This is supported by 973 MOST grant (Grant No. 2011CB504402, 2012CB947602), National Natural Science Foundation of China (Grant No. 91132724, U1332136) and the 'Hundred Talents Project' of Chinese Academy of Science. The protocol was approved by the Committee on the Ethics of Animal Experiments of the USTC (Permit Number: USTCACUC1103013).

1. Costruire l&#39;Apparato Chirurgia NOTA: per garantire il pesce rimane vivo durante e dopo l&#39;operazione, l&#39;anestesia gocciolamento soluzione etile metansolfonato 3-amminobenzoato (MS-222, o Tricaine) a mezzo di concentrazione (0,015%) con una velocità di 1 goccia / sec attraverso la bocca del pesce utilizzando un sistema autocostruito gocciolamento illustrato nella Figura 1. <ol><li> Fare una scatola come mostrato in Figura 1A (la lunghezza è di 28 centimetri, la larghezza è di 10 cm, l&#39;altezza è di 5 cm), mettere una spugna (lunghezza di 6 cm, larghezza è di 9 cm, altezza 4 cm) nel mezzo e aprire una gap su di esso. </li><li> Fai una superficie liscia globulare sulla fine l&#39;ago con vincolo polimerizzazione (Figura 1B), che sarà poi inserito nella bocca del pesce. Assicurarsi che la superficie dell&#39;ago è liscia per evitare bocca del pesce venga danneggiato. </li><li> Aggiungi la metà concentrazione di MS-222 (camera di sinistra, la lunghezza è di 6 centimetri, la larghezza è di 10 cm, l&#39;altezza è di 8 cm) e soluzione salina (camera destra, lunghezza di 4 cm, larghezza è di 10 cm, l&#39;altezza è di 8 cm) per i serbatoi come mostrato in Figura 1C. Nota: Fresco MS-222 è raccomandato. </li><li> Anestetizzare il pesce in 0,03% MS-222 per 2 min. </li><li> Mettere il pesce nella fessura della spugna e fissare il pesce con due coppie di perni, inseriti dietro la pinna pettorale e accanto il poro cloaca, rispettivamente, 11. </li><li> Collegare bocca del pesce, MS-222, e acqua allevamento con un tubo di tipo T, come mostrato nella Figura 1C. </li><li> Accendere il tubo collegato alla MS-222. </li></ol> 2. RGCs Label retrogradi dal Tectum Destra NOTA: Prima di iniziare, disinfettare tutti gli apparati con il 70-75% di etanolo, assicurando che non l&#39;etanolo rimane. <ol><li> Rossing: rimuovere leggermente la pelle su tutta cranio con sclerectome (vista dorsale del cranio è mostrata nelle figure 2A e 2B </strong&gt;). </li><li> Clearing: lavare il cranio con soluzione salina e poi asciugare con orecchio lampadina lavaggio. </li><li> Corrosione iniziale: corrodere il cranio con il mordenzante per 10 sec. </li><li> Clearing: completamente spazzare via il mordenzante con un batuffolo di cotone e poi lavare la zona con soluzione fisiologica e asciugare. </li><li> Protezione: al fine di proteggere il cranio in altre zone, tranne il Tectum destro da eccesso di corrosione, coprire queste zone con vincolo indurimento luce e poi curarla per esposizione a luce blu con illuminante portatile. </li><li> Corrosione Completa: mettere il mordenzante nella zona centrale del Tectum ancora a destra per l&#39;incisione completa per 2 min. Nota: Poiché crani di pesci anziani sono calcificate, corrosione richiederà più tempo. </li><li> Clearing: completamente spazzare via il mordenzante con un batuffolo di cotone e poi lavare la zona con soluzione fisiologica e asciugare di nuovo. </li><li> Apertura del cranio: rimuovere con attenzione il cranio Malacic (Figura 2C) con una pinza per esporre il 2D Tectum destra (Figura </strong&gt;). </li><li> Clearing: pulire il muco e effusing sangue dal buco con pezzi di Gelfoam e lavarlo con soluzione fisiologica fino a quando l&#39;emorragia si è fermata. </li><li> Posizionamento Dye: mettere il colorante (pasta di tessuto-etichettatura) su tutta la Tectum destra e coprire con Gelfoam. </li><li> Segregare: coprire il buco con una scala sterile dallo stesso animale. </li><li> Tenuta: legame polimerizzazione posto luce sulla bilancia e poi curare con la luce blu ancora per 40 sec. </li><li> Revival: lavare la superficie del vincolo e rilanciare l&#39;animale con soluzione fisiologica. </li><li> Nursing e l&#39;allevamento: Tenere il pesce in 28,5 ° C di media embrione (ZFIN) per 5 giorni ed alimentare 2 volte / die. Non includere pesce il cui colorante non riesce a rimanere in Tectum per 5 giorni durante l&#39;esperimento. Nota: soluzione a medio Embryo (EM) è vitale per la sopravvivenza dei pesci e la temperatura è il fattore chiave per l&#39;etichettatura DII. </li></ol> 3. Wholemounting Retina e Imaging <ol><li> Mettere il pesce in un campo scuro per 2 ore prima di retina chelemount. </li><li> Anestetizzare il pesce con acqua ghiacciata. </li><li> Perforare un buco nel margine di cornea e di fare un oculare rimuovendo la cornea con le forbici venus. </li><li> Rimuovere la lente e poi svuotare il centro della retina con ghiaccio freddo 1x PBS. </li><li> Lavare il divario tra la retina e la sclera con ghiaccio freddo 1x PBS fino a quando non pigmento viene lasciato. </li><li> Tagliare il nervo ottico al disco. </li><li> Mantenere lo strato RGC verso l&#39;alto e tenere la retina con un cucchiaio vetro self-made (Figure 3A e 3B). Un contagocce può anche essere utilizzato per trasferire la retina. </li><li> Mettere la retina in una goccia di ghiaccio 30% glicerina su un vetrino con lo strato RGC verso l&#39;alto (Figura 3C). </li><li> Rimuovere la glicerina e poi appiattire la retina sul vetrino prima di tagliare retina in quattro quadranti (Figura 3D). Mantenere la retina dispiegato con RGC strato alto sarà utile per appiattire la retina. </li><li> Gocciolare gelido 50% glicerina su tegli retina per lavare via i frammenti di pigmento. </li><li> Rimuovere la glicerina e poi cadere 20 ml di ghiacciata 75% glicerina sulla retina. </li><li> Coprire il campione con un 1,8 centimetri x 1,8 centimetri coprioggetto quadrati. </li><li> Sigillare il coprioggetto con smalto. Si raccomanda di imaging immediato della retina. </li><li> Un&#39;immagine non interlacciata tutta la retina sotto una lente oggetto 20X (NA = 0,70) con DP72 CCD (ogni immagine è 1360 x 1024 pixel). Ogni campo ha tre diversi obiettivi. </li><li> Estendere la profondità di ogni campo con lo strumento di &quot;profondità di campo esteso&quot; del software. </li><li> Assemblare una retina virtuale con la funzione di Photomerge. </li><li> Selezionare tre settori di 680 x 512 pixel (area effettiva è di 350 micron da 264 micron, 0,092 millimetri 2) in ciascun orientamento della retina per analizzare densità media di RGC (Figura 4A). </li><li> Avere la zona con la funzione di misurazioni - creare un poligono nell&#39;immaginesoftware. </li><li> Calcolare il numero totale di RGC dall&#39;equazione &quot;numero RGC = destino x zona&quot; 9. </li></ol>

