Ringraziamo Brian G. Coon e Claudia B. Hanna per le discussioni utili e supporto. Questo progetto è stato sostenuto da fondi di start-up dal Dep. di Scienze Biologiche, la Purdue University di Claudio R. Aguilar e un americano Cancer Society istituzionali Research Grant a Claudio R. Aguilar attraverso il Centro Purdue Cancro.

A. coltura cellulare e induzione di proteine Questa sezione descrive le condizioni di coltura cellulare, ciclo cellulare sincronizzazione con Nocodazole, seguita da induzione di espressione della proteina da un promotore regolabile in cellule di lievito. <ol><li> Il selvaggio lievito ceppo del tipo W303 (leu2-3, 112 TRP1-1 CAN1-100 ura3-1 ade2-1 his3-11, 15) si trasforma con copia alto (2μ) DNA plasmide che contiene il nostro gene di interesse (ENTH2) sotto il controllo di metionina-reprimibile promotore (MET25). Metionina 2mM è sufficiente per sopprimere l&#39;attività promotore, mentre i media manca metionina permette l&#39;espressione massima. Quindi, una gamma di concentrazioni di metionina può essere utilizzato per esprimere la proteina al livello desiderato. 1 Trasformazione di DNA plasmidico in cellule W303 viene fatto usando il LIAC-TE metodo secondo le procedure standard 2. Nota: Questo esperimento deve essere eseguita da crescere le cellule durante la notte, in presenza di 2mM metionina per garantire l&#39;espressione della proteina solo a livelli di fondo. La mattina dopo, espressione di proteine ​​deve essere indotta da risospendere le cellule in mancanza di mezzi di metionina subito dopo la sincronizzazione del ciclo cellulare (circa 4h). Tuttavia, abbiamo scoperto che il ENTH2-dipendente fenotipo divisione cellulare è indotta solo dopo una notevole concentrazione di ENTH2 ha accumulato nelle cellule (in genere dopo 4-6h di induzione di proteine ​​3), rendendo l&#39;andamento temporale per l&#39;analisi di tutte le manifestazioni di il fenotipo molto lungo (almeno 16h). Abbiamo scoperto che le cellule in crescita durante la notte, in presenza di metionina 0.2mm reprime il fenotipo morfologico, ma permette di concentrarsi subcritico proteina che può essere rapidamente aumentato a fenotipo che inducono i livelli quando vengono trasferiti su supporti privi metionina. Ciò consente un&#39;analisi dettagliata di gravi manifestazioni del difetto divisione cellulare in un periodo relativamente breve di tempo. Noi consigliamo quindi che lo sperimentatore determinare la concentrazione di metionina che è sotto-soglia per l&#39;induzione fenotipo caso per caso. </li><li> Scegliete sei colonie da un piatto contenente cellule recentemente trasformata e inoculare in 50 ml di terreni selettivi con 0.2mm metionina in un pallone sterilizzato conica utilizzando le normali tecniche sterili. Incubare per una notte a 30 ° C con agitazione a 200 giri al minuto. (Per ulteriori informazioni sulle condizioni standard di coltura di lievito, vedi rif. 4) </li><li> La mattina seguente, la densità delle cellule stimare misurando la densità ottica della cultura a 600nm. Trasferire l&#39;equivalente di 20 OD 600nm di cellule in una provetta sterile e raccogliere facendo girare a 2200 rpm per 5 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Risospendere le cellule in YPD ad una concentrazione di 0,4 OD 600nm / ml e aggiungere Nocodazole ad una concentrazione finale di 15μg/ml di da uno stock di 1mg/ml in DMSO. Incubare per 4 ore a 30 ° C con agitazione a 200gpm. Nota: i metodi alternativi di arresti tra cui l&#39;arresto in fase G0 con alfa-factor o in fase G1-S con idrossiurea può essere utilizzato. Abbiamo scoperto che l&#39;arresto in mitosi usando Nocodazole è semplice e abbastanza efficace per i nostri scopi. </li><li> Dopo 4 ore, controllare la percentuale di cellule in mitosi arrestati contando il numero di celle con dimensioni pari gemme osservando al microscopio. Se l&#39;arresto è superiore al 90%, passare alla fase successiva. In caso contrario, mantenere le cellule nel Nocodazole fino a quando la percentuale desiderata di arresto mitotico è raggiunto. </li><li> Celle di raccolta per centrifugazione a 2200 rpm per 5 minuti e lavare con acqua ghiacciata per tre volte. Dopo l&#39;ultimo lavaggio, risospendere il pellet in terreni selettivi mancano metionina ad una densità cellulare di circa 0,5 OD 600nm / ml. Trasferire la metà del volume delle cellule in una nuova provetta sterile e aggiungere metionina ad una concentrazione finale di 0,2 mm. Questo servirà come un controllo per gli effetti a causa di livelli basali di espressione della proteina. Questo segna la prima volta, punto dell&#39;esperimento (tempo = 0h). Analizzare le cellule ogni ora per 6 ore. </li></ol> B. Analisi dello Sviluppo Fenotipo