimangono buone per circa due settimane se conservati a 4 ° C. <ol><li> Soluzione dissezione: La soluzione salina utilizzata durante la dissezione dell&#39;arteria epigastrica superiore è composto di (in mmol / L): 137 NaCl, KCl 5, 1 MgCl2, 10 N-2-hydroxyethylpiperazine-N&#39;-2-etansolfonico acido ( HEPES), 10 glucosio, 0,01 sodio nitroprussiato (SNP), und 0,1% di siero albumina bovina (BSA) con un pH di 7,4. L&#39;SNP donatore NO è incluso per aiutare a rilassare cellule muscolari lisce, rendendo così più facili da cannulare l&#39;arteria e per facilitare la rimozione delle cellule muscolari lisce durante triturazione. </li><li> Soluzione dissociazione: La soluzione salina utilizzata durante la dissociazione del tubo endoteliale è composto di (in mmol / L): 137 NaCl, KCl 5, 1 MgCl 2, 10, 10 HEPES glucosio, 2 CaCl 2, e 0,1% BSA, con un pH di 7,4. Per un 1 ml aliquota di questo buffer, aggiungere: papaina 0,62 mg / ml, 1,5 mg / ml di collagenasi e 1,0 mg / ml ditioeritritolo. Poiché gli enzimi di fornitori diversi possono avere diversi livelli di attività enzimatica, i numeri di prodotto di quelli utilizzati per questo lavoro sono incluse per riferimento nella tabella dei materiali. Nota: Durante il protocollo sia buffer di dissociazione e buffer di dissociazione con gli enzimi vengono utilizzati in diverse fasi. </li><li> Soluzione superfusione: La soluzione salina fisiologica (PSS) utilizzato per superfusing tubo endoteliale isolato è composto di (in mmol / L): 137 NaCl, KCl 5, 1 MgCl 2, 10, 10 HEPES glucosio e 2 CaCl 2, con un pH di 7,4. </li><li> Preparare tamponi e soluzioni prima di iniziare le procedure chirurgiche. Rimuovere le soluzioni da 4 ° C e aliquota 50 ml di tampone di dissezione in una beuta Erlenmeyer da 200 ml e posizionarlo sul ghiaccio. Inoltre, aliquote di 50 ml di dissociazione tampone senza enzimi e posizionarlo sul banco equilibrare a temperatura ambiente. Rimuovere la soluzione di superfusione da 4 ° C e lasciarlo equilibrare a temperatura sul banco camera. </li></ol></li></ol> 2. Preparazione degli animali Assicurarsi che tutte le procedure ei protocolli che coinvolgono animali sono in accordo con il National Institutes of Health Guide per la cura e l&#39;uso di animali da laboratorio. Le procedure qui descritte sono state approvate dal Comitato cura degli animali ed uso dell &#39;Università diMissouri. <ol><li> Utilizzare maschio o femmine di topo almeno 9 settimane e studiare singolarmente. Anestetizzare un mouse con sodio pentobarbital (60 mg / kg) via intraperitoneale (ip) iniezione. Tip: La diluizione del pentobarbital 10 mg / ml in soluzione fisiologica sterile prima dell&#39;iniezione riduce la possibilità di sovradosaggio. </li><li> Anestesia compromette la regolazione della temperatura, in modo da mantenere il mouse calda immediatamente dopo la prima iniezione di pentobarbital. Utilizzo di un supporto metallico (cestello in alluminio ventilato) sopra una piastra di riscaldamento (calibrato a ~ 37 ° C) funziona bene per mantenere la temperatura del mouse stabile. In alternativa, utilizzare una lampada di calore, avendo cura di posizionarlo ad una opportuna distanza dal mouse. Monitorare il mouse ogni 5-10 minuti fino a quando il livello adeguato di anestesia è raggiunto (mancanza di recesso ai piedi o la coda pizzico). Una dose supplementare può essere richiesto dopo 15-20 min. E &#39;meglio procedere lentamente e con cautela per evitare sovradosaggio, soprattutto con obesi, di età compresa, o animales altrimenti sottolineato. </li><li> Rimuovere i capelli dal lato ventrale da barba accuratamente con piccoli tosatrici pet. Particolare attenzione deve essere presa per evitare traumi all&#39;animale. E &#39;utile rimuovere tutti i capelli da una zona che attraversa le ascelle alla zona pubica. Rimuovere tutti i capelli vagamente aggrappato con un tampone imbevuto di alcool fresca. </li><li> Posizionare il mouse sulla sua schiena, sdraiato sia anteriori e posteriori degli arti sparsi per esporre come gran parte della parete addominale il più possibile. Se necessario, utilizzare il nastro laboratorio per fissare le gambe in maniera spread-eagle. </li></ol> 3. Isolamento della arteria epigastrica Superiore <ol><li> Fare una piccola incisione attraverso la pelle appena sopra l&#39;area della regione pubica. Assicurarsi che solo la pelle viene tagliata evitando danni al muscolo addominale sottostante; estendere l&#39;incisione lateralmente in ogni direzione verso rispettive arti posteriori. Continua l&#39;incisione rostralmente lungo la linea mediana ventrale all&#39;inizio della gabbia toracica e lan estendere l&#39;incisione lateralmente in ogni direzione per rispettive arti anteriori. </li><li> Sollevare delicatamente la pelle e usare le forbici per tagliare il tessuto connettivo che tiene la pelle al muscolo sottostante, esponendo in tal modo l&#39;intera superficie della muscolatura addominale (Figura 3A). Irrigare il muscolo esposta con temperatura ambiente di soluzione salina allo 0,9%. </li><li> A causa delle piccole dimensioni della VAS, posizionare l&#39;animale sotto uno stereomicroscopio per ulteriori procedure. Sollevare il cuscinetto adiposo trova nella parte inferiore dello sterno con una pinza, ed effettuare una incisione attraverso esso. Continuare l&#39;incisione lungo la costola inferiore, facendo attenzione a non tagliare troppo in profondità nel tessuto sottostante. La VAS deve essere visibile, fare attenzione per evitare di danneggiarlo. Una volta che l&#39;incisione è completa, irrigare il tessuto esposto temperatura ambiente con soluzione salina allo 0,9%. </li><li> Dopo lo strato superiore del muscolo scheletrico è stato ritirato, il mare e muscolo sottostante sono facilmente identificabili. Suggerimento: Nota la lunghezza diSEA in vivo prima di isolare estendere tubi endoteliali (che accorciano lungo il loro asse su isolamento) per approssimare la lunghezza iniziale. Utilizzando pinze e forbici, accise accuratamente lo strato muscolare sottile sotto la SEA. </li><li> Utilizzando pinze ad angolo, passa una lunghezza di 6-0 sutura di seta sotto il mare e legare l&#39;arteria e la sua vena adiacente a tenerlo sotto pressione e sangue conservato all&#39;interno del lume del vaso per facilitare la visualizzazione durante il successivo isolamento e la pulizia. </li><li> Ripetere la procedura di legatura mare sul lato controlaterale. </li><li> Una volta che entrambi i mari sono stati legatura, fare un&#39;incisione lungo la linea mediana dei muscoli addominali per separare i rispettivi lati. </li><li> Estendere l&#39;incisione lateralmente in ogni direzione come fatto per la pelle, poi continuare l&#39;incisione verticalmente lungo il bordo esterno di separare completamente i muscoli addominali dal corpo. Evitare danni ai vasi alimentato dalla SEA per mantenere il lume pressione. </li><li> Cut SEA sopra la legatura di mantenere la tenuta, e posizionare il muscolo isolato e arteria in un becher da 50 ml contenente 10 ml di 4 ° C buffer di dissezione. </li><li> Ripetere la procedura per l&#39;altro lato del ventre e incubare i tessuti nel buffer dissezione per 10 min. </li><li> Posizionare il muscolo addominale contenente il mare in un (4 ° C) camera di dissezione contenente tampone dissezione refrigerata (vedi Figura 3B). La camera di dissezione consiste in una piastra di Petri con uno strato di Sylgard (polidimetilsilossano [PDMS]) nella parte inferiore. </li><li> Utilizzando perni di insetti (0,15 millimetri), allungare la SEA isolata e muscoli addominali ad approssimare