Gli autori di questo documento non hanno interessi finanziari concorrenti.

1. PEDOT: PSS Soluzione Preparazione <ol><li> A 50 ml di PEDOT PSS, aggiunta di glicole etilenico (aumenta conducibilità) in un rapporto in volume di 1:4 (glicole etilenico a PEDOT PSS), 0,5 microlitri / ml di acido Dodecylbenzenesulfonic (DBSA) come un tensioattivo, e 10 mg / ml 3-glicidossipropiltrimetossisilano (GOPS) come reticolante per favorire l&#39;adesione del polimero conduttore al vetrino. </li></ol> 2. OECT Fabrication (Figura 3) <ol><li> Definire i contatti di source e drain oro evaporato termicamente tramite lift-off litografia: <ol><li> Spin cappotto photoresist su un normale vetrino pulito a 3000 rpm per 30 sec. Dimensioni di vetro sono 3 in x 1 pollice </li><li> Definire modelli da fotolitografia. Dimensioni possono essere modificate, tuttavia le dimensioni qui elencate hanno mostrato di portare alla sensibilità ottimale. Quindi utilizzare uno sviluppatore. </li><li> Evaporare 5 nm e 100 nm di cromo e oro, rispettivamente. </li><li> Sollevare-off il photoresist in un acbagno di acetone per 1 ora, lasciando il substrato con la sorgente e il pozzo nell&#39;area contatti Au solo. </li></ol></li><li> La lunghezza desiderata della PEDOT: canale PSS è di 1 mm. Questo è ottenuto utilizzando un patterning parylene-C (Pa-C) tecnica peel-off: <ol><li> Caricare 3,5 g di Pa-C nel setup rivestimento. Uniformemente evaporare 2 micron di parylene-C sulla parte superiore del substrato con Au contatti. </li><li> Motivo canale mediante fotolitografia: <ol><li> Spin cappotto fotoresist a 3000 rpm per 30 sec. </li><li> Utilizzare una maschera per illuminare il canale e il contatto oro 20 sec ai raggi UV, il photoresist esposto diventerà solubile nello sviluppatore. </li><li> Utilizzare sviluppatore per aprire l&#39;area canale sul photoresist. </li></ol></li><li> Incidere il Pa-C nell&#39;area canale da un passo plasma 15 min (O 2 (50 sccm) e CHF 4 (3 sccm) plasma a 160 W) per aprire il canale e il contatto oro. </li></ol></li><li> Depositare la PEDOT: soluzione miscela PSS da spin coating a500 rpm per 45 sec. Infornare per 30 secondi a 110 ° C. </li><li> Peel-off della Pa-C per rivelare la PEDOT: canale PSS del substrato sottostante. Questo canale dovrebbe sovrapporsi leggermente con i contatti Au assunti nel protocollo 1. </li><li> Campioni cuocere per 1 ora a 140 ° C in condizioni atmosferiche. </li></ol> 3. Assemblea dispositivo <ol><li> Fai PDMS mescolando due soluzioni (di solito forniti insieme in un kit) con un rapporto 01:10 di salamoia in soluzione base. Cuocere per 1 ora a 120 ° C. </li><li> Progettare bene usando un punzone buco e tagliare un quadrato intorno alla zona desiderata. </li><li> Colla un PDMS ben sopra il canale, al risultato in una zona canale di circa 6 mm 2. Assicurarsi che i contatti di source e drain non sono coperti. </li><li> Effettuare un supporto di plastica con un foro in esso (può utilizzare il supporto per l&#39;inserto di coltura cellulare) e poi incollarlo sopra le PDMS. Lasciate asciugare per una notte. </li><li> Testare il bene della fuga dalla precarica con watER. </li><li> Saldare i fili elettrici sul contatto source e drain con stagno. </li></ol> 4. Cell Culture <ol><li> Preparare delle cellule di coltura come segue: <ol><li> In DMEM, aggiungere 1% glutammina, 10% siero fetale bovino, 0,5% penicillina-streptomicina, e 0,1% Gentamicina. </li><li> Sterilizzare terreni di coltura cellulare utilizzando un dispositivo di filtro sterile. </li></ol></li><li> Mantenere cellule Caco-2 tra il passaggio 49 e 68 a 37 ° C in atmosfera umidificata al 5% CO 2, in cellule di coltura. </li><li> Dividere le celle una volta alla settimana con tripsina e di sementi a 1,5 x 10 4 cellule / inserimento. </li><li> Cambiare cella cultura dei media due volte a settimana per 3 settimane. </li></ol> 5. Misure con OECT <ol><li> Collegare un filo di Ag / AgCl ad un Sourcemeter per uso come elettrodo cancello. Immergere la punta nella cella terreni di coltura, che viene utilizzato come elettrolita, come illustrato in figura 1a. </li><li> Collegare i fili di source e drain di tegli Sourcemeter (configurazione in dual channel). </li><li> Applicare un impulso quadrato tensione positiva (GS V) tra il gate e source (usato come elettrodo di riferimento: terra). Una tensione costante negativa tra drain e source (V DS) è applicata e corrente corrispondente (I DS) è misurata. </li><li> Utilizzare una raccolta di dati programma in esecuzione PC. Parametri OECT inseriti in un programma di acquisizione personalizzato dovrebbero essere le seguenti: V DS = -0,2 V, V GS = 0.3 V, V GS in tempo = 2 sec, off time = 28 sec. </li><li> Lettura corrente source-drain (I DS) e la corrente di gate (I GS). Effettuare la misurazione per alcuni minuti per garantire un segnale stabile base. </li></ol> 6. Integrazione Celle con OECT per Misura Nota: Prima dell&#39;esperimento, l&#39;integrità dello strato di cellule può essere verificata misurando TER con un dispositivo di spettroscopia di impedenza. TER di ogni 3 settimane di età Caco-2 inse cellularert dovrebbe essere superiore a 400 Ω. cm 2. <ol><li> Durante il tempo off di misurazione OECT: Rimuovere l&#39;elettrodo di porta dalla elettrolita, incorporare l&#39;inserto di coltura cellulare, e sostituire l&#39;elettrodo di porta all&#39;interno dell&#39;inserto di coltura cellulare. </li><li> Effettuare una misura di base con le cellule per diversi minuti al fine di garantire un segnale stabile. Questa linea di base sarà utilizzato come per il calcolo del valore normalizzato corrispondente a un monostrato intatto (0). </li></ol> 7. Preparazione e introduzione di composto tossico <ol><li> Preparare una soluzione 1 M di EGTA in acqua deionizzata, prima regolando il pH della soluzione a 7,4 con Tris base. </li><li> Aggiungere la soluzione EGTA nel volume appropriato per ottenere la concentrazione desiderata (ad esempio tra 5 mM e 100 mM), tenendo conto del volume. Il EGTA dovrebbe essere aggiunto nella camera basale durante il tempo libero. </li><li> Misurare continuamente per 90 minuti come nel protocollo 5. Se la misura è being effettuata a temperatura ambiente, la stabilità delle cellule non rimarrà costante dopo 90 min. </li><li> Alla fine della corsa, graffiare lo strato di cellule di provocare la completa distruzione dello strato di barriera misura e per 15 min, questo punto potrebbe essere fatto rimuovendo il filtro e immergendo l&#39;elettrodo di gate nei media. Questa linea di base sarà utilizzato come per il calcolo del valore normalizzato corrispondente a un monostrato distrutta. </li></ol>