Nota: Tutti i metodi di analisi descritti di seguito non devono essere eseguite simultaneamente. Determinazione dei livelli di espressione della proteina mediante Western blotting <ol><li> Ad ogni time-point, misurare la OD 600nm della cultura e del raccolto 2 OD 600nm equivalenti di cellule per centrifugazione a 2200 rpm per 5 minuti. </li><li> Risospendere il pellet in 1 ml di acqua sterile e trasferire la sospensione in una provetta da 1,5 ml Eppendorf. Ripetere la centrifugazione per ottenere un pellet. Aspirare il sopranatante. </li><li> Risospendere il pellet in 50μl SDS-PAGE tampone campione Laemmli (50 mM Tris pH 6.8, 2% SDS, 10% glicerolo, 2% β-mercaptoetanolo e 0,006% bromofenolo blu). Aggiungere 50μl di lavata con acido perle di vetro (0.2-0.4 micron di diametro) e vortex per 1 min. </li><li> Tubi bollire a 95 ° C di calore block per 2 minuti, vortice di nuovo per 30 secondi e di riprendere la bollitura per 5 minuti. Congelare il campione a -20 ° C. </li><li> Esegui campioni di proteine ​​su un 12% SDS-PAGE gel, trasferimento su una membrana di nitrocellulosa ed eseguire Western blotting con anticorpi idonei a rilevare la proteina di interesse. In questo esempio, si sonda la presenza di emoagglutinina (HA) tagged domini settimo incubando con il mouse anticorpi anti-HA (Covance, Princeton, NJ) a 1:2000 diluizione in Blotto-Tween (1XPBS, 5% senza grassi del latte secco , 0,1% Tween). HRP tag capra anti-topo anticorpo secondario (Pierce) a una diluizione di 1:2500, anche in Blotto-Tween, è consentito di legare l&#39;anticorpo primario sulla membrana per 1 ora a temperatura ambiente. Supersignal substrato Pico Occidente chemiluminescenza viene utilizzato per rilevare HRP anticorpo murino anti tag. </li><li> Quantificare i livelli di espressione della proteina di densitometria. </li></ol> Questa sezione descrive due metodi di sviluppo fenotipo monitoraggio in funzione della concentrazione di proteine ​​in aumento. Il primo metodo è la cellula-base della popolazione, mentre gli studi di secondo, a livello di una singola cella. Quantificazione di cellule fenotipo-divisione e morte cellulare <ol><li> Ad ogni time-point, trasferimento di sospensione 1 ml di cellule in una provetta sterile eppendorf utilizzando tecniche sterili e raccogliere le cellule per centrifugazione a 2200 rpm per 5 minuti. </li><li> Aspirare il surnatante e risospendere il pellet in 70μl media, seguita dalla blu di metilene 30μl da uno stock di 1mg/ml in acqua sterile. Blu di metilene è un colorante blu vitale che diventa incolore in ambiente riducente del citosol quindi le cellule morte possono essere identificati dal loro colore blu. </li><li> Pipettare ~ 6μl di questa sospensione su un vetrino pulito e mettere un coprioggetto sopra la goccia. Premere il coprioggetto delicatamente a formare uno strato sottile e uniforme di cellule tra le interfacce di vetro. </li><li> Dividere il coprioggetto in 9 quadranti e prendere 3 immagini al quadrante come indicato in fig. 2. Il numero di cellule / campo deve essere non più grandi di 30 celle per consentire una quantificazione precisa. Ogni vetrino possono essere esposte per circa 15 minuti prima di bolle d&#39;aria danneggiare la preparazione. </li><li> Contare il numero di cellule che mostrano il fenotipo in fase di studio. Il difetto divisione cellulare indotta su ENTH2 sovraespressione porta alla morte cellulare e, di conseguenza, abbiamo anche contare il numero di cellule morte identificati dal loro colore blu. </li><li> Calcolare la percentuale di cellule fenotipo. </li><li> Tracciare i dati come mostrato in fig. 3. </li></ol> Visualizzazione di fenotipo-specifici difetti usando la microscopia a fluorescenza Divisione cellulare delle cellule difettose, come si è visto su ENTH2 iperespressione, sono spesso caratterizzate da difetti della parete cellulare e Septin mislocalization3 (visualizzato come GFP-fusione di proteine). La parete cellulare del lievito può essere facilmente visibili con la colorazione Calcofluor Bianco (CFW) che si lega in maniera irreversibile alla chitina nelle pareti delle cellule di lievito. <ol><li> Ad ogni time-point, 1ml aliquota della cultura in un tubo eppendorf sterile e raccogliere le cellule per centrifugazione a 2200 rpm per 5 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Risospendere il pellet cellulare in 100μl di 1mg/ml soluzione CFW in acqua sterile e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente al buio. </li><li> Celle di raccolta per centrifugazione e lavare 3 volte con PBS 1X. </li><li> Risospendere il pellet in 100μl di PBS 1X e l&#39;immagine al microscopio utilizzando ottiche UV (parete cellulare) e di filtri FITC (GFP-Septin) con