Ringraziamo tutti i membri del Kerscher laboratorio per il loro sostegno. Ringraziamo Mark Hochstrasser per ceppo di lievito MHY3765. Questo lavoro è stato sostenuto da NSF concedere 1051970 (per OK) e un Howard Hughes Medical Institute di laurea concessione Viaggi e Monroe Scholars Program Grant (ad ES).

Purificazione di proteine ​​6xHis-tagged espressi in cellule di lievito in erba in condizioni native 1. La crescita di cellule di lievito e l&#39;induzione di proteine ​​Espressione (Modificato da 2) OPTIONAL: utilizzare logaritmicamente crescenti colture di lievito esprimenti proteina di interesse, invece delle culture galattosio indotte descritte di seguito. <ol><li> Trasformare cellule di un ceppo Gal + lievito con un plasmide codificante una proteina di galattosio-inducibile di scelta 6xHis-tag. Ad esempio, vedere elenco reagenti. </li><li> Inoculare trasformanti in 5 ml di appropriati mezzi selettivi (ad esempio, SD-uracile) contenente 2% di saccarosio. Incubare a 30 ° CO / N, rotante. </li><li> Diluire coltura O / N in modo che la densità ottica a 600 nm misura 0,3 (OD 600 = 0.3) in 33 ml di terreno selettivo con il 2% di saccarosio. Crescere a 30 ° C, agitando (Δ150 rpm). </li><li> Quando la coltura ha raggiunto OD 600 = 0.8-1.5, Indurre l&#39;espressione della proteina desiderata aggiungendo 17 ml di 3x YEP con 6% di galattosio (Ricetta in tabella 1), per una concentrazione finale di 1x YEP con 2% di galattosio. Volume di cultura totale ora è 50 ml. Incubare, agitazione, a 30 ° C per altre 5-6 ore. Nota: il volume di coltura può essere variata. Nel passo 1.3, diluito in due terzi del volume finale desiderato. Nel passo 1.4, aggiungere un terzo del volume finale di 3x YEP / 6% galattosio. </li><li> Misurare il diametro esterno 600 della coltura indotta e centrifugare Δ150-200 OD 600 unità di cellule per 5 min a 5000 rpm a 4 ° C. </li><li> Risospendere il pellet di cellule con 1 ml di ghiacciata PBS 1x 1x con inibitore della proteasi cocktail e trasferimento ad un 2 ml tappo a vite del tubo. </li><li> Centrifugare le cellule per 1 min a 15.000 rpm a 4 ° C. Decantare il surnatante. </li><li> Snap freeze pellet di cellule in azoto liquido, seguita da lisi immediato cella o stoccaggio a -80 ° C fino all&#39;utilizzo. </li></ol><ol><li> Alla cella pellet congelato dal passaggio precedente, aggiungere 200 ml di perline di vetro lavata con acido e 500 microlitri di tampone di lisi ghiacciato (Ricetta nella Tabella 1 o utilizzare tampone di lisi cellulare di scelta). </li><li> Brevemente pipetta su e giù. Non è richiesto per risospendere completamente il pellet cellulare. Tenere i tubi in ghiaccio in ogni momento. Nota: La fine del puntale può essere tagliato prima di pipettare su e giù. </li><li> A 4 ° C, posto il tubo (s) con le cellule nel mulino tallone, l&#39;equilibrio, la serratura, ed eseguire la macchina secondo le indicazioni del produttore. </li><li> Esegui il battitore tallone contenente il tubo (s) per 20 sec a 5,5 m / sec, quindi immettere sul ghiaccio fangosa per 1 min. Ripetere 6x in totale. </li><li> Cancellare le proteine ​​estratte mediante centrifugazione per 15 min a 15.000 rpm a 4 ° C. OPTIONAL: rimuovere piccole particelle mediante centrifugazione attraverso un filtro Spinx. </li><li> Preparare un campione di cellula intera eXtract (WCE) per confermare la presenza della proteina di interesse mediante Western Blot: <ol><li> Aggiungere WCE corrispondente con 2 OD 600 unità di cellule (ad esempio 5 ml di estratto eliminato se OD 200 600 unità di cellule sono state raccolte) a 800 microlitri di acido tricloroacetico al 20% (TCA). Vortex per mescolare. </li><li> Centrifugare per 2,5 min a 15.000 rpm a 4 ° C. Decantare il surnatante, ma attenzione a conservare il pellet. </li><li> Aggiungere 800 ml di 2% TCA al pellet vortice e il tubo, seguita da centrifugazione per 2,5 min a 15.000 rpm a 4 ° C. Decantare il surnatante, ma attenzione a conservare il pellet. </li><li> Aggiungere 100 