lunghezze in vivo (illustrato qui sopra) e fissarlo al Sylgard. Tip: Orientando il muscolo tale che lo strato sottile di fronte al peritoneo è in cima rende il mare facilmente visibile utilizzando transilluminazione. </li><li> Utilizzando gli strumenti di microdissezione pregiati e di lavoro dal sito a monte della legatura verso l&#39;estremità a valle, cancellare il mare dalla sua vena associato e il tessuto circostante fino a quando il primo sito ramo maggiore (1-2 cm). Poi asportare il SEA tagliandolo appena sopra il sito di succursale e appena sotto la legatura. </li><li> Per rimuovere il sangue conservato all&#39;interno del lume del vaso, incannulare la SEA e lavare con tampone di ghiaccio dissezione a freddo. Utilizzando un pezzo di tubazione di silastic, collegare l&#39;estremità posteriore di una pipetta incannulamento di una siringa da 5 ml contenente ghiaccio tampone dissezione a freddo e fissare la micropipetta in un micromanipolatore per posizionare la punta all&#39;interno della camera di dissezione per incannulare la SEA. </li><li> Una volta che tutti gli eritrociti sono lavata, rimuovere la VAS dalla pipetta incannulamento, e sollevare la pipetta fuori del piatto dissezione. </li><li> Tagliare la VAS in segmenti più piccoli ogni 1-3 mm di lunghezza. Questi segmenti più corti facilitano l&#39;isolamento di tubi endoteliali. </li></ol> 4. L&#39;isolamento del tubo Endothelial <ol><li> Riempire un cult 12 millimetri x 75 millimetri di vetroa metà tubo ure con ghiaccio buffer di dissezione a freddo. Utilizzando pinze ad angolo, trasferire i pezzi arteriosi nel tubo cultura e posto sul ghiaccio. A questo punto, unire gli enzimi digestivi con tampone di dissociazione per un volume finale di 1 ml in un 12 mm x 75 millimetri tubo cultura separato (vedi 1.3.2 Solutions) e preriscaldare la soluzione a 37 ° C con una piastra riscaldante. </li><li> Mentre il buffer di dissociazione e gli enzimi sono in fase di riscaldamento, aspirare accuratamente il buffer dissezione dal tubo cultura lasciando un piccolo volume contenente i segmenti di flotta. </li><li> Aggiungere delicatamente temperatura ambiente tampone di dissociazione senza enzimi per lavare via restante tampone di dissezione. Tip: Aggiungere la soluzione tampone di dissociazione lentamente in modo che i pezzi arteriose rimangono sul fondo della provetta di coltura per risparmiare tempo di attesa per il loro reinsediamento. Aumentare la temperatura tampone su più passi da ghiaccio (4 ° C), a temperatura ambiente (~ 24 ° C), a 37 ° C per minimizzare gli urti. </li><li> Aspirare accuratamente la dissociation tampone dalla provetta cultura, ancora una volta avendo cura di lasciare un piccolo volume contenente i segmenti di flotta. </li><li> Rimuovere il tampone di dissociazione preriscaldo con enzimi dal blocco termico, trasferire 1 ml di soluzione enzimatica nella provetta di coltura contenente i segmenti del vaso, e porre il tubo cultura nel blocco riscaldante. Incubare a 37 ° C per 30 min. </li><li> Durante l&#39;incubazione con enzimi, preparare la pipetta triturazione, reinterro con olio minerale e fissarlo su una microsiringa che è montato in un micromanipolatore. Quindi ritrarre lo stantuffo microsiringa per riempire la pipetta con 2 nl di tampone dissociazione e posizionare la punta della pipetta sopra la camera di flusso. </li><li> Al termine dei 30 minuti di incubazione, rimuovere il tubo cultura dal blocco termico e con attenzione aspirare il tampone come sopra. </li><li> Lavare i segmenti arteriosi con 4 ml di tampone di dissociazione temperatura ambiente. Nota: Non è più necessario mantenere il segm navegenitori nella parte inferiore della provetta di coltura; disturbare i pezzi arteriosi aiuta ad assicurare effettivamente che gli enzimi residui sono efficacemente rimossi. </li><li> Trasferimento segmento un recipiente per la camera di flusso aspirando delicatamente con una micropipetta 1 ml, e posizionarlo nella camera di flusso di 1 ml di tampone di dissociazione. </li><li> Utilizzando micromanipolatore contenente la microsiringa, posizionare la punta della pipetta triturazione vicino ad una estremità del segmento del vaso. </li><li> Aspirare il segmento del vaso (500 nl ritirato) nella pipetta triturazione lentamente (225 nl / sec), in modo da non provocare sollecitazioni meccaniche alla EC, e poi espellerlo nuovamente nella camera. Se la digestione è stata eseguita correttamente, le cellule muscolari lisce e avventizia saranno dissociate dal tubo endoteliale. </li><li> Ripetere la triturazione fino a quando tutte le cellule muscolari lisce sono dissociate. Essere consapevoli del fatto che la triturazione eccessivo (4x o superiore) può danneggiare la EC e renderli insensibili agli agonisti. Suggerimento:usando la pipetta triturazione, spostare il avventizia lontano dal tubo endoteliale appena possibile per evitare che impiglianti tubo. Nota: Utilizzando la pipetta triturazione, il tubo endoteliale isolato può essere aspirato e trasferito in una camera separata. </li><li> Posizionare il tubo endoteliale nel centro della camera di flusso, allineate lungo la direzione del flusso, e rimuovere la pipetta triturazione. </li><li> Sicuri pipette pinning in micromanipolatori montate alle estremità della camera di flusso, e posizionare le punte a rispettive estremità del tubo endoteliale. </li><li> Abbassare una pipetta pinning su un&#39;estremità del tubo per premere contro il fondo della camera. Posizionare la seconda pipetta pinning nello stesso modo all&#39;estremità opposta del tubo. Nota: Posizionamento delle pipette pinning è un compromesso tra il tubo di fissaggio (mettendoli lontano dall&#39;estremità del tubo) e consentendo un più immagini / area sperimentale (posizionandole più vicino all&#39;estremità del tubo). Individuazione torlo ~ 50 micron da ciascuna estremità del tubo funziona bene. Così come la pipetta pinning contatto con il tubo, lentamente ritrarlo lungo l&#39;asse del tubo, estendendo così di approssimare in vivo lunghezza e quindi premere la pipetta contro il fondo della camera per fissare il tubo. </li><li> Iniziare il flusso della soluzione superfusione, e lasciare il tubo endoteliale riposare per almeno 20 minuti per equilibrare e rispettare (vedi Figura 3C). Utilizzare una pompa peristaltica per mantenere il flusso di fluido costante (superfusione) attraverso il tubo endoteliale. Nota: pipette Inchiodamento possono essere rimosse una volta che il tubo endoteliale ha aderito al fondo della camera di flusso (~ 25 min) oa sinistra per garantire il tubo endoteliale non è spostato. </li></ol> 5. Dye Caricamento e Imaging di calcio <ol><li> Per visualizzare le risposte intracellulari di calcio, caricare il tubo endoteliale con fluo-04:00 colorante a temperatura ambiente (~ 24 ° C). Interrompere il flusso del fluido nella vasca da bagno, e aggiungere fluo-4AM alla camera ad una concentrazione finale di 10 mM. Attendere 10 minuti per consentire al colorante di entrare nelle cellule, poi superfuse tubo endoteliale con PSS fresco per 20 min a garantire colorante extracellulare viene rimosso e questo colorante intracellulare è stato completamente deesterificata. </li><li> Eseguire l&#39;imaging di calcio. Per questo lavoro, un microscopio verticale (vedi figura 2) dotato di un sistema di imaging confocale disco rotante è stato utilizzato a temperatura ambiente. Eccitare il colorante fluorescente calcio con un laser 491 nm e acquisire immagini (a 500-550 nm di emissione) utilizzando una fotocamera digitale intensificata. </li></ol>

