المؤلفين أشكر الدكتور Pooneh باقر والدكتور اريكا يستكوت للتعليقات افتتاحية في إعداد المخطوطة. وأيد هذا العمل من قبل المعهد الوطني للقلب والرئة والدم المعهد من المعاهد الوطنية للصحة تحت أرقام جائزة R37-R01-HL041026 وHL086483 لنظام الضمان الاجتماعي وF32-HL107050 لMJS. هذا المحتوى هو فقط من مسؤولية الكتاب ولا تمثل بالضرورة وجهة النظر الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة.

<ol>
	<li>Campbell, W. B., Gebremedhin, D., Pratt, P. F., Harder, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+epoxyeicosatrienoic+acids+as+endothelium-derived+hyperpolarizing+factors.">Identification of epoxyeicosatrienoic acids as endothelium-derived hyperpolarizing factors.</a> Circ. Res. 78, 415-423 (1996).</li><li>Crutchley, D. J., Ryan, J. W., Ryan, U. S., Fisher, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bradykinin-induced+release+of+prostacyclin+and+thromboxanes+from+bovine+pulmonary+artery+endothelial+cells.+Studies+with+lower+homologs+and+calcium+antagonists.">Bradykinin-induced release of prostacyclin and thromboxanes from bovine pulmonary artery endothelial cells. Studies with lower homologs and calcium antagonists.</a> Biochim. Biophys. Acta. 751, 99-107 (1983).</li><li>Kruse, H. J., Grunberg, B., Siess, W., Weber, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+biologically+active+autacoids+is+regulated+by+calcium+influx+in+endothelial+cells.">Formation of biologically active autacoids is regulated by calcium influx in endothelial cells.</a> Arterioscler. Thromb. 14, 1821-1828 (1994).</li><li>Busse, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EDHF:+bringing+the+concepts+together.">EDHF: bringing the concepts together.</a> Trends Pharmacol. Sci. 23, 374-380 (2002).</li><li>Ledoux, J., Bonev, A. D., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2+-activated+K++channels+in+murine+endothelial+cells:+block+by+intracellular+calcium+and+magnesium.">Ca2+-activated K+ channels in murine endothelial cells: block by intracellular calcium and magnesium.</a> J. Gen. Physiol. 131, 125-135 (2008).</li><li>Behringer, E. J., Socha, M. J., Polo-Parada, L., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+conduction+along+endothelial+cell+tubes+from+mouse+feed+arteries:+confounding+actions+of+glycyrrhetinic+acid+derivatives.">Electrical conduction along endothelial cell tubes from mouse feed arteries: confounding actions of glycyrrhetinic acid derivatives.</a> Br. J. Pharmacol. 166, 774-787 (2012).</li><li>Socha, M. J., Domeier, T. L., Behringer, E. J., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+of+intercellular+Ca2++signaling+in+endothelial+cell+tubes+of+mouse+resistance+arteries.">Coordination of intercellular Ca2+ signaling in endothelial cell tubes of mouse resistance arteries.</a> Microcirculation. 19, 757-770 (2012).</li><li>Cohen, K. D., Jackson, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+hyperpolarization+is+not+required+for+sustained+muscarinic+agonist-induced+increases+in+intracellular+Ca2++in+arteriolar+endothelial+cells.">Membrane hyperpolarization is not required for sustained muscarinic agonist-induced increases in intracellular Ca2+ in arteriolar endothelial cells.</a> Microcirculation. 12, 169-182 (2005).</li><li>Socha, M. J., Hakim, C. H., Jackson, W. F., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature+effects+on+morphological+integrity+and+Ca2++signaling+in+freshly+isolated+murine+feed+artery+endothelial+cell+tubes.">Temperature effects on morphological integrity and Ca2+ signaling in freshly isolated murine feed artery endothelial cell tubes.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 301, 773-783 (2011).</li><li>Hakim, C. H., Jackson, W. F., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin+isoform+expression+in+smooth+muscle+cells+and+endothelial+cells+of+hamster+cheek+pouch+arterioles+and+retractor+feed+arteries.">Connexin isoform expression in smooth muscle cells and endothelial cells of hamster cheek pouch arterioles and retractor feed arteries.</a> Microcirculation. 15, 503-514 (1908).</li><li>Behringer, E. J., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuning+electrical+conduction+along+endothelial+tubes+of+resistance+arteries+through+Ca2+-activated+K++channels.">Tuning electrical conduction along endothelial tubes of resistance arteries through Ca2+-activated K+ channels.</a> Circ. Res. 110, 1311-1321 (2012).</li><li>Bagher, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+intravascular+pressure+activates+endothelial+cell+TRPV4+channels,+local+Ca2++events,+and+IKCa+channels,+reducing+arteriolar+tone.">Low intravascular pressure activates endothelial cell TRPV4 channels, local Ca2+ events, and IKCa channels, reducing arteriolar tone.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 18174-18179 (2012).</li><li>Faraci, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+vascular+effects+of+angiotensin+II:+new+insights+from+genetic+models.">Cerebral vascular effects of angiotensin II: new insights from genetic models.</a> J. Cereb. Blood Flow Metab. 26, 449-455 (2006).</li><li>Emerson, G. G., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+coupling+between+endothelial+cells+and+smooth+muscle+cells+in+hamster+feed+arteries:+role+in+vasomotor+control.">Electrical coupling between endothelial cells and smooth muscle cells in hamster feed arteries: role in vasomotor control.</a> Circ. Res. 87, 474-479 (2000).</li><li>Ledoux, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+architecture+of+inositol+1,4,5-trisphosphate+signaling+in+restricted+spaces+of+myoendothelial+projections.">Functional architecture of inositol 1,4,5-trisphosphate signaling in restricted spaces of myoendothelial projections.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 9627-9632 (2008).</li><li>Tran, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+Ca2++wavelets+and+the+induction+of+myoendothelial+feedback.">Endothelial Ca2+ wavelets and the induction of myoendothelial feedback.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 302, 1226-1242 (2012).</li><li>Nausch, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sympathetic+nerve+stimulation+induces+local+endothelial+Ca2++signals+to+oppose+vasoconstriction+of+mouse+mesenteric+arteries.">Sympathetic nerve stimulation induces local endothelial Ca2+ signals to oppose vasoconstriction of mouse mesenteric arteries.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 302, 594-602 (2012).</li><li>Duza, T., Sarelius, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increase+in+endothelial+cell+Ca2++in+response+to+mouse+cremaster+muscle+contraction.">Increase in endothelial cell Ca2+ in response to mouse cremaster muscle contraction.</a> J Physiol. 555, 459-469 (2004).</li><li>Colden-Stanfield, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bradykinin-induced+increases+in+cytosolic+calcium+and+ionic+currents+in+cultured+bovine+aortic+endothelial+cells.">Bradykinin-induced increases in cytosolic calcium and ionic currents in cultured bovine aortic endothelial cells.</a> Circ. Res. 61, 632-640 (1987).</li><li>Brunner, F., Kukovetz, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radioligand+binding+to+muscarinic+receptors+of+bovine+aortic+endothelial+cells.">Radioligand binding to muscarinic receptors of bovine aortic endothelial cells.</a> Br. J. Pharmacol. 102, 373-380 (1991).</li><li>Tracey, W. R., Peach, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+muscarinic+receptor+mRNA+expression+by+freshly+isolated+and+cultured+bovine+aortic+endothelial+cells.">Differential muscarinic receptor mRNA expression by freshly isolated and cultured bovine aortic endothelial cells.</a> Circ. Res. 70, 234-240 (1992).</li><li>Adams, D. J., Hill, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potassium+channels+and+membrane+potential+in+the+modulation+of+intracellular+calcium+in+vascular+endothelial+cells.">Potassium channels and membrane potential in the modulation of intracellular calcium in vascular endothelial cells.</a> J. Cardiovasc. Electrophysiol. 15, 598-610 (2004).</li><li>Jackson, W. F., Huebner, J. M., Rusch, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+isolation+and+characterization+of+single+vascular+smooth+muscle+cells+from+cremasteric+arterioles.">Enzymatic isolation and characterization of single vascular smooth muscle cells from cremasteric arterioles.</a> Microcirculation. 4, 35-50 (1997).</li></ol>

