Questo lavoro è stato sostenuto da una borsa di MK e BKK dal Ellison Medical Foundation. MK è una Ellison Medical Foundation Scholar Nuove invecchiamento. Vorremmo ringraziare Soumya Kotireddy per l&#39;assistenza durante le riprese.

Parte 1: Preparare i ceppi e le piastre per l&#39;analisi del ciclo di vita replicativa Questa sezione descrive la preparazione delle lastre solide YEPD per l&#39;uso nella sperimentazione durata replicativa vita e la preparazione di cellule di lievito per l&#39;analisi durata della vita. <ol><li> Utilizzando opportuni tecnica sterile, preparare piastre di agar YEPD (1 estratto di lievito%, 2% bacto-peptone, 2% agar, 2% di glucosio) che verrà utilizzato per la coltura e le cellule di lievito per l&#39;analisi durata replicativo. Si dovrebbe preparare almeno 2 piastre per ogni 4-5 ceppi da analizzare nell&#39;esperimento durata della vita. Piastre devono essere preparate almeno 2 giorni prima dell&#39;esperimento durata della vita e lasciato asciugare prima di iniziare il saggio durata della vita. Se l&#39;esperimento non sarà avviata entro 4-5 giorni di versare le piastre, devono essere collocati in un incubatore refrigerato e avvolto in parafilm o plastica per evitare essiccazione. </li><li> Rimuovere ceppi di lievito da scorte congelate e strisciare per singole colonie su piastre di agar YEPD. Fino a 6 ceppi possono essere facilmente striature sulla stessa piastra YEPD suddividendo il piatto in uguali dimensioni torta a forma di cunei. </li><li> Incubare le cellule a 30 ° C per 2 giorni. </li><li> Rimuovere le cellule dal termostato e le cellule patch da una singola colonia su un piatto fresco YEPD. Due patch da due colonie diverse deve essere generato per ogni ceppo. A questo punto, i ceppi da analizzare deve essere codificato per garantire la vita esperimento replicativo durata viene effettuato &quot;alla cieca&quot;, dove il dissettori non conoscono l&#39;identità dei singoli ceppi. </li><li> Incubare le patch, le cellule codificati a 30 ° C fino alla sera successiva. </li><li> Rimuovere le cellule e leggermente cellule patch da ogni ceppo codificato a fresco piatti YEPD, che servirà come le piastre sperimentali utilizzati per l&#39;analisi durata replicativa vita. Le cellule devono essere patchato lungo una linea verticale sul lato sinistro del piatto YEPD (Figura 1). Circa 3-5 patch per ciascuna piastra è ottimale, assumendo vita analisi replicativa durata di 20 celle da ogni patch. Non è necessario (né auspicabile) per trasferire un gran numero di cellule al piatto fresco YEPD, come questo farà sì che le cellule a crescere abbondantemente durante la notte di incubazione, che può limitare la loro durata di vita successive replicativo. </li><li> Incubare le piastre appena patchato durante la notte sulla cima panchina. </li></ol> Parte 2: le cellule di posizione per l&#39;analisi del ciclo di vita replicativa. In questa sezione viene descritto come posizionare le cellule di lievito sul piatto e come ottenere cellule figlie vergini per l&#39;analisi del ciclo di vita replicativa. Da questo punto in poi, tutte le lastre devono essere parafilmed, tranne quando sottoposti a dissezione, per evitare essiccazione. <ol><li> Utilizzando un microscopio dotato di un apparato adatto per microdissezione lievito, il trasferimento di circa 50 cellule dal ceppo prima patch ad una posizione sul piatto distale alle cellule patch. Se il vostro stadio è classificato microscopio, queste gradazioni possono essere utilizzate per garantire le cellule saranno facili da trovare durante le iterazioni successive. Sul Axioscope Zeiss 40, le cellule del ceppo prima patch può essere posizionato in corrispondenza delle coordinate 90 x 10 e disposte in verticale da lì. </li><li> Pulire l&#39;ago di cellule ripetutamente di toccare la superficie di agar, quindi creare un buco nel agar forzando l&#39;ago attraverso la superficie di agar. Questo buco servirà come marcatore orientativa sul piatto durante iterazioni successive della dissezione e la rimozione delle cellule figlie. Fare attenzione a non ottenere cellule di lievito nel foro, o saranno crescere e formare una colonia. </li><li> Direttamente sopra il foro, allineare verticalmente singole cellule di lievito in 20 punti