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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potassium+channels+and+membrane+potential+in+the+modulation+of+intracellular+calcium+in+vascular+endothelial+cells.">Potassium channels and membrane potential in the modulation of intracellular calcium in vascular endothelial cells.</a> J. Cardiovasc. Electrophysiol. 15, 598-610 (2004).</li><li>Jackson, W. F., Huebner, J. M., Rusch, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+isolation+and+characterization+of+single+vascular+smooth+muscle+cells+from+cremasteric+arterioles.">Enzymatic isolation and characterization of single vascular smooth muscle cells from cremasteric arterioles.</a> Microcirculation. 4, 35-50 (1997).</li></ol>

Qui si descrive l&#39;isolamento di tubi endoteliali dal mare e l&#39;uso di questo preparato per visualizzare Ca 2 + eventi di segnalazione all&#39;interno della sua costitutiva EC. Questa procedura è stata adattata da un originariamente sviluppato per isolare i tubi endoteliali da arteriole del muscolo cremastere criceto 8. Utilizzando piccole variazioni delle tecniche qui presentate, abbiamo isolato i tubi endoteliali da una varietà di letti vascolari, tra cui: le arterie di alimentazione del muscolo criceto riavvolgitore e guancia arteriole sacchetto 10, topo superiore arteria epigastrica 6,7,9, il mouse mesenterica e cerebrale arterie e microvasi linfatici (osservazioni non pubblicate; riferimenti sono inclusi per isolare i vasi mesenterici 12 e vasi cerebrali 13). Isolare i tubi endoteliali da nuovi letti vascolari può richiedere modifiche al protocollo originale. Se l&#39;isolamento non è riuscita, è meglio cominciare alterando i tempi di digestione:Aumentare il tempo di digestione se tubi endoteliali sono difficili da isolare da cellule muscolari lisce e avventizia e ridurre il tempo di digestione se il tubo endoteliale non rimane intatto. Se alterando tempi di digestione non è riuscita, regolando la concentrazione di enzimi digestivi o la temperatura di digestione deve essere provato. Un&#39;altra opzione è quella di ridurre il diametro interno della pipetta triturazione, che aumenta la forza di taglio a rimuovere le cellule muscolari lisce. Aumentando la velocità di espulsione del fluido può essere processato per lo stesso effetto, ma è più probabile che danneggiare la preparazione. Va riconosciuto che potrebbe non essere possibile isolare tubi endoteliali intatte dalle navi in ​​cui le cellule endoteliali non sono ben collegate tra loro da proteine ​​giunzionali. Dissociazione delle cellule muscolari lisce seguente digestione enzimatica è stata inizialmente effettuata utilizzando una pipetta mano stile 8. Abbiamo affinato la procedura di triturazione mediante un microsyrsistema inge, che ha permesso l&#39;isolamento coerente di tubi endoteliali più lunghi (fino a 3 mm) 6. Quando si utilizza questo sistema, la pipetta triturazione viene riempita con olio minerale per fornire una colonna di fluido continuo tra il pistone di controllo movimento fluido e PSS contenente il segmento del vaso. Incomprimibilità del liquido con la forza motrice costante dei risultati pistone microsiringa a taglio costante la nave è forzato attraverso la punta della pipetta. Al contrario, le tecniche usate spesso utilizzati per le cellule dissociazione (ad esempio comprimendo l&#39;ampolla gomma all&#39;estremità di una pipetta Pasteur) comporta la compressione dell&#39;aria, che introduce variabilità nella pressione di guida e, quindi, di taglio esercitata sulla punta della pipetta. Ci sono molteplici vantaggi per la preparazione del tubo per lo studio della funzione endoteliale nei microvasi. La prima è che il processo di isolamento prevede distinte popolazioni omogenee autoctone cellulari di EC e mu lisciacellule SCLE. Dal momento che l&#39;EC rimangono fisicamente collegato i tubi, che sono distinti da singole cellule muscolari lisce, che conservano una configurazione &quot;C&quot; se rimangono rilassati durante la triturazione. Così rispettivi tipi di cellule sono facilmente distinguibili, ad esempio, quando l&#39;ottenimento di campioni per le tecniche molecolari come real-time PCR e immunoistochimica 10. Poiché più tubi sono isolati da una sola nave (o da navi bilaterali come fatto per il mare), i dati molecolari e dati funzionali possono essere ottenuti dalle stesse navi di un determinato animale. Così espressione molecolare può essere correlata con il comportamento funzionale del microvascolari. Inoltre, gli eventi di segnalazione sia intra ed intercellulari intrinseche microvascolari possono essere risolti indipendente dalla influenza di forze emodinamiche (pressione, flusso), agenti vasoattivi trasportati nel flusso sanguigno (ad esempio ormoni), o da cellule muscolari lisce circostanti (es60, tramite l&#39;accoppiamento myoendothelial 14-16), i nervi 17, o tessuto parenchima 18. È importante sottolineare che, poiché l&#39;endotelio è appena isolate da microvasi designate, non vi è alcuna alterazione di fenotipo che altrimenti associata coltura EC 19-21. Ad esempio, cellule endoteliali coltivate perdono l&#39;espressione dei recettori muscarinici e quindi alterano i loro profili segnalazione di calcio. Inoltre, le proprietà elettrofisiologiche di EC può cambiare nella cultura 22. Poiché i singoli EC rimangono accoppiati attraverso canali giunzioni gap funzionali, il tubo endoteliale presenta un modello ideale per studiare la conduzione di 2 + e Ca segnali elettrici tra le cellule 6,7. Va inoltre rilevato che le cellule muscolari lisce dissociate sono prontamente studiati con tecniche di patch-clamp per dati complementari alla base della funzione microvascolare 23. Una limitazione chiave al tubo endoteliale modello è l&#39;instabilità del preparato con l&#39;aumentare della temperatura. Mentre i nostri preparati dal mare hanno dimostrato stabile e sano a temperatura ambiente (~ 24 ° C) e per diverse ore a 32 ° C, il degrado morfologico e funzionale si verificano in meno di un&#39;ora a 37 ° C 9. Una seconda importante limitazione del tubo endoteliale è la perdita delle giunzioni myoendothelial ei loro domini di segnalazione intrinseche che sono parte integrante funzione CE nella parete del vaso intatto 14-16. Va inoltre rilevato che, mentre i tubi più lunghi permettono di segnalazione intercellulare da studiare sopra relativamente grandi distanze 6, preparazione di tubi è complicato come ottengono più perché diventa più difficile dissociare completamente circonda le cellule muscolari lisce e avventizia. Abbiamo trovato che i tubi più lunghi di 1-2 mm sono anche più difficile posizionare e fissare nella camera di flusso. Al contrario, mentre tubi più corti (ad esempio &lt;1 mm) enabili Ca 2 + e segnali elettrici da studiare 8, sono difficili da mantenere durante superfusione nella camera di flusso. Infine, anche con isolamento ottimale tubi bilateralmente, c&#39;è materiale sufficiente per la quantificazione tradizionale dell&#39;espressione proteica mediante Western blot, sebbene immunomarcatura fornisce un indice di espressione della proteina e localizzazione. Nonostante queste limitazioni, il tubo endoteliale rappresenta una nuova preparazione per la fornitura di una nuova visione dei meccanismi della funzione delle cellule endoteliale microvascolare in vivo.