ingrandimento 100X. </li><li> Quantificare la percentuale di cellule con difetti della parete cellulare e mislocalization Septin seguendo i passaggi 4-6 nella sezione B.2.1 </li></ol> B.3. Determinazione del fenotipo di sviluppo a livello di singola cellula: Time-lapse microscopia video. <ol><li> Pulire un vetrino con una depressione concava con il 70% di alcol e lasciare asciugare all&#39;aria. </li><li> Lessate 0,06 g di agarosio in 5ml terreni selettivi mancano metionina in un tubo di vetro sterile in un forno a microonde fino a quando l&#39;agarosio si scioglie completamente. </li><li> Rapidamente 200μl pipetta della agarosio contenente i media nella depressione diapositive e invertire un altro vetrino pulito di vetro su di esso, facendo attenzione che non bolle d&#39;aria intrappolate sotto. </li><li> Quando il gel si solidifica, spostare la diapositiva in cima senza problemi di distanza dalla diapositiva depressione, mantenendo le loro superfici parallele in ogni momento. Questo assicura che la superficie del letto di agarosio è a filo con la superficie del vetrino depressione. Pulire la regione scivolo che circonda il letto di agarosio con un tessuto delicato. Il vetrino è pronto per l&#39;uso. </li><li> Al tempo = 4 ore, 1 ml trasferimento di cellule dalla cultura in una provetta eppendorf sterile e la raccolta per centrifugazione a 2200 rpm per 5 minuti a temperatura ambiente. Nota: Si consiglia un secondo tempo punto di essere scelto per assicurare alti livelli di espressione della proteina in modo che lo sviluppo del fenotipo è garantita. Esperimenti pilota sono tenuti al determine tempi di induzione caso per caso. </li><li> Aspirare il surnatante e risospendere le cellule in 100μl di fresco terreni selettivi mancano metionina. </li><li> Applicare vaselina ai bordi del coprioggetto. Poi mettete una goccia di sospensione cellulare al centro del letto di agarosio e diffusa uniformemente premendo delicatamente un coprioggetto su di loro. </li><li> Sigillare i bordi del coprioggetto con vaselina e fissare la sua posizione, allineando i bordi con smalto. Attendere che la asciuga smalto. </li><li> Posizionare il vetrino su un palco riscaldato di un microscopio e scegliere un campo che contiene non più di 10 cellule distanziate in modo adeguato. Come le cellule si dividono, il campo affollato nel tempo. </li><li> Prendete l&#39;immagine del campo ogni 5 minuti per ~ 5 ore. Progressione del fenotipo possono essere studiati con l&#39;assemblaggio di immagini in un filmato utilizzando il software ImageJ ( <a name="cite">Rasband, WS, ImageJ, US National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, http://rsb.info.nih.gov/ij/, 1997 -2005</a> ) </li></ol> Nota: utilizzare microscopio Zeiss Axiovert 200M, Zeiss AxioCam MRM monocromatica fotocamera digitale e Carl Zeiss software di acquisizione immagini AxioVision (versione 4.4) per l&#39;imaging cellulare dal vivo. Il controllo della temperatura si ottiene mettendo diapositive su un palco riscaldato mantenuta a 30 ° C, secondo il Tempcontrol Pecon 37 dispositivo. Al fine di evitare ri-regolazione la messa a fuoco più volte, è conveniente per programmare il software di acquisizione immagini per acquisire automaticamente un paio di Z-Stack immagini a ogni time-point e scegliere l&#39;immagine con la migliore messa a fuoco più tardi, quando il montaggio del film. Alcuni software di acquisizione immagini hanno la possibilità di messa a fuoco automatica per gli esperimenti corso del tempo. E &#39;conveniente usare l&#39;opzione a quando disponibili. Selvatico cellule di lievito tipo crescono meglio a 30 ° C quindi il controllo della temperatura è un fattore critico. Al fine di garantire un adeguato riscaldamento, è utile per fornire una fonte esterna di calore, oltre alla fase di riscaldamento. Per esempio, lasciare la luce trasmessa bianca del microscopio per tutta la durata delle immagini. E &#39;anche fondamentale per evitare bolle d&#39;aria durante la preparazione del letto di agarosio e panino cellulare. L&#39;aria intrappolate nelle bolle si espande quando riscaldato nel tempo e tendono a spingere le cellule lontano dal campo di essere fotografato. E &#39;inoltre importante garantire che le posizioni delle singole celle all&#39;interno del campo non cambiano sensibilmente per tutta la durata del processo di imaging, in particolare durante rifocalizzazione tentativi. Plugin di stabilizzazione delle immagini sono disponibili per ImageJ per correggere piccoli spostamenti nella posizione di cella dopo il film è stato assemblato. ( <a href="http://www.cs.cmu.edu/~kangli/code/Image_Stabilizer.html">http://www.cs.cmu.edu/ ~ kangli / code / Image_Stabilizer.html</a> ).