ml di TCA Sample Buffer (ricetta in tabella 1), vortice di sciogliere pellet. Nota: Se il tampone diventa acido (diventa giallo) dopo l&#39;aggiunta al pellet, aggiungere aliquote di Δ10 microlitri di base Tris [1M] fino a quando il campione è di nuovo blu. </li><li> Incubare in un blocco di calore 100 ° C per 2-5 min. </li><li> Vortice again per sciogliere completamente se resti di pellet sono ancora presenti. Pellets preparati da questo metodo sono notoriamente difficili da sciogliere completamente. Si può prendere Δ10 min di vortex per sciogliere completamente pellet. </li><li> Campione Conservare a -80 ° C fino a nuovo uso. </li></ol></li><li> Snap congelare aliquote di rimanere WCE eliminato in azoto liquido e conservare a -80 ° C fino a nuovo uso. </li></ol> 3. Purificazione Batch di proteine ​​da lievito omogenati cellulari Nota: Questo metodo di purificazione è stato ottimizzato per la purificazione di proteine ​​6xHis-targhetta su Co 2 + metallo resina di affinità. <ol><li> Resina Equilibration <ol><li> Per un campione di WCE eliminato preparato da Δ20-40 OD 600 unità di cellule, aggiungere 50-100 ml di resina di affinità in una provetta da microcentrifuga. Proteine ​​estratte da cellule che non esprimono la proteina desiderata o una resina non specifico, come amilosio, possono essere utilizzati come controllos per il legame non specifico. </li><li> Lavare resina 5x con 1 ml di tampone di lavaggio: capovolgere top-over-basso fino a quando la resina viene risospeso, e poi girare per 1 min a 5000 rpm a 4 ° C. Aspirare il surnatante. Nota: se si esegue l&#39;estrazione e purificazione nello stesso giorno, equilibramento resina può essere eseguita prima dell&#39;estrazione. </li></ol></li><li> Binding Protein per Affinity Purification <ol><li> Aggiungere 100-200 ml di lisato eliminato (Δ20-40 OD 600 unità) di 50-100 microlitri perline lavati, e portare il volume totale di 1 ml di tampone di lisi. </li><li> Incubare con nutazione o dondolo a 4 ° C per 2-5 ore. </li><li> Spin per 1 min a 5000 rpm a 4 ° C. </li><li> Se desiderato, salvare un campione del surnatante rimanente per la successiva analisi delle proteine ​​non legate. TCA precipitano come sopra per la WCE (passo 2,6). </li><li> Lavare resina con proteine ​​legate 5x con 1 ml di tampone di lavaggio, seguiti da una centrifuga per 1 min a 5.000 giri al4 ° C. Conservare i campioni a freddo durante i lavaggi. </li></ol></li><li> Eluizione di proteine ​​legate <ol><li> Aggiungere 150 microlitri di tampone di eluizione della resina, nutate a 4 ° C per 5 min, centrifugare per 1 min a 5000 rpm a 4 ° C e salvare il surnatante in una nuova provetta. OPTIONAL: repeat 2X e eluizioni piscina. </li><li> Preparare campione eluito per Western Blot: A 25 ml di proteine ​​eluite, aggiungere 25 ml di litio 2x dodecil solfato (LDS) tampone campione con 2 ml β-mercaptoetanolo (BME) e incubare in un blocco di calore ° C 100 per 2 min. Nota: 2X tampone campione Laemmli standard può anche essere usato. </li><li> Snap freeze eccesso di proteine ​​eluite in azoto liquido. OPTIONAL: strip rimanenti proteine ​​da resina con un volume uguale di tampone campione 2x LDS a 65 ° C per 5 min, rimuovono le proteine ​​LDS-eluite in una nuova provetta, quindi aggiungere 2 microlitri BME alle proteine ​​eluite, non alla resina. Questo scopo è quello di impedire la rimozione di eventuali ioni o anticorpi Conjugated ai talloni. </li><li> Conservare i campioni a -80 ° C fino a nuovo uso. </li></ol></li><li> Western Blot e sonda con anticorpi adeguati per visualizzare le proteine. <ol><li> Caricare 10-20 microlitri (Δ1-3 OD 600 unità) di ciascun campione e 3-10 microlitri di una scala proteina in un gel SDS-PAGE di scelta. Gel ordinariamente utilizzato questo protocollo sono 4-12% Bis-Tris e l&#39;8% Tris-Glycine. </li><li> Esegui gel a 200 V per 50 min. </li><li> Trasferire le proteine ​​da gel a una membrana PVDF mediante trasferimento a semi-secco a 19 V per 20-30 min (ricetta