In questo protocollo, si descrive l&#39;isolamento di tubi cellule endoteliali dalla SEA mouse. La VAS nasce dalla interna arteria toracica e forniture sangue ossigenato alla muscolatura addominale anteriore. La nostra collaborazione con il mare come modello è attribuibile ad esso fornire relativamente lunghi, segmenti microvasali ramificati che sono adatti per studiare gli eventi di segnalazione intercellulare alla base il ruolo dell&#39;endotelio nel governo e coordinare il rilassamento delle cellule muscolari lisce. Per coloro che sono interessati in tessuti diversi dai muscoli scheletrici, abbiamo trovato questa tecnica per essere facilmente adattato per ottenere tubi endoteliali da microcircolo di cervello, intestino e il sistema linfatico. Le caratteristiche principali di questo metodo sono che le lunghezze intatte (1-3 mm) di endotelio microvascolare sono isolati, protetti contro un vetrino di vetro in una camera di flusso in cui sono superfuse con PSS, e ripreso per il Ca 2 + segnalazione 7-9 oimpalato per 6,8 segnalazione elettrica. All&#39;interno della camera di flusso, la metà superiore di un tubo è esposto alla soluzione superfusione e risponde ad interventi sperimentali, mentre la metà inferiore (a contatto con il coprioggetto) è protetta e rimane quiescente. Oltre a studiare entrambe Ca 2 + eventi di segnalazione intra ed intercellulari, tubi endoteliali possono essere utilizzati per quantitativa real-time PCR per valutare l&#39;espressione genica 6,10, immunoistochimica per indagare l&#39;espressione della proteina 6,10, e gli studi elettrofisiologici per definire le proprietà biofisiche di 6,11 conduzione elettrica. Ci sono diversi vantaggi per la preparazione del tubo endoteliale per lo studio della funzione endoteliale. Il primo è che il processo di isolamento fornisce una semplice distinzione tra due popolazioni cellulari: cellule endoteliali (che restano nella formazione del tubo) e cellule muscolari lisce (dissociato singolarmente; tipicamente &quot;C&quot; quandorilassato). Questo permette per il campionamento selettivo e studio delle proprietà uniche sottostanti contributo rispettive cellule &#39;di funzione dei vasi. In secondo luogo, questo modello consente la risoluzione di segnalare eventi intrinseci all&#39;endotelio, indipendente dall&#39;influenza del flusso sanguigno, che circonda muscolatura liscia, nervi, e parenchima. Terzo, l&#39;endotelio è studiato mentre isolate di fresco, evitando così alterazioni nel gene o espressione della proteina associata coltura cellulare.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="632">
	<colgroup>
		<col span="4" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:159px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:159px;">Fisher</td>
			<td style="width:159px;">S642-212</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:159px;">Potassium Chloride</td>
			<td style="width:159px;">Sigma</td>
			<td style="width:159px;">P9541</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:159px;">Magnesium Sulfate</td>
			<td style="width:159px;">Sigma</td>
			<td style="width:159px;">M2643</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:159px;">Calcium Chloride</td>
			<td style="width:159px;">Sigma</td>
			<td style="width:159px;">C1016</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:159px;">Sodium Nitroprusside</td>
			<td style="width:159px;">Sigma</td>
			<td style="width:159px;">431451</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:159px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:159px;">USB Products</td>
			<td style="width:159px;">9048-46-8</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:159px;">Papain</td>
			<td style="width:159px;">Sigma</td>
			<td style="width:159px;">P-4762</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:159px;">Collagenase</td>
			<td style="width:159px;">Sigma</td>
			<td style="width:159px;">C-8051</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:159px;">Dithioerythritol</td>
			<td style="width:159px;">Sigma</td>
			<td style="width:159px;">D-8255</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:159px;">Boroscilicate Glass (Cannulation and Pinning Pipettes)</td>
			<td style="width:159px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:159px;">G150-4</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:159px;">Boroscilicate Glass (Trituration Pipettes)</td>
			<td style="width:159px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:159px;">4897</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:159px;">Nanoliter Injector Microsyringe</td>
			<td style="width:159px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:159px;">B203MC4</td>
			<td style="width:159px;">Updated to Nanoliter 2010 from Nanoliter 2000</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:159px;">Micro4 Controller</td>
			<td style="width:159px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:159px;">SYS-MICRO4</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:159px;">12 mm x 75 mm Culture Tubes</td>
			<td style="width:159px;">Fisher</td>
			<td style="width:159px;">14-961-26</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:159px;">3-Axis Micromanipulator</td>
			<td style="width:159px;">Siskiyou Corp</td>
			<td style="width:159px;">DT3-100</td>
			<td style="width:159px;">Holding and positioning the pinning pipettes</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:159px;">Flow Chamber</td>
			<td style="width:159px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:159px;">RC-27N</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:159px;">100-1,000 &#181;l Pipette</td>
			<td style="width:159px;">Eppendorf</td>
			<td>3120000062</td>
			<td style="width:159px;">For transferring digested vessel segment to the flow chamber</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:159px;">1 ml Pipette Tips</td>
			<td style="width:159px;">Fisher</td>
			<td style="width:159px;">02-707-405</td>
			<td style="width:159px;">For transferring digested vessel segment to the flow chamber</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:159px;">Upright Microscope</td>
			<td style="width:159px;">Olympus</td>
			<td style="width:159px;">BX51W1</td>
			<td style="width:159px;">The actual microscope is up to the user</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:159px;">Spinning Disc Confocal System</td>
			<td style="width:159px;">Yokogawa</td>
			<td style="width:159px;">CSU-X1</td>
			<td style="width:159px;">Confocal imaging is optional</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:159px;">XR/TURBO EX Camera</td>
			<td style="width:159px;">Stanford Photonics</td>
			<td style="width:159px;">XR/TURBO EX</td>
			<td style="width:159px;">Ideal for our needs; may vary with user</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:159px;">Piper Control Software</td>
			<td style="width:159px;">Stanford Photonics</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:159px;">Imaging software for TURBO EX camera</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:159px;">Stereo Microscrope</td>
			<td style="width:159px;">Leica</td>
			<td style="width:159px;">MZ8</td>
			<td style="width:159px;">may vary with user</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:159px;">Sylgard</td>
			<td style="width:159px;">Dow Corning</td>
			<td style="width:159px;">184</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:159px;">Microdissection Scissors</td>
			<td style="width:159px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:159px;">15003-08</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:159px;">Dumont Forceps</td>
			<td style="width:159px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:159px;">#5/45</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:159px;">Minutiens Insect Pins</td>
			<td style="width:159px;">Austerlitz</td>
			<td style="width:159px;">M size 0.15 mm</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:159px;">GP Millipore Express PLUS Membrane</td>
			<td style="width:159px;">Millipore</td>
			<td style="width:159px;">SCGPT05RE</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:159px;">Pipette Scoring Device</td>
			<td style="width:159px;">Austin Flameworks</td>
			<td style="width:159px;">Small Handheld Scoring Tool</td>
			<td style="width:159px;">austinflameworks.com</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:159px;">Compact Pet Trimmer</td>
			<td style="width:159px;">Wahl Clipper Corp.</td>
			<td style="width:159px;">Model 9966</td>
			<td style="width:159px;">Clean well after each use to maintain life</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of microvascular endothelial tubes from mouse resistance arteries