<ol>
	<li>Wyatt, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+astray/robo2+zebrafish+mutant+reveals+that+degenerating+tracts+do+not+provide+strong+guidance+cues+for+regenerating+optic+axons.">Analysis of the astray/robo2 zebrafish mutant reveals that degenerating tracts do not provide strong guidance cues for regenerating optic axons.</a> J Neurosci. 30, 13838-13849 (2010).</li><li>Grieshaber, P., Lagreze, W. A., Noack, C., Boehringer, D., Biermann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staining+of+fluorogold-prelabeled+retinal+ganglion+cells+with+calcein-AM:+A+new+method+for+assessing+cell+vitality.">Staining of fluorogold-prelabeled retinal ganglion cells with calcein-AM: A new method for assessing cell vitality.</a> J Neurosci Methods. 192, 233-239 (2010).</li><li>Schwalb, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+factors+secreted+by+the+goldfish+optic+nerve+induce+retinal+ganglion+cells+to+regenerate+axons+in+culture.">Two factors secreted by the goldfish optic nerve induce retinal ganglion cells to regenerate axons in culture.</a> J Neurosci. 15, 5514-5525 (1995).</li><li>Watanabe, M., Inukai, N., Fukuda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+of+retinal+ganglion+cells+after+transection+of+the+optic+nerve+in+adult+cats:+a+quantitative+study+within+two+weeks.">Survival of retinal ganglion cells after transection of the optic nerve in adult cats: a quantitative study within two weeks.</a> Vis Neurosci. 18, 137-145 (2001).</li><li>Chiu, K., Lau, W. M., Yeung, S. C., Chang, R. C., So, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrograde+labeling+of+retinal+ganglion+cells+by+application+of+fluoro-gold+on+the+surface+of+superior+colliculus.">Retrograde labeling of retinal ganglion cells by application of fluoro-gold on the surface of superior colliculus.</a> J Vis Exp. , (2008).</li><li>Bakken, T. E., Stevens, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visual+system+scaling+in+teleost+fish.">Visual system scaling in teleost fish.</a> J Comp Neurol. 520, 142-153 (2012).</li><li>Zhou, L. X., Wang, Z. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+number+and+distribution+of+retinal+ganglion+cells+after+optic+nerve+crush+in+zebrafish.">Changes in number and distribution of retinal ganglion cells after optic nerve crush in zebrafish.</a> Shi Yan Sheng Wu Xue Bao. 35, 159-162 (2002).</li><li>Sherpa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ganglion+cell+regeneration+following+whole-retina+destruction+in+zebrafish.">Ganglion cell regeneration following whole-retina destruction in zebrafish.</a> Dev Neurobiol. 68, 166-181 (2008).</li><li>Zou, S., Tian, C., Ge, S., Hu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenesis+of+retinal+ganglion+cells+is+not+essential+to+visual+functional+recovery+after+optic+nerve+injury+in+adult+zebrafish.">Neurogenesis of retinal ganglion cells is not essential to visual functional recovery after optic nerve injury in adult zebrafish.</a> PLoS One. 8, (2013).</li><li>Choi, D., Li, D., Raisman, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+retrograde+neuronal+tracers+that+label+the+rat+facial+nucleus:+a+comparison+of+Fast+Blue,+Fluoro-ruby,+Fluoro-emerald,+Fluoro-Gold+and+DiI.">Fluorescent retrograde neuronal tracers that label the rat facial nucleus: a comparison of Fast Blue, Fluoro-ruby, Fluoro-emerald, Fluoro-Gold and DiI.</a> J Neurosci Methods. 117, 167-172 (2002).</li><li>Zou, S. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+the+optokinetic+response+to+study+visual+function+of+zebrafish.">Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish.</a> J Vis Exp. , (2010).</li><li>Tokuoka, H., Yoshida, T., Matsuda, N., Mishina, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+by+glycogen+synthase+kinase-3beta+of+the+arborization+field+and+maturation+of+retinotectal+projection+in+zebrafish.">Regulation by glycogen synthase kinase-3beta of the arborization field and maturation of retinotectal projection in zebrafish.</a> J Neurosci. 22, 10324-10332 (2002).</li><li>Xiao, T., Roeser, T., Staub, W., Baier, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+GFP-based+genetic+screen+reveals+mutations+that+disrupt+the+architecture+of+the+zebrafish+retinotectal+projection.">A GFP-based genetic screen reveals mutations that disrupt the architecture of the zebrafish retinotectal projection.</a> Development. 132, 2955-2967 (2005).</li><li>Li, L., Dowling, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+the+olfactoretinal+centrifugal+pathway+may+relate+to+the+visual+system+defect+in+night+blindness+b+mutant+zebrafish.">Disruption of the olfactoretinal centrifugal pathway may relate to the visual system defect in night blindness b mutant zebrafish.</a> Journal of Neuroscience. 20, 1883-1892 (2000).</li><li>Kassing, V., Engelmann, J., Kurtz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+Single-Cell+Responses+in+the+Optic+Tectum+of+Adult+Zebrafish+with+Dextran-Coupled+Calcium+Dyes+Delivered+via+Local+Electroporation.">Monitoring of Single-Cell Responses in the Optic Tectum of Adult Zebrafish with Dextran-Coupled Calcium Dyes Delivered via Local Electroporation.</a> PLoS One. 8, (2013).</li></ol>