لا شيء.

نحن هنا وصف عزلة أنابيب البطانية من البحر واستخدام هذا المستحضر لتصور كا 2 + اشارة الأحداث داخل ECS التأسيسي. وقد تم تكييف هذا الإجراء من واحد وضعت أصلا لعزل أنابيب البطانية من الشرايين من العضلات المشمرة الهامستر 8. الاستفادة اختلافات طفيفة من التقنيات المقدمة هنا، ونحن عزلت أنابيب البطانية من مجموعة متنوعة من أسرة الأوعية الدموية، بما في ذلك: الشرايين تغذية عضلة الهامستر ضام والخد الشرايين الحقيبة 10، والماوس الشريان شرسوفي 6،7،9، المساريقي الماوس والدماغية (؛ وترد إشارات لعزل الأوعية المساريقي 12 والأوعية الدماغية 13 الملاحظات غير منشورة) الشرايين وmicrovessels اللمفاوي. عزل أنابيب البطانية من أسرة الأوعية الدموية الجديدة قد تتطلب تعديلات على البروتوكول الأصلي. إذا العزلة غير ناجحة، فمن الأفضل أن تبدأ من خلال تغيير أوقات الهضم:زيادة الوقت الهضم إذا أنابيب البطانية يصعب عزل من خلايا العضلات الملساء والبرانية وتقليل الوقت الهضم إذا لا يبقى أنبوب البطانية سليمة. إذا تغيير أوقات الهضم غير ناجحة، وضبط تركيز أنزيمات الهضم أو درجة الحرارة الهضم يجب أن يحاكم. خيار آخر هو للحد من القطر الداخلي للماصة سحن، مما يزيد من قوة القص في إزالة خلايا العضلات الملساء. زيادة سرعة قذف السائل يمكن أيضا أن يحاكم لنفس الغرض، لكن من المرجح أن تضر التحضير. وينبغي الاعتراف بأن ذلك قد لا يكون من الممكن عزل أنابيب البطانية سليمة من السفن في الخلايا البطانية التي لا ترتبط مع بعضها البعض بشكل جيد من البروتينات وصلي. تم إجراء تفكك خلايا العضلات الملساء التالية الهضم الأنزيمي في البداية باستخدام pipettor على غرار اليد 8. لقد المكرر الإجراء سحن باستخدام microsyrنظام إنجي، مما أتاح العزلة ثابت من أنابيب البطانية أطول (تصل إلى 3 ملم) 6. عند استخدام هذا النظام، يتم ردم ماصة سحن مع الزيوت المعدنية لتوفير عمود السائل المستمر بين المكبس السيطرة على حركة السوائل وجهاز الأمن الوقائي الذي يحتوي على شريحة السفينة. يتم فرض incompressibility السائل جنبا إلى جنب مع القوة الدافعة المستمرة لنتائج المكبس محقنة مكروية في القص المستمر كما السفينة من خلال طرف ماصة. في المقابل، تقنيات اليد غالبا ما تستخدم لخلايا الانفصال (مثل الضغط لمبة المطاط في نهاية ماصة باستور) ينطوي على ضغط الهواء، الذي يدخل التغير في الضغط القيادة، وبالتالي تمارس القص في الطرف ماصة. هناك مزايا متعددة لإعداد أنبوب لدراسة وظيفة بطانة الأوعية الدموية في microvessels. الأول هو أن عملية العزل يوفر السكان الأصليين متميزة متجانسة الخلوية من ECS ومو سلسالخلايا بعد المقطع. منذ ECS البقاء على اتصال جسديا وأنابيب، فهي متميزة من خلايا العضلات الملساء الفردية، التي تحتفظ تكوين &quot;C&quot; إذا كانت لا تزال خففت خلال سحن. وتتميز أنواع الخلايا المعنية بذلك بسهولة، على سبيل المثال عند الحصول على عينات لالتقنيات الجزيئية مثل الوقت الحقيقي PCR والمناعية 10. منذ يتم عزل أنابيب متعددة من سفينة واحدة (أو من السفن الثنائية كما فعلت لSEA)، ويمكن الحصول على البيانات الجزيئية والبيانات الفنية من نفس السفن من حيوان معين. يمكن ربط التعبير الجزيئية وهكذا مع سلوك وظيفي من الاوعية الدموية الدقيقة البطانة. علاوة على ذلك، يشير كلا من الأحداث داخل وبين الخلايا الذاتية لالاوعية الدموية الدقيقة البطانة يمكن حلها مستقلة عن تأثير القوى الدورة الدموية (الضغط، التدفق)، وكلاء فعال في الأوعية نفذت في مجرى الدم (مثل الهرمونات)، أو من خلايا العضلات الملساء المحيطة بها (على سبيل المثال60؛ عبر اقتران myoendothelial 14-16)، والأعصاب 17، أو الأنسجة حمة 18. الأهم من ذلك، منذ البطانة معزولة حديثا من microvessels المعينة، وليس هناك تغيير في النمط الظاهري الذي يرتبط إلا مع زراعة ECS 19-21. على سبيل المثال، ECS مثقف تفقد مستقبلات المسكارينية التعبير، وبالتالي تغيير ملامح إشارات الكالسيوم بهم. علاوة على ذلك، يمكن أن الخصائص الكهربية من ECS تغيير في الثقافة 22. لأن ECS الفردية تبقى جانب من خلال قنوات تقاطع الفجوة الوظيفية، ويعرض أنبوب البطانية نموذجا مثاليا لدراسة التوصيل من 2 + إشارات كهربائية والكالسيوم بين الخلايا 6،7. وينبغي أيضا الاعتراف بأن خلايا العضلات الملساء فصلها ودراستها بسهولة مع تقنيات التصحيح، المشبك عن البيانات التكميلية الكامنة وراء وظيفة الاوعية الدموية الدقيقة 23. وجود قيود مفتاح أنبوب البطانية ممركز Odel هو عدم الاستقرار في التحضير مع زيادة درجة الحرارة. في حين أثبتت تحضيراتنا من SEA مستقرة وصحية في درجة حرارة الغرفة المحيطة (~ 24 درجة مئوية) ولعدة ساعات في 32 درجة مئوية، وتدهور المورفولوجية والوظيفية تحدث في أقل من ساعة عند 37 درجة مئوية 9. وجود قيود الثاني المهم من الأنبوب البطانية هو فقدان تقاطعات myoendothelial والمجالات الإشارات الكامنة التي هي جزء لا يتجزأ من وظيفة المفوضية الأوروبية في جدار الوعاء الدموي سليمة 14-16. وينبغي أيضا الاعتراف بأن، في حين تمكن أنابيب أطول إشارات بين الخلايا لدراستها عبر مسافات كبيرة نسبيا 6، معقد إعداد أنابيب لأنها تحصل على أطول لأنه يصبح من الصعب فصل كامل المحيطة خلايا العضلات الملساء والبرانية. لقد وجدنا أن أنابيب أطول من 1-2 ملم هي أيضا أكثر صعوبة لوضع وتأمين في غرفة التدفق. في المقابل، في حين أنابيب أقصر (على سبيل المثال &lt;1 مم) ENAبلي كا 2 + والكهربائية إشارات لدراستها 8، فهي صعبة للحفاظ خلال superfusion في غرفة التدفق. أخيرا، حتى مع العزلة الأمثل للأنابيب على المستوى الثنائي، هناك مواد كافية لتقدير التقليدية للتعبير البروتين باستخدام البقع الغربية، على الرغم من immunolabeling يوفر مؤشر التعبير البروتين والتعريب. على الرغم من هذه القيود، وأنبوب البطانية يمثل إعداد رواية لتقديم رؤية جديدة في آليات الاوعية الدموية الدقيقة وظيفة الخلايا البطانية في الجسم الحي.