distribuiti uniformemente, con diametri di aghi 1-3 (~ 100 mM) tra ogni posizione delle cellule (Figura 1). Ogni poche cellule, luogo due celle adiacenti gli uni agli altri nella stessa posizione nella linea piuttosto che uno. Questo consente la ridondanza durante la selezione della cellula figlia vergine, se una delle celle trasferite non riesce a dividere. </li><li> Tra il 10 e 11 ° posizione in prima linea, creare una serie orizzontale di 7-8 fori nella agar. Questo servirà come marcatore orientativa sul piatto durante iterazioni successive della dissezione e la rimozione delle cellule figlie. Fare attenzione a non ottenere cellule di lievito nei fori, o saranno crescere e formare una colonia. </li><li> Ripetere i passaggi 2,1-2,4 per ogni patch sul piatto, continuando a celle di serie verticalmente lungo l&#39;asse stesso. Per il passaggio 2.2, il numero di fori creati deve corrispondere al numero di patch (una buca per la prima patch, due fori per il secondo, ecc.) </li><li> Una volta che le cellule sono stati schierati per ogni patch, parafilm la piastra e incubare a 30 ° C per circa 2 ore. </li><li> Ripetere i passaggi 2,1-2,6 per ogni piastra nell&#39;esperimento. </li></ol> Parte 3: Ottenere cellule figlie vergini per l&#39;analisi durata della vita In questa sezione abbiamo iniziato l&#39;analisi durata della vita facendo in modo che ogni cellula inizia come una figlia verginecell. <ol><li> Rimuovere le piastre dal termostato e verificare che la maggior parte delle cellule schierati hanno subito una divisione cellulare. Se è necessario ulteriore tempo per consentire la divisione cellulare per essere completato, riportare la piastra per l&#39;incubatore. </li><li> A partire dalla prima cella schierati, utilizzare l&#39;ago a staccarsi cellule figlie dalla cellula madre con delicatezza mettendo l&#39;ago sulla parte superiore delle celle collegate. A volte è utile per toccare il lato della base microscopio mentre l&#39;ago è appoggiato sulle cellule. </li><li> Posizionare il cellulare staccato figlia in linea verticale, sostituendo la cellula madre e le cellule figlie aggiuntivi e spostarli temporaneamente da parte. </li><li> Ripetere il punto 3.2 e 3.3 per ognuna delle celle in serie. Se una cellula non riesce a dividere, prendere una cellula figlia da una delle celle ridondanti posizionato al punto 2.3. Al termine, si dovrebbe avere 20 cellule figlie per ogni patch allineati verticalmente sulla piastra di vita. </li><li> Raccogliere tutte le cellule madri e cellule figlie in più in un mucchio e trasferire di nuovo a una zona vicino le patch (&quot;il cimitero&quot;). E &#39;importante mantenere le cellule indesiderate lontano dalle cellule in fase di analisi durata di vita per prevenire la formazione di microcolonie e l&#39;esaurimento delle sostanze nutritive locale. </li><li> Parafilm la piastra e incubare a 30 ° C per circa 2 ore. </li><li> Ripetere i passaggi 3,2-3,6 per ogni piastra nell&#39;esperimento. </li></ol> Parte 4: misura la capacità replicativa delle singole cellule <ol><li> Preparare i dati di durata fogli. Una vita scheda può essere una semplice griglia dove ogni riga corrisponde ad una cellula madre individuo e ogni colonna corrisponde ad una età-punto (Figura 2). Etichetta ogni scheda in base al numero di ceppi da analizzare. </li><li> Rimuovere le piastre dal termostato e verificare che la maggior parte delle cellule schierati hanno subito almeno una divisione cellulare. Se è necessario ulteriore tempo per consentire la divisione cellulare per essere completato, riportare la piastra per l&#39;incubatore. </li><li> A partire dalla prima cella schierati sul piatto prima, visivamente osservare la cellula madre e figlia (s) e determinare il numero di divisioni cellulari che si sono verificati. In genere è facile determinare il numero di cellule figlie di una madre ha prodotto, sulla base di modelli caratteristici di accordi cellulare. Registrare il numero di cellule figlie prodotte dalla cellula madre nella apposita casella sulla scheda di valutazione durata della vita. </li><li> Utilizzare l&#39;ago a staccarsi cellule figlie dalla cellula madre come descritto al punto 3.2. </li><li> Conservare la cellula madre nella sua posizione nella linea verticale e