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Questo progetto è sostenuto da FP7-PEOPLE-2009-RG, Marie Curie progetto n 256.367 (CELLTOX) e la Commissione europea ERC-2010-StG Research Council Proposta n 258.966 (IONOSENSE), così come una concessione congiunta dal Conseil Regional de Provenza-Alpi-Costa Azzurra e CDL Pharma per ST. Ringraziamo George Malliaras per utili discussioni relative al design e funzionalità OECT.

Questa tecnica fornisce un nuovo metodo per integrare un transistore elettrochimica organica con cellule vive per misurare l&#39;integrità del tessuto barriera. I principali vantaggi di questa tecnica sono la rapidità e sensibilità, ma anche il basso costo del dispositivo per il controllo dinamico di tessuto barriera. Poiché questo metodo utilizza cellule vive, un punto critico è quello di assicurarsi di utilizzare un monostrato, che rappresenta uno strato barriera intatto. I parametri ...

L&#39;epitelio gastrointestinale è un esempio di tessuto barriera, che controlla il passaggio di molecole tra differenti compartimenti del corpo. L&#39;epitelio è costituito da cellule cilindriche allungate unite da complessi di proteine ​​che forniscono una barriera fisica 1 contro patogeni e tossine, pur consentendo il passaggio di acqua e sostanze nutritive necessarie per sostenere il corpo. Questa selettività è dovuta alla polarizzazione delle cellule epiteliali, che crea due differenti domini di membrana: il lato apicale delle cellule esposte al lume e il lato basale delle cellule ancorate sui tessuti sottostanti 2,3. Giunzioni strette (TJ) sono complessi di proteine ​​presenti nella porzione apicale delle cellule epiteliali e sono parte di un complesso più larga nota come la giunzione apicale 4. Flusso di ioni attraverso il tessuto barriera può andare sia tramite il transcellulare (attraverso la cella) o tramite un paracellular (tra due celle adiacenti) percorso. La somma diil trasporto attraverso entrambe le vie è noto come la resistenza transepiteliale. La giunzione apicale è responsabile della regolazione di ioni e molecole che passano attraverso la barriera 5,6 tramite una specifica funzione di chiusura e di apertura. Una disfunzione o alterazione di tali complessi proteici sono spesso correlati alla malattia 7-11. Inoltre, molti enterici patogeni / tossine sono noti per indirizzare specificamente questo complesso, entrando così il corpo e che porta a diarrea, molto probabilmente come conseguenza della massiccia disregolazione del flusso di ioni / acqua attraverso la barriera 12-14. Tessuto barriera può anche essere modificato cambiando il microambiente extracellulare. Caderina è una proteina critica per adesione cellula-cellula, ed è coinvolta nella formazione della giunzione apicale. Il calcio è necessaria per la conformazione strutturale corretta di caderina, e una diminuzione del calcio extracellulare ha dimostrato di causare la distruzione della giunzione cellula-cellula e una successiva apertura delparacellular percorso tra le celle 15. In questo studio, EGTA (etilenglicole-bis (beta-amminoetil etere)-N, N, N &#39;, N&#39;-acido acetico tetra), uno specifico chelante del calcio, è stato usato per indurre una breccia nel tessuto barriera, in quanto ha dimostrato di avere un effetto rapido e drastico sul paracellulare ion flusso 16,17. Questo chelante del calcio è stato utilizzato su un monostrato confluente e differenziata della linea cellulare Caco-2. Coltivate in inserti coltura cellulare, questa linea cellulare è noto per sviluppare le caratteristiche del tratto gastrointestinale ed è ampiamente utilizzato dall&#39;industria farmaceutica per testare l&#39;assorbimento di farmaci 18,19. Metodi per monitorare l&#39;integrità dei tessuti barriera sono abbondanti. Questi metodi sono spesso ottica, basandosi su immunofluorescenza di particolari proteine ​​note per essere all&#39;incrocio apicale 20, o basandosi sulla quantificazione di una molecola tracciante fluorescente che è normalmente impermeabile al tessuto barriera21,22. Tuttavia, i metodi label-free (ovvero senza un fluoroforo / cromoforo) sono preferibili come l&#39;uso di un&#39;etichetta può incorrere artefatti, e spesso aumenta il tempo di costo e dosaggio. Elettrico, monitoraggio senza etichetta di tessuto barriera è recentemente emerso come un metodo di monitoraggio dinamico 23. Ad esempio recenti progressi tecnologici nella spettroscopia di impedenza elettrica hanno consentito lo sviluppo di un apparecchio di scansione disponibile in commercio 24,25 che può misurare la resistenza transepiteliale (TER), una misurazione della conduttanza di ioni attraverso lo strato di cellule. Elettronica organica ha creato un&#39;opportunità unica per interfacciare il mondo dell&#39;elettronica e della biologia 26,27 28,29 utilizzando polimeri conduttori che possono condurre entrambi i vettori elettronici e ionici. Una nuova tecnica per rilevare le infrazioni in tessuto barriera usando l&#39;OECT 30-32 è stato recentemente introdotto. Questo dispositivo è stato validato con tecniche esistenti con noiEd valutare integrità della barriera di tessuto, tra cui immunofluorescenza, test di permeabilità con Lucifero giallo, e spettroscopia di impedenza utilizzando il Cellzscope. Nel caso di tutti i composti tossici testati, il OECT stato trovato per operare con sensibilità uguale o migliore, e con maggiore risoluzione temporale, rispetto alle tecniche precedenti. In questo dispositivo, PEDOT PSS, un polimero