We have nothing to disclose.

Marcatura retrograda di RGC è importante per ricercare sopravvivenza RGC in mammiferi, ma non è stato usato in zebrafish. I metodi alternativi, HE macchiava 7 e colorazione anticorpale 8, non sono gold standard per il conteggio numero RGC, e le linee transgeniche con tutti RGCs etichettati non ha ancora stati costruiti 12, 13. In questo video, vi presentiamo un metodo per retrograda RGCs etichette nella retina di zebrafish adulto. Anche se circa l&#39;1% degli assoni proiettano al bulb...

Come zebrafish adulto ha una forte capacità di rigenerare gli assoni dopo la lesione del nervo ottico 1, un metodo corretto per contare tutto il RGC è essenziale per valutare la sopravvivenza RGCs e rigenerazione 2. Sulla base dei metodi di RGCs marcatura retrograda in mammiferi e pesci rossi 3-5, abbiamo costruito il metodo per etichettare RGCs dal Tectum in zebrafish adulto. Per zebrafish adulto, due problemi tecnici critici devono essere notato: il cranio di zebrafish adulto è molto piccolo 6; vivono in un ambiente acquatico. Qui, trattiamo il cranio con mordenzante che riduce al minimo i rischi associati alla perforazione 5. Poi, abbiamo sigillare il foro con vincolo di polimerizzazione luce che migliora la sopravvivenza degli animali dopo l&#39;intervento chirurgico. In precedenza, sono state adottate diverse altre tecniche per contare il numero RGCs in modi indiretti. HE colorazione in sezioni retina etichetta tutti i tipi di cellule nel RGCL 7. Etichettatura anticorpo in tutta rEtina, come isolotto-1, può anche marcare cellule amacrine 8. Anche se l&#39;etichetta retrogrado dal moncone del nervo ottico può etichettare tutti RGCs nella retina, non può essere adottato nel modello calca perché provoca lesioni più al nervo ottico. Approfittando di etichetta retrogrado dal Tectum, abbiamo ricercato la sopravvivenza RGC e il rinnovamento nelle schiacciamento del nervo ottico. I risultati mostrano che quasi tutti RGCs sopravvissero e oltre il 90% di RGCs rigenerati al Tectum alla prima settimana nel modello calca 9. Al fine di etichettare correttamente tutti RGC, pasta DII è stato scelto dopo un confronto con diversi altri coloranti commerciali 10. In primo luogo, è stato appositamente progettato per l&#39;etichettatura tessuto in vivo. In secondo luogo, è un colorante lipofilo che non può diffondere in acqua. Inoltre, questa fluorescenza può persistere per lungo tempo che gli rende un candidato ideale per RGC ricerca sopravvivenza.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="608">
	<tbody>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:152px;">MS222</td>
			<td style="width:152px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:152px;">E10521</td>
			<td style="width:152px;">USA</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:152px;">DiI</td>
			<td style="width:152px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:152px;">N22880</td>
			<td style="width:152px;">USA</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:152px;">lightcuring bond</td>
			<td style="width:152px;">Heraeus Kulzer&#160;</td>
			<td style="width:152px;">Durafill bond</td>
			<td style="width:152px;">Germany</td>
		</tr>
		<tr height="55">
			<td height="55" style="height:55px;width:152px;">Gluma Etch</td>
			<td style="width:152px;">Heraeus Kulzer&#160;</td>
			<td style="width:152px;">Gluma Etch 35 Gel</td>
			<td style="width:152px;">Germany</td>
		</tr>
		<tr height="73">
			<td height="73" style="height:73px;width:152px;">Blue LED</td>
			<td style="width:152px;">Shenruo Medical Equipment Co.</td>
			<td style="width:152px;">Power Blue Light Curing Unit</td>
			<td style="width:152px;">China</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

retrograde labeling of retinal ganglion cells in adult zebrafish with fluorescent dyes

Etichettatura cellule gangliari della retina come retrograde (RGCs) in grado di isolare RGC somata di morire siti, è diventato il gold standard per il conteggio RGC nella sopravvivenza RGCs ed esperimenti di rigenerazione. Molti studi sono stati condotti negli animali mammiferi per ricercare la sopravvivenza RGC dopo la lesione del nervo ottico. Tuttavia, marcatura retrograda di RGCs in zebrafish adulto non è ancora stato segnalato, anche se alcuni metodi alternativi possono contare il numero di cellule negli strati della retina cellule gangliari (RGCL). Considerando le piccole dimensioni del cranio adulto zebrafish e l&#39;alto rischio di morte dopo la foratura sul cranio, apriamo il cranio con l&#39;aiuto di acido-incisione e sigillare il foro con un legame fotopolimerizzazione, che potrebbero migliorare significativamente il tasso di sopravvivenza. Dopo aver assorbito le tinture per 5 giorni, quasi tutti i RGC sono etichettati. Dato che questo metodo non ha bisogno di transetto il nervo ottico, è insostituibile nella ricerca della sopravvivenza RGC dopo schiacciamento del nervo ottico in zebrafish adulto. Qui, vi presentiamoquesto metodo passo passo e fornire risultati rappresentativi.

Come figure 4B-D mostra, il numero di cellule + Dii è di due terzi dei DAPI + cellule RGCL. In una retina normale, un&#39;immagine montaggio di tutta una retina (Figura 4E) mostra che DII + RGC sono distribuiti su tutta la retina ma in una retina rigenerato (Figura 4F), come RGC nella zona centrale non hanno rigenerato alla loro destinazione a la prima settimana, non potevano essere etichettati. <p class="jove_content" fo:keep-toget...

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Retrograde Labeling of Retinal Ganglion Cells in Adult Zebrafish with Fluorescent Dyes

We introduce an efficient method to retrograde label retinal ganglion cells (RGCs) in adult zebrafish.

Etichettatura retrograda di cellule gangliari della retina in Zebrafish adulti con coloranti fluorescenti

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs ...

retrograde-labeling-retinal-ganglion-cells-adult-zebrafish-with

Research

JoVE Journal

Neuroscience

9.4K Views.  University of Science and Technology of China. We introduce an efficient method to retrograde label retinal ganglion cells (RGCs) in adult zebrafish.