spostare la cellula figlia (s) a temporaneamente da parte. </li><li> Ripetere i passaggi 4,3-4,5 per ciascuna delle cellule schierati. </li><li> Raccogli tutte le cellule figlie scartato e spostarli al &#39;cimitero&#39;, che si trova nei pressi della patch originale. </li><li> Parafilm la piastra e incubare a 30 ° C per 2-3 ore. </li><li> Ripetere i passaggi 4,3-4,8 per ogni piastra nell&#39;esperimento. </li><li> Ripetere i passaggi 4,2-4,9 fino a quando tutte le cellule madre hanno smesso di dividersi. Come l&#39;età della madre cellule, la progressione del ciclo cellulare diventa più lento e sarà auspicabile incubare la piastra per lunghi periodi di tempo tra età-punti. Piastre possono essere posizionati a 4 ° C durante la notte. </li></ol> Parte 5: Risultati Rappresentante. I dati grezzi prodotti da un esperimento durata replicativa vita è un elenco di numeri corrispondenti alle cellule figlie prodotte da ogni cellula madre ad ogni età-punto (Figura 2). Sommando ogni riga del foglio di punteggio, la durata della vita di replicazione per ogni cellula madre si ottiene. Dati per le cellule madre dello stesso gruppo sperimentale possono essere raggruppati per generare una curva di sopravvivenza (Figura 3A) e di eseguire calcoli statistici, come la durata della vita media, la durata della vita media e deviazione standard. Un test non parametrico, come il rank-sum test di Wilcoxon, possono essere eseguite per determinare se le differenze significative nella durata della vita sono stati individuati tra i gruppi sperimentali. Quando l&#39;esperimento funziona correttamente, la curva di sopravvivenza dovrebbero essere grosso modo in linea con Gompertz-Makeham cinetica che mostra un shap sigmoidale con bassa mortalità precoce seguì un declino relativamente rapido in termini di sopravvivenza e un appiattimento della curva uno epoche successive. La maggior parte dei ceppi wild-type hanno replicativa valori di durata della vita nel range 20-30 generazione, anche se al di fuori di questo intervallo di variazione è stato riportato. <img src="/files/ftp_upload/1209/1209fig1.jpg" alt="figura 1" /> <img src="/files/ftp_upload/1209/fig1.2.jpg" alt="Figura 1.5" /> Figura 1. Schema di un tipico piatto vita replicativa. La sera prima dell&#39;inizio microdissezione di cellule di lievito, 3-5 ceppi sono leggermente patchato sulla superficie di una piastra YEPD (box rosso) in una linea verticale lungo un lato della piastra. Dopo una crescita durante la notte, circa 30 celle singole da ogni ceppo sono disposte verticalmente in una linea contenente 20 posizioni. Durata della vita l&#39;analisi dells sarà eseguita su v cellule figlie vergini ottenuti da queste cellule iniziali. Extra cellule ottenute da microdissezione durante l&#39;esperimento (ad esempio cellule figlie indesiderate) sono collocati nel &quot;cimitero&quot; (ovale grigio), che si trova lontano dalle celle sperimentali in modo da evitare l&#39;esaurimento locale di sostanze nutritive come colonie sono formate. <img src="/files/ftp_upload/1209/1209fig3.jpg" alt="figura 2" /> Figura 2. Una vita replicativa foglio durata riscontro. I dati grezzi da un esperimento durata replicativa vita è mostrato. Ogni riga corrisponde ad una singola cellula di lievito madre e ogni colonna corrisponde ad una età-point. Il numero inserito in ogni casella è il numero di cellule figlie prodotte da quella cellula madre a quell&#39;età-point. Ogni sforzo è etichettato con un numero codificato in modo tale che l&#39;individuo dissezionare le cellule di lievito non è a conoscenza dell&#39;identità dei ceppi analizzati. Venti cellule sono analizzati per ogni ceppo. <img src="/files/ftp_upload/1209/1209fig2.jpg" alt="figura 3" /> Figura 3. Rappresentante sopravvivenza e curve di crescita di un esperimento durata replicativa vita. (A) Le curve di sopravvivenza sono ottenuta riportando la frazione di cellule madre ancora in vita in funzione di età replicativa (numero di divisioni cellulari. (B) le curve di crescita sono ottenuta riportando la numero medio di cellule figlie prodotto da un ceppo dato in funzione di età-point. In questo esempio, ceppo # 2 è a lungo vissuto, ma è più lenta crescita, come dimostra la pendenza ridotta iniziale della trama di crescita.