<ol>
	<li>R&#246;nicke, V., Graulich, W., Mumberg, D., M&#252;ller, R., Funk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+conditional+promoters+for+expression+of+heterologous+proteins+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Use of conditional promoters for expression of heterologous proteins in Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods Enzymol. 283, 313-322 (1997).</li><li>Gietz, R. D., Woods, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> High efficiency transformation with lithium acetate in Molecular Genetics of Yeast: A Practical Approach. , 121-134 (1994).</li><li>Mukherjee, D., Coon, B. G., Edwards, D. F., Hanna, C. B., Longhi, S. A., McCaffery, J. M., Wendland, B., Retegui, L. A., Bi, E., Aguilar, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yeast+endocytic+protein+Epsin+2+functions+in+a+cell-division+signaling+pathway.">The yeast endocytic protein Epsin 2 functions in a cell-division signaling pathway.</a> J Cell Sci. 122, 2453-2463 (2009).</li><li>Sherman, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Getting started with yeast in Guide to Yeats genetics and Molecular Biology. , 3-21 (1991).</li></ol>

Questo protocollo descrive come monitorare lo sviluppo di un fenotipo morfologico (cellula di lievito in grado di sottoporsi corretta divisione cellulare) al momento della sovraespressione proteica. Nel fare questa procedura è importante ricordarsi di raccogliere le cellule di lievito da pellettatura alla velocità di centrifugazione raccomandata come velocità più elevate possono danneggiare le cellule ed i risultati oscuri. Blu di metilene e Calcofluor bianco deve essere aggiunto a vivere le cellule appena prima di ...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Nocodazole</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma (St. Louis, MO)</td>
<td>M1404</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Methylene Blue 1% (w/v)</td>
<td>Reagent</td>
<td>VWR International</td>
<td>VW6276-0</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Calcofluor White</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma (St. Louis, MO)</td>
<td>F3543</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Petroleum Jelly</td>
<td>Reagent</td>
<td>VWR International</td>
<td>VW3339-2</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