nella Tabella 1). </li><li> Membrana Block nel 4% milk/1x soluzione salina tamponata Tris-Tween (TBST) per 1 ora a temperatura ambiente o O / N a 4 ° C (ricetta nella Tabella 1). </li><li> Incubare la membrana con l&#39;anticorpo primario alla proteina-tag epitopo di interesse 4% milk/1x TBST per 1-3 ore a RT o O / N a 4 ° C. </li><li> Lavare membrana 3x per 5 minuti ciascuno con TBST 1x. </li><li> Incubare la membrana con adeguatasecondario perossidasi di rafano (HRP)-coniugato anticorpo per 1-3 ore a temperatura ambiente. </li><li> Lavare membrana 3x per 15 minuti ciascuno in un grande volume di TBST 1x. </li><li> Coprire membrana con substrato ECL e avvolgere in pellicola trasparente. </li><li> Esporre membrana al cinema e lo sviluppo di visualizzare le proteine. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Klis, F. M., Boorsma, A., De Groot, P. W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+wall+construction+inSaccharomyces+cerevisiae.">Cell wall construction inSaccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 23 (3), 185-202 (2006).</li><li>Gelperin, D. M., White, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+and+genetic+analysis+of+the+yeast+proteome+with+a+movable+ORF+collection.">Biochemical and genetic analysis of the yeast proteome with a movable ORF collection.</a> Genes Dev. 19 (23), 2816-2826 (2005).</li><li>Caserta, E., Haemig, H. A. 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T., Lewis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+SUMO-modified+proteome+by+multiple+approaches+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Defining the SUMO-modified proteome by multiple approaches in Saccharomyces cerevisiae.</a> J. Biol. Chem. 280 (6), 4102-4110 (2005).</li><li>Xie, Y., Rubenstein, E. M., Matt, T., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMO-independent+in+vivo+activity+of+a+SUMO-targeted+ubiquitin+ligase+toward+a+short-lived+transcription+factor.">SUMO-independent in vivo activity of a SUMO-targeted ubiquitin ligase toward a short-lived transcription factor.</a> Genes Dev. 24 (9), 893-903 (2010).</li><li>Daum, G. G., B&#246;hni, P. C. P., Schatz, G. 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T. M., Cox, L. M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+affinity+of+cholera+toxin+for+Ni2++ion.">The affinity of cholera toxin for Ni2+ ion.</a> Protein Eng. 11 (7), 577-581 (1998).</li><li>Hautbergue, G. G., Goguel, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yeast+C-type+cyclin+Ctk2p+is+phosphorylated+and+rapidly+degraded+by+the+ubiquitin-proteasome+pathway.">The yeast C-type cyclin Ctk2p is phosphorylated and rapidly degraded by the ubiquitin-proteasome pathway.</a> Mol. Cell. Biol. 19 (4), 2527-2534 (1999).</li><li>Elmore, Z. C., Donaher, M., Matson, B. C., Murphy, H., Westerbeck, J. W., Kerscher, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sumo-dependent+substrate+targeting+of+the+SUMO+protease+Ulp1.">Sumo-dependent substrate targeting of the SUMO protease Ulp1.</a> BMC Biol. 9, 74 (2011).</li><li>Xie, Y., Kerscher, O., Kroetz, M. B., McConchie, H. F., Sung, P., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yeast+Hex3.Slx8+heterodimer+is+a+ubiquitin+ligase+stimulated+by+substrate+sumoylation.">The yeast Hex3.Slx8 heterodimer is a ubiquitin ligase stimulated by substrate sumoylation.</a> J. Biol. Chem. 282 (47), 34176-34184 (2007).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questo protocollo si concentra sulla preparazione di intatto, nativo, e post-traduzionali modificato proteine ​​da cellule di lievito in erba per le applicazioni a valle. Prima di tentare questo protocollo, è fondamentale per determinare se la proteina di interesse può essere facilmente rilevata in estratti proteici preparati in condizioni denaturanti 12. Se gli anticorpi policlonali non sono disponibili può essere vantaggioso per tag epitopo della proteina di interesse in modo che la proteina di fusio...

