Ringraziamo il Dott. Martin Rosenberg, il dottor Gary Tarpley, e il dottor Keith Wood per il supporto di questo lavoro, e il Dr. James Cali per la lettura critica del manoscritto. DLD, JM, HB, NM, AN, JC, e MU sono dipendenti di Promega Corporation. MF, RJ, RA, e DA sono dipendenti di MS Bioworks, LLC.

Nota: Il seguente protocollo può essere utilizzato con qualsiasi fusione HaloTag e in qualsiasi linea cellulare di scelta stabilmente o transitoriamente transfettate. Per questi esempi, gli daremo i protocolli di trasfezione transiente di fusioni HaloTag in cellule HEK293T o HeLa. Per tutti gli esperimenti, si raccomanda di utilizzare il solo controllo della proteina. 1. Fusion Protein Expression test <ol><li> Ottenere proteina di fusione costrutto: <ol><li> Ottenere pre-made vettore HaloTag fusione o costruire utilizzando vettori esistenti. Per ulteriori informazioni sui costrutti disponibili, vedere la Tabella dei reagenti specifici. </li><li> Se fare qualsiasi clone, si raccomanda di verificare sequenziare il DNA. </li></ol></li><li> Test espressione della proteina e controllo di fusione: <ol><li> Per ogni campione, preparare 250 ml di 1X SDS tampone di colorante di caricamento (60 mM Tris HCl pH6.8, 0,75 mm blu di bromofenolo e 12,5% glicerolo, ditiotreitolo 100 mm, 0,5% SDS). </li><li> Per ogni proteina di fusionee controllo, piatto 0,5 ml di HEK293T o cellule HeLa nel loro supporto appropriato ad una densità di 2-4 x 10 5 cellule / ml in una piastra standard da 24 pozzetti. </li><li> Incubare per 18-24 ore a 37 ° C e 5% di CO 2, poi trasfezione come raccomandato. </li><li> 24 ore dopo la trasfezione, aggiungere 0,5 ml di 5 mm rodammina tetra-metil (TMR), ligando ai media di ogni pozzetto e mescolare delicatamente piatto. </li><li> Incubare le cellule transfettate contenenti ligando per 15 min a 37 ° C e 5% di CO 2. </li><li> Aspirare il terreno off contenente il ligando e lavare ogni pozzetto di cellule delicatamente con 1 ml di RT PBS. </li><li> Aspirare off PBS ed eseguire un secondo lavaggio con 1 ml di RT PBS. </li><li> Rimuovere PBS e aggiungere 200 ml di 1X SDS Caricamento buffer di colorante direttamente alle cellule. </li><li> Pipetta lisato dalla piastra in 1,5 ml provetta Eppendorf. </li><li> Lisato bollire per 5 min a 95 ° C. </li><li> Rimuovere 5-10 microlitri della reazione e carico su gel SDS-PAGE. </li><li> Utilizzare uno scanner di rilevamento fluorescente(TMR eccitazione: 555 nm, emissione: 585 nm) per individuare le bande. Utilizzare marcatori proteici fluorescenti come standard. </li><li> Se uno scanner rilevazione fluorescente è più disponibile, eseguire western blot utilizzando anticorpi contro la proteina esca sia o tag proteina di fusione per rilevare l&#39;espressione della proteina di fusione. </li></ol></li></ol> 2. Pulldowns proteine <ol><li> Preparazione delle cellule trasfettate in maniera transiente: <ol><li> Per ogni fusione o il controllo preparare un piatto 15 centimetri con 30 ml di cellule a 3-4 x 10 5 cellule / ml o 1-1,2 x 10 7 cellule totale per costrutto. </li><li> Incubare per 18-24 ore a 37 ° C e 5% di CO 2, poi trasfettare costruire come raccomandato. </li><li> Dopo 24-48 ore dopo la trasfezione, rimuovere il supporto e lavare delicatamente lo strato di cellule con 20-25 ml di ghiaccio PBS freddo. </li><li> Rimuovere lavaggio PBS, quindi aggiungere 25-30 ml di 4 ° C refrigerati PBS e raschiare delicatamente le cellule dalla piastra. </li><li> Raccogliere le cellule in provette coniche e centrifugaFuge per 5-10 min a 2.000 xg e 4 ° C. </li><li> Scartare il surnatante e mettere il pellet cellulare a -80 ° C per un minimo di 30 min o un massimo di 6 mesi. </li></ol></li><li> Equilibration della resina HaloLink: <ol><li> Per ogni campione di fusione o di controllo, preparare 12 ml di tampone in resina Equilibration / Wash (100 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, e 0,005% IGEPAL CA-630). Nota: È molto importante da fare e usare la resina Equilibration Buffer entro 12 ore come diluito IGEPAL CA-630 non è stabile o efficace oltre questo lasso di tempo. </li><li> Agitare delicatamente o miscela di resina per ottenere una sospensione uniforme. </li><li> Per ogni esperimento pull-down, dispensare 200 ml di resina in un provette da 1,5 ml microcentrifuga. </li><li> Centrifugare per 1 min a 800 xg (ad esempio, 3,000 rpm in una microcentrifuga), poi rimuovere con attenzione e scartare il surnatante (etanolo) senza disturbare resina sul fondo della provetta. </li><li> Aggiungere 800 ml di resina equilibrazione / Wash tampone e mescolare accuratamente capovolgendo la provetta diverse volte. </li><li> Centrifugare per 2 minuti a 800 xg, rimuovere con cautela e scartare il surnatante. </li><li> Ripetere i punti 2.2.5 e 2.2.6 altre due volte per un totale di 3 lavaggi. </li><li> Non rimuovere il lavaggio finale o surnatante fino al momento di aggiungere lisati cellulari descritte di seguito (Passo 2.3.8) per evitare che la resina si secchi. </li></ol></li><li> Rilegatura e lavaggio di complessi di fusione: <ol><li> Per ogni campione, preparare 500 ml di Mammalian Lysis buffer (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0,1% Na Desossicolato) e 1 ml di tampone 1X TBS (100 mM Tris-HCl pH 7.5 e NaCl 150 mM). </li><li> Scongelare il pellet e risospendere in 300 ml di mammiferi Lysis Buffer pipettando su e giù o brevemente vortex. </li><li> Aggiungere 6 ml di 50X inibitore della proteasi Cocktail (800 mcg / ml benzamidina HCl, 500 mg / fenantrolina ml, 500 mg / ml aprotinina, 500 mg / ml leupeptina, 500 &amp; #. 