analysis of the development of a morphological phenotype as a function of protein concentration in budding yeast

Delezione del gene e l&#39;iperespressione delle proteine ​​sono metodi comuni per lo studio delle funzioni delle proteine. In questo articolo, descriviamo un protocollo per l&#39;analisi del fenotipo di sviluppo in funzione della concentrazione di proteine ​​a popolazione e monocellulari livelli<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;. Anche se questo protocollo si basa sulla sovraespressione di una proteina, può essere facilmente adattato per fenotipi morfologici dipende soppressione della espressione proteica. Il nostro laboratorio è interessato a studiare le proprietà di segnalazione delle epsin endocitico proteina adattatore. A tal fine abbiamo utilizzato un approccio dominante negativa in cui siamo sovra-espresso il conservati<u&gt; E</u&gt; Psin<u&gt; N</u&gt; -<u&gt; T</u&gt; Erminal<u&gt; H</u&gt; Omology (settimo) dominio al fine di interferire con le funzioni di endogeno epsin-2 (o Ent2 YLR206W). Abbiamo osservato che l&#39;iperespressione del dominio settimo di Ent2 (ENTH2) nelle cellule wild-type ha portato a un difetto di divisione cellulare, che dipende dalla mislocalization di una famiglia di proteine ​​ponteggi, septins.

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Analysis of the Development of a Morphological Phenotype as a Function of Protein Concentration in Budding Yeast

Delezione del gene e l&#39;iperespressione delle proteine ​​sono metodi comuni per lo studio delle funzioni delle proteine. In questo articolo, descriviamo un protocollo per l&#39;analisi del fenotipo di sviluppo in funzione della concentrazione di proteine ​​a popolazione e monocellulari livelli<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;.

Analisi dello sviluppo di un fenotipo morfologico come funzione della concentrazione di proteine ​​in lievito

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of ...

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10.7K Views.  Purdue University. Delezione del gene e l'iperespressione delle proteine ​​sono metodi comuni per lo studio delle funzioni delle proteine. In questo articolo, descriviamo un protocollo per l'analisi del fenotipo di sviluppo in funzione della concentrazione di proteine ​​a popolazione e monocellulari livelli Saccharomyces cerevisiae.

Video: Analysis of the Development of a Morphological Phenotype as a Function of Protein Concentration in Budding Yeast

Use of Rotorod as a Method for the Qualitative Analysis of Walking in Rat

High speed videoanalysis of the details of movement can provide a source of information about qualitative aspects of walking movements. When walking on a rotorod, animals remain in approximately the same place making repetitive movements of stepping. Thus the task provides a rich source of information on the details of foot stepping movements. Subjects were hemi-Parkinson analogue rats, produced by injection of 6-hydroxydopamine (6-OHDA) into the right nigrostriatal bundle to deplete nigrostriatal dopamine (DA). The present report provides a video analysis illustration of animals previously were filmed from frontal, lateral, and posterior views as they walked (15). Rating scales and frame-by-frame replay of the video records of stepping behavior indicated that the hemi-Parkinson rats were chronically impaired in posture and limb use contralateral to the DA-depletion. The contralateral limbs participated less in initiating and sustaining propulsion than the ipsilateral limbs. These deficits secondary to unilateral DA-depletion show that the rotorod provides a use task for the analysis of stepping movements.