conduttore che ha dimostrato di essere stabile e biocompatibile 33,34, viene utilizzato come materiale attivo nel canale transistor. Il OECT è composto di elettrodi di drain e di source su entrambi i lati di un canale polimero conduttivo. Questo viene poi messo in contatto con un elettrolita, che costituisce parte integrante del dispositivo. Un elettrodo di gate è immerso nell&#39;elettrolita (Figura 1), e quando una tensione di gate positiva è applicata al gate, cationi dell&#39;elettrolita sia costretto ad entrare canale, dedoping così il polimero conduttore ed una conseguente variazione del source-drain corrente. Il device è quindi estremamente sensibile ai cambiamenti minute a flusso di ioni a causa di amplificazione del transistor. Uno strato di cellule coltivate su un inserto di coltura cellulare è stata posta tra l&#39;elettrodo di gate e il canale polimero conduttivo. La presenza di uno strato di cellule intatte agisce come barriera per i cationi entrare nel polimero conduttore, quindi, in presenza di un monostrato intatto, la corrente diminuisce di scarico (Figura 2: transizione da una regione a b). In presenza di un composto tossico, il tessuto barriera progressivamente perdere la sua integrità, lasciando che i cationi entrano nel film polimerico e aumentando la corrente di drain (Figura 2: regione c). Con questa tecnica, la breccia nel tessuto barriera è visto dalla modulazione della corrente di drain, corrispondente alla modulazione del flusso attraverso il monostrato. Questo dispositivo è in grado di misurare le variazioni minute a flusso ionico con risoluzione temporale senza precedenti e la sensibilità in tempo reale. Questo wil tecnologial essere di interesse nel campo della tossicologia per il test anti-droga, diagnostica delle malattie o di ricerca di base, come il modello di barriera può essere facilmente adattato. Questo metodo aiuterà anche a ridurre la sperimentazione animale, in quanto consente la validazione dei modelli in vitro per sostituire nei test in vivo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="589">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">CLEVIOS PH 1000</td>
			<td style="width:87px;">HERAUS CLEVIOS</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">AZ9260 resin</td>
			<td style="width:87px;">CIPEC SPECIALITIES</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Dodecylbenzenesulfonic acid (DBSA)</td>
			<td style="width:87px;">Acros Organic</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">3-glycidoxypropyltrimethoxysilane (GOPS)</td>
			<td style="width:87px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">24-well Suspended cell Culture insert Millicell&#160; PET 0.4 &#956;m Millipore</td>
			<td style="width:87px;">Dominique dutscher</td>
			<td style="width:119px;">51705</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">24-well cell culture plate BD Falcon</td>
			<td style="width:87px;">Dominique dutscher</td>
			<td style="width:119px;">51705</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">STERICUP-GP PES 0.22 &#956;M</td>
			<td style="width:87px;">Dominique dutscher</td>
			<td style="width:119px;">51246</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">ADVANCED DMEM Marque GIBCO</td>
			<td style="width:87px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:119px;">E3434T</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">FBS HEAT INACT. S.AMERICAN</td>
			<td style="width:87px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:119px;">E3387M</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">PENICILLIN STREPTOMYCIN</td>
			<td style="width:87px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:119px;">E3470C</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">GLUTAMAX</td>
			<td style="width:87px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:119px;">E3524T</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">TRYPSIN 0.05% EDTA</td>
			<td style="width:87px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:119px;">E3513N</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">EGTA (Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N&#8242;,N&#8242;-tetraacetic acid)</td>
			<td style="width:87px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">E4378</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">ETHYLENE GLYCOL, ANHYDROUS, 99.8%,</td>
			<td style="width:87px;">Sigma aldrich</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Caco-2 cells</td>
			<td style="width:87px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">PDMS</td>
			<td style="width:87px;">Dow corning</td>
			<td style="width:119px;">SYLGARD 184 SILICONE ELASTOMER</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Au (99.99%)</td>
			<td style="width:87px;">NEYCO</td>
			<td style="width:119px;">AU3X6</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Chromium (99.95%)</td>
			<td style="width:87px;">NEYCO</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Parylene C</td>
			<td style="width:87px;">Specialty Coating Systems</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Ag/AgCl wire</td>
			<td style="width:87px;">HARVARD APPARATUS</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Photoresist</td>
			<td style="width:87px;">CIPEC SPECIALITIES</td>
			<td style="width:119px;">R&#233;sine AZ9260</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sensing of barrier tissue disruption with an organic electrochemical transistor