في هذا البروتوكول، ونحن تصف عزل أنابيب الخلية البطانية من SEA الماوس. دعت SEA من الشريان واللوازم الصدري الدم المؤكسج الداخلية لعضلات البطن الأمامي. لدينا عمل مع SEA كنموذج يعزى إليها تقديم طويلة نسبيا، وقطاعات microvessel غير متفرعة التي هي مناسبة تماما لدراسة الأحداث الإشارات بين الخلايا الكامنة دور البطانة في حكم وتنسيق سلس استرخاء الخلايا العضلية. للراغبين في الأنسجة الأخرى من العضلات والهيكل العظمي، وجدنا هذه التقنية يمكن تكييفها بسهولة للحصول على أنابيب البطانية من microvessels من الدماغ، الأمعاء والجهاز اللمفاوي. الملامح الرئيسية لهذه الطريقة هي أن أطوال سليمة (1-3 ملم) من الاوعية الدموية الدقيقة البطانة هي معزولة، مضمونة مقابل ساترة الزجاج في غرفة التدفق التي يتم superfused أنها مع جهاز الأمن الوقائي، وتصوير لكا 2 + اشارة 7-9 أومخوزق للإشارات الكهربائية 6،8. داخل غرفة التدفق، يتعرض النصف العلوي من أنبوب إلى حل superfusion ويستجيب لتدخلات التجريبية، في حين أن النصف السفلي (في اتصال مع ساترة) محمية وتبقى هادئة. بالإضافة إلى دراسة كل من داخل وبين الخلايا كا 2 + الأحداث يشير، وأنابيب البطانية يمكن استخدامها لكمية الوقت الحقيقي PCR لتقييم التعبير الجيني 6،10، المناعية للتحقيق في تعبير البروتين 6،10، والدراسات الكهربية لتحديد الخصائص الفيزيائية الحيوية من التوصيل الكهربائي 6،11. وهناك العديد من المزايا لإعداد أنبوب البطانية لدراسة وظيفة بطانة الأوعية الدموية. الأول هو أن عملية العزل يوفر تمييز بسيط بين اثنين من السكان الخلية: الخلايا البطانية (التي لا تزال في تشكيل أنبوب) وخلايا العضلات الملساء (فصل على حدة؛ عادة &quot;C&quot; عندما شكلاسترخاء). وهذا يسمح لأخذ عينات انتقائية ودراسة خصائص فريدة من نوعها الكامنة مساهمة منها خلايا &#39;إلى وظيفة السفينة. الثانية، وهذا النموذج يمكن حل إشارات الأحداث الجوهرية إلى البطانة، مستقلة عن تأثير تدفق الدم، العضلات الملساء المحيطة والأعصاب، وحمة. الثالث، هو درس البطانة حين طازجة معزولة، وبالتالي تجنب التغيرات في الجينات أو التعبير البروتين المرتبطة ثقافة الخلية.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="632">
	<colgroup>
		<col span="4" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:159px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:159px;">Fisher</td>
			<td style="width:159px;">S642-212</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:159px;">Potassium Chloride</td>
			<td style="width:159px;">Sigma</td>
			<td style="width:159px;">P9541</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:159px;">Magnesium Sulfate</td>
			<td style="width:159px;">Sigma</td>
			<td style="width:159px;">M2643</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:159px;">Calcium Chloride</td>
			<td style="width:159px;">Sigma</td>
			<td style="width:159px;">C1016</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:159px;">Sodium Nitroprusside</td>
			<td style="width:159px;">Sigma</td>
			<td style="width:159px;">431451</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:159px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:159px;">USB Products</td>
			<td style="width:159px;">9048-46-8</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:159px;">Papain</td>
			<td style="width:159px;">Sigma</td>
			<td style="width:159px;">P-4762</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:159px;">Collagenase</td>
			<td style="width:159px;">Sigma</td>
			<td style="width:159px;">C-8051</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:159px;">Dithioerythritol</td>
			<td style="width:159px;">Sigma</td>
			<td style="width:159px;">D-8255</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:159px;">Boroscilicate Glass (Cannulation and Pinning Pipettes)</td>
			<td style="width:159px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:159px;">G150-4</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:159px;">Boroscilicate Glass (Trituration Pipettes)</td>
			<td style="width:159px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:159px;">4897</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:159px;">Nanoliter Injector Microsyringe</td>
			<td style="width:159px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:159px;">B203MC4</td>
			<td style="width:159px;">Updated to Nanoliter 2010 from Nanoliter 2000</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:159px;">Micro4 Controller</td>
			<td style="width:159px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:159px;">SYS-MICRO4</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:159px;">12 mm x 75 mm Culture Tubes</td>
			<td style="width:159px;">Fisher</td>
			<td style="width:159px;">14-961-26</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:159px;">3-Axis Micromanipulator</td>
			<td style="width:159px;">Siskiyou Corp</td>
			<td style="width:159px;">DT3-100</td>
			<td style="width:159px;">Holding and positioning the pinning pipettes</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:159px;">Flow Chamber</td>
			<td style="width:159px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:159px;">RC-27N</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:159px;">100-1,000 &#181;l Pipette</td>
			<td style="width:159px;">Eppendorf</td>
			<td>3120000062</td>
			<td style="width:159px;">For transferring digested vessel segment to the flow chamber</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:159px;">1 ml Pipette Tips</td>
			<td style="width:159px;">Fisher</td>
			<td style="width:159px;">02-707-405</td>
			<td style="width:159px;">For transferring digested vessel segment to the flow chamber</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:159px;">Upright Microscope</td>
			<td style="width:159px;">Olympus</td>
			<td style="width:159px;">BX51W1</td>
			<td style="width:159px;">The actual microscope is up to the user</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:159px;">Spinning Disc Confocal System</td>
			<td style="width:159px;">Yokogawa</td>
			<td style="width:159px;">CSU-X1</td>
			<td style="width:159px;">Confocal imaging is optional</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:159px;">XR/TURBO EX Camera</td>
			<td style="width:159px;">Stanford Photonics</td>
			<td style="width:159px;">XR/TURBO EX</td>
			<td style="width:159px;">Ideal for our needs; may vary with user</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:159px;">Piper Control Software</td>
			<td style="width:159px;">Stanford Photonics</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:159px;">Imaging software for TURBO EX camera</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:159px;">Stereo Microscrope</td>
			<td style="width:159px;">Leica</td>
			<td style="width:159px;">MZ8</td>
			<td style="width:159px;">may vary with user</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:159px;">Sylgard</td>
			<td style="width:159px;">Dow Corning</td>
			<td style="width:159px;">184</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:159px;">Microdissection Scissors</td>
			<td style="width:159px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:159px;">15003-08</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:159px;">Dumont Forceps</td>
			<td style="width:159px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:159px;">#5/45</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:159px;">Minutiens Insect Pins</td>
			<td style="width:159px;">Austerlitz</td>
			<td style="width:159px;">M size 0.15 mm</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:159px;">GP Millipore Express PLUS Membrane</td>
			<td style="width:159px;">Millipore</td>
			<td style="width:159px;">SCGPT05RE</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:159px;">Pipette Scoring Device</td>
			<td style="width:159px;">Austin Flameworks</td>
			<td style="width:159px;">Small Handheld Scoring Tool</td>
			<td style="width:159px;">austinflameworks.com</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:159px;">Compact Pet Trimmer</td>
			<td style="width:159px;">Wahl Clipper Corp.</td>
			<td style="width:159px;">Model 9966</td>
			<td style="width:159px;">Clean well after each use to maintain life</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of microvascular endothelial tubes from mouse resistance arteries