181; g / ml pepstatina A, 50 mM PMSF) Nota: cocktail proteasi che comprendono AEBSF non possono essere utilizzati come tali funzioni interferiscono con tag proteina di fusione di legame. </li><li> Aggiungere 3 microlitri DNasi RQ1 e capovolgere per 10 minuti a RT. </li><li> Dounce con vetro omogeneizzatore 2,0 ml dimensione; . 25-30 colpi su ghiaccio, o passare cellule attraverso un ago G 25 o 27 5-10 volte per completare lisi Nota: Sonicazione non è raccomandato in quanto complessi possono cadere a pezzi e sovra-riscaldamento possono influenzare l&#39;attività tag proteina di fusione. </li><li> Centrifugare a 14.000 xg per 5 minuti a 4 ° C per cancellare il lisato. </li><li> Trasferire il lisato chiaro, circa 300 volume totale ml, a nuovo tubo e posto sul ghiaccio. </li><li> Aggiungi a cancellare lisato altri 700 ml di tampone 1X TBS e mescolare bene pipettando su e giù. </li><li> Prendere tubi resina equilibrata preparata al punto 2.2.8 e rimuovere finale di lavaggio / surnatante da resina senza disturbare resina sul fondo della provetta. </li><li> Aggiungere a ciascuna tuessere di resina, i 1 ml di lisato diluito. </li><li> Incubare con miscelazione su un rotatore tubo (o mixer dolce) per 15 min a 22 ° C. Nota: assestamento di resina durante questo tempo riduce l&#39;efficienza di legame. Se vincolante a 4 ° C è desiderato, farlo mescolando per 1 ora. </li><li> Tubi in resina centrifugare per 2 min a 800 xg ed eliminare il surnatante. </li><li> Aggiungere 1 ml di tampone in resina Equilibration / Wash effettuate nella Fase 2.2.1 e mescolare accuratamente capovolgendo il tubo di resina a mano diverse volte. </li><li> Tubi in resina centrifugare per 2 min a 800 xg ed eliminare il lavaggio. </li><li> Ripetere i passaggi 2.3.12 2.3.14, seguita da altre tre volte. </li><li> Aggiungere 1 ml di tampone di equilibrazione resina / lavaggio e incubare a 22 ° C per 5 minuti con rotazione costante. </li><li> Tubi in resina centrifugare per 2 min a 800 xg ed eliminare il lavaggio. </li><li> A seconda dell&#39;applicazione finale (vedere Introduzione per ulteriori spiegazioni), procede alla Sezione 2.4 o 2.5. </li></ol></li><li> SEluizione DS per i gel denaturanti, macchie occidentali, o spettrometria di massa: <ol><li> Risospendere la resina da ciascun campione in 50 microlitri tampone SDS eluizione (1% SDS e 50 mM Tris-HCl pH7.5) </li><li> Agitare le provette a temperatura ambiente per 30 min. </li><li> Centrifugare per 2 minuti a 800 XG e trasferire eluati a tubi nuovi per l&#39;analisi. </li><li> Per western blot o gel macchia d&#39;argento, carico 5-10 microlitri su un gel denaturante SDS. </li><li> Per spettrometria di massa, salvare 40 microlitri di ciascun campione a -20 ° C. </li></ol></li><li> TEV Protease eluizione per test funzionali, macchie occidentali, o spettrometria di massa: <ol><li> Dopo aver rimosso l&#39;ultimo lavaggio, risospendere la resina in 50 microlitri tampone ProTEV clivaggio e 30 unità di enzima TEV. </li><li> Incubare a 25 ° C con agitazione per 1 ora. </li><li> Centrifugare per 2 minuti a 800 x g. </li><li> Trasferimento eluato ai tubi freschi. </li><li> Conservare il campione a 4 ° C per un uso immediato in saggi funzionali. </li></ol></li></ol> 3.Cellular Imaging di fluorescenza con etichette proteine ​​di fusione Utilizzando un citoplasmatica e nucleare permeabile Ligand <ol><li> Transfettare, etichetta, e le cellule di immagine: <ol><li> In un 8 coprioggetti ben camerata per ciascuna proteina di fusione o di controllo, piatto 400 microlitri di cellule HeLa in loro supporto appropriato in ciascun pozzetto ad una densità di 1-2 x 10 5 cellule / ml. </li><li> Incubare per 18-24 ore a 37 ° C e 5% di CO 2, poi trasfezione come raccomandato. </li><li> 18-24 hr dopo la trasfezione, diluire TMR ligando 1:200 cellulari in mezzi appropriati, quindi aggiungere 100 ml di questa soluzione in ogni pozzetto e mescolare delicatamente. </li><li> Incubare le cellule transfettate contenenti ligando per 15 min a 37 ° C e 5% di CO 2. </li><li> Aspirare il terreno off contenenti ligando e sostituirlo con 500 ml di mezzi di comunicazione idonei privi di proteina di fusione tag ligando, che è stato pre-riscaldato a 37 ° C. </li><li> Ripetere due volte per un totale di tre lavaggi. </li><li> Mettere le cellule di nuovo in incubatrice (376, C e 5% CO 2) per 30 min. </li><li> Aspirare off media e sostituirlo con 500 ml di mezzi appropriati, che è stato pre-riscaldato a 37 ° C. </li><li> Immagine su un microscopio utilizzando adeguati parametri di acquisizione (TMR di eccitazione: 555 nm, emissione: 585 nm). </li></ol></li></ol>

