In un vaso sanguigno, il numero di cellule endoteliali è molto basso, il che rende difficile studiarle. Il nostro protocollo elimina questa limitazione e ci consente di studiare nuovi percorsi molecolari e terapie. Il nostro protocollo ci consente di ottenere campioni arricchiti endoteliali e studiare come il flusso disturbato acuto e cronico influisce su questo tipo di cellula.
La capacità di studiare le cellule endoteliali in modo più dettagliato consente di definire i geni bersaglio, e quindi potenziali terapie per l'aterosclerosi che prendono di mira le cellule endoteliali. L'isolamento dell'arteria carotide è complicato e richiede pazienza ed esperienza. Per iniziare, preparare l'animale iniettando 0,05 milligrammi per chilogrammo di buprenorfina per via sottocutanea.
Sterilizzare l'area epilata usando Betadine e soluzione di isopropanolo tre volte. Fare un'incisione ventrale della linea mediana di circa un centimetro nella regione del collo. Quindi esporre il punto di diramazione LCA mediante dissezione smussata.
Ligare la carotide interna sinistra, la carotide esterna e le arterie occipitali con 6-0 punti di sutura, lasciando intatta l'arteria tiroidea superiore. Chiudere l'incisione con colla di tessuto o punti di sutura. Trasferire il mouse in una gabbia di recupero preriscaldata mantenuta a 37 gradi Celsius.
Posizionare il mouse su un asciugamano pulito per un massimo di un'ora per evitare l'ipotermia post-operatoria. Inserire un ago di calibro 21 nella linea IV collegata attraverso l'apice del cuore nel ventricolo sinistro. Lasciare la perfusione retrograda per due o tre minuti utilizzando soluzione salina normale a temperatura ambiente.
Mantenere una portata costante applicando una pressione costante durante l'iniezione o l'utilizzo di una linea IV e mantenendo la sacca salina ad un'altezza di otto-nove piedi. Rimuovere la pelle dalla regione del collo con tutto il grasso, i muscoli e i tessuti connettivi per esporre le arterie carotidi. Quindi rimuovere i tessuti periavventiziali intorno alle carotidi lasciando la carotide attaccata al corpo.
Fare un'incisione sotto il sito di legatura nella LCA per consentire la perfusione. Perfondere l'LCA attraverso il ventricolo sinistro per un altro minuto per rimuovere eventuali tracce di sangue. Lavare l'esterno delle arterie carotidi con una normale soluzione salina per rimuovere eventuali tracce di sangue.
Utilizzare una siringa da insulina con un ago da 29 gauge per iniettare 50 microlitri di tampone digestivo nel lume dell'estremità distale dell'arteria carotide sinistra. Utilizzare una micro clip per bloccare l'estremità prossimale dell'arteria carotide piena di tampone digestivo. Aggiungere da 15 a 20 microlitri di tampone di digestione nel lume e tagliare l'estremità distale per evitare qualsiasi rilascio di tampone di digestione.
Trasferire le arterie carotidi dal topo in piatti da 35 millimetri contenenti soluzione salina tamponata HEPES calda a 37 gradi Celsius. E incubarli per 45 minuti a 37 gradi Celsius con oscillazioni intermittenti. Rimuovere l'arteria carotide con i morsetti dal piatto di 35 millimetri dopo aver completato la digestione enzimatica luminale.
Staccare accuratamente i morsetti, in modo che il tampone di digestione non perda. Tenere un'estremità dell'arteria carotide sopra un tubo da microcentrifuga da 1,5 millilitri. Aggiungere 100 microlitri di tampone di digestione caldo al lume inserendo un ago da 29 gauge dotato di una siringa da insulina.
Lavare rapidamente il lume dell'arteria carotide nel tubo della microcentrifuga, quindi aggiungere 0,3 microlitri di FBS nel tubo per fermare la reazione. Posizionare il tubo della microcentrifuga sul ghiaccio. Centrifugare le celle a 500 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius, utilizzando una centrifuga dotata di rotore ad angolo fisso e scartare il surnatante.
Risospendere le cellule nel tampone di digestione, contenente il reagente di dissociazione cellulare, e incubarle per cinque minuti a 37 gradi Celsius per separarle in singole cellule. Bloccare la reazione enzimatica aggiungendo 0,15 millilitri di FBS al tubo da 0,5 millilitri e ripetere la centrifugazione. Scartare il surnatante e risospendere le cellule in 100 microlitri di soluzione ghiacciata all'1% BSA in PBS in una provetta da microcentrifuga da 0,2 millilitri.
Per l'analisi a cella singola, risospendere il pellet con 100 microlitri di ghiaccio freddo 1% BSA in PBS in un tubo da 0,2 millilitri. Per l'analisi del singolo nucleo, risospendere il pellet cellulare in 100 microlitri di 0,04% BSA in PBS ghiacciato e centrifugare la sospensione a singola cellula a 500G a quattro gradi Celsius per cinque minuti. Scomporre la sospensione monocellulare con tampone di lisi ghiacciato e incubare per cinque minuti su ghiaccio.
Mescolare il lisato con una pipetta P20 e incubare per altri 10 minuti. Successivamente, trasferire il lisato in un tubo da 0,5 millilitri. Lavare le celle con 500 microlitri di tampone e mescolarle con una pipetta.
Quindi ripetere la centrifugazione. Scartare il surnatante e risospendere il pellet di nuclei in 150 microlitri del tampone nuclei diluiti. Contare i preparati di singoli nuclei usando un emocitometro.
A seguito dello studio di sequenziamento di singoli nuclei, sono stati ottenuti nuclei singoli e singoli nuclei e visualizzati mediante microscopia a campo luminoso e a contrasto di fase. È stata anche dimostrata l'efficienza della preparazione di singoli nuclei dalla sospensione monocellulare. Dopo lo studio di sequenziamento dell'RNA a singola cellula, sono stati ottenuti vari parametri come la distribuzione dei geni per cellula, l'identificatore molecolare univoco per cellula, le letture mitocondriali per cellula e i dati di saturazione del sequenziamento.
Per lo studio della sequenza ATAC a singola cellula, è stata osservata la distribuzione delle dimensioni dell'inserto, incluso il modello di banding del nucleosoma. È stato osservato anche il punteggio di arricchimento TSS normalizzato. Inoltre, il frammento percentuale legge nei picchi.
Sono stati determinati i frammenti della regione di picco, il punteggio di arricchimento TSS, il rapporto delle letture nei siti genomici della lista nera e il rapporto del segnale dei nucleosomi. La digestione enzimatica è uno stress per le cellule, quindi è fondamentale mantenere i campioni sul ghiaccio ed eseguire la procedura il più rapidamente possibile. Possiamo usare questo metodo per ottenere e placcare le cellule endoteliali dai topi.
Possiamo anche utilizzare questa tecnica per eseguire studi basati su Omix di massa. Questa tecnica ha aperto la strada allo studio dell'effetto del flusso sanguigno disturbato sulle cellule endoteliali in vivo in modo da una singola cellula.