Il tratto gastrointestinale è un esempio di tessuto barriera che fornisce una barriera fisica contro l&#39;ingresso di agenti patogeni e tossine, pur consentendo il passaggio di ioni e molecole necessarie. Una violazione in questa barriera può essere causato da una riduzione della concentrazione di calcio extracellulare. Questa riduzione nella concentrazione di calcio provoca un cambiamento conformazionale di proteine ​​coinvolte nella tenuta della barriera, portando ad un aumento del flusso paracellular. Per simulare questo effetto chelante calcio etilene glicole bis (beta-amminoetil etere)-N, N, N &#39;, N&#39;-acido acetico tetra (EGTA) è stato utilizzato su un monostrato di cellule note per essere rappresentativo del tratto gastrointestinale. Esistono già diversi metodi per rilevare la rottura del tessuto barriera, come immunofluorescenza e permeabilità saggi. Tuttavia, questi metodi sono molto tempo e costosa e non adatta per misure dinamiche o ad alto rendimento. Strumenti elettronici per la misurazione del tessuto barrieraintegrità esiste anche per la misura della resistenza transepiteliale (TER), tuttavia questi sono spesso costosi e complessi. Lo sviluppo di metodi rapidi, economici, e sensibili è urgente l&#39;integrità del tessuto barriera è un parametro chiave nella scoperta di nuovi farmaci e la diagnostica patogeno / tossina. Il transistor elettrochimica organica (OECT) integrato con il tessuto barriera formando cellule è stato dimostrato come un nuovo dispositivo in grado di controllare dinamicamente l&#39;integrità del tessuto barriera. Il dispositivo è in grado di misurare le variazioni minute a flusso ionico con risoluzione temporale senza precedenti e sensibilità, in tempo reale, come indicatore di integrità del tessuto barriera. Questo nuovo metodo è basato su un semplice dispositivo che può essere compatibile con le applicazioni di screening ad alta produttività e fabbricato a basso costo.