L&#39;incredibile potenza di lievito genetica è leggendaria, ma la preparazione e l&#39;analisi delle proteine ​​native di lievito in erba, Saccharomyces cerevisiae, è spesso pieno di problemi. Quest&#39;ultimo è dovuto al notevole resistenza meccanica e di elasticità della cellula di lievito parete 1. Mezzi diversi sono stati descritti per la enzimatica, chimiche, meccaniche, e la pressione a base di disgregazione di cellule di lievito avere estratto proteico cellula intera 2-6. Queste tecniche variano ampiamente nella loro efficacia di cedere, estratti di proteine ​​native cellula-rappresentative che possono essere utilizzati per le successive analisi o fasi di purificazione. Ad esempio, la parete cellulare del lievito può essere rimosso con enzimi litici (es. zymolyase) e risultanti spheroblasts possono essere disturbate da taglio, detergenti, o lisi osmotica per rilasciare proteine. Questo approccio è stato impiegato con successo come punto di partenza per molte frazionamenti subcellulari ma richiede lunghe fasi di incubazioneche non sono compatibili con la stabilità di alcune proteine ​​7. Reagenti di lisi del lievito di proprietà (come i detersivi) per l&#39;estrazione chimica delle proteine ​​di cellule di lievito sono disponibili in commercio, ma l&#39;efficacia di questi reagenti in estrazione di proteine ​​e il loro effetto sulla successiva caratterizzazione biochimica delle proteine ​​non è sempre chiara 8. Omogeneizzatori ad alta pressione, spesso definito come presse francesi, effettivamente rompere le cellule di lievito per primo sottoponendoli ad alta pressione e poi l&#39;estrusione attraverso una piccola apertura in una cella di pressione. Questa tecnica produce estratti di alta qualità, ma l&#39;attrezzatura è molto costosa e può non essere adatto per piccole quantità di cellule o di campioni multipli 9. Pertanto, distruzione meccanica delle cellule di lievito in un mulino a sfere è spesso il metodo di scelta per native lievito preparazioni proteiche 10. Questa tecnica comporta distruzione meccanica della parete cellulare del lievito con acido-wagettare perle di vetro, che possono essere condotti con una varietà di agitatori, vortex o mulini tallone. In particolare, questo metodo può essere utilizzato per elaborare simultaneamente più piccoli campioni (1 ml di cellule o meno). Molti perline diversi o perline mill matrici disagi sono ora disponibili in commercio per distruggere quasi ogni tipo di tipo di cellule in 2 ml provette. Considerando le altre tecniche ed apparecchiature, un mulino branello ha il vantaggio aggiunto che la rottura delle cellule di lievito verifica molto veloce, che aiuta a preservare modificazioni post-traduzionali, come sumoylation, specialmente quando i buffer appropriati con proteasi e / o inibitori del proteasoma sono utilizzati e la temperatura di estratti è controllata. Questo protocollo si concentra sul veloce, efficace, affidabile e di estrazione di proteine ​​endogene e over-espressa in condizioni di dolci con il fine ultimo di preservare la funzione delle proteine, interazioni e modificazioni post-traduzionali. Mezzi di crescita, buffer di lisi cellularecomposizioni e le impostazioni mulino tallone sono ottimizzati per mantenere interazioni proteina e modificazioni post-traduzionali, come sumoylation e ubiquitylation.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1039">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Omni Bead Ruptor 24</td>
			<td style="width:124px;">Omni International</td>
			<td style="width:119px;">19-010</td>
			<td style="width:580px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Yeast ORF strain in BG1805</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>YSC3869</td>
			<td>GAL+ yeast strain that can be used for induction and extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">pYES2.1 TOPO vector</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>K4150-01</td>
			<td>GAL+ yeast strain that can be used for induction and extraction; contains a V5/6xHIS tag</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Halt Protease Inhibitor Single-Use Cocktail (100x)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">1860932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">2.0 ml Skirted Tube with Tethered Screw Cap</td>
			<td>BioExpress</td>
			<td style="width:119px;">C-3369-3</td>
			<td>Make sure that the tube properly fits in the bead ruptor</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Glass beads, acid-washed, 425-600 &#181;m (30-40 US sieve)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">CLS8161</td>
			<td>Use for additional filtering of clarified lysate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TALON Metal Affinity Resin</td>
			<td style="width:124px;">Clontech</td>
			<td>635502</td>
			<td>For the purification of 6xHIS tagged proteins</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">NuPAGE LDS Sample Buffer (4x)</td>
			<td style="width:124px;">Life Technologies</td>
			<td>NP0007</td>
			<td>To prepare and/or elute samples prior to SDS-PAGE and Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel</td>
			<td style="width:124px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">NP0321BOX</td>
			<td>Precast gels often used for SDS-PAGE prior to Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Simply Blue</td>
			<td style="width:124px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">#LC6060</td>
			<td>Protein gel stain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Mammalian Lysis Buffer</td>
			<td>Promega</td>
			<td style="width:119px;">G9381</td>
			<td>Alternative commercial lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Anti-V5 agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A7345</td>
			<td>Method of immunoprecipitation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ECL</td>
			<td style="width:124px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">WBKL S0 050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PVDF membrane</td>
			<td style="width:124px;">Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">BIS-TRIS gels</td>
			<td style="width:124px;">Life Technologies</td>
			<td>NP0321BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">anti-myc antibody</td>
			<td style="width:124px;">Covance</td>
			<td style="width:119px;">mms-150R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">secondary antibody</td>
			<td style="width:124px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab97040</td>
			<td>Goat pAb to mouse IgG (HRP)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