The rotorod test is used to assess motor status in the walking movement of hemi-Parkinson analogue rats.

L&#39;uso di Rotorod come un metodo per l&#39;analisi qualitativa del Camminare in Rat

High speed videoanalysis of the details of movement can provide a source of information about qualitative aspects of walking movements. When walking on a ...

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Biologia

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

Un neuronale e astrociti Co-Cultura Assay per l&#39;analisi dei contenuti elevati di neurotossicità

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Measuring Replicative Life Span in the Budding Yeast

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae has been used extensively to study the biology of aging, and several determinants of yeast longevity have been shown to be conserved in multicellular eukaryotes, including worms, flies, and mice 1. Due to the lack of easily quantified age-associated phenotypes, aging in yeast has been assayed almost exclusively by measuring the life span of cells in different contexts, with two different life span paradigms in common usage 2. Chronological life span refers to the length of time that a mother cell can survive in a non-dividing, quiescence-like state, and is proposed to serve as a model for aging of post-mitotic cells in multicellular eukaryotes. Replicative life span, in contrast, refers the number of daughter cells produced by a mother cell prior to senescence, and is thought to provide a model of aging in mitotically active cells. Here we present a generalized protocol for measuring the replicative life span of budding yeast mother cells. The goal of the replicative life span assay is to determine how many times each mother cell buds. The mother and daughter cells can be easily differentiated by an experienced researcher using a standard light microscope (total magnification 160X), such as the Zeiss Axioscope 40 or another comparable model. Physical separation of daughter cells from mother cells is achieved using a manual micromanipulator equipped with a fiber-optic needle. Typical laboratory yeast strains produce 20-30 daughter cells per mother and one life span experiment requires 2-3 weeks.

In this article we present a general protocol for measuring the replicative life span of yeast mother cells.

Durata pannello misura replicazione in lievito

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding ...

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis 

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), a plant cysteine protease, by real-time label-free analysis using Biacore X100. Several cystatin B variants with point mutations in areas of interaction with papain, are produced. For each cystatin B variant we determine its specific binding concentration using calibration-free concentration analysis (CFCA) and compare the values obtained with total protein concentration as determined by A280. After that, the kinetics of each cystatin B variant binding to papain is measured using single-cycle kinetics (SCK). We show that one of the four cystatin B variants we examine is only partially active for binding. This partial activity, revealed by CFCA, translates to a significant difference in the association rate constant (ka) and affinity (KD), compared to the values calculated using total protein concentration. Using CFCA in combination with kinetic analysis in a structure-function study contributes to obtaining reliable results, and helps to make the right interpretation of the interaction mechanism.

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis

We apply label-free protein interaction analysis using Biacore X100 for structure-function analysis of the binding of several cystatin B mutants to papain through kinetic characterization. Calibration-free concentration analysis (CFCA) measures the concentration of protein with retained binding activity without the need for a standard curve. We show that confirmation of concentrations using CFCA increases the reliability of the kinetic analysis and that kinetic constants can reliably be determined even if the activity of a recombinant protein is reduced.

L&#39;importanza della concentrazione della proteina corretta per Cinetica e determinazione affinità nella struttura-funzione di analisi