السيطرة على تدفق الدم من الأوعية الدموية المقاومة ينظم امدادات من الاوكسجين والمواد المغذية يصاحب ذلك مع إزالة الأيضية والمنتجات، كما يتضح من خلال ممارسة العضلات والهيكل العظمي. الخلايا البطانية (ECS) خط البطانية من جميع السفن المقاومة وتلعب دورا رئيسيا في التحكم في القطر (مثل البطانة التي تعتمد على توسع الأوعية)، وبالتالي، فإن حجم وتوزيع تدفق الدم الأنسجة. ويتم تنظيم المقاومة الوعائية من قبل ECS من قبل الخلايا كا 2 + إشارات، مما يؤدي إلى إنتاج autacoids إنتشاري (مثل أكسيد النيتريك وحمض الأراكيدونيك الأيض) 1-3 وفرط الاستقطاب 4،5 التي تثير على نحو سلس استرخاء الخلايا العضلية. وبالتالي فهم ديناميات البطانية كا 2 + إشارات هو خطوة رئيسية نحو فهم الآليات التي تحكم مراقبة تدفق الدم. عزل أنابيب البطانية يلغي المتغيرات التباس المرتبطة BLالعود في التجويف السفينة ومع توضيح خلايا العضلات الملساء المحيطة بالأوعية والأعصاب، والتي تؤثر على خلاف ذلك بنية EC وظيفة. هنا نقدم عزل أنابيب البطانية من الشريان الشرسوفي متفوقة (SEA) باستخدام بروتوكول الأمثل لهذه السفينة. لعزل أنابيب البطانية من الماوس تخدير، هو ligated على البحر في الموقع للحفاظ على الدم داخل التجويف السفينة (لتسهيل تصور أنه خلال تشريح)، ويتم رفعه ورقة كاملة من عضلات البطن. يتم تشريح SEA المحيطة خالية من ألياف العضلات والهيكل العظمي والنسيج الضام، يتم مسح الدم من التجويف، ويتم تنفيذ عملية الهضم الأنزيمية خفيفة الى تمكين إزالة البرانية والأعصاب وخلايا العضلات الملساء باستخدام سحن لطيف. هذه الاستعدادات معزولة طازجة من البطانة سليمة الاحتفاظ مورفولوجيا وطنهم، مع الفردية ECS المتبقية إلى جانب وظيفيا مع بعضها البعض، وقادرة على نقل المواد الكيميائية والاشتراكية الكهربائيةgnals intercellularly من خلال تقاطعات الفجوة 6،7. بالإضافة إلى تقديم رؤية جديدة في إشارات الكالسيوم والغشاء الفيزياء الحيوية، هذه الاستعدادات تمكين الدراسات الجزيئية للتعبير الجينات والبروتينات التعريب داخل الاوعية الدموية الدقيقة البطانة الأصلية.