budding yeast protein extraction and purification for the study of function, interactions, and post-translational modifications

Omogeneizzazione di battitura tallone è un modo veloce ed efficace per liberare il DNA, RNA, proteine ​​e metaboliti da cellule di lievito in erba, che sono notoriamente difficile da interrompere. Qui si descrive l&#39;uso di un mulino omogeneizzatore tallone per l&#39;estrazione delle proteine ​​nei buffer ottimizzati per mantenere le funzioni, interazioni e modificazioni post-traduzionali di proteine. Cellule in crescita logaritmica che esprimono la proteina di interesse sono coltivate in un mezzo di crescita liquide di scelta. I terreni di coltura possono essere completate con i reagenti per indurre l&#39;espressione della proteina da promotori inducibili (ad esempio galattosio), sincronizzare fase del ciclo cellulare (ad es nocodazole), o inibire la funzione del proteasoma (es. MG132). Le cellule sono poi pellettato e risospese in un tampone adatto contenente proteasi e / o inibitori di fosfatasi e siano evase immediatamente o congelati in azoto liquido per uso successivo. Omogeneizzazione si ottiene sei cicli di 20 sec bead-battito (5,5 m / sec), ciascuno seguito di un minuto incubazione in ghiaccio. L&#39;omogenato risultante è eliminato per centrifugazione e piccole particelle può essere rimosso per filtrazione. L&#39;estratto cellulare e dovute eliminato (WCE) viene precipitato con 20% TCA per l&#39;analisi diretta delle proteine ​​totali mediante SDS-PAGE e Western blotting. Estratti sono adatti per affinità purificazione di proteine ​​specifiche, la rilevazione di modificazioni post-traduzionali, o l&#39;analisi delle proteine ​​co-purificazione anche. Come è il caso per la maggior parte dei protocolli di purificazione delle proteine, alcuni enzimi e proteine ​​possono richiedere condizioni uniche o composizioni tampone per la loro purificazione e altri possono essere instabili o insolubili nelle condizioni sopra indicate. In quest&#39;ultimo caso, il protocollo presentato può fornire un punto di partenza utile per determinare empiricamente la migliore strategia tallone-battitura per estrazione e purificazione di proteine. Mostriamo l&#39;estrazione e purificazione di un epitopo-tag SUMO E3 ligasi, SIZ1, un ciclo cellulareregolato proteina che diventa sia sumoylated e fosforilato, nonché un SUMO-mirata ubiquitina ligasi subunità, Slx5.

Nostri risultati rappresentativi rivelano che il protocollo di estrazione del tallone-battitura e proteina descritta è utile per la preparazione riproducibile di proteine ​​per una varietà di applicazioni a valle (riassunti nella tabella 2). SDS-PAGE seguita da colorazione con Coomassie di WCEs mostrano che una vasta gamma di proteine ​​(~ 12 a&gt; 250 kDa) può essere riproducibile estratto da cellule di lievito (Figura 1A). Bande discrete su una gamma di pesi molecolari sono...

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Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

La preparazione di estratti cellulari di lievito di alta qualità è un primo passo necessario per l&#39;analisi delle singole proteine ​​o intere proteomi. Qui si descrive un protocollo veloce, efficiente, e affidabile omogeneizzazione per le cellule di lievito in erba che è stato ottimizzato per preservare le funzioni della proteina, interazioni e modificazioni post-traduzionali.

Germogliamento lievito proteine ​​estrazione e purificazione per lo Studio della funzione, interazioni e modificazioni post-traduzionali

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

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Biology

24.8K Views.  The College of William & Mary.  La preparazione di estratti cellulari di lievito di alta qualità è un primo passo necessario per l'analisi delle singole proteine ​​o intere proteomi. Qui si descrive un protocollo veloce, efficiente, e affidabile omogeneizzazione per le cellule di lievito in erba che è stato ottimizzato per preservare le funzioni della proteina, interazioni e modificazioni post-traduzionali. 