<ol>
	<li>Kaeberlein, M., Burtner, C. R., Kennedy, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+developments+in+yeast+aging.">Recent developments in yeast aging.</a> PLoS Genet. 3, (2007).</li><li>Kaeberlein, M., Conn, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of models for human aging. , 109-120 (2006).</li><li>Smith, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+evidence+for+conserved+longevity+pathways+between+divergent+eukaryotic+species.">Quantitative evidence for conserved longevity pathways between divergent eukaryotic species.</a> Genome Res. 18, 564-570 (2008).</li><li>Steinkraus, K. A., Kaeberlein, M., Kennedy, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replicative+aging+in+yeast:+the+means+to+the+end.">Replicative aging in yeast: the means to the end.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 24, 29-54 (2008).</li><li>Murakami, C. J., Burtner, C. R., Kennedy, B. K., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+high-throughput+quantitative+analysis+of+yeast+chronological+life+span.">A method for high-throughput quantitative analysis of yeast chronological life span.</a> J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 63, 113-121 (2008).</li><li>Jiang, J. C., Jaruga, E., Repnevskaya, M. V., Jazwinski, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+intervention+resembling+caloric+restriction+prolongs+life+span+and+retards+aging+in+yeast.">An intervention resembling caloric restriction prolongs life span and retards aging in yeast.</a> Faseb J. 14, 2135-2137 (2000).</li><li>Kaeberlein, M., Kirkland, K. T., Fields, S., Kennedy, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sir2-independent+life+span+extension+by+calorie+restriction+in+yeast.">Sir2-independent life span extension by calorie restriction in yeast.</a> PLoS Biol. 2, E296-E296 (2004).</li><li>Lin, S. J., Defossez, P. A., Guarente, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+of+NAD+and+SIR2+for+life-span+extension+by+calorie+restriction+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Requirement of NAD and SIR2 for life-span extension by calorie restriction in Saccharomyces cerevisiae.</a> Science. 289, 2126-2128 (2000).</li><li>Kaeberlein, M., Kennedy, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+identification+in+yeast+of+conserved+ageing+genes.">Large-scale identification in yeast of conserved ageing genes.</a> Mech Ageing Dev. 126, 17-21 (2005).</li><li>Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+yeast+replicative+life+span+by+TOR+and+Sch9+in+response+to+nutrients.">Regulation of yeast replicative life span by TOR and Sch9 in response to nutrients.</a> Science. 310, 1193-1196 (2005).</li></ol>