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Spese di pubblicazione per questo articolo sono sponsorizzati da Promega Corporation. Danette L. Daniels, Jacqui Méndez, Hélène Benink, Andrew Niles, Nancy Murphy e Marjeta Urh sono dipendenti di Promega Corporation, il proprietario imprese cessione di brevetti della tecnologia HaloTag e le sue applicazioni. Michael Ford, Richard Jones, Ravi Amunugama, e David Allen sono dipendenti di MSBioworks, che fornisce servizi di spettrometria di massa descritti in questo manoscritto.

Presentato qui ci sono due proteine ​​di fusione, Halo-BRD4 e Halo-HDAC1, caratterizzato in cellule di mammifero eucariote per l&#39;espressione, proteina complessa isolamento e di attività, e la localizzazione cellulare. Nel lavoro attraverso questi diversi protocolli, ci sono diversi passi importanti per il successo di ogni esperimento. Come è il caso con qualsiasi proteina di fusione, livelli di espressione e la posizione del tag stesso può essere critico per il mantenimento fisiologia. E &#39;quindi importante considerare che fusioni C-terminale N-e / o dovranno essere progettato se non è stata dimostrata conoscenza o lavorare con un altro tag preliminare per la particolare proteina di scelta. Per quanto riguarda l&#39;espressione, se il livello è troppo alto, la diluizione del DNA può essere eseguita durante la transfezione o l&#39;utilizzo di vettori con promotori deboli sono possibili per raggiungere il livello appropriato. Il lavoro precedente è stato eseguito mostrando isolamento efficiente di complessi macromolecolari a endogeno levels di espressione 8, che consentono il lavoro a livelli molto bassi di espressione. Se possibile, studi localizzazione cellulare sarebbe anche in grado di fornire indicazioni circa la collocazione del tag ottimale così come il livello di espressione rispetto necessario per una corretta fisiologia. Una volta che le proteine ​​di fusione sono pronti per esperimenti pulldown, per ottenere il massimo successo con il protocollo è molto importante seguire i tempi consigliati nella lisi, l&#39;associazione e sezioni di lavaggio, come uno dei maggiori vantaggi è la velocità dell&#39;isolamento complesso processo. Se uno qualsiasi di questi passaggi sono allungate nel tempo, come è richiesto per un metodo di cattura a base di anticorpi, vi è il rischio di dissociazione complesso o aumentata vincolante 8 non specifico. Allo stesso modo se i tempi si accorciano durante la lisi cellulare o vincolante, le cellule non possono essere completamente lisati o efficiente catturati rispettivamente. Se il numero di lavaggi è dimalleviato o buona miscelazione della resina non si verifica durante i lavaggi vincolanti o, quindi saranno aumentati livelli di proteine ​​non specifici di sfondo. Inoltre, i mezzi di lisi è molto importante in quanto correlata alla efficienza di legame alla resina. I tentativi di Sonicare i campioni, rimuovere il prodotto detergente raccomandato, aggiungere SDS o altre sostanze detergenti e / o includere il AEBSF inibitore della proteasi si tradurrà in riduzione o la perdita di legame delle proteine ​​di fusione e dei loro complessi alla resina. Metodi esistenti per l&#39;isolamento complesso da cellule di mammifero e lotta analisi proteomica umana con la sfida di ridurre background in analisi mediante spettrometria di massa 16. Questo è stato così significativo che un deposito di proteine ​​contaminanti è stata creata da numerosi gruppi di spettrometria di massa 16. Sfondo in campioni spettrometria di massa a tendina può essere definito come qualcosa che impedisce l&#39;identificazione diveri interattori della proteina esca. Come tale, sfondo può derivare da proteine ​​contaminanti non specifici o anche grandi concentrazioni di proteine ​​esche o anticorpi utilizzati per precipitare le proteine ​​esca. Lavoro significativo è stato fatto per ottimizzare sia il protocollo pulldown presentata qui, come la resina di minimizzare il livello delle proteine ​​contaminanti non specifici nel processo pulldown. Questo è evidente nei gel macchia d&#39;argento e analisi di spettrometria di massa di controllo (Figura 2). Per affrontare gli elevati livelli di proteina esche o di anticorpi che possono essere altrettanto dannosi come agenti inquinanti e con altre metodologie che lottano, si raccomanda il menu a discesa con SDS eluizione (Protocollo Sezione 2.4). A causa del legame covalente alla resina, questo processo lascerà la maggior parte della proteina di fusione partenza covalentemente alla resina. Una piccola percentuale di esca si osserva nella analisi di spettrometria di massa, che si ritieneche avvenga attraverso idrolisi, ma non presenta un problema per il rilevamento di altre interazioni deboli o transitori 8. Come accennato nell&#39;introduzione, progressi significativi nella proteomica sono stati abilitati da significativi progressi nella spettrometria di massa 1,7. Pertanto, è importante sottolineare parametri importanti della scelta di analisi di spettrometria di massa per deconvolute la miscela di proteine ​​ottenuti nelle pulldowns. Strumentazione deve essere robusto e in grado di analizzare regolarmente ed efficiente campioni contenenti una piccola quantità di proteine, spesso inferiore &lt;1 mg. Cromatografia nanoscala coinvolge 50-75 micron colonne HPLC diametro interno con portate nell&#39;intervallo nl / min 100-300 è tipicamente impiegato per la compatibilità con i campioni di piccole dimensioni e per massimizzare la sensibilità dello spettrometro di massa. Per massimizzare le informazioni acquisite in uno Stato o singola analisif gli spettrometri di massa dell&#39;arte in grado di acquisire spettri di massa ad alta risoluzione su una scala temporale compatibile con le suddette separazioni su scala nanometrica, ≥ 10 Hz, sono tipicamente impiegati. Questi strumenti hanno livelli attomolar di sensibilità e possono ordinariamente acquisire dati con sub precursore ppm e tolleranze di massa di ioni prodotto. Tali caratteristiche di rendimento servono per aumentare la resa del numero di proteine ​​identificate e l&#39;attendibilità associato tali identificazioni. Con questi dati ci dimostrano la localizzazione fisiologico cellulare, la proteina corretta: interazioni proteina insieme con un potenziale per la scoperta di nuove interazioni, e l&#39;isolamento di complessi attivi tutto utilizzando un unico costrutto. Infatti tecnologie alternative possono essere usate per ciascuno di questi diversi aspetti, ma probabilmente non per tutti 23,24. Con la tecnologia HaloTag, un approccio multifunzionale può essere utilizzato, avanzando proteomCI studi e ottenere una comprensione più completa della funzione della proteina in cellule di mammifero.