ويمكن البدء الردود الكالسيوم في أنابيب معزولة البطانية حديثا باستخدام أستيل (ACH). في هذا الفيلم، يتم تحفيز أنبوب البطانية محملة 10 ميكرومتر FLUO-4 صباحا مع superfusion من 1 ميكرومتر أدن تشافيز (فيلم 1). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50759/SochaandSegal_movie1.avi" target="_blank">اضغط هنا لمشاهدة الفيلم</a> . هو متحمس الصبغة في 491 نانومتر، ويتم تسجيل الانبعاثات 500-550 نانومتر باستخدام كاميرا الجهاز المسؤول عن جانب تكثيف. يتم الحصول على مداخن صورة في 120 لقطة / ثانية لفترة ثانية 25 ويمكن بعد ذلك بلغ متوسط ​​(على سبيل المثال إلى 40 لقطة / ثانية). وتظهر الصور مضان ممثل على مر الزمن في الشكل 4. <img alt="الشكل 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50759/50759fig1.jpg" width="500px" /> الشكل 1. تدفق غرفة والماصات المستخدمة خلال عزل أنابيب البطانية. </stro<html> نانوغرام&gt; A) وغرفة تدفق تجميعها مع 24 مم × 50 مم الزجاج ساترة كقاعدة. ب) أمثلة لسحبها (إلى اليسار) وسحب، مكسورة، مصقول والزاوية (يمين) القسطرة ماصة. ويستخدم هذا ماصة لطرد الكريات الحمراء من تجويف الشريان التالية تشريح. مقياس شريط = 200 ميكرون. C) أمثلة من سحبت (يسار) وانسحبت، وكسر ومصقول (يمين) سحن ماصة. يتم تحديد القطر الداخلي للماصة قبل هذا القطر الخارجي للشريان. شريط النطاق = 200 ميكرومتر. D) أمثلة من سحبها (إلى اليسار) وسحب، وكسر ومصقول (ماصة اليمين) تعلق. يتم تقريب هذا غيض من ماصة قبالة ومختومة لتأمين أنبوب البطانية في غرفة التدفق تماما. مقياس شريط = 200 ميكرومتر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50759/50759fig1highres.jpg" target="_blank">اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر</a> . الطبقة = &quot;jove_content&quot; FO: المحافظة على together.within صفحة = &quot;دائما&quot;&gt; <img alt="الرقم 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50759/50759fig2.jpg" width="500px" /> الشكل 2. الغزل القرص المجهر متحد البؤر التصوير من كا 2 + إشارات. A) المجهر تستقيم تستخدم للتصوير الكالسيوم. ب) (أ) وحدة القرص الغزل متحد البؤر مع (ب) تكثيف تهمة الكاميرا إلى جانب جهاز. C) أهداف الغمر (أ) 63X ( NA = 1) و (ب) 20X (NA = 0.5) المستخدمة في التصوير. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50759/50759fig2highres.jpg" target="_blank">اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر</a> . <img alt="الرقم 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50759/50759fig3.jpg" width="500px" /> الرقم 3. عزل عضلات البطن والشريان الشرسوفي متفوقة. A </st<html> رونغ&gt;) تخدير الفأر مع عضلات البطن المكشوفة والمروية مع درجة حرارة الغرفة 0.9٪ محلول ملحي. السهام الحمراء بمناسبة مواقع تحت منصات الدهون التي التقييمات البيئية منها إدخال كل المستقيمة البطنية العضلات (أي حيث ينبغي ligated السفن). مقياس بار = 1 سم. ب) العضلات المعزولة في البطن (من جانب واحد) وSEA معلقة في غرفة تشريح لتسليخ مجهري. السهم الأحمر يشير إلى أول موقع التشعب الرئيسية للSEA (أي النقطة التي توقفت تنظيف السفينة). مقياس بار = 1 سم. C) معزولة أنبوب الخلية البطانية من البحر. الفرق تدخل تباين الصورة من أنبوب البطانية التالية 1 ساعة حضانة في درجة حرارة الغرفة. تم superfused أنبوب البطانية مع العازلة Superfusion في 3 مل / دقيقة. مقياس بار = 50 ميكرومتر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50759/50759fig3highres.jpg" target="_blank">اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر</a> . ether.within صفحة = &quot;دائما&quot;&gt; <img alt="الرقم 4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50759/50759fig4.jpg" width="500px" /> الشكل 4. مضان الكالسيوم في أنبوب الخلايا البطانية. الصور الفلورسنت ممثل أنبوب البطانية ردا على التحفيز مع 1 ميكرومتر أستيل. A) الإسفار قبل التحفيز. B) البطانية أنبوب مضان في وقت الإدارة أستيل كولين، ر = 0 ثانية. C) أنبوب البطانية مضان في ر = 5 ثانية. D) أنبوب البطانية مضان في ر = 10 ثانية. E) البطانية مضان أنبوب في ر = 15 ثانية. F) البطانية مضان أنبوب في ر = 20 ثانية. أشرطة النطاق = 40 ميكرومتر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50759/50759fig4highres.jpg" target="_blank">اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر</a> .

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Microvascular Endothelial Tubes from Mouse Resistance Arteries at JoVE.com

Isolation of Microvascular Endothelial Tubes from Mouse Resistance Arteries

نقدم التحضير لتصور والتلاعب إشارات الكالسيوم في الأم، سليمة الاوعية الدموية الدقيقة البطانة. أنابيب البطانية المعزولة حديثا من الشرايين المقاومة الماوس توريد الهيكل العظمي والعضلات في الاحتفاظ مورفولوجيا الجسم الحي والإشارات الحيوية داخل وبين الخلايا المجاورة. أنابيب البطانية يمكن إعداد من microvessels من الأنسجة والأعضاء الأخرى.

عزل الاوعية الدموية الدقيقة البطانية أنابيب الشرايين ماوس المقاومة

The control of blood flow by the resistance vasculature regulates the supply of oxygen and nutrients concomitant with the removal of metabolic ...

isolation-microvascular-endothelial-tubes-from-mouse-resistance

Research

JoVE Journal

Biology

15.5K Views.  University of Missouri.  نقدم التحضير لتصور والتلاعب إشارات الكالسيوم في الأم، سليمة الاوعية الدموية الدقيقة البطانة. أنابيب البطانية المعزولة حديثا من الشرايين المقاومة الماوس توريد الهيكل العظمي والعضلات في الاحتفاظ مورفولوجيا الجسم الحي والإشارات...