Il controllo del flusso di sangue dal sistema vascolare resistenza regola il rifornimento di ossigeno e nutrienti concomitante con la rimozione di sottoprodotti metabolici, come esemplificato da esercizio muscolare scheletrico. Cellule endoteliali (EC) linea intima di tutte vasi di resistenza e servono un ruolo chiave nel controllo diametro (ad es vasodilatazione endotelio-dipendente) e, quindi, l&#39;entità e la distribuzione del flusso ematico tissutale. La regolazione della resistenza vascolare da ECS è effettuata mediante intracellulare Ca 2 + segnalazione, che porta alla produzione di autacoidi diffusibili (ad esempio ossido nitrico e metaboliti dell&#39;acido arachidonico) 1-3 e iperpolarizzazione 4,5 che provocano il rilassamento delle cellule muscolari lisce. Così comprendere le dinamiche del endoteliale Ca 2 + segnalazione è un passo fondamentale verso la comprensione dei meccanismi che regolano il controllo del flusso di sangue. Isolare i tubi endoteliali elimina variabili confondenti associati blOOD nel lume del vaso e cellule muscolari lisce circostanti e nervi perivascolari, che influenzano altrimenti struttura e funzione CE. Qui vi presentiamo l&#39;isolamento di tubi endoteliali dalla arteria epigastrica superiore (SEA) utilizzando un protocollo ottimizzato per questo vaso. Per isolare i tubi endoteliali da un topo anestetizzato, il mare è ligato in situ per mantenere il sangue all&#39;interno del lume del vaso (per facilitare la visualizzazione durante la dissezione), e l&#39;intero foglio di muscolo addominale viene asportato. La VAS è sezionato libero da circonda le fibre muscolari scheletriche e del tessuto connettivo, il sangue viene lavata dal lume, e mite digestione enzimatica è effettuata per consentire la rimozione di avventizia, nervi e cellule muscolari lisce con delicato triturazione. Queste preparazioni appena isolate di endotelio intatto mantengono la loro morfologia originaria, con i singoli EC rimanendo funzionalmente accoppiati l&#39;uno all&#39;altro, in grado di trasferire chimica e SI elettricognals intercellularly attraverso giunzioni gap 6,7. Oltre a fornire una nuova visione biofisica segnalazione di calcio e di membrana, questi preparativi consentono studi molecolari di espressione genica e localizzazione delle proteine ​​all&#39;interno nativa microvascolari.

Risposte di calcio possono essere avviate in tubi endoteliali appena isolati utilizzando acetilcolina (ACH). In questo film, un tubo endoteliale caricato con 10 mM fluo-04:00 viene stimolato con superfusione di 1 micron ACh (Movie 1). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50759/SochaandSegal_movie1.avi" target="_blank">Clicca qui per vedere film</a> . Il colorante è eccitato a 491 nm ed emissione viene registrato 500-550 nm utilizzando una fotocamera del dispositivo ad accoppiamento di carica intensificata. Stack di immagini sono acquisite a 120 fotogrammi / sec per un periodo di 25 secondi e possono quindi essere mediate (ad esempio a 40 fotogrammi / sec). Immagini di fluorescenza rappresentativo nel tempo sono riportati nella Figura 4. <img alt="Figura 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50759/50759fig1.jpg" width="500px" /> Figura 1. Flusso camera e pipette utilizzate durante l&#39;isolamento di tubi endoteliali. </strong&gt; A) della camera di flusso montato con un 24 millimetri x 50 mm coprioggetto di vetro come base. B) Esempi di una tirata (a sinistra) e un tirato, rotto, lucido e ad angolo (a destra) incannulamento pipetta. Questo pipetta viene utilizzato per ripulire eritrociti dal lume dell&#39;arteria seguente dissezione. Scale bar = 200 micron. C) Esempi di una tirata (a sinistra) e un tirato, rotto e lucido (a destra) triturazione pipetta. Il diametro interno di questa pipetta è determinato dal diametro esterno dell&#39;arteria. Barra della scala = 200 micron. D) Esempi di una tirata (a sinistra) e una pipetta a destra) pinning tirato, rotto e levigato (. La punta della pipetta è arrotondato e completamente sigillato per fissare il tubo endoteliale nella camera di flusso. Scale bar = 200 micron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50759/50759fig1highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita</a> . <pclass = &quot;jove_content&quot; fo: keep-together.within-page = &quot;always&quot;&gt; <img alt="Figura 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50759/50759fig2.jpg" width="500px" /> Figura 2. Spinning disco microscopio confocale per l&#39;imaging di Ca 2 + segnali. A) microscopio Montante utilizzato per l&#39;imaging del calcio. B) (a) un&#39;unità disco rotante confocale con una (b) intensificare carica fotocamera coupled device. C) obiettivi di immersione (a) 63x ( NA = 1) e (b) 20X (NA = 0.5) utilizzato per l&#39;imaging. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50759/50759fig2highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita</a> . <img alt="Figura 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50759/50759fig3.jpg" width="500px" /> Figura 3. Isolamento del muscolo addominale e l&#39;arteria epigastrica superiore. A </strong&gt;) anestetizzato mouse con muscoli addominali a vista e irrigato con temperatura ambiente di soluzione salina allo 0,9%. Le frecce rosse indicano i siti sotto i cuscinetti di grasso in cui rispettive VAS entrano ogni muscolo retto addominale (cioè dove dovrebbero essere ligati navi). Scala bar = 1 centimetro. B) isolato muscoli addominali (unilaterale) e SEA appuntato in una camera di dissezione per microdissezione. Freccia rossa indica il primo sito biforcazione principale della SEA (cioè il punto in cui pulizia della nave è ferma). Scala bar = 1 centimetro. C) isolato tubo cellule endoteliali da un SEA. Immagine differenziale contrasto interferenziale di un tubo endoteliale seguente 1 ora di incubazione a temperatura ambiente. Il tubo è stato endoteliale superfuse con tampone superfusione a 3 ml / min. Scale bar = 50 pm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50759/50759fig3highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita</a> . Figura 4. Fluorescenza calcio in un tubo di cellule endoteliali. Immagini fluorescenti rappresentativi di un tubo endoteliale in risposta alla stimolazione con 1 mM acetilcolina. A) fluorescenza prima della stimolazione. B) endoteliale tubo fluorescenza al momento della somministrazione acetilcolina, t = 0 sec. C) fluorescenza tubo endoteliale at = 5 sec. D) del tubo endoteliale fluorescenza a t = 10 sec. E) fluorescenza tubo endoteliale in t = 15 sec. F) fluorescenza tubo endoteliale a t = 20 sec. Barre di scala = 40 micron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50759/50759fig4highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita</a> .