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously hard to disrupt. Here we describe the use of a bead mill homogenizer for the extraction of proteins into buffers optimized to maintain the functions, interactions and post-translational modifications of proteins. Logarithmically growing cells expressing the protein of interest are grown in a liquid growth media of choice. The growth media may be supplemented with reagents to induce protein expression from inducible promoters (e.g. galactose), synchronize cell cycle stage (e.g. nocodazole), or inhibit proteasome function (e.g. MG132). Cells are then pelleted and resuspended in a suitable buffer containing protease and/or phosphatase inhibitors and are either processed immediately or frozen in liquid nitrogen for later use. Homogenization is accomplished by six cycles of 20 sec&#160;bead-beating (5.5 m/sec), each followed by one minute incubation on ice. The resulting homogenate is cleared by centrifugation and small particulates can be removed by filtration. The resulting cleared whole cell extract (WCE) is precipitated using 20% TCA for direct analysis of total proteins by SDS-PAGE followed by Western blotting. Extracts are also suitable for affinity purification of specific proteins, the detection of post-translational modifications, or the analysis of co-purifying proteins. As is the case for most protein purification protocols, some enzymes and proteins may require unique conditions or buffer compositions for their purification and others may be unstable or insoluble under the conditions stated. In the latter case, the protocol presented may provide a useful starting point to empirically determine the best bead-beating strategy for protein extraction and purification. We show the extraction and purification of an epitope-tagged SUMO E3 ligase, Siz1, a cell cycle regulated protein that becomes both sumoylated and phosphorylated, as well as a SUMO-targeted ubiquitin ligase subunit, Slx5.

The preparation of high quality yeast cell extracts is a necessary first step in the analysis of individual proteins or entire proteomes. Here we describe a fast, efficient, and reliable homogenization protocol for budding yeast cells that has been optimized to preserve protein functions, interactions, and post-translational modifications.

Germogliamento lievito proteine ​​estrazione e purificazione per lo Studio della funzione, interazioni e modificazioni post-traduzionali

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys are composed of functional units known as nephrons, which are highly conserved with other vertebrates, including mammals. Research in zebrafish has recently demonstrated that two distinctive phenomena transpire after adult nephrons incur damage: first, there is robust regeneration within existing nephrons that replaces the destroyed tubule epithelial cells; second, entirely new nephrons are produced from renal progenitors in a process known as neonephrogenesis. In contrast, humans and other mammals seem to have only a limited ability for nephron epithelial regeneration. To date, the mechanisms responsible for these kidney regeneration phenomena remain poorly understood. Since adult zebrafish kidneys undergo both nephron epithelial regeneration and neonephrogenesis, they provide an outstanding experimental paradigm to study these events. Further, there is a wide range of genetic and pharmacological tools available in the zebrafish model that can be used to delineate the cellular and molecular mechanisms that regulate renal regeneration. One essential aspect of such research is the evaluation of nephron structure and function. This protocol describes a set of labeling techniques that can be used to gauge renal composition and test nephron functionality in the adult zebrafish kidney. Thus, these methods are widely applicable to the future phenotypic characterization of adult zebrafish kidney injury paradigms, which include but are not limited to, nephrotoxicant exposure regimes or genetic methods of targeted cell death such as the nitroreductase mediated cell ablation technique. Further, these methods could be used to study genetic perturbations in adult kidney formation and could also be applied to assess renal status during chronic disease modeling.

The zebrafish adult kidney is an excellent system for renal regeneration and disease studies. An essential aspect of such research is the assessment of nephron structure and function. This protocol describes several methodologies that can be implemented to assess nephron tubule composition and to evaluate renal reabsorption.

Analisi di Nefrone Composizione e funzione del rene Zebrafish adulti

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys ...

Protein Purification Technique that Allows Detection of Sumoylation and Ubiquitination of Budding Yeast Kinetochore Proteins Ndc10 and Ndc80

Post-translational Modifications (PTMs), such as phosphorylation, methylation, acetylation, ubiquitination, and sumoylation, regulate the cellular function of many proteins. PTMs of kinetochore proteins that associate with centromeric DNA mediate faithful chromosome segregation to maintain genome stability. Biochemical approaches such as mass spectrometry and western blot analysis are most commonly used for identification of PTMs. Here, a protein purification method is described that allows the detection of both sumoylation and ubiquitination of the kinetochore proteins, Ndc10 and Ndc80, in Saccharomyces cerevisiae. A strain that expresses polyhistidine-Flag-tagged Smt3 (HF-Smt3) and Myc-tagged Ndc10 or Ndc80 was constructed and used for our studies. For detection of sumoylation, we devised a protocol to affinity purify His-tagged sumoylated proteins by using nickel beads and used western blot analysis with anti-Myc antibody to detect sumoylated Ndc10 and Ndc80. For detection of ubiquitination, we devised a protocol for immunoprecipitation of Myc-tagged proteins and used western blot analysis with anti-Ub antibody to show that Ndc10 and Ndc80 are ubiquitinated. Our results show that epitope tagged-protein of interest in the His-Flag tagged Smt3 strain facilitates the detection of multiple PTMs. Future studies should allow exploitation of this technique to identify and characterize protein interactions that are dependent on a specific PTM.