Comprensione della funzione cellulare, la risposta agli stimoli, e le variazioni di sviluppo e / o malattia membri è strettamente legata alla de-convoluzione del proteoma in questi diversi stati dinamici 1,2. Molto è stato fatto per capire il proteoma di organismi inferiori, tuttavia, dato il numero di proteine ​​e di tutte le interazioni possibili, questo è stato molto impegnativo per affrontare il proteoma umano 1,3-7. I progressi nella spettrometria di massa hanno notevolmente consentito la capacità di intraprendere questi studi, e qui vi presentiamo un progresso ulteriore e significativo con lo sviluppo della tecnologia HaloTag sia per la cattura efficiente di complessi proteici e la caratterizzazione funzionale delle proteine ​​umane da cellule di mammifero 8-10. Questa tecnologia è stata recentemente dimostrato in diversi studi per essere un fattore critico per la scoperta di interazioni importanti, consentendo spaccato funzione nuova proteina e understanding di malattia 11-13. La proteina di fusione HaloTag è stato inizialmente sviluppato per affrontare diverse sfide di tag tradizionali affinità e anticorpi relativi alla cattura proteina, la purificazione, l&#39;etichettatura e 8-10. Da quasi tutti i metodi di cattura e purificazione della proteina, è prevista una fase di interazione non covalente che viene utilizzato per l&#39;arricchimento di una particolare proteina 14. Durante questa fase, la proteina e / o complesso può dissociarsi per diffusione, soprattutto se il processo richiede ore anziché minuti. Per risolvere questo problema, la proteina di fusione è stato specificamente progettati per rapidamente ed irreversibilmente interagire con i suoi ligandi, che può essere sia particelle, superfici o fluorofori 9. Pertanto una volta che è legato al suo ligando, resta vincolato, che è uno dei fattori più differenziante rispetto ad altri tag di affinità. Anche dimostrato qui, è la capacitàaffrontare diverse questioni biologiche con un singolo costrutto, che è possibile alternando ligandi 9 (Figura 1). Ad esempio, per interrogare interazioni o funzione della proteina, ligandi di superficie sono utilizzati per la cattura di proteine ​​o complessi (Figura 1). In un esperimento separato, la stessa proteina di fusione può essere fluorescente per studiare la localizzazione cellulare, il traffico, o ricambio proteico (Figura 1). È importante ricordare, tuttavia, che una volta ligando è vincolata, se si tratta di una superficie o un fluorocromo, è irreversibile e quindi altri ligandi non può quindi essere successivamente associato nello stesso esperimento. Analisi delle tecnologie esistenti per mappare le interazioni proteina rivela la difficoltà di isolare efficacemente le interazioni specifiche, compresi quelli che sono più transitori o sono in abbondanza inferiori 1,6,7,14,15. Inoltre, un recente lavoro di numerosi gruppis mostra la preoccupazione che all&#39;interno dei metodi di isolamento tradizionali, in particolare nel settore della proteomica umani, ci sono un numero significativo di contaminanti proteici che possono mascherare segnali da veri interattori in spettrometria di massa 16. Le proprietà sviluppati per la proteina HaloTag e il suo indirizzo resina co-sviluppato bene queste preoccupazioni. Nel protocollo per pulldowns complessi (Figura 1), il legame dei complessi può essere raggiunto in 15 min, sia promuovendo cattura complessa e riducendo i livelli di legame non specifico 8. Inoltre, permette irreversibilmente vincolante per la cattura efficace di proteine ​​poco abbondanti e consente l&#39;uso di molte meno cellule, riducendo ulteriormente sfondo 8. Una volta stabilita la cattura di complessi, il protocollo prevede condizioni di lavaggio miti per mantenere l&#39;integrità complesso. Eluizione di complessi catturati può essere eseguita in due modi e scegliendo quale metodo è dettata dall&#39;obiettivo di anale vallelisi. Se il desiderio è quello di analizzare o scoprire proteine ​​interagenti mediante Western blot o spettrometria di massa, allora è consigliabile per eluire complessi con denaturanti come SDS o urea (Figura 1). Ciò è particolarmente vantaggioso per spettrometria di massa come la proteina originariamente fusa HaloTag, chiamata proteina esca, rimarrà dietro legato alla resina e quindi non dominerà la frazione di peptidi identificati nella spettrometria di massa. Questo significa anche però che la proteina esca probabilmente non sarà visibile in analisi mediante western blot, una differenza significativa rispetto ad altre purificazioni affinità non covalenti o co-immunoprecipitazione. Se l&#39;obiettivo è quello di purificare una intatta complesso da utilizzare per studi funzionali, eluizione può essere effettuata utilizzando TEV (Tobacco Etch Virus) proteasi, che riconosce la sequenza di clivaggio cognate codificata tra la proteina di fusione e la proteina esca (Figura 1). Tueste campioni possono anche essere analizzati mediante spettrometria di massa, ma come mostrato in seguito, conterranno una quantità significativa di proteina esca che possono impedire il rilevamento di bassa abbondanza, interattori specifici. Qui vi presentiamo i protocolli a tendina e di imaging applicate a due importanti proteine ​​terapeutiche, la proteina bromodomain BRD4 e un istone deacetilasi, HDAC1 17. Abbiamo dimostrato con questi esempi, l&#39;interazione con partner attesi come determinato mediante spettrometria di massa, l&#39;attività enzimatica dopo l&#39;isolamento complessa per HDAC1 e localizzazione cellulare adeguata per entrambi. Insieme, questi risultati dimostrano la multifunzionalità e la forza della tecnologia per la caratterizzazione delle interazioni proteina eucariotica e funzioni.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="924">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:337px;">HeLa Cells</td>
			<td style="width:204px;">ATCC</td>
			<td style="width:103px;">CCL-2</td>
			<td style="width:280px;">Adherent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEK293T Cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-11268</td>
			<td style="width:280px;">Adherent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cellular growth media</td>
			<td>Invitrogen/Gibco</td>
			<td></td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS - tissue culture certified</td>
			<td>Invitrogen/Gibco</td>
			<td></td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FuGENE HD Transfection Reagent</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2311</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HaloTag Control Vector</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G6591</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HaloTag-BRD4</td>
			<td>Kazusa DNA Research Institute</td>
			<td>FHC11882</td>
			<td style="width:280px;">N-terminal HaloTag fusion</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HaloTag-HDAC1</td>
			<td>Kazusa DNA Research Institute</td>
			<td>FHC02563</td>
			<td style="width:280px;">N-terminal HaloTag fusion</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HaloTag Clones containing content</td>
			<td>Promega</td>
			<td>Various</td>
			<td style="width:280px;">http://www.promega.com/FindMyGene/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HaloTag Flexi Vectors for cloning (N- or C-terminal)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>Various</td>
			<td style="width:280px;">Choose based upon expression level and HaloTag orientation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HaloTag TMR Ligand</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G8251</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">IGEPAL CA-630</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>18896</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HaloTag Mammalian Pull-Down and Labelling System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G6500</td>
			<td style="width:280px;">Contains HaloTag TMR ligand</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HaloTag Mammalian Pull-Down System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G6504</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Protease Inhibitor Cocktail, 50X</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G6521</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mammalian Lysis Buffer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G9381</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HaloTag Monoclonal Antibody</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G9211</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ProTEV Plus</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V6101</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RQ1 Dnase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M6101</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HaloLink Resin</td>
			<td>Promega&#160;</td>
			<td>G1912</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HDAC-Glo</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G6420</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS + 0.1% Triton X-100</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:280px;">For optional imaging</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">4% paraformaldehyde/0.2M sucrose/PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:280px;">For optional imaging</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tissue culture vessels and dishes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cell culture incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Disposable cell lifter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>08-773-1</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">Glass homogenizer such as Kontes Dounce Tissue Grinder</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>K885300-0002</td>
			<td style="width:280px;">25-to 27- gauge needle could also be used</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microcentrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tube rotator such as Labquake</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4002110Q</td>
			<td style="width:280px;">Ideal for binding and washing steps</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Shaking platform such as Eppendorf Thermomixer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>05-400-200</td>
			<td style="width:280px;">Ideal for SDS elution and TEV cleavage steps</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Chambered cover glass</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>155409</td>
			<td style="width:280px;">For optional imaging</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fluorescent Microscrope (555nm Ex/585nm Em)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:280px;">For optional imaging</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

discovering protein interactions and characterizing protein function using halotag technology