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Isolation of Microvascular Endothelial Tubes from Mouse Resistance Arteries

Vi presentiamo una preparazione per la visualizzazione e la manipolazione di segnalazione del calcio in nativo, intatto microvascolari. Tubi endoteliali appena isolate da arterie di resistenza topo che forniscono muscolo scheletrico mantenere in vivo la morfologia e la segnalazione dinamica all&#39;interno e tra le cellule vicine. Tubi endoteliali possono essere preparati da microvasi di altri tessuti e organi.

Isolamento di microvascolare endoteliale tubi da arterie di resistenza mouse

The control of blood flow by the resistance vasculature regulates the supply of oxygen and nutrients concomitant with the removal of metabolic ...

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Research

JoVE Journal

Biology

15.5K Views.  University of Missouri.  Vi presentiamo una preparazione per la visualizzazione e la manipolazione di segnalazione del calcio in nativo, intatto microvascolari. Tubi endoteliali appena isolate da arterie di resistenza topo che forniscono muscolo scheletrico mantenere in vivo la morfologia e la segnalazione dinamica all'interno e tra le cellule vicine. Tubi endoteliali possono essere preparati da microvasi di altri tessuti e organi. 

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Isolation of Valvular Endothelial Cells

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system. These thin, fibrous tissues are subjected to significant mechanical stresses as they open and close several billion times over a lifespan. The incredible endurance of these tissues is due to the resident valvular endothelial (VEC) and interstitial cells (VIC) that constantly repair and remodel in response to local mechanical and biological signals. Only recently have we begun to understand the unique behaviors of these cells, for which in vitro experimentation has played a key role. Particularly challenging is the isolation and culture of VEC. Special care must be used from the moment the tissue is removed from the host through final plating. Here we present protocols for direct isolation, side specific isolation, culture, and verification of pure populations of VEC. We use enzymatic digestion followed by a gentle swab scraping technique to dislodge only surface cells. These cells are then collected into a tube and centrifuged into a pellet. The pellet is then resuspended and plated into culture flasks pre-coated with collagen I matrix. VEC phenotype is confirmed by contact inhibited growth and the expression of endothelial specific markers such as PECAM1 (CD31), Von Willebrand Factor (vWF), and negative expression of alpha-smooth muscle actin (&alpha;-SMA). The functional characteristics of VEC are associated with high levels of acetylated LDL. Unlike vascular endothelial cells, VEC have the unique capacity to transform into mesenchyme, which normally occurs during embryonic valve formation1. This can also occur during significantly prolonged post confluent in vitro culture, so care should be made to passage at or near confluence. After VEC isolation, pure populations of VIC can then be easily acquired.

We provide a method for isolating and culturing pure populations of heart valve endothelial cells (VEC). VEC can be isolated from either side of the cusp or leaflet and immediately following, underlying interstitial cell (VIC) isolation is straightforward.

Isolamento di cellule endoteliali valvolare

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system.  These thin, fibrous tissues are ...

Ricerca

Biologia

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) have shown to be convenient, easy to obtain and culture, and thus are the most widely studied endothelial cells. However, for research focused on processes like angiogenesis, permeability or many others, microvascular endothelial cells (ECs) are a much more physiologically relevant model to study 2. Furthermore, ECs isolated from knockout mice provide a useful tool for analysis of protein function ex vivo. Several approaches to isolate and culture microvascular ECs of different origin have been reported to date 3-7, but consistent isolation and culture of pure ECs is still a major technical problem in many laboratories. Here, we provide a step-by-step protocol on a reliable and relatively simple method of isolating and culturing mouse lung endothelial cells (MLECs). In this approach, lung tissue obtained from 6- to 8-day old pups is first cut into pieces, digested with collagenase/dispase (C/D) solution and dispersed mechanically into single-cell suspension. MLECS are purified from cell suspension using positive selection with anti-PECAM-1 antibody conjugated to Dynabeads using a Magnetic Particle Concentrator (MPC). Such purified cells are cultured on gelatin-coated tissue culture (TC) dishes until they become confluent. At that point, cells are further purified using Dynabeads coupled to anti-ICAM-2 antibody. MLECs obtained with this protocol exhibit a cobblestone phenotype, as visualized by phase-contrast light microscopy, and their endothelial phenotype has been confirmed using FACS analysis with anti-VE-cadherin 8 and anti-VEGFR2 9 antibodies and immunofluorescent staining of VE-cadherin. In our hands, this two-step isolation procedure consistently and reliably yields a pure population of MLECs, which can be further cultured. This method will enable researchers to take advantage of the growing number of knockout and transgenic mice to directly correlate in vivo studies with results of in vitro experiments performed on isolated MLECs and thus help to reveal molecular mechanisms of vascular phenotypes observed in vivo.

Here, we describe a protocol for isolation and culture of murine pulmonary endothelial cells. This method comprises mechanic and enzymatic lung tissue dissociation as well as a 2-step purification process using anti-PECAM-1 and anti-ICAM-2 antibodies conjugated to magnetic beads, which produces a pure endothelial cell population of mostly microvascular origin.