Video: Isolation of Microvascular Endothelial Tubes from Mouse Resistance Arteries

Isolation of Valvular Endothelial Cells

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system. These thin, fibrous tissues are subjected to significant mechanical stresses as they open and close several billion times over a lifespan. The incredible endurance of these tissues is due to the resident valvular endothelial (VEC) and interstitial cells (VIC) that constantly repair and remodel in response to local mechanical and biological signals. Only recently have we begun to understand the unique behaviors of these cells, for which in vitro experimentation has played a key role. Particularly challenging is the isolation and culture of VEC. Special care must be used from the moment the tissue is removed from the host through final plating. Here we present protocols for direct isolation, side specific isolation, culture, and verification of pure populations of VEC. We use enzymatic digestion followed by a gentle swab scraping technique to dislodge only surface cells. These cells are then collected into a tube and centrifuged into a pellet. The pellet is then resuspended and plated into culture flasks pre-coated with collagen I matrix. VEC phenotype is confirmed by contact inhibited growth and the expression of endothelial specific markers such as PECAM1 (CD31), Von Willebrand Factor (vWF), and negative expression of alpha-smooth muscle actin (&alpha;-SMA). The functional characteristics of VEC are associated with high levels of acetylated LDL. Unlike vascular endothelial cells, VEC have the unique capacity to transform into mesenchyme, which normally occurs during embryonic valve formation1. This can also occur during significantly prolonged post confluent in vitro culture, so care should be made to passage at or near confluence. After VEC isolation, pure populations of VIC can then be easily acquired.

We provide a method for isolating and culturing pure populations of heart valve endothelial cells (VEC). VEC can be isolated from either side of the cusp or leaflet and immediately following, underlying interstitial cell (VIC) isolation is straightforward.

عزل الخلايا البطانية صمامي

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system.  These thin, fibrous tissues are ...

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) have shown to be convenient, easy to obtain and culture, and thus are the most widely studied endothelial cells. However, for research focused on processes like angiogenesis, permeability or many others, microvascular endothelial cells (ECs) are a much more physiologically relevant model to study 2. Furthermore, ECs isolated from knockout mice provide a useful tool for analysis of protein function ex vivo. Several approaches to isolate and culture microvascular ECs of different origin have been reported to date 3-7, but consistent isolation and culture of pure ECs is still a major technical problem in many laboratories. Here, we provide a step-by-step protocol on a reliable and relatively simple method of isolating and culturing mouse lung endothelial cells (MLECs). In this approach, lung tissue obtained from 6- to 8-day old pups is first cut into pieces, digested with collagenase/dispase (C/D) solution and dispersed mechanically into single-cell suspension. MLECS are purified from cell suspension using positive selection with anti-PECAM-1 antibody conjugated to Dynabeads using a Magnetic Particle Concentrator (MPC). Such purified cells are cultured on gelatin-coated tissue culture (TC) dishes until they become confluent. At that point, cells are further purified using Dynabeads coupled to anti-ICAM-2 antibody. MLECs obtained with this protocol exhibit a cobblestone phenotype, as visualized by phase-contrast light microscopy, and their endothelial phenotype has been confirmed using FACS analysis with anti-VE-cadherin 8 and anti-VEGFR2 9 antibodies and immunofluorescent staining of VE-cadherin. In our hands, this two-step isolation procedure consistently and reliably yields a pure population of MLECs, which can be further cultured. This method will enable researchers to take advantage of the growing number of knockout and transgenic mice to directly correlate in vivo studies with results of in vitro experiments performed on isolated MLECs and thus help to reveal molecular mechanisms of vascular phenotypes observed in vivo.

Here, we describe a protocol for isolation and culture of murine pulmonary endothelial cells. This method comprises mechanic and enzymatic lung tissue dissociation as well as a 2-step purification process using anti-PECAM-1 and anti-ICAM-2 antibodies conjugated to magnetic beads, which produces a pure endothelial cell population of mostly microvascular origin.

العزلة والثقافة في الخلايا البطانية الرئوي من الفئران حديثي الولادة

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

RNA-seq Analysis of Transcriptomes in Thrombin-treated and Control Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells

The characterization of gene expression in cells via measurement of mRNA levels is a useful tool in determining how the transcriptional machinery of the cell is affected by external signals (e.g. drug treatment), or how cells differ between a healthy state and a diseased state. With the advent and continuous refinement of next-generation DNA sequencing technology, RNA-sequencing (RNA-seq) has become an increasingly popular method of transcriptome analysis to catalog all species of transcripts, to determine the transcriptional structure of all expressed genes and to quantify the changing expression levels of the total set of transcripts in a given cell, tissue or organism1,2 . RNA-seq is gradually replacing DNA microarrays as a preferred method for transcriptome analysis because it has the advantages of profiling a complete transcriptome, providing a digital type datum (copy number of any transcript) and not relying on any known genomic sequence3.
Here, we present a complete and detailed protocol to apply RNA-seq to profile transcriptomes in human pulmonary microvascular endothelial cells with or without thrombin treatment. This protocol is based on our recent published study entitled "RNA-seq Reveals Novel Transcriptome of Genes and Their Isoforms in Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells Treated with Thrombin,"4 in which we successfully performed the first complete transcriptome analysis of human pulmonary microvascular endothelial cells treated with thrombin using RNA-seq. It yielded unprecedented resources for further experimentation to gain insights into molecular mechanisms underlying thrombin-mediated endothelial dysfunction in the pathogenesis of inflammatory conditions, cancer, diabetes, and coronary heart disease, and provides potential new leads for therapeutic targets to those diseases.
The descriptive text of this protocol is divided into four parts. The first part describes the treatment of human pulmonary microvascular endothelial cells with thrombin and RNA isolation, quality analysis and quantification. The second part describes library construction and sequencing. The third part describes the data analysis. The fourth part describes an RT-PCR validation assay. Representative results of several key steps are displayed. Useful tips or precautions to boost success in key steps are provided in the Discussion section. Although this protocol uses human pulmonary microvascular endothelial cells treated with thrombin, it can be generalized to profile transcriptomes in both mammalian and non-mammalian cells and in tissues treated with different stimuli or inhibitors, or to compare transcriptomes in cells or tissues between a healthy state and a disease state.