Durante la prima fase di misurazione, la corrente di drain può variare leggermente, ma nella maggior parte dei casi dovrebbe rimanere stabile (figura 2, parte a). Se il segnale non è stabile, il transistore deve essere eliminata e sostituita. Questo controllo della stabilità garantisce inoltre che le eventuali perdite iniziali conducibilità del dispositivo non influenzano la misura successiva. Dopo alcuni minuti di misurazione, l&#39;inserto con cellule che formano il tessuto barriera è posto sulla...

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Sensing of Barrier Tissue Disruption with an Organic Electrochemical Transistor

Il Transistor elettrochimica organica è integrato con cellule vive e utilizzato per monitorare il flusso di ioni attraverso la barriera epiteliale intestinale. In questo studio, un aumento di flusso di ioni, correlate a rottura di giunzioni strette, indotta dalla presenza del chelante calcio EGTA (etilenglicole-bis (beta-amminoetil etere)-N, N, N &#39;, N&#39;-tetra acetico acido), viene misurata.

Rilevamento di Barriera tessuto Turbativa con una Transistor elettrochimica biologico

The gastrointestinal tract is an example of barrier tissue that provides a physical barrier against entry of pathogens and toxins, while allowing the ...

sensing-barrier-tissue-disruption-with-an-organic-electrochemical

Research

JoVE Journal

Bioengineering

11.6K Views.  Ecole Nationale Superieure des Mines.  Il Transistor elettrochimica organica è integrato con cellule vive e utilizzato per monitorare il flusso di ioni attraverso la barriera epiteliale intestinale. In questo studio, un aumento di flusso di ioni, correlate a rottura di giunzioni strette, indotta dalla presenza del chelante calcio EGTA (etilenglicole-bis (beta-amminoetil etere)-N, N, N ', N'-tetra acetico acido), viene misurata. 

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Hollow Microneedle-based Sensor for Multiplexed Transdermal Electrochemical Sensing

The development of a minimally invasive multiplexed monitoring system for rapid analysis of biologically-relevant molecules could offer individuals suffering from chronic medical conditions facile assessment of their immediate physiological state. Furthermore, it could serve as a research tool for analysis of complex, multifactorial medical conditions. In order for such a multianalyte sensor to be realized, it must be minimally invasive, sampling of interstitial fluid must occur without pain or harm to the user, and analysis must be rapid as well as selective.
Initially developed for pain-free drug delivery, microneedles have been used to deliver vaccines and pharmacologic agents (e.g., insulin) through the skin.1-2 Since these devices access the interstitial space, microneedles that are integrated with microelectrodes can be used as transdermal electrochemical sensors. Selective detection of glucose, glutamate, lactate, hydrogen peroxide, and ascorbic acid has been demonstrated using integrated microneedle-electrode devices with carbon fibers, modified carbon pastes, and platinum-coated polymer microneedles serving as transducing elements.3-7,8
This microneedle sensor technology has enabled a novel and sophisticated analytical approach for in situ and simultaneous detection of multiple analytes. Multiplexing offers the possibility of monitoring complex microenvironments, which are otherwise difficult to characterize in a rapid and minimally invasive manner. For example, this technology could be utilized for simultaneous monitoring of extracellular levels of, glucose, lactate and pH,9 which are important metabolic indicators of disease states7,10-14 (e.g., cancer proliferation) and exercise-induced acidosis.15

This article details the construction of a multiplexed microneedle-based sensor. The device is being developed for in situ sampling and electrochemical analysis of multiple analytes in a rapid and selective manner. We envision clinical medicine and biomedical research uses for these microneedle-based sensors.