This manuscript describes the detection of sumoylation and ubiquitination of kinetochore proteins, Ndc10 and Ndc80, in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.

Purificazione delle proteine ​​tecnica che permette la rilevazione di sumoilazione e Ubiquitinazione di lievito in erba cinetocore proteine ​​Ndc10 e Ndc80

Post-translational Modifications (PTMs), such as phosphorylation, methylation, acetylation, ubiquitination, and sumoylation, regulate the cellular ...

Applications of pHluorin for Quantitative, Kinetic and High-throughput Analysis of Endocytosis in Budding Yeast

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal remodeling and vesicular trafficking in living cells. Quantitative methodologies using chimeric GFP fusions have been developed for many applications; however, GFP is somewhat resistant to proteolysis, thus its fluorescence persists in the lysosome/vacuole, which can impede quantification of cargo trafficking in the endocytic pathway. An alternative method for quantifying endocytosis and post-endocytic trafficking events makes use of superecliptic pHluorin, a pH-sensitive variant of GFP that is quenched in acidic environments. Chimeric fusion of pHluorin to the cytoplasmic tail of transmembrane cargo proteins results in a dampening of fluorescence upon incorporation of the cargo into multivesicular bodies (MVBs) and delivery to the lysosome/vacuole lumen. Thus, quenching of vacuolar fluorescence facilitates quantification of endocytosis and early events in the endocytic pathway. This paper describes methods using pHluorin-tagged cargos for quantification of endocytosis via fluorescence microscopy, as well as population-based assays using flow cytometry.

Accurate quantification of vesicular trafficking events often provides key insights into roles for specific proteins and the effects of mutations. This paper presents methods for using superecliptic pHluorin, a pH-sensitive GFP variant, as a tool for quantification of endocytic events in living cells using quantitative fluorescence microscopy and flow cytometry.

Le domande di pHluorin per quantitativa, Cinetica e high-throughput analisi di endocitosi in germogliamento lievito

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal ...

High-resolution Imaging and Analysis of Individual Astral Microtubule Dynamics in Budding Yeast

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells regulate these processes and how genetic mutations impact regulation. The quantification of microtubule dynamics in metazoan models has a number of associated challenges, including a high microtubule density and limitations on genetic manipulations. In contrast, the budding yeast model offers advantages that overcome these challenges. This protocol describes a method to measure the dynamics of single microtubules in living yeast cells. Cells expressing fluorescently tagged tubulin are adhered to assembled slide chambers, allowing for stable time-lapse image acquisition. A detailed guide for high-speed, four-dimensional image acquisition is also provided, as well as a protocol for quantifying the properties of dynamic microtubules in confocal image stacks. This method, combined with conventional yeast genetics, provides an approach that is uniquely suited for quantitatively assessing the effects of microtubule regulators or mutations that alter the activity of tubulin subunits.

Budding yeast is an advantageous model for studying microtubule dynamics in vivo due to its powerful genetics and the simplicity of its microtubule cytoskeleton. The following protocol describes how to transform and culture yeast cells, acquire confocal microscopy images, and quantitatively analyze microtubule dynamics in living yeast cells.

Ad alta risoluzione Imaging e analisi dei singoli microtubuli astrali Dynamics in germogliamento lievito

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells ...

Analisi dello sviluppo di un fenotipo morfologico come funzione della concentrazione di proteine ​​in lievito

Analisi dello sviluppo di un fenotipo morfologico come funzione della concentrazione di proteine in lievito