Video: Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

Measuring Replicative Life Span in the Budding Yeast

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae has been used extensively to study the biology of aging, and several determinants of yeast longevity have been shown to be conserved in multicellular eukaryotes, including worms, flies, and mice 1. Due to the lack of easily quantified age-associated phenotypes, aging in yeast has been assayed almost exclusively by measuring the life span of cells in different contexts, with two different life span paradigms in common usage 2. Chronological life span refers to the length of time that a mother cell can survive in a non-dividing, quiescence-like state, and is proposed to serve as a model for aging of post-mitotic cells in multicellular eukaryotes. Replicative life span, in contrast, refers the number of daughter cells produced by a mother cell prior to senescence, and is thought to provide a model of aging in mitotically active cells. Here we present a generalized protocol for measuring the replicative life span of budding yeast mother cells. The goal of the replicative life span assay is to determine how many times each mother cell buds. The mother and daughter cells can be easily differentiated by an experienced researcher using a standard light microscope (total magnification 160X), such as the Zeiss Axioscope 40 or another comparable model. Physical separation of daughter cells from mother cells is achieved using a manual micromanipulator equipped with a fiber-optic needle. Typical laboratory yeast strains produce 20-30 daughter cells per mother and one life span experiment requires 2-3 weeks.

In this article we present a general protocol for measuring the replicative life span of yeast mother cells.

Durata pannello misura replicazione in lievito

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding ...

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Biologia

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

La colorazione delle proteine ​​in gel con Coomassie G-250, senza solventi organici acido acetico e

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Analysis of the Development of a Morphological Phenotype as a Function of Protein Concentration in Budding Yeast

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae. Although this protocol is based on the overexpression of a protein, it can easily be adapted for morphological phenotypes dependent on suppression of protein expression. Our lab is interested in studying the signaling properties of the endocytic adaptor protein epsin. To that purpose we used a dominant negative approach in which we over-expressed the conserved Epsin N-Terminal Homology (ENTH) domain in order to interfere with the functions of endogenous epsin-2 (Ent2 or YLR206W). We observed that overexpression of the ENTH domain of Ent2 (ENTH2) in wild type cells led to a cell division defect that is dependent on the mislocalization of a family of scaffolding proteins, septins.

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae.

Analisi dello sviluppo di un fenotipo morfologico come funzione della concentrazione di proteine ​​in lievito

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of ...

Detection of Post-translational Modifications on Native Intact Nucleosomes by ELISA

The genome of eukaryotes exists as chromatin which contains both DNA and proteins. The fundamental unit of chromatin is the nucleosome, which contains 146 base pairs of DNA associated with two each of histones H2A, H2B, H3, and H41. The N-terminal tails of histones are rich in lysine and arginine and are modified post-transcriptionally by acetylation, methylation, and other post-translational modifications (PTMs). The PTM configuration of nucleosomes can affect the transcriptional activity of associated DNA, thus providing a mode of gene regulation that is epigenetic in nature 2,3. We developed a method called nucleosome ELISA (NU-ELISA) to quantitatively determine global PTM signatures of nucleosomes extracted from cells. NU-ELISA is more sensitive and quantitative than western blotting, and is useful to interrogate the epiproteomic state of specific cell types. This video journal article shows detailed procedures to perform NU-ELISA analysis.

Nucleosome ELISA (NU-ELISA) is a sensitive and quantitative method to detect global patterns of post-translational modifications in preparations of native, intact nucleosomes. These modifications include methylations, acetylations, and phosphorylations at specific histone amino acid residues, and hence NU-ELISA provides a global proteomic assay of the overall chromatin modification states of specific cell types.

Rilevazione di modificazioni post-traduzionali in nativo nucleosomi intatto da ELISA

The genome of eukaryotes exists as chromatin which contains both DNA and proteins. The fundamental unit of chromatin is the nucleosome, which contains 146 ...

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to infection via the recruitment and activation of immune complexes. Activation of immune complexes is associated with post-translational modifications (PTMs) of proteins, such as phosphorylation, glycosylation, or ubiquitination. Understanding how these PTMs are choreographed will lead to a better understanding of how resistance is achieved.
Here we describe a protein purification method for nucleotide-binding leucine-rich repeat (NB-LRR)-interacting proteins and the subsequent identification of their post-translational modifications (PTMs). With small modifications, the protocol can be applied for the purification of other plant protein complexes. The method is based on the expression of an epitope-tagged version of the protein of interest, which is subsequently partially purified by immunoprecipitation and subjected to mass spectrometry for identification of interacting proteins and PTMs.
This protocol demonstrates that: i). Dynamic changes in PTMs such as phosphorylation can be detected by mass spectrometry; ii). It is important to have sufficient quantities of the protein of interest, and this can compensate for the lack of purity of the immunoprecipitate; iii). In order to detect PTMs of a protein of interest, this protein has to be immunoprecipitated to get a sufficient quantity of protein.