Hollow microago-based sensore per Multiplexed transdermico elettrochimica Sensing

The development of a minimally invasive multiplexed monitoring system for rapid analysis of biologically-relevant molecules could offer individuals ...

Ricerca

Bioingegneria

Bacterial Detection &amp; Identification Using Electrochemical Sensors

Electrochemical sensors are widely used for rapid and accurate measurement of blood glucose and can be adapted for detection of a wide variety of analytes. Electrochemical sensors operate by transducing a biological recognition event into a useful electrical signal. Signal transduction occurs by coupling the activity of a redox enzyme to an amperometric electrode. Sensor specificity is either an inherent characteristic of the enzyme, glucose oxidase in the case of a glucose sensor, or a product of linkage between the enzyme and an antibody or probe.
Here, we describe an electrochemical sensor assay method to directly detect and identify bacteria. In every case, the probes described here are DNA oligonucleotides. This method is based on sandwich hybridization of capture and detector probes with target ribosomal RNA (rRNA). The capture probe is anchored to the sensor surface, while the detector probe is linked to horseradish peroxidase (HRP). When a substrate such as 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) is added to an electrode with capture-target-detector complexes bound to its surface, the substrate is oxidized by HRP and reduced by the working electrode. This redox cycle results in shuttling of electrons by the substrate from the electrode to HRP, producing current flow in the electrode.

We describe an electrochemical sensor assay method for rapid bacterial detection and identification. The assay involves a sensor array functionalized with DNA oligonucleotide capture probes for ribosomal RNA (rRNA) species-specific sequences. Sandwich hybridization of target rRNA with the capture probe and a horseradish peroxidase-linked DNA oligonucleotide detector probe produces a measurable amperometric current.

Rilevamento e identificazione batterica Utilizzando Sensori elettrochimici

Electrochemical  sensors are widely used for rapid and accurate measurement of blood glucose and  can be adapted for detection of a wide variety of ...

Electric Cell-substrate Impedance Sensing for the Quantification of Endothelial Proliferation, Barrier Function, and Motility

Electric Cell-substrate Impedance Sensing (ECIS) is an in vitro impedance measuring system to quantify the behavior of cells within adherent cell layers. To this end, cells are grown in special culture chambers on top of opposing, circular gold electrodes. A constant small alternating current is applied between the electrodes and the potential across is measured. The insulating properties of the cell membrane create a resistance towards the electrical current flow resulting in an increased electrical potential between the electrodes. Measuring cellular impedance in this manner allows the automated study of cell attachment, growth, morphology, function, and motility. Although the ECIS measurement itself is straightforward and easy to learn, the underlying theory is complex and selection of the right settings and correct analysis and interpretation of the data is not self-evident. Yet, a clear protocol describing the individual steps from the experimental design to preparation, realization, and analysis of the experiment is not available. In this article the basic measurement principle as well as possible applications, experimental considerations, advantages and limitations of the ECIS system are discussed. A guide is provided for the study of cell attachment, spreading and proliferation; quantification of cell behavior in a confluent layer, with regard to barrier function, cell motility, quality of cell-cell and cell-substrate adhesions; and quantification of wound healing and cellular responses to vasoactive stimuli. Representative results are discussed based on human microvascular (MVEC) and human umbilical vein endothelial cells (HUVEC), but are applicable to all adherent growing cells.

This protocol reviews Electric Cell-substrate Impedance Sensing, a method to record and analyze the impedance spectrum of adherent cells for the quantification of cell attachment, proliferation, motility, and cellular responses to pharmacological and toxic stimuli. Detection of endothelial permeability and assessment of cell-cell and cell-substrate contacts are emphasized.

Elettrico Cell-substrato Impedance Sensing per la quantificazione dei Endothelial proliferazione, Barriera funzione e motilità

Electric Cell-substrate Impedance Sensing (ECIS) is an in vitro impedance measuring system to quantify the behavior of cells within adherent cell layers. ...