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Agar</td>
<td>Reagent</td>
<td>Fisher Scientific (BD Diagnostic Systems)</td>
<td>DF0145-17-0 (214530)</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bacto-Peptone</td>
<td>Reagent</td>
<td>Fisher Scientific (BD Diagnostic Systems)</td>
<td>DF0118-17-0 (211677)</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Yeast Extract</td>
<td>Reagent</td>
<td>Fisher Scientific (BD Diagnostic Systems)</td>
<td>DF0886-17-0 (288620)</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glucose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

measuring replicative life span in the budding yeast

L&#39;invecchiamento è un processo degenerativo caratterizzato da un progressivo deterioramento delle componenti cellulari e gli organelli con conseguente mortalità. Il lievito in erba<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; È stato ampiamente utilizzato per studiare la biologia dell&#39;invecchiamento, e alcuni fattori determinanti di longevità lievito hanno dimostrato di essere conservato negli eucarioti pluricellulari, tra cui vermi, mosche e topi<sup&gt; 1</sup&gt;. A causa della mancanza di facilmente quantificabile associate all&#39;età fenotipi, l&#39;invecchiamento nel lievito sono stati analizzati quasi esclusivamente misurando la durata della vita delle cellule in contesti diversi, con due diversi paradigmi durata nell&#39;uso comune<sup&gt; 2</sup&gt;. Durata cronologica si riferisce alla lunghezza del tempo che una cellula madre può sopravvivere in un non-divisione, quiescenza stato simile, e si propone di servire da modello per l&#39;invecchiamento della post-mitotico in cellule di eucarioti pluricellulari. Durata della vita replicativa, al contrario, si riferisce al numero di cellule figlie prodotte da una cellula madre prima della senescenza, ed è pensato per fornire un modello di invecchiamento nelle cellule mitoticamente attivo. Qui vi presentiamo un protocollo generalizzato per misurare la durata della vita di replicazione di cellule di lievito madre in erba. L&#39;obiettivo del test replicativa durata della vita è quello di determinare quante volte ogni cellula madre germogli. Le cellule madre e figlia possono essere facilmente distinguibili da un ricercatore esperto utilizzando un microscopio a luce standard (totale ingrandimento 160X), come il Axioscope Zeiss 40 o un altro modello comparabile. Separazione fisica delle cellule figlie dalle cellule madre è ottenuta utilizzando un micromanipolatore manuale dotato di una fibra ottica ago. Ceppi di lievito tipici di laboratorio 20-30 produrre cellule figlie per madre e una sperimentazione durata richiede 2-3 settimane.

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Replicative Life Span in the Budding Yeast at JoVE.com

Measuring Replicative Life Span in the Budding Yeast

In questo articolo vi presentiamo un protocollo generale per misurare la durata della vita di replicazione delle cellule di lievito madre.

Durata pannello misura replicazione in lievito

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding ...

measuring-replicative-life-span-in-the-budding-yeast

Research

JoVE Journal

Biology

20.5K Views.  University of Washington. In questo articolo vi presentiamo un protocollo generale per misurare la durata della vita di replicazione delle cellule di lievito madre.

Video: Measuring Replicative Life Span in the Budding Yeast

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The nematode Caenorhabditis elegans has emerged as a principal model used to study the biology of aging. Because virtually every biological subsystem undergoes functional decline with increasing age, life span is the primary endpoint of interest when considering total rate of aging. In nematodes, life span is typically defined as the number of days an animal remains responsive to external stimuli. Nematodes can be propagated either in liquid media or on solid media in plates, and techniques have been developed for measuring life span under both conditions. Here we present a generalized protocol for measuring life span of nematodes maintained on solid nematode growth media and fed a diet of UV-killed bacteria. These procedures can easily be adapted to assay life span under various common conditions, including a diet consisting of live bacteria, dietary restriction, and RNA interference.

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

In this article we present a general protocol for measuring life span of nematodes maintained on solid media with UV-killed bacterial food.

Misura Caenorhabditis elegans Life Span su terreni solidi

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The nematode ...

Ricerca

Biologia

Quantifying Yeast Chronological Life Span by Outgrowth of Aged Cells

The budding yeast Saccharomyces cerevisiae has proven to be an important model organism in the field of aging research 1. The replicative and chronological life spans are two established paradigms used to study aging in yeast. Replicative aging is defined as the number of daughter cells a single yeast mother cell produces before senescence; chronological aging is defined by the length of time cells can survive in a non-dividing, quiescence-like state 2. We have developed a high-throughput method for quantitative measurement of chronological life span. This method involves aging the cells in a defined medium under agitation and at constant temperature. At each age-point, a sub-population of cells is removed from the aging culture and inoculated into rich growth medium. A high-resolution growth curve is then obtained for this sub-population of aged cells using a Bioscreen C MBR machine. An algorithm is then applied to determine the relative proportion of viable cells in each sub-population based on the growth kinetics at each age-point. This method requires substantially less time and resources compared to other chronological lifespan assays while maintaining reproducibility and precision. The high-throughput nature of this assay should allow for large-scale genetic and chemical screens to identify novel longevity modifiers for further testing in more complex organisms.

Chronological aging in yeast refers to the loss of cell viability associated with time in stationary phase. Here we describe a high-throughput method for quantitatively determining yeast chronological life span.

Quantificare cronologica Span lievito Life di conseguenza di cellule invecchiate

The budding yeast Saccharomyces cerevisiae has proven to be an important model organism in the field of aging research 1. The replicative and ...