Isolamento e la coltura di cellule endoteliali polmonari da topi neonati

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

RNA-seq Analysis of Transcriptomes in Thrombin-treated and Control Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells

The characterization of gene expression in cells via measurement of mRNA levels is a useful tool in determining how the transcriptional machinery of the cell is affected by external signals (e.g. drug treatment), or how cells differ between a healthy state and a diseased state. With the advent and continuous refinement of next-generation DNA sequencing technology, RNA-sequencing (RNA-seq) has become an increasingly popular method of transcriptome analysis to catalog all species of transcripts, to determine the transcriptional structure of all expressed genes and to quantify the changing expression levels of the total set of transcripts in a given cell, tissue or organism1,2 . RNA-seq is gradually replacing DNA microarrays as a preferred method for transcriptome analysis because it has the advantages of profiling a complete transcriptome, providing a digital type datum (copy number of any transcript) and not relying on any known genomic sequence3.
Here, we present a complete and detailed protocol to apply RNA-seq to profile transcriptomes in human pulmonary microvascular endothelial cells with or without thrombin treatment. This protocol is based on our recent published study entitled "RNA-seq Reveals Novel Transcriptome of Genes and Their Isoforms in Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells Treated with Thrombin,"4 in which we successfully performed the first complete transcriptome analysis of human pulmonary microvascular endothelial cells treated with thrombin using RNA-seq. It yielded unprecedented resources for further experimentation to gain insights into molecular mechanisms underlying thrombin-mediated endothelial dysfunction in the pathogenesis of inflammatory conditions, cancer, diabetes, and coronary heart disease, and provides potential new leads for therapeutic targets to those diseases.
The descriptive text of this protocol is divided into four parts. The first part describes the treatment of human pulmonary microvascular endothelial cells with thrombin and RNA isolation, quality analysis and quantification. The second part describes library construction and sequencing. The third part describes the data analysis. The fourth part describes an RT-PCR validation assay. Representative results of several key steps are displayed. Useful tips or precautions to boost success in key steps are provided in the Discussion section. Although this protocol uses human pulmonary microvascular endothelial cells treated with thrombin, it can be generalized to profile transcriptomes in both mammalian and non-mammalian cells and in tissues treated with different stimuli or inhibitors, or to compare transcriptomes in cells or tissues between a healthy state and a disease state.

This protocol presents a complete and detailed procedure to apply RNA-seq, a powerful next-generation DNA sequencing technology, to profile transcriptomes in human pulmonary microvascular endothelial cells with or without thrombin treatment. This protocol is generalizable to various cells or tissues affected by different reagents or disease states.

RNA-seq Analisi trascrittomi in trombina-trattati e di controllo dell&#39;uomo polmonari cellule endoteliali microvascolari

The characterization of gene expression in cells via measurement of mRNA levels is a useful tool in determining how the transcriptional machinery of the ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an important model for cardiovascular disease research. This study demonstrates a simple method to isolate and culture endothelial cells from the mouse aorta without any special equipment. To isolate endothelial cells, the thoracic aorta is quickly removed from the mouse body, and the attached adipose tissue and connective tissue are removed from the aorta. The aorta is cut into 1 mm rings. Each aortic ring is opened and seeded onto a growth factor reduced matrix with the endothelium facing down. The segments are cultured in endothelial cell growth medium for about 4 days. The endothelial sprouting starts as early as day 2. The segments are then removed and the cells are cultured continually until they reach confluence. The endothelial cells are harvested using neutral proteinase and cultured in endothelial cell growth medium for another two passages before being used for experiments. Immunofluorescence staining indicated that after the second passage the majority of cells were double positive for Dil-ac-LDL uptake, Lectin binding, and CD31 staining, the typical characteristics of endothelial cells. It is suggested that cells at the second to third passages are suitable for in vitro and in vivo experiments to study the endothelial biology. Our protocol provides an effective means of identifying specific cellular and molecular mechanisms in endothelial cell physiopathology.

The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

Isolamento e colture primarie di cellule di topo aortica endoteliali

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

Endothelium-derived nitric oxide (NO) produced from endothelial NO-synthase (eNOS) is one of the most important vasoprotective molecules in cardiovascular physiology. Dysfunctional eNOS such as uncoupling of eNOS leads to decrease in NO bioavailability and increase in superoxide anion (O2.&#8722;) production, and in turn promotes cardiovascular diseases. Therefore, appropriate measurement of NO and O2.&#8722; levels in the endothelial cells are pivotal for research on cardiovascular diseases and complications. Because of the extremely labile nature of NO and O2.&#8722;, it is difficult to measure NO and O2.&#8722; directly in a blood vessel. Numerous methods have been developed to measure NO and O2.&#8722; production. It is, however, either insensitive, or non-specific, or technically demanding and requires special equipment. Here we describe an adaption of the fluorescence dye method for en face simultaneous detection and visualization of intracellular NO and O2.&#8722; using the cell permeable diaminofluorescein-2 diacetate (DAF-2DA) and dihydroethidium (DHE), respectively, in intact aortas of an obesity mouse model induced by high-fat-diet feeding. We could demonstrate decreased intracellular NO and enhanced O2.&#8722; levels in the freshly isolated intact aortas of obesity mouse as compared to the control lean mouse. We demonstrate that this method is an easy technique for direct detection and visualization of NO and O2.&#8722; in the intact blood vessels and can be widely applied for investigation of endothelial (dys)function under (physio)pathological conditions.

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

In this article we describe an adapted relatively easy method using the fluorescence dye diaminofluorescein-2 diacetate (DAF-2DA) and dihydroethidium (DHE) for en face simultaneous detection and visualization of intracellular nitric oxide (NO) and superoxide anion (O2.&#8722;) respectively, in freshly isolated intact aortas of an obesity mouse model.

En Face Detection di ossido nitrico e superossido in strato endoteliale delle arterie Intact

Endothelium-derived nitric oxide (NO) produced from endothelial NO-synthase (eNOS) is one of the most important vasoprotective molecules in cardiovascular ...

Isolation of Mouse Coronary Endothelial Cells

Endothelial cells line the inner wall of blood vessels and play an important role in the regulation of vascular tone, vascular permeability, and new vascular formation. Endothelial cell dysfunction is implicated in the development and progression of many cardiovascular diseases including ischemic heart disease. To examine the function and characterization of coronary endothelial cells, cell isolation is the first step and it requires high purity and quantity to conduct subsequent experiments. This protocol describes an efficient method to isolate adult mouse coronary endothelial cells. The mouse heart is dissected and minced into small pieces. After the digestion of the heart using dispase and collagenase II, cells are washed&#160;and incubated with magnetic beads which are conjugated with anti-CD31 antibody. The beads with endothelial cells are washed several times and are ready to use in various applications, including imaging and molecular biological experiments. Efficient isolation yields approximately 104 cells per one heart with over 90% purity.

This protocol is prepared to share our method of isolating mouse coronary endothelial cells for the purpose of imaging or to conduct molecular biological experiments.

Isolamento di cellule di topo coronarica endoteliali

Endothelial cells line the inner wall of blood vessels and play an important role in the regulation of vascular tone, vascular permeability, and new ...

Isolation and Culture of Primary Aortic Endothelial Cells from Miniature Pigs

Xenotransplantation is a promising way to resolve the shortage of human organs for patients with end-stage organ failure, and the pig is considered as a suitable organ source. Immune rejection and coagulation are two major hurdles for the success of xenotransplantation. Vascular endothelial cell (EC) injury and dysfunction are important for the development of the inflammation and coagulation responses in xenotransplantation. Thus, isolation of porcine aortic endothelial cells (pAECs) is necessary for investigating the immune rejection and coagulation responses. Here, we have developed a simple enzymatic approach for the isolation, characterization, and expansion of highly purified pAECs from miniature pigs. First, the miniature pig was anaesthetized with ketamine, and a length of aorta was excised. Second, the endothelial surface of aorta was exposed to 0.005% collagenase IV digestive solution for 15 min. Third, the endothelial surface of the aorta was scraped in only one direction with a cell scraper (&#60;10 times), and was not compressed during the process of scraping. Finally, the isolated pAECs of Day 3, and after passage 1 and passage 2, were identified by flow cytometry with an anti-CD31 antibody. The percentages of CD31-positive cells were 97.4% &#177; 1.2%, 94.4% &#177; 1.1%, and 92.4% &#177; 1.7% (mean &#177; SD), respectively. The concentration of Collagenase IV, the digestive time, the direction, and frequency and intensity of scraping are critical for decreasing fibroblast contamination and obtaining high-purity and a large number of ECs. In conclusion, our enzymatic method is a highly-effctive method for isolating ECs from the miniature pig aorta, and the cells can be expanded in vitro to investigate the immune and coagulation responses in xenotransplantation.