This protocol presents a complete and detailed procedure to apply RNA-seq, a powerful next-generation DNA sequencing technology, to profile transcriptomes in human pulmonary microvascular endothelial cells with or without thrombin treatment. This protocol is generalizable to various cells or tissues affected by different reagents or disease states.

RNA-يليها تحليل Transcriptomes في المعاملة والثرومبين الإنسان الرئوي مراقبة الخلايا البطانية الاوعية الدموية الدقيقة

The characterization of gene expression in cells via measurement of mRNA levels is a useful tool in determining how the transcriptional machinery of the ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an important model for cardiovascular disease research. This study demonstrates a simple method to isolate and culture endothelial cells from the mouse aorta without any special equipment. To isolate endothelial cells, the thoracic aorta is quickly removed from the mouse body, and the attached adipose tissue and connective tissue are removed from the aorta. The aorta is cut into 1 mm rings. Each aortic ring is opened and seeded onto a growth factor reduced matrix with the endothelium facing down. The segments are cultured in endothelial cell growth medium for about 4 days. The endothelial sprouting starts as early as day 2. The segments are then removed and the cells are cultured continually until they reach confluence. The endothelial cells are harvested using neutral proteinase and cultured in endothelial cell growth medium for another two passages before being used for experiments. Immunofluorescence staining indicated that after the second passage the majority of cells were double positive for Dil-ac-LDL uptake, Lectin binding, and CD31 staining, the typical characteristics of endothelial cells. It is suggested that cells at the second to third passages are suitable for in vitro and in vivo experiments to study the endothelial biology. Our protocol provides an effective means of identifying specific cellular and molecular mechanisms in endothelial cell physiopathology.

The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

العزلة والثقافة الابتدائية من خلايا الفأر الأورطي غشائي

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

Endothelium-derived nitric oxide (NO) produced from endothelial NO-synthase (eNOS) is one of the most important vasoprotective molecules in cardiovascular physiology. Dysfunctional eNOS such as uncoupling of eNOS leads to decrease in NO bioavailability and increase in superoxide anion (O2.&#8722;) production, and in turn promotes cardiovascular diseases. Therefore, appropriate measurement of NO and O2.&#8722; levels in the endothelial cells are pivotal for research on cardiovascular diseases and complications. Because of the extremely labile nature of NO and O2.&#8722;, it is difficult to measure NO and O2.&#8722; directly in a blood vessel. Numerous methods have been developed to measure NO and O2.&#8722; production. It is, however, either insensitive, or non-specific, or technically demanding and requires special equipment. Here we describe an adaption of the fluorescence dye method for en face simultaneous detection and visualization of intracellular NO and O2.&#8722; using the cell permeable diaminofluorescein-2 diacetate (DAF-2DA) and dihydroethidium (DHE), respectively, in intact aortas of an obesity mouse model induced by high-fat-diet feeding. We could demonstrate decreased intracellular NO and enhanced O2.&#8722; levels in the freshly isolated intact aortas of obesity mouse as compared to the control lean mouse. We demonstrate that this method is an easy technique for direct detection and visualization of NO and O2.&#8722; in the intact blood vessels and can be widely applied for investigation of endothelial (dys)function under (physio)pathological conditions.

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

In this article we describe an adapted relatively easy method using the fluorescence dye diaminofluorescein-2 diacetate (DAF-2DA) and dihydroethidium (DHE) for en face simultaneous detection and visualization of intracellular nitric oxide (NO) and superoxide anion (O2.&#8722;) respectively, in freshly isolated intact aortas of an obesity mouse model.

أون كشف الوجه من اكسيد النيتريك وفوق الأكسيد في طبقة بطانة الأوعية الدموية من شرايين سليمة

Endothelium-derived nitric oxide (NO) produced from endothelial NO-synthase (eNOS) is one of the most important vasoprotective molecules in cardiovascular ...

Isolation of Mouse Coronary Endothelial Cells

Endothelial cells line the inner wall of blood vessels and play an important role in the regulation of vascular tone, vascular permeability, and new vascular formation. Endothelial cell dysfunction is implicated in the development and progression of many cardiovascular diseases including ischemic heart disease. To examine the function and characterization of coronary endothelial cells, cell isolation is the first step and it requires high purity and quantity to conduct subsequent experiments. This protocol describes an efficient method to isolate adult mouse coronary endothelial cells. The mouse heart is dissected and minced into small pieces. After the digestion of the heart using dispase and collagenase II, cells are washed&#160;and incubated with magnetic beads which are conjugated with anti-CD31 antibody. The beads with endothelial cells are washed several times and are ready to use in various applications, including imaging and molecular biological experiments. Efficient isolation yields approximately 104 cells per one heart with over 90% purity.

This protocol is prepared to share our method of isolating mouse coronary endothelial cells for the purpose of imaging or to conduct molecular biological experiments.

عزل خلايا الفأر التاجي غشائي

Endothelial cells line the inner wall of blood vessels and play an important role in the regulation of vascular tone, vascular permeability, and new ...

Isolation and Culture of Primary Aortic Endothelial Cells from Miniature Pigs

Xenotransplantation is a promising way to resolve the shortage of human organs for patients with end-stage organ failure, and the pig is considered as a suitable organ source. Immune rejection and coagulation are two major hurdles for the success of xenotransplantation. Vascular endothelial cell (EC) injury and dysfunction are important for the development of the inflammation and coagulation responses in xenotransplantation. Thus, isolation of porcine aortic endothelial cells (pAECs) is necessary for investigating the immune rejection and coagulation responses. Here, we have developed a simple enzymatic approach for the isolation, characterization, and expansion of highly purified pAECs from miniature pigs. First, the miniature pig was anaesthetized with ketamine, and a length of aorta was excised. Second, the endothelial surface of aorta was exposed to 0.005% collagenase IV digestive solution for 15 min. Third, the endothelial surface of the aorta was scraped in only one direction with a cell scraper (&#60;10 times), and was not compressed during the process of scraping. Finally, the isolated pAECs of Day 3, and after passage 1 and passage 2, were identified by flow cytometry with an anti-CD31 antibody. The percentages of CD31-positive cells were 97.4% &#177; 1.2%, 94.4% &#177; 1.1%, and 92.4% &#177; 1.7% (mean &#177; SD), respectively. The concentration of Collagenase IV, the digestive time, the direction, and frequency and intensity of scraping are critical for decreasing fibroblast contamination and obtaining high-purity and a large number of ECs. In conclusion, our enzymatic method is a highly-effctive method for isolating ECs from the miniature pig aorta, and the cells can be expanded in vitro to investigate the immune and coagulation responses in xenotransplantation.