Purification of the M. magneticum Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamA&Delta;41

Magnetotactic bacteria comprise a diverse group of aquatic microorganisms that are able to orientate themselves along geomagnetic fields. This behavior is believed to aid their search for suitable environments (1). This capability is conferred by the magnetosome, a subcellular organelle that consists of a linear-chain assembly of lipid vesicles each able to biomineralize and enclose a ~50-nm crystal of magnetite or greigite. A principle component of the magnetosome that was shown to be required for the formation of functional vesicles is MamA. MamA is a highly abundant magnetosome-associated protein which is one of the most characterized magnetosome-associated proteins in vivo (2-6). This article focuses on the purification of MamA, which despite being studied in vivo, no clear functional or structural details have been identified for it. Bioinformatics analysis suggested that MamA is a tetra-tricopeptide repeat (TPR) containing protein. TPR is a structural motif found as such or forming part of a bigger fold in a wide range of proteins, it serves as a template for protein-protein interactions and mediates multi-protein complexes (7). TPRs are involved in many crucial tasks in eukaryotic cell organelle processes and many bacterial pathways (8-14). In order to understand MamA, a unique TPR containing protein, highly purified protein is required as a first step. In this article, we present the purification protocol for a stable MamA deletion mutant (MamA&Delta;41) from M. magneticum AMB-1.

Purification of the &lt;em&gt;M. magneticum&lt;/em&gt; Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamA&amp;Delta;41

MamA is a unique Magnetosome associated protein which was shown to be involved in magnetosome activation. Here we present the purification protocol of MamA deletion mutant (MamA&Delta;41) from M. magneticum AMB-1.

Purificazione della M. magneticum Strain AMB-1 proteina Magnetosome Associated MamAΔ41

Magnetotactic bacteria comprise a diverse group of aquatic microorganisms that are able to orientate themselves along geomagnetic fields. This behavior is ...

Analysis of the Development of a Morphological Phenotype as a Function of Protein Concentration in Budding Yeast

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae. Although this protocol is based on the overexpression of a protein, it can easily be adapted for morphological phenotypes dependent on suppression of protein expression. Our lab is interested in studying the signaling properties of the endocytic adaptor protein epsin. To that purpose we used a dominant negative approach in which we over-expressed the conserved Epsin N-Terminal Homology (ENTH) domain in order to interfere with the functions of endogenous epsin-2 (Ent2 or YLR206W). We observed that overexpression of the ENTH domain of Ent2 (ENTH2) in wild type cells led to a cell division defect that is dependent on the mislocalization of a family of scaffolding proteins, septins.

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae.

Analisi dello sviluppo di un fenotipo morfologico come funzione della concentrazione di proteine ​​in lievito

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of ...

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

Lifespan is a biological process regulated by several genetic pathways. One strategy to investigate the biology of aging is to study animals that harbor mutations in components of age-regulatory pathways. If these mutations perturb the function of the age-regulatory pathway and therefore alter the lifespan of the entire organism, they provide important mechanistic insights1-3.
Another strategy to investigate the regulation of lifespan is to use small molecules to perturb age-regulatory pathways. To date, a number of molecules are known to extend lifespan in various model organisms and are used as tools to study the biology of aging4-16. The number of molecules identified thus far is small compared to the genetic "toolset" that is available to study the biology of aging.
Caenorhabditis elegans is one of the principle models used to study aging because of its excellent genetics and short lifespan of three weeks. More recently, C.elegans has emerged as a model organism for phenotype based drug screens5,7,16-20 because of its small size and its ability to grow in microtiter plates.
Here we present an assay to measure C.elegans lifespan in 96 well microtiter plates. The assay was developed and successfully used to screen large libraries for molecules that extend C.elegans lifespan7. The reliability of the assay was evaluated in multiple tests: first, by measuring the lifespan of wild type animals grown at different temperatures; second, by measuring the lifespan of mutants with altered lifespans; third, by measuring changes in lifespan in response to different concentrations of the antidepressant Mirtazepine. Mirtazepine has previously been shown to extend lifespan in C.elegans7. The results of these tests show that the assay is able to replicate previous findings from other assays and is quantitative. The microtiter format also makes this lifespan assay compatible with automated liquid handling systems and allows integration into automated platforms.

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

In this protocol we present a method to measure Caenorhabditis elegans lifespan in 96 well microtiter plates.

Misura Caenorhabditis elegans Life Span in 96 piastre per microtitolazione Bene

Lifespan is a biological process regulated by several genetic pathways. One strategy to investigate the biology of aging is to study animals that harbor ...