An effective enzymatic method for isolation of primary porcine aortic endothelial cells (pAECs) from miniature pigs is described. The isolated primary pAECs can be used to investigate the immune and coagulation response in xenotransplantation.

Isolamento e cultura delle cellule endoteliali aortiche primarie dai suini in miniatura

Xenotransplantation is a promising way to resolve the shortage of human organs for patients with end-stage organ failure, and the pig is considered as a ...

Isolation and Characterization of Mouse Primary Liver Sinusoidal Endothelial Cells

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. LSECs have a distinct morphology characterized by the presence of fenestrae and the absence of basement membrane. LSECs play essential roles in many pathological disorders in the liver, including metabolic dysregulation, inflammation, fibrosis, angiogenesis, and carcinogenesis. However, little has been published about the isolation and characterization of the LSECs. Here, this protocol discusses the isolation of LSEC from both healthy and nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) mice. The protocol is based on collagenase perfusion of the mouse liver and magnetic beads positive selection of nonparenchymal cells to purify LSECs. This study characterizes LSECs using specific markers by flow cytometry and identifies the characteristic phenotypic features by scanning electron microscopy. LSECs isolated following this protocol can be used for functional studies, including adhesion and permeability assays, as well as downstream studies for a particular pathway of interest. In addition, these LSECs can be pooled or used individually, allowing multi-omics data generation including RNA-seq bulk or single cell, proteomic or phospho-proteomics, and Assay for Transposase-Accessible Chromatin using sequencing (ATAC-seq), among others. This protocol will be useful for investigators studying LSECs&#39; communication with other liver cells in health and disease and allow an in-depth understanding of the role of LSECs in the pathogenic mechanisms of acute and chronic liver injury.

Here we outline and demonstrate a protocol for primary mouse liver sinusoidal endothelial cell (LSEC) isolation. The protocol is based on liver collagenase perfusion, nonparenchymal cell purification by low-speed centrifugation, and CD146 magnetic bead selection. We also phenotype and characterize these isolated LSECs using flow cytometry and scanning electron microscopy.

Isolamento e caratterizzazione di cellule endoteliali sinusoidali primarie del fegato di topo

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. ...

Isolation of Endothelial Cells from the Lumen of Mouse Carotid Arteries for Single-Cell Multi-Omics Experiments

Atherosclerosis is an inflammatory disease of the arterial regions exposed to disturbed blood flow (d-flow). D-flow regulates the expression of genes in the endothelium at the transcriptomic and epigenomic levels, resulting in proatherogenic responses. Recently, single-cell RNA sequencing (scRNAseq) and single-cell Assay for Transposase Accessible Chromatin sequencing (scATACseq) studies were performed to determine the transcriptomic and chromatin accessibility changes at a single-cell resolution using the mouse partial carotid ligation (PCL) model. As endothelial cells (ECs) represent a minor fraction of the total cell populations in the artery wall, a luminal digestion method was used to obtain EC-enriched single-cell preparations. For this study, mice were subjected to PCL surgery to induce d-flow in the left carotid artery (LCA) while using the right carotid artery (RCA) as a control. The carotid arteries were dissected out two days or two weeks post PCL surgery. The lumen of each carotid was subjected to collagenase digestion, and endothelial-enriched single cells or single nuclei were obtained. These single-cell and single-nuclei preparations were subsequently barcoded using a 10x Genomics microfluidic setup. The barcoded single-cells and single-nuclei were then utilized for RNA preparation, library generation, and sequencing on a high-throughput DNA sequencer. Post bioinformatics processing, the scRNAseq and scATACseq datasets identified various cell types from the luminal digestion, primarily consisting of ECs. Smooth muscle cells, fibroblasts, and immune cells were also present. This EC-enrichment method aided in understanding the effect of blood flow on the endothelium, which could have been difficult with the total artery digestion method. The EC-enriched single-cell preparation method can be used to perform single-cell omics studies in EC-knockouts and transgenic mice where the effect of blood flow on these genes has not been studied. Importantly, this technique can be adapted to isolate EC-enriched single cells from human artery explants to perform similar mechanistic studies.

We present a method for isolating endothelial cells and nuclei from the lumen of mouse carotid arteries exposed to stable or disturbed flow conditions to perform single-cell omics experiments.

Isolamento delle cellule endoteliali dal lume delle arterie carotidi di topo per esperimenti multi-omici a singola cellula

Atherosclerosis is an inflammatory disease of the arterial regions exposed to disturbed blood flow (d-flow). D-flow regulates the expression of genes in ...

Isolation of Conditionally Immortalized Mouse Glomerular Endothelial Cells with Fluorescent Mitochondria

Glomerular endothelial cell (GEC) dysfunction can initiate and contribute to glomerular filtration barrier breakdown. Increased mitochondrial oxidative stress has been suggested as a mechanism resulting in GEC dysfunction in the pathogenesis of some glomerular diseases. Historically the isolation of GECs from in vivo models has been notoriously challenging due to difficulties in isolating pure cultures from glomeruli. GECs have complex growth requirements in vitro and a very limited lifespan. Here, we describe the procedure for isolating and culturing conditionally immortalized GECs with fluorescent mitochondria, enabling the tracking of mitochondrial fission and fusion events. GECs were isolated from the kidneys of a double transgenic mouse expressing the thermolabile SV40 TAg (from the Immortomouse), conditionally promoting proliferation and suppressing cell differentiation, and a photo-convertible fluorescent protein (Dendra2) in all mitochondria (from the photo-activatable mitochondria [PhAMexcised] mouse). The stable cell line generated allows for cell differentiation after inactivation of the immortalizing SV40 TAg gene and photo-activation of a subset of mitochondria causing a switch in fluorescence from green to red. The use of mitoDendra2-GECs allows for live imaging of fluorescent mitochondria&#39;s distribution, fusion, and fission events without staining the cells.

The article describes the method for isolating conditionally immortalized glomerular endothelial cells from the kidneys of transgenic mice expressing the thermolabile simian virus 40 and photo-activatable mitochondria, PhAMexcised. We describe the procedure for glomeruli isolation from whole kidneys using beads, digestion steps, seeding, and culturing of GECs-CD31 positive.

Isolamento di cellule endoteliali glomerulari di topo condizionatamente immortalizzate con mitocondri fluorescenti

Glomerular endothelial cell (GEC) dysfunction can initiate and contribute to glomerular filtration barrier breakdown. Increased mitochondrial oxidative ...