La ricerca in proteomica è esploso negli ultimi anni con i progressi nella capacità di spettrometria di massa che hanno portato alla caratterizzazione di numerosi proteoma, comprese quelle da virus, batteri e lieviti. In confronto, l&#39;analisi del proteoma umano resta indietro, in parte a causa del gran numero di proteine ​​che devono essere studiati, ma anche la complessità delle reti e delle interazioni essi presenti. Per affrontare in modo specifico le sfide della comprensione del proteoma umano, abbiamo sviluppato la tecnologia HaloTag per l&#39;isolamento delle proteine, particolarmente forte per l&#39;isolamento di complessi multiproteici e permettendo la cattura più efficiente delle interazioni e / o proteine ​​deboli o transitori in bassa abbondanza. HaloTag è un tag geneticamente codificato proteina di fusione, progettato per covalente, specifica e immobilizzazione o l&#39;etichettatura delle proteine ​​con vari ligandi rapido. Sfruttando queste proprietà, numerose applicazioni di cellule di mammiferi sono stati sviluppati a carattereize funzione delle proteine ​​e qui vi presentiamo metodologie, tra cui: proteine ​​pull-down utilizzati per la scoperta di nuove interazioni o test funzionali e la localizzazione cellulare. Troviamo vantaggi significativi nella velocità, specificità e covalente cattura di proteine ​​di fusione di superfici per l&#39;analisi proteomica rispetto ad altri approcci non-covalenti tradizionali. Dimostriamo questi e l&#39;ampia utilità della tecnologia utilizzando due importanti proteine ​​epigenetici come esempi, la proteina bromodomain umana BRD4, e istone deacetilasi HDAC1. Questi esempi dimostrano la potenza di questa tecnologia per consentire la scoperta di nuove interazioni e caratterizzare la localizzazione cellulare negli eucarioti, che sarà insieme una maggiore comprensione di proteomica funzionale umani.