Measuring the Kinetics of mRNA Transcription in Single Living Cells

The transcriptional activity of RNA polymerase II (Pol II) is a dynamic process and therefore measuring the kinetics of the transcriptional process in vivo is of importance. Pol II kinetics have been measured using biochemical or molecular methods.1-3 In recent years, with the development of new visualization methods, it has become possible to follow transcription as it occurs in real time in single living cells.4 Herein we describe how to perform analysis of Pol II elongation kinetics on a specific gene in living cells.5, 6 Using a cell line in which a specific gene locus (DNA), its mRNA product, and the final protein product can be fluorescently labeled and visualized in vivo, it is possible to detect the actual transcription of mRNAs on the gene of interest.7, 8 The mRNA is fluorescently tagged using the MS2 system for tagging mRNAs in vivo, where the 3'UTR of the mRNA transcripts contain 24 MS2 stem-loop repeats, which provide highly specific binding sites for the YFP-MS2 coat protein that labels the mRNA as it is transcribed.9 To monitor the kinetics of transcription we use the Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) method. By photobleaching the YFP-MS2-tagged nascent transcripts at the site of transcription and then following the recovery of this signal over time, we obtain the synthesis rate of the newly made mRNAs.5 In other words, YFP-MS2 fluorescence recovery reflects the generation of new MS2 stem-loops in the nascent transcripts and their binding by fluorescent free YFP-MS2 molecules entering from the surrounding nucleoplasm. The FRAP recovery curves are then analyzed using mathematical mechanistic models formalized by a series of differential equations, in order to retrieve the kinetic time parameters of transcription.

RNA polymerase II transcriptional kinetics are measured on specific genes in living cells. mRNAs transcribed from the gene of interest are fluorescently tagged and using Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) the in vivo kinetics of transcriptional elongation are obtained.

Misurazione della Cinetica di Trascrizione mRNA nelle cellule viventi singolo

The transcriptional activity of RNA polymerase II (Pol II) is a dynamic process and therefore measuring the kinetics of the transcriptional process in ...

Acquiring Fluorescence Time-lapse Movies of Budding Yeast and Analyzing Single-cell Dynamics using GRAFTS

Fluorescence time-lapse microscopy has become a powerful tool in the study of many biological processes at the single-cell level. In particular, movies depicting the temporal dependence of gene expression provide insight into the dynamics of its regulation; however, there are many technical challenges to obtaining and analyzing fluorescence movies of single cells. We describe here a simple protocol using a commercially available microfluidic culture device to generate such data, and a MATLAB-based, graphical user interface (GUI) -based software package to quantify the fluorescence images. The software segments and tracks cells, enables the user to visually curate errors in the data, and automatically assigns lineage and division times. The GUI further analyzes the time series to produce whole cell traces as well as their first and second time derivatives. While the software was designed for S. cerevisiae, its modularity and versatility should allow it to serve as a platform for studying other cell types with few modifications.

We present a simple protocol to obtain fluorescence microscopy movies of growing yeast cells, and a GUI-based software package to extract single-cell time series data. The analysis includes automated lineage and division time assignment integrated with visual inspection and manual curation of tracked data.

L&#39;acquisizione di fluorescenza filmati time-lapse di lievito in erba e Analisi Dinamica singola cella utilizzando innesti

Fluorescence time-lapse microscopy has become a powerful tool in the study of many biological processes at the single-cell level. In particular, movies ...

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously hard to disrupt. Here we describe the use of a bead mill homogenizer for the extraction of proteins into buffers optimized to maintain the functions, interactions and post-translational modifications of proteins. Logarithmically growing cells expressing the protein of interest are grown in a liquid growth media of choice. The growth media may be supplemented with reagents to induce protein expression from inducible promoters (e.g. galactose), synchronize cell cycle stage (e.g. nocodazole), or inhibit proteasome function (e.g. MG132). Cells are then pelleted and resuspended in a suitable buffer containing protease and/or phosphatase inhibitors and are either processed immediately or frozen in liquid nitrogen for later use. Homogenization is accomplished by six cycles of 20 sec&#160;bead-beating (5.5 m/sec), each followed by one minute incubation on ice. The resulting homogenate is cleared by centrifugation and small particulates can be removed by filtration. The resulting cleared whole cell extract (WCE) is precipitated using 20% TCA for direct analysis of total proteins by SDS-PAGE followed by Western blotting. Extracts are also suitable for affinity purification of specific proteins, the detection of post-translational modifications, or the analysis of co-purifying proteins. As is the case for most protein purification protocols, some enzymes and proteins may require unique conditions or buffer compositions for their purification and others may be unstable or insoluble under the conditions stated. In the latter case, the protocol presented may provide a useful starting point to empirically determine the best bead-beating strategy for protein extraction and purification. We show the extraction and purification of an epitope-tagged SUMO E3 ligase, Siz1, a cell cycle regulated protein that becomes both sumoylated and phosphorylated, as well as a SUMO-targeted ubiquitin ligase subunit, Slx5.