An effective enzymatic method for isolation of primary porcine aortic endothelial cells (pAECs) from miniature pigs is described. The isolated primary pAECs can be used to investigate the immune and coagulation response in xenotransplantation.

عزل وثقافة الخلايا البطانية الأبهرية الأولية من الخنازير المصغرة

Xenotransplantation is a promising way to resolve the shortage of human organs for patients with end-stage organ failure, and the pig is considered as a ...

Isolation and Characterization of Mouse Primary Liver Sinusoidal Endothelial Cells

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. LSECs have a distinct morphology characterized by the presence of fenestrae and the absence of basement membrane. LSECs play essential roles in many pathological disorders in the liver, including metabolic dysregulation, inflammation, fibrosis, angiogenesis, and carcinogenesis. However, little has been published about the isolation and characterization of the LSECs. Here, this protocol discusses the isolation of LSEC from both healthy and nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) mice. The protocol is based on collagenase perfusion of the mouse liver and magnetic beads positive selection of nonparenchymal cells to purify LSECs. This study characterizes LSECs using specific markers by flow cytometry and identifies the characteristic phenotypic features by scanning electron microscopy. LSECs isolated following this protocol can be used for functional studies, including adhesion and permeability assays, as well as downstream studies for a particular pathway of interest. In addition, these LSECs can be pooled or used individually, allowing multi-omics data generation including RNA-seq bulk or single cell, proteomic or phospho-proteomics, and Assay for Transposase-Accessible Chromatin using sequencing (ATAC-seq), among others. This protocol will be useful for investigators studying LSECs&#39; communication with other liver cells in health and disease and allow an in-depth understanding of the role of LSECs in the pathogenic mechanisms of acute and chronic liver injury.

Here we outline and demonstrate a protocol for primary mouse liver sinusoidal endothelial cell (LSEC) isolation. The protocol is based on liver collagenase perfusion, nonparenchymal cell purification by low-speed centrifugation, and CD146 magnetic bead selection. We also phenotype and characterize these isolated LSECs using flow cytometry and scanning electron microscopy.

عزل وتوصيف الخلايا البطانية الجيبية الأولية للكبد الفأر

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. ...

Isolation of Endothelial Cells from the Lumen of Mouse Carotid Arteries for Single-Cell Multi-Omics Experiments

Atherosclerosis is an inflammatory disease of the arterial regions exposed to disturbed blood flow (d-flow). D-flow regulates the expression of genes in the endothelium at the transcriptomic and epigenomic levels, resulting in proatherogenic responses. Recently, single-cell RNA sequencing (scRNAseq) and single-cell Assay for Transposase Accessible Chromatin sequencing (scATACseq) studies were performed to determine the transcriptomic and chromatin accessibility changes at a single-cell resolution using the mouse partial carotid ligation (PCL) model. As endothelial cells (ECs) represent a minor fraction of the total cell populations in the artery wall, a luminal digestion method was used to obtain EC-enriched single-cell preparations. For this study, mice were subjected to PCL surgery to induce d-flow in the left carotid artery (LCA) while using the right carotid artery (RCA) as a control. The carotid arteries were dissected out two days or two weeks post PCL surgery. The lumen of each carotid was subjected to collagenase digestion, and endothelial-enriched single cells or single nuclei were obtained. These single-cell and single-nuclei preparations were subsequently barcoded using a 10x Genomics microfluidic setup. The barcoded single-cells and single-nuclei were then utilized for RNA preparation, library generation, and sequencing on a high-throughput DNA sequencer. Post bioinformatics processing, the scRNAseq and scATACseq datasets identified various cell types from the luminal digestion, primarily consisting of ECs. Smooth muscle cells, fibroblasts, and immune cells were also present. This EC-enrichment method aided in understanding the effect of blood flow on the endothelium, which could have been difficult with the total artery digestion method. The EC-enriched single-cell preparation method can be used to perform single-cell omics studies in EC-knockouts and transgenic mice where the effect of blood flow on these genes has not been studied. Importantly, this technique can be adapted to isolate EC-enriched single cells from human artery explants to perform similar mechanistic studies.

We present a method for isolating endothelial cells and nuclei from the lumen of mouse carotid arteries exposed to stable or disturbed flow conditions to perform single-cell omics experiments.

عزل الخلايا البطانية عن تجويف الشرايين السباتية للفئران لإجراء تجارب متعددة الخلايا أحادية الخلية

Atherosclerosis is an inflammatory disease of the arterial regions exposed to disturbed blood flow (d-flow). D-flow regulates the expression of genes in ...

Isolation of Conditionally Immortalized Mouse Glomerular Endothelial Cells with Fluorescent Mitochondria

Glomerular endothelial cell (GEC) dysfunction can initiate and contribute to glomerular filtration barrier breakdown. Increased mitochondrial oxidative stress has been suggested as a mechanism resulting in GEC dysfunction in the pathogenesis of some glomerular diseases. Historically the isolation of GECs from in vivo models has been notoriously challenging due to difficulties in isolating pure cultures from glomeruli. GECs have complex growth requirements in vitro and a very limited lifespan. Here, we describe the procedure for isolating and culturing conditionally immortalized GECs with fluorescent mitochondria, enabling the tracking of mitochondrial fission and fusion events. GECs were isolated from the kidneys of a double transgenic mouse expressing the thermolabile SV40 TAg (from the Immortomouse), conditionally promoting proliferation and suppressing cell differentiation, and a photo-convertible fluorescent protein (Dendra2) in all mitochondria (from the photo-activatable mitochondria [PhAMexcised] mouse). The stable cell line generated allows for cell differentiation after inactivation of the immortalizing SV40 TAg gene and photo-activation of a subset of mitochondria causing a switch in fluorescence from green to red. The use of mitoDendra2-GECs allows for live imaging of fluorescent mitochondria&#39;s distribution, fusion, and fission events without staining the cells.

The article describes the method for isolating conditionally immortalized glomerular endothelial cells from the kidneys of transgenic mice expressing the thermolabile simian virus 40 and photo-activatable mitochondria, PhAMexcised. We describe the procedure for glomeruli isolation from whole kidneys using beads, digestion steps, seeding, and culturing of GECs-CD31 positive.

عزل الخلايا البطانية الكبيبية للفأر الخالدة المشروطة مع الميتوكوندريا الفلورية

Glomerular endothelial cell (GEC) dysfunction can initiate and contribute to glomerular filtration barrier breakdown. Increased mitochondrial oxidative ...