Preparation of Silicon Nanowire Field-effect Transistor for Chemical and Biosensing Applications

Surveillance using biomarkers is critical for the early detection, rapid intervention, and reduction in the incidence of diseases. In this study, we describe the preparation of polycrystalline silicon nanowire field-effect transistors (pSNWFETs) that serve as biosensing devices for biomarker detection. A protocol for chemical and biomolecular sensing by using pSNWFETs is presented. The pSNWFET device was demonstrated to be a promising transducer for real-time, label-free, and ultra-high-sensitivity biosensing applications. The source/drain channel conductivity of a pSNWFET is sensitive to changes in the environment around its silicon nanowire (SNW) surface. Thus, by immobilizing probes on the SNW surface, the pSNWFET can be used to detect various biotargets ranging from small molecules (dopamine) to macromolecules (DNA and proteins). Immobilizing a bioprobe on the SNW surface, which is a multistep procedure, is vital for determining the specificity of the biosensor. It is essential that every step of the immobilization procedure is correctly performed. We verified surface modifications by directly observing the shift in the electric properties of the pSNWFET following each modification step. Additionally, X-ray photoelectron spectroscopy was used to examine the surface composition following each modification. Finally, we demonstrated DNA sensing on the pSNWFET. This protocol provides step-by-step procedures for verifying bioprobe immobilization and subsequent DNA biosensing application.

We describe key steps for biosensing by using polysilicon nanowire field-effect transistors, including the preparation of the device and the immobilization and confirmation of a DNA molecular probe on the nanowire surface, as well as conditions for DNA sensing.

Preparazione della Silicon Nanowire effetto di campo transistor per l&#39;industria chimica e biosensing Applicazioni

Surveillance using biomarkers is critical for the early detection, rapid intervention, and reduction in the incidence of diseases. In this study, we ...

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and trade one defect for another. Tissue engineering holds the promise to address this increasing demand. However, most tissue engineering strategies fail to generate stable and functional tissue substitutes because of poor vascularization. This paper focuses on an in vivo tissue engineering chamber model of intrinsic vascularization where a perfused artery and a vein either as an arteriovenous loop or a flow-through pedicle configuration is directed inside a protected hollow chamber. In this chamber-based system angiogenic sprouting occurs from the arteriovenous vessels and this system attracts ischemic and inflammatory driven endogenous cell migration which gradually fills the chamber space with fibro-vascular tissue. Exogenous cell/matrix implantation at the time of chamber construction enhances cell survival and determines specificity of the engineered tissues which develop. Our studies have shown that this chamber model can successfully generate different tissues such as fat, cardiac muscle, liver and others. However, modifications and refinements are required to ensure target tissue formation is consistent and reproducible. This article describes a standardized protocol for the fabrication of two different vascularized tissue engineering chamber models in vivo.

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

This is a guideline for constructing in vivo vascularized tissue using a microsurgical arteriovenous loop or a flow-through pedicle configuration inside a tissue engineering chamber. The vascularized tissues generated can be employed for organ regeneration and replacement of tissue defects, as well as for drug testing and disease modeling.

Ingegneria dei tessuti da parte intrinseca Vascolarizzazione in un<em&gt; In Vivo</em&gt; Camera ingegneria dei tessuti

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and ...

Wet Chemistry and Peptide Immobilization on Polytetrafluoroethylene for Improved Cell-adhesion

Endowing materials surface with cell-adhesive properties is a common strategy in biomaterial research and tissue engineering. This is particularly interesting for already approved polymers that have a long standing use in medicine because these materials are well characterized and legal issues associated with the introduction of newly synthesized polymers may be avoided. Polytetrafluoroethylene (PTFE) is one of the most frequently employed materials for the manufacturing of vascular grafts but the polymer lacks cell adhesion promoting features. Endothelialization, i.e., complete coverage of the grafts inner surface with a confluent layer of endothelial cells is regarded key to optimal performance, mainly by reducing thrombogenicity of the artificial interface.
This study investigates the growth of endothelial cells on peptide-modified PTFE and compares these results to those obtained on unmodified substrate. Coupling with the endothelial cell adhesive peptide Arg-Glu-Asp-Val (REDV) is performed via activation of the fluorin-containing polymer using the reagent sodium naphthalenide, followed by subsequent conjugation steps. Cell culture is accomplished using Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) and excellent cellular growth on peptide-immobilized material is demonstrated over a two-week period.

Cell-adhesiveness is key to many approaches in biomaterial research and tissue engineering. A step-by-step technique is presented using wet-chemistry for the surface modification of the important polymer PTFE with peptides.