Quando si lavora con qualsiasi nuova proteina di fusione, è importante prima prova per l&#39;espressione di detta proteina dopo trasfezione e anche verificare che una proteina del peso molecolare corretto viene prodotto. Come proteine ​​di fusione HaloTag possono essere fluorescente e covalentemente marcato con ligandi impermeabili, permeabili o seconda localizzazione, è possibile determinare rapidamente espressione applicando lisati cellulari per elettroforesi su gel denaturante seguita dalla scansione in un fluorimager. Utilizzando il protocollo descritto nella Sezione 1.2, espressione di Halo-BRD4 (189 kD), e il solo controllo HaloTag (Ctrl) viene osservato (34 kD, Figura 2A). Come indicato nel protocollo, l&#39;espressione di proteine ​​di fusione può anche essere rilevato utilizzando le macchie tradizionali occidentali con anticorpi anti-HaloTag, o se sono disponibili, gli anticorpi alla proteina esca. Se possibile, si raccomanda di utilizzare il ligando fluorescente invece come è più preciso, più veloce e più facile trilevazione degli anticorpi han, e anche quantitativa 10. Dopo espressione della proteina di fusione corretta full-length è verificato, pulldowns proteine ​​possono essere eseguite. Mostrato nella Figura 2B sono i gel colorati d&#39;argento di repliche biologiche di Halo-BRD4 e Ctrl pulldowns eluiti dalla SDS (Protocollo Sezione 2.4), che dimostrano un&#39;alta riproducibilità. I gel macchia d&#39;argento mostrano un numero significativo di proteine ​​si trovano ad interagire con la proteina BRD4 e bassissima sfondo nel controllo (Figura 2B). Come accennato nell&#39;introduzione, in questo processo di eluizione, la Halo-BRD4 non verrà eluita dalla resina che rimane a legame covalente. Pertanto, non vi è una banda significativa a questo peso molecolare essere rilevato nella macchia argento (Figura 2B) o western blot (dati non mostrati). Per determinare se queste proteine ​​sono specifiche BRD4, spettrometria di massa cromatografia liquida (LC-MS/MS) è stata eseguita sulla cmiscela omplex ottenuto dopo SDS eluizione. Mostrato nella Figura 2C sono conteggi spettrali e normalizzato fattore abbondanza spettrale valori (NSAF) per interattori noti di BRD4 18-20 trovate nel spettrometria di massa Halo-BRD4. La grande abbondanza di componenti provenienti da pTEFb 18,20 e anche la proteina BRD9 19 confermano specifica acquisizione di complessi BRD4. Come previsto dalle argento macchia gel (Figura 2B), numerose altre proteine ​​sono state anche identificate come potenziali interattori di BRD4 che non sono state osservate nel controllo (dati non riportati). In quanto questi sono finora sconosciuta, hanno bisogno di essere verificate in modo indipendente da altre metodologie per confermare se la proteina è un vero interattore, e se sì, se è direttamente o indirettamente connesso con BRD4. Isolato complessi possono anche essere studiati per l&#39;attività; si consiglia di eluire complessi utilizzando TEV proteasi (Protocollo Sezione 2.5), in modo che essi mantengono functionality. Nella Figura 3A, un argento macchia gel di complessi pulldown Alo-HDAC1 rilasciati dalla resina utilizzando proteasi TEV è mostrato. Come proteasi TEV si unirà in una regione linker tra il tag proteina di fusione e il suo partner di fusione, quantità significative di proteina esca, in questo caso HDAC1, sono osservati (Figura 3A). Per determinare se tale frazione contenuta attività HDAC1, campioni di TEV eluiti sono stati testati in un saggio di HDAC luminescenti, HDAC-Glo 21. Come mostrato in Figura 3B, campioni HDAC1 pulldown mostrato alti livelli di attività HDAC1 (colonna 1), che è stato specificamente inibita da un inibitore HDAC noto, SAHA 22 (colonna 2). Come controlli per dimostrare ulteriormente la specificità, nessuna inibizione HDAC è stata osservata con un inibitore famiglia sirtuin correlato, EX-527 22 (colonna 3) e nessun segnale è stato rilevato usando tampone da solo senza campione HDAC1 pulldown aggiunto (colonna 4). Una componente significativa della funzioneAL proteomica e comprensione complessi, è anche la comprensione di localizzazione e / o traffico di proteine. Poiché questi costrutti stessa fusione può essere fluorescente all&#39;interno delle cellule, abbiamo monitorato la loro localizzazione utilizzando l&#39;imaging confocale. A seguito del protocollo nella sezione 3, cellule HeLa trasfettate transitoriamente con Halo-BRD4 (Figura 4A) e Halo-HDAC1 (Figura 4B) sono stati fluorescente etichettati con il ligando TMR e ripreso. Come mostrato nelle figure 4A e 4B, sia localizzata nel nucleo come previsto 17. Questi dati dimostrano che la presenza di tag non ha alterato localizzazione cellulare fisiologica dei suoi partner di fusione. <img alt="Figura 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51553/51553fig1highres.jpg" width="600" /> Figura 1. Schema di proteine ​​a tendina e applicazioni di imaging confocale. Utilizzo come<html> ingle costruire diverse applicazioni per comprendere la funzione delle proteine ​​in cellule di mammifero sono possibili. Per tutti, un costrutto di fusione Halo è sia stabilmente che transientemente espresso in cellule di mammifero aderenti o sospensione. Per le proteine ​​pulldowns complessi, le cellule vengono quindi lisate, complessi sono covalentemente catturati in resina, e eluite sia attraverso SDS eluizione (percorso di sinistra) o scissione TEV (sentiero a destra). SDS eluizione è raccomandato per procedere ad analisi di spettrometria di massa, mentre TEV clivaggio è ottimale per l&#39;esecuzione di analisi funzionale. Per caratterizzare espressione, localizzazione cellulare, gli eventi di traffico, o turnover delle proteine, le cellule vive che esprimono proteine ​​di fusione sono fluorescente e in seguito analizzati su SDS PAGE gel o utilizzando l&#39;imaging confocale. Entrambi i ligandi fluorescenti permeabile o impermeabile cella sono disponibili a seconda della localizzazione o presentazione della proteina di fusione all&#39;interno della cellula. IGURA 2 &quot;fo: content-width =&quot; 6in &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/51553/51553fig2highres.jpg &quot;width =&quot; 600 &quot;/&gt; Figura 2. Espressione Halo-BRD4 proteine, a tendina e analisi di spettrometria di massa. (A) SDS PAGE gel che mostrano l&#39;espressione di Halo-BRD4 proteina di fusione, 189 kD, e Halo tag proteina di fusione da solo, 34 kD, di controllo (Ctrl) all&#39;interno di un lisato cellulare HEK293T marcato con TMR ligando (protocollo paragrafo 2.1). I gel sono stati scansionati con fluorimager per il rilevamento e un marcatore fluorescente peso molecolare è stato utilizzato. (B) gel macchia d&#39;argento di repliche biologiche per pulldowns di Halo-BRD4 e Ctrl campioni diluiti con SDS. Dimensioni peso molecolare sono indicati per il gel. (C) conta spettrali (pannello di sinistra) e normalizzati fattori spettrali abbondanza valori (NSAF) (pannello di destra) che rappresentano la proteina peso molecolare di proteine ​​identificate in spettrometria di massa di repliche biologiche di Halo- BRD4 e Ctrl. Mostrato sono proteine ​​note per interagire wesima BRD4, compresi i componenti di pTEFb (CDK9 e ciclina T) 18,20, così come BRD9 19. Nessun peptidi di queste proteine ​​sono state identificate nel Ctrl. <img alt="Figura 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51553/51553fig3highres.jpg" width="600" /> Figura 3. Alo-HDAC1 complesso isolamento e analisi dell&#39;attività. (A) gel macchia d&#39;argento che mostrano l&#39;isolamento di complessi Halo-HDAC1 e lo sfondo dal Ctrl dopo TEV scissione (Protocollo Sezione 2.5). La band di spicco HDAC1 (55 kDa) e la band proteasi TEV sono etichettati. Il HDAC1 libero è generato da TEV scissione all&#39;interno di un linker ottimizzato tra la sequenza di fusione HaloTag e HDAC1 dopo la cattura sulla resina (Figura 1). (B) Il grafico mostra l&#39;attività di HDAC1 isolamenti complessi campioni in una luminescente test istone deacetilasi, HDAC- Glo 21. Colonna 1 del grafico mostra alta lEvels di attività HDAC contenuti con i campioni a tendina Halo-HDAC1 (HDAC1). Colonna 2 rivela questa attività può essere specificamente diminuita mediante aggiunta dell&#39;inibitore HDAC, SAHA 22, ai campioni pulldown HDAC1. Come controlli, colonna 3 mostra un inibitore della deacetilasi specifico alla famiglia sirtuin, ma non HDAC, EX-527 22, non inibisce l&#39;attività HDAC1 e Colonna 4 mostra alcuna attività si osserva utilizzando tampone da solo. <img alt="Figura 4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51553/51553fig4highres.jpg" width="600" /> Figura 4. Alo-BRD4 e Alo-HDAC1 confocale. Vivo cella confocale di cellule HeLa trasfettate con Alo-BRD4 (A) o alo-HDAC1 (B) fluorescente con TMR ligando. (A) espressione Alo-BRD4 è limitata al nucleo e (B) l&#39;espressione Halo-HDAC1 è prevalentemente NUClear. Lato sinistro dei pannelli è il canale fluorescente e sul lato destro è una sovrapposizione del canale fluorescente con il canale DIC per ciascuno. Le immagini sono state acquisite su un microscopio confocale dotato di 37 ° C + CO 2 camera ambientale utilizzando appositi set di filtri. Bar scale = 20 micron.

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Discovering Protein Interactions and Characterizing Protein Function Using HaloTag Technology

Tecnologia HaloTag è una tecnologia multifunzionale che ha mostrato un significativo successo in isolamento di piccole e grandi complessi proteici da cellule di mammifero. Qui si segnalano i vantaggi di questa tecnologia rispetto alle alternative esistenti e dimostrare la sua utilità per studiare numerosi aspetti della funzione delle proteine ​​all&#39;interno delle cellule eucariotiche.