We describe here a protocol for the purification and characterization of plant protein complexes. We demonstrate that by immunoprecipitating a single protein within a complex, so we can identify its post-translational modifications and its interacting partners.

Identificazione delle modificazioni post-traduzionali di proteine ​​vegetali Complessi

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...

Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method offers the opportunity of investigating interactions occurring in solution (thus avoiding problems due to closeby surfaces as in other single molecule methods), controlling the DNA extension and tracking interaction dynamics as a function of both mechanical parameters and DNA sequence. The methods for establishing successful optical trapping and nanometer localization of single molecules are illustrated. We illustrate the experimental conditions allowing the study of interaction of lactose repressor (lacI), labeled with Atto532, with a DNA molecule containing specific target sequences (operators) for LacI binding. The method allows the observation of specific interactions at the operators, as well as one-dimensional diffusion of the protein during the process of target search. The method is broadly applicable to the study of protein-DNA interactions but also to molecular motors, where control of the tension applied to the partner track polymer (for example actin or microtubules) is desirable.

Here we describe the instrumentation and methods for detecting single fluorescently-labeled protein molecules interacting with a single DNA molecule suspended between two optically trapped microspheres.

Combinando singola molecola di manipolazione e di imaging per lo studio delle interazioni proteina-DNA

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method ...

Discovering Protein Interactions and Characterizing Protein Function Using HaloTag Technology

Research in proteomics has exploded in recent years with advances in mass spectrometry capabilities that have led to the characterization of numerous proteomes, including those from viruses, bacteria, and yeast.&#160; In comparison, analysis of the human proteome lags behind, partially due to the sheer number of proteins which must be studied, but also the complexity of networks and interactions these present. To specifically address the challenges of understanding the human proteome, we have developed HaloTag technology for protein isolation, particularly strong for isolation of multiprotein complexes and allowing more efficient capture of weak or transient interactions and/or proteins in low abundance. &#160;HaloTag is a genetically encoded protein fusion tag, designed for covalent, specific, and rapid immobilization or labelling of proteins with various ligands. Leveraging these properties, numerous applications for mammalian cells were developed to characterize protein function and here we present methodologies including: protein pull-downs used for discovery of novel interactions or functional assays, and cellular localization. We find significant advantages in the speed, specificity, and covalent capture of fusion proteins to surfaces for proteomic analysis as compared to other traditional non-covalent approaches. We demonstrate these and the broad utility of the technology using two important epigenetic proteins as examples, the human bromodomain protein BRD4, and histone deacetylase HDAC1.&#160; These examples demonstrate the power of this technology in enabling &#160;the discovery of novel interactions and characterizing cellular localization in eukaryotes, which will together further understanding of human functional proteomics. &#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;

HaloTag technology is a multifunctional technology which has shown significant success in isolation of both small and large protein complexes from mammalian cells.&#160; Here we highlight the advantages of this technology compared to existing alternatives and demonstrate its utility to study numerous aspects of protein function inside eukaryotic cells.

Scoprire le interazioni proteina e caratterizzazione di proteine ​​Funzione Con HaloTag Tecnologia

Research in proteomics has exploded in recent years with advances in mass spectrometry capabilities that have led to the characterization of numerous ...

Protein Purification Technique that Allows Detection of Sumoylation and Ubiquitination of Budding Yeast Kinetochore Proteins Ndc10 and Ndc80

Post-translational Modifications (PTMs), such as phosphorylation, methylation, acetylation, ubiquitination, and sumoylation, regulate the cellular function of many proteins. PTMs of kinetochore proteins that associate with centromeric DNA mediate faithful chromosome segregation to maintain genome stability. Biochemical approaches such as mass spectrometry and western blot analysis are most commonly used for identification of PTMs. Here, a protein purification method is described that allows the detection of both sumoylation and ubiquitination of the kinetochore proteins, Ndc10 and Ndc80, in Saccharomyces cerevisiae. A strain that expresses polyhistidine-Flag-tagged Smt3 (HF-Smt3) and Myc-tagged Ndc10 or Ndc80 was constructed and used for our studies. For detection of sumoylation, we devised a protocol to affinity purify His-tagged sumoylated proteins by using nickel beads and used western blot analysis with anti-Myc antibody to detect sumoylated Ndc10 and Ndc80. For detection of ubiquitination, we devised a protocol for immunoprecipitation of Myc-tagged proteins and used western blot analysis with anti-Ub antibody to show that Ndc10 and Ndc80 are ubiquitinated. Our results show that epitope tagged-protein of interest in the His-Flag tagged Smt3 strain facilitates the detection of multiple PTMs. Future studies should allow exploitation of this technique to identify and characterize protein interactions that are dependent on a specific PTM.