The preparation of high quality yeast cell extracts is a necessary first step in the analysis of individual proteins or entire proteomes. Here we describe a fast, efficient, and reliable homogenization protocol for budding yeast cells that has been optimized to preserve protein functions, interactions, and post-translational modifications.

Germogliamento lievito proteine ​​estrazione e purificazione per lo Studio della funzione, interazioni e modificazioni post-traduzionali

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient (Pf) of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is a simple and very efficient method for the determination of the osmotic water permeability coefficient (Pf) in plant protoplasts, applicable in principle also to other spherical cells such as frog oocytes. The first step of the assay is the isolation of protoplasts from the plant tissue of interest by enzymatic digestion into a chamber with an appropriate isotonic solution. The second step consists of an osmotic challenge assay: protoplasts immobilized on the bottom of the chamber are submitted to a constant perfusion starting with an isotonic solution and followed by a hypotonic solution. The cell swelling is video recorded. In the third step, the images are processed offline to yield volume changes, and the time course of the volume changes is correlated with the time course of the change in osmolarity of the chamber perfusion medium, using a curve fitting procedure written in Matlab (the &#8216;PfFit&#8217;), to yield Pf.

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient Pf of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Measuring the osmotic water permeability coefficient (Pf) of cells can help understand the regulatory mechanisms of aquaporins (AQPs). Pf determination in spherical plant cell protoplasts presented here involves protoplasts isolation and numerical analysis of their initial rate of volume change as a result of an osmotic challenge during constant bath perfusion.

Misurare il osmotica dell&#39;acqua Permeabilità Coefficiente (P<sub&gt; F</sub&gt;) Di celle sferiche: protoplasti impianto isolato come un esempio

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is ...

Protein Purification Technique that Allows Detection of Sumoylation and Ubiquitination of Budding Yeast Kinetochore Proteins Ndc10 and Ndc80

Post-translational Modifications (PTMs), such as phosphorylation, methylation, acetylation, ubiquitination, and sumoylation, regulate the cellular function of many proteins. PTMs of kinetochore proteins that associate with centromeric DNA mediate faithful chromosome segregation to maintain genome stability. Biochemical approaches such as mass spectrometry and western blot analysis are most commonly used for identification of PTMs. Here, a protein purification method is described that allows the detection of both sumoylation and ubiquitination of the kinetochore proteins, Ndc10 and Ndc80, in Saccharomyces cerevisiae. A strain that expresses polyhistidine-Flag-tagged Smt3 (HF-Smt3) and Myc-tagged Ndc10 or Ndc80 was constructed and used for our studies. For detection of sumoylation, we devised a protocol to affinity purify His-tagged sumoylated proteins by using nickel beads and used western blot analysis with anti-Myc antibody to detect sumoylated Ndc10 and Ndc80. For detection of ubiquitination, we devised a protocol for immunoprecipitation of Myc-tagged proteins and used western blot analysis with anti-Ub antibody to show that Ndc10 and Ndc80 are ubiquitinated. Our results show that epitope tagged-protein of interest in the His-Flag tagged Smt3 strain facilitates the detection of multiple PTMs. Future studies should allow exploitation of this technique to identify and characterize protein interactions that are dependent on a specific PTM.

This manuscript describes the detection of sumoylation and ubiquitination of kinetochore proteins, Ndc10 and Ndc80, in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.

Purificazione delle proteine ​​tecnica che permette la rilevazione di sumoilazione e Ubiquitinazione di lievito in erba cinetocore proteine ​​Ndc10 e Ndc80