Scoprire le interazioni proteina e caratterizzazione di proteine ​​Funzione Con HaloTag Tecnologia

Research in proteomics has exploded in recent years with advances in mass spectrometry capabilities that have led to the characterization of numerous ...

discovering-protein-interactions-characterizing-protein-function

Research

JoVE Journal

Biology

36.8K Views.  Promega Corporation.  Tecnologia HaloTag è una tecnologia multifunzionale che ha mostrato un significativo successo in isolamento di piccole e grandi complessi proteici da cellule di mammifero. Qui si segnalano i vantaggi di questa tecnologia rispetto alle alternative esistenti e dimostrare la sua utilità per studiare numerosi aspetti della funzione delle proteine ​​all'interno delle cellule eucariotiche. 

Video: Discovering Protein Interactions and Characterizing Protein Function Using HaloTag Technology

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

La colorazione delle proteine ​​in gel con Coomassie G-250, senza solventi organici acido acetico e

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

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Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based fractionation. The system is comprised of single-use, 8-sample capacity cartridges and a benchtop GELFREE Fractionation Instrument. During separation, a constant voltage is applied between the anode and cathode reservoirs, and each protein mixture is electrophoretically driven from a loading chamber into a specially designed gel column gel. Proteins are concentrated into a tight band in a stacking gel, and separated based on their respective electrophoretic mobilities in a resolving gel. As proteins elute from the column, they are trapped and concentrated in liquid phase in the collection chamber, free of the gel. The instrument is then paused at specific time intervals, and fractions are collected using a pipette. This process is repeated until all desired fractions have been collected. If fewer than 8 samples are run on a cartridge, any unused chambers can be used in subsequent separations.
This novel technology facilitates the quick and simple separation of up to 8 complex protein mixtures simultaneously, and offers several advantages when compared to previously available fractionation methods. This system is capable of fractionating up to 1mg of total protein per channel, for a total of 8mg per cartridge. Intact proteins over a broad mass range are separated on the basis of molecular weight, retaining important physiochemical properties of the analyte. The liquid phase entrapment provides for high recovery while eliminating the need for band or spot cutting, making the fractionation process highly reproducible1.

The accompanying video describes the use of the GELFREE 8100 Fractionation System, which partitions complex protein samples on the basis of molecular weight and recovers the fractions in liquid phase. The video describes how the technology works, how it is used, and provides resultant data, with polyacrylamide gel electrophoresis analysis of fractionated bovine liver homogenate.

Utilizzando il sistema GELFREE 8100 Frazionamento per peso molecolare basata su Frazionamento con recupero della fase liquida

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, preventing their identification and analysis through traditional biochemical methods such as co-immunoprecipitation. In this regard, the genetically encodable fluorescent proteins (GFP, RFP, etc.) and their associated overlapping fluorescence spectrum have revolutionized our ability to monitor weak interactions in vivo using F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)1-3. Here, we detail our use of a FRET-based proximity assay for monitoring receptor-receptor interactions on the endothelial cell surface.

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

This protocol describes how to image protein-protein interactions using a FRET-based proximity assay.

Imaging interazioni proteina-proteina In vivo</em

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

Proteomics research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that proteins in cells mostly exist not as isolated entities but exert their biological activity in association with many other proteins, in humans ten or more, forming assembly lines in the cell for most if not all vital functions.1,2 Knowledge of the function and architecture of these multiprotein assemblies requires their provision in superior quality and sufficient quantity for detailed analysis. The paucity of many protein complexes in cells, in particular in eukaryotes, prohibits their extraction from native sources, and necessitates recombinant production. The baculovirus expression vector system (BEVS) has proven to be particularly useful for producing eukaryotic proteins, the activity of which often relies on post-translational processing that other commonly used expression systems often cannot support.3 BEVS use a recombinant baculovirus into which the gene of interest was inserted to infect insect cell cultures which in turn produce the protein of choice. MultiBac is a BEVS that has been particularly tailored for the production of eukaryotic protein complexes that contain many subunits.4 A vital prerequisite for efficient production of proteins and their complexes are robust protocols for all steps involved in an expression experiment that ideally can be implemented as standard operating procedures (SOPs) and followed also by non-specialist users with comparative ease. The MultiBac platform at the European Molecular Biology Laboratory (EMBL) uses SOPs for all steps involved in a multiprotein complex expression experiment, starting from insertion of the genes into an engineered baculoviral genome optimized for heterologous protein production properties to small-scale analysis of the protein specimens produced.5-8 The platform is installed in an open-access mode at EMBL Grenoble and has supported many scientists from academia and industry to accelerate protein complex research projects.

Protein complexes catalyze key cellular functions. Detailed functional and structural characterization of many essential complexes requires recombinant production. MultiBac is a baculovirus/insect cell system particularly tailored for expressing eukaryotic proteins and their complexes. MultiBac was implemented as an open-access platform, and standard operating procedures developed to maximize its utility.

Il MultiBac Protein Complex Piattaforma di produzione al EMBL

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously hard to disrupt. Here we describe the use of a bead mill homogenizer for the extraction of proteins into buffers optimized to maintain the functions, interactions and post-translational modifications of proteins. Logarithmically growing cells expressing the protein of interest are grown in a liquid growth media of choice. The growth media may be supplemented with reagents to induce protein expression from inducible promoters (e.g. galactose), synchronize cell cycle stage (e.g. nocodazole), or inhibit proteasome function (e.g. MG132). Cells are then pelleted and resuspended in a suitable buffer containing protease and/or phosphatase inhibitors and are either processed immediately or frozen in liquid nitrogen for later use. Homogenization is accomplished by six cycles of 20 sec&#160;bead-beating (5.5 m/sec), each followed by one minute incubation on ice. The resulting homogenate is cleared by centrifugation and small particulates can be removed by filtration. The resulting cleared whole cell extract (WCE) is precipitated using 20% TCA for direct analysis of total proteins by SDS-PAGE followed by Western blotting. Extracts are also suitable for affinity purification of specific proteins, the detection of post-translational modifications, or the analysis of co-purifying proteins. As is the case for most protein purification protocols, some enzymes and proteins may require unique conditions or buffer compositions for their purification and others may be unstable or insoluble under the conditions stated. In the latter case, the protocol presented may provide a useful starting point to empirically determine the best bead-beating strategy for protein extraction and purification. We show the extraction and purification of an epitope-tagged SUMO E3 ligase, Siz1, a cell cycle regulated protein that becomes both sumoylated and phosphorylated, as well as a SUMO-targeted ubiquitin ligase subunit, Slx5.