This manuscript describes the detection of sumoylation and ubiquitination of kinetochore proteins, Ndc10 and Ndc80, in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.

Purificazione delle proteine ​​tecnica che permette la rilevazione di sumoilazione e Ubiquitinazione di lievito in erba cinetocore proteine ​​Ndc10 e Ndc80

Post-translational Modifications (PTMs), such as phosphorylation, methylation, acetylation, ubiquitination, and sumoylation, regulate the cellular ...

Complete Workflow for Analysis of Histone Post-translational Modifications Using Bottom-up Mass Spectrometry: From Histone Extraction to Data Analysis

Nucleosomes are the smallest structural unit of chromatin, composed of 147 base pairs of DNA wrapped around an octamer of histone proteins. Histone function is mediated by extensive post-translational modification by a myriad of nuclear proteins. These modifications are critical for nuclear integrity as they regulate chromatin structure and recruit enzymes involved in gene regulation, DNA repair and chromosome condensation. Even though a large part of the scientific community adopts antibody-based techniques to characterize histone PTM abundance, these approaches are low throughput and biased against hypermodified proteins, as the epitope might be obstructed by nearby modifications. This protocol describes the use of nano liquid chromatography (nLC) and mass spectrometry (MS) for accurate quantification of histone modifications. This method is designed to characterize a large variety of histone PTMs and the relative abundance of several histone variants within single analyses. In this protocol, histones are derivatized with propionic anhydride followed by digestion with trypsin to generate peptides of 5 - 20 aa in length. After digestion, the newly exposed N-termini of the histone peptides are derivatized to improve chromatographic retention during nLC-MS. This method allows for the relative quantification of histone PTMs spanning four orders of magnitude.

This protocol outlines a fully integrated workflow for characterizing histone post-translational modifications using mass spectrometry (MS). The workflow includes histone purification from cell cultures or tissues, histone derivatization and digestion, MS analysis using nano-flow liquid chromatography and instructions for data analysis. The protocol is designed for completion within 2 - 3 days.

Flusso di lavoro completo per l&#39;analisi dell&#39;istone modificazioni post-traduzionali Utilizzando Bottom-up Spettrometria di Massa: Da istone estrazione all&#39;analisi dei dati

Nucleosomes are the smallest structural unit of chromatin, composed of 147 base pairs of DNA wrapped around an octamer of histone proteins. Histone ...

Applications of pHluorin for Quantitative, Kinetic and High-throughput Analysis of Endocytosis in Budding Yeast

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal remodeling and vesicular trafficking in living cells. Quantitative methodologies using chimeric GFP fusions have been developed for many applications; however, GFP is somewhat resistant to proteolysis, thus its fluorescence persists in the lysosome/vacuole, which can impede quantification of cargo trafficking in the endocytic pathway. An alternative method for quantifying endocytosis and post-endocytic trafficking events makes use of superecliptic pHluorin, a pH-sensitive variant of GFP that is quenched in acidic environments. Chimeric fusion of pHluorin to the cytoplasmic tail of transmembrane cargo proteins results in a dampening of fluorescence upon incorporation of the cargo into multivesicular bodies (MVBs) and delivery to the lysosome/vacuole lumen. Thus, quenching of vacuolar fluorescence facilitates quantification of endocytosis and early events in the endocytic pathway. This paper describes methods using pHluorin-tagged cargos for quantification of endocytosis via fluorescence microscopy, as well as population-based assays using flow cytometry.

Accurate quantification of vesicular trafficking events often provides key insights into roles for specific proteins and the effects of mutations. This paper presents methods for using superecliptic pHluorin, a pH-sensitive GFP variant, as a tool for quantification of endocytic events in living cells using quantitative fluorescence microscopy and flow cytometry.

Le domande di pHluorin per quantitativa, Cinetica e high-throughput analisi di endocitosi in germogliamento lievito

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal ...

Germogliamento lievito proteine ​​estrazione e purificazione per lo Studio della funzione, interazioni e modificazioni post-traduzionali

Germogliamento lievito proteine estrazione e purificazione per lo Studio della funzione, interazioni e modificazioni post-traduzionali