The preparation of high quality yeast cell extracts is a necessary first step in the analysis of individual proteins or entire proteomes. Here we describe a fast, efficient, and reliable homogenization protocol for budding yeast cells that has been optimized to preserve protein functions, interactions, and post-translational modifications.

Germogliamento lievito proteine ​​estrazione e purificazione per lo Studio della funzione, interazioni e modificazioni post-traduzionali

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) is an in vivo method to monitor such interactions in plant cells. In the presented protocol the investigated candidate proteins are fused to complementary halves of fluorescent proteins and the respective constructs are introduced into plant cells via agrobacterium-mediated transformation. Subsequently, the proteins are transiently expressed in tobacco leaves and the restored fluorescent signals can be detected with a confocal laser scanning microscope in the intact cells. This allows not only visualization of the interaction itself, but also the subcellular localization of the protein complexes can be determined. For this purpose, marker genes containing a fluorescent tag can be coexpressed along with the BiFC constructs, thus visualizing cellular structures such as the endoplasmic reticulum, mitochondria, the Golgi apparatus or the plasma membrane. The fluorescent signal can be monitored either directly in epidermal leaf cells or in single protoplasts, which can be easily isolated from the transformed tobacco leaves. BiFC is ideally suited to study protein-protein interactions in their natural surroundings within the living cell. However, it has to be considered that the expression has to be driven by strong promoters and that the interaction partners are modified due to fusion of the relatively large fluorescence tags, which might interfere with the interaction mechanism. Nevertheless, BiFC is an excellent complementary approach to other commonly applied methods investigating protein-protein interactions, such as coimmunoprecipitation, in vitro pull-down assays or yeast-two-hybrid experiments.

Formation of protein complexes in vivo can be visualized by bimolecular fluorescence complementation. Interaction partners are fused to complementary parts of fluorescent tags and transiently expressed in tobacco leaves, resulting in a reconstituted fluorescent signal upon close proximity of the two proteins.

Interazioni proteina-proteina visualizzati tramite bimolecular complementazione fluorescenza in protoplasti di tabacco e foglie

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular ...

Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live cells. BRET is the non-radiative transfer of energy from a 'donor' luciferase enzyme to an 'acceptor' fluorescent protein. In the most common configuration of this assay, the donor is Renilla reniformis luciferase and the acceptor is Yellow Fluorescent Protein (YFP). Because the efficiency of energy transfer is strongly distance-dependent, observation of the BRET phenomenon requires that the donor and acceptor be in close proximity. To test for an interaction between two proteins of interest in cultured mammalian cells, one protein is expressed as a fusion with luciferase and the second as a fusion with YFP. An interaction between the two proteins of interest may bring the donor and acceptor sufficiently close for energy transfer to occur. Compared to other techniques for investigating protein-protein interactions, the BRET assay is sensitive, requires little hands-on time and few reagents, and is able to detect interactions which are weak, transient, or dependent on the biochemical environment found within a live cell. It is therefore an ideal approach for confirming putative interactions suggested by yeast two-hybrid or mass spectrometry proteomics studies, and in addition it is well-suited for mapping interacting regions, assessing the effect of post-translational modifications on protein-protein interactions, and evaluating the impact of mutations identified in patient DNA.

Interactions between proteins are fundamental to all cellular processes. Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer, the interaction between a pair of proteins can be monitored in live cells and in real time. Furthermore, the effects of potentially pathogenic mutations can be assessed.

Indagare interazioni proteina-proteina in cellule vive utilizzando il trasferimento bioluminescenza Resonance Energy

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live ...

Determination of Protein-ligand Interactions Using Differential Scanning Fluorimetry

A wide range of methods are currently available for determining the dissociation constant between a protein and interacting small molecules. However, most of these require access to specialist equipment, and often require a degree of expertise to effectively establish reliable experiments and analyze data. Differential scanning fluorimetry (DSF) is being increasingly used as a robust method for initial screening of proteins for interacting small molecules, either for identifying physiological partners or for hit discovery. This technique has the advantage that it requires only a PCR machine suitable for quantitative PCR, and so suitable instrumentation is available in most institutions; an excellent range of protocols are already available; and there are strong precedents in the literature for multiple uses of the method. Past work has proposed several means of calculating dissociation constants from DSF data, but these are mathematically demanding. Here, we demonstrate a method for estimating dissociation constants from a moderate amount of DSF experimental data. These data can typically be collected and analyzed within a single day. We demonstrate how different models can be used to fit data collected from simple binding events, and where cooperative binding or independent binding sites are present. Finally, we present an example of data analysis in a case where standard models do not apply. These methods are illustrated with data collected on commercially available control proteins, and two proteins from our research program. Overall, our method provides a straightforward way for researchers to rapidly gain further insight into protein-ligand interactions using DSF.

Differential scanning fluorimetry is a widely used method for screening libraries of small molecules for interactions with proteins. Here, we present a straightforward method to extend these analyses to provide an estimate of the dissociation constant between a small molecule and its protein partner.

Determinazione delle interazioni proteina-ligando Utilizzo scansione differenziale Fluorimetria

A wide range of methods are currently available for determining the dissociation constant between a protein and interacting small molecules. However, most ...

Probing High-density Functional Protein Microarrays to Detect Protein-protein Interactions

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an affinity purified yeast kinase fusion protein containing a V5-epitope tag for read-out. Purified kinase is obtained through culture of a yeast strain optimized for high copy protein production harboring a plasmid containing a Kinase-V5 fusion construct under a GAL inducible promoter. The yeast is grown in restrictive media with a neutral carbon source for 6 hr followed by induction with 2% galactose. Next, the culture is harvested and kinase is purified using standard affinity chromatographic techniques to obtain a highly purified protein kinase for use in the assay. The purified kinase is diluted with kinase buffer to an appropriate range for the assay and the protein microarrays are blocked prior to hybridization with the protein microarray. After the hybridization, the arrays are probed with monoclonal V5 antibody to identify proteins bound by the kinase-V5 protein. Finally, the arrays are scanned using a standard microarray scanner, and data is extracted for downstream informatics analysis1,2 to determine a high confidence set of protein interactions for downstream validation in vivo.

Using protein microarrays containing nearly the entire S. cerevisiae proteome is probed for rapid unbiased interrogation of thousands of protein-protein interactions in parallel. This method can be utilized for protein-small molecule, posttranslational modification, and other assays in high-throughput.

Probing ad alta densità di microarrays della proteina funzionali per rilevare le interazioni proteina-proteina

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

Green Fluorescent Protein-base Espressione Proiezione di proteine ​​di membrana in<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

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