Wet Chimica e Peptide immobilizzazione su politetrafluoroetilene per Miglioramento di adesione cellulare

Endowing materials surface with cell-adhesive properties is a common strategy in biomaterial research and tissue engineering. This is particularly ...

Development of an Electrochemical DNA Biosensor to Detect a Foodborne Pathogen

Vibrio parahaemolyticus (V. parahaemolyticus) is a common foodborne pathogen that contributes to a large proportion of public health problems globally, significantly affecting the rate of human mortality and morbidity. Conventional methods for the detection of V. parahaemolyticus such as culture-based methods, immunological assays, and molecular-based methods require complicated sample handling and are time-consuming, tedious, and costly. Recently, biosensors have proven to be a promising and comprehensive detection method with the advantages of fast detection, cost-effectiveness, and practicality. This research focuses on developing a rapid method of detecting V. parahaemolyticus with high selectivity and sensitivity using the principles of DNA hybridization. In the work, characterization of synthesized polylactic acid-stabilized gold nanoparticles (PLA-AuNPs) was achieved using X-ray Diffraction (XRD), Ultraviolet-visible Spectroscopy (UV-Vis), Transmission Electron Microscopy (TEM), Field-emission Scanning Electron Microscopy (FESEM), and Cyclic Voltammetry (CV). We also carried out further testing of stability, sensitivity, and reproducibility of the PLA-AuNPs. We found that the PLA-AuNPs formed a sound structure of stabilized nanoparticles in aqueous solution. We also observed that the sensitivity improved as a result of the smaller charge transfer resistance (Rct) value and an increase of active surface area (0.41 cm2). The development of our DNA biosensor was based on modification of a screen-printed carbon electrode (SPCE) with PLA-AuNPs and using methylene blue (MB) as the redox indicator. We assessed the immobilization and hybridization events by differential pulse voltammetry (DPV). We found that complementary, non-complementary, and mismatched oligonucleotides were specifically distinguished by the fabricated biosensor. It also showed reliably sensitive detection in cross-reactivity studies against various food-borne pathogens and in the identification of V. parahaemolyticus in fresh cockles.

A protocol for the development of an electrochemical DNA biosensor comprising a polylactic acid-stabilized, gold nanoparticles-modified, screen-printed carbon electrode to detect Vibrio parahaemolyticus is presented.

Sviluppo di un biosensore elettrochimico del DNA per rilevare un patogeni di origine alimentare

Vibrio parahaemolyticus (V. parahaemolyticus) is a common foodborne pathogen that contributes to a large proportion of public health problems globally, ...

In Vitro Multiparametric Cellular Analysis by Micro Organic Charge-modulated Field-effect Transistor Arrays

Modern electrophysiology has been constantly fueled by the parallel development of increasingly sophisticated tools and materials. In turn, discoveries in this field have driven technological progress in a back-and-forth process that ultimately determined the impressive achievements of the past 50 years. However, the most employed devices used for cellular interfacing (namely, the microelectrode arrays and microelectronic devices based on transistors) still present several limitations such as high cost, the rigidity of the materials, and the presence of an external reference electrode. To partially overcome these issues, there have been developments in a new scientific field called organic bioelectronics, resulting in advantages such as lower cost, more convenient materials, and innovative fabrication techniques.
Several interesting new organic devices have been proposed during the past decade to conveniently interface with cell cultures.&#160;This paper presents the protocol for the fabrication of devices for cellular interfacing based on the organic charge-modulated field-effect transistor (OCMFET). These devices, called micro OCMFET arrays (MOAs), combine the advantages of organic electronics and the peculiar features of the OCMFET to prepare transparent, flexible, and reference-less tools with which it is possible to monitor both the electrical and the metabolic activities of cardiomyocytes and neurons in vitro, thus allowing a multiparametric evaluation of electrogenic cell models.

In Vitro Multiparametric Cellular Analysis by Micro Organic Charge-modulated Field-effect Transistor Arrays

Here, we present the fabrication protocol of an organic charge-modulated field-effect transistor (OCMFET)-based device for in vitro cellular interfacing. The device, called a micro OCMFET array, is a flexible, low-cost, and reference-less device, which will enable the monitoring of the electrical and metabolic activities of electroactive cell cultures.

In vitro Analisi cellulare multiparametrica mediante array di transistor a effetto di campo modulati con carica organica micro

Modern electrophysiology has been constantly fueled by the parallel development of increasingly sophisticated tools and materials. In turn, discoveries in ...

Disruption of the Blood-Spinal Cord Barrier Using Low-Intensity Focused Ultrasound in a Rat Model

Low-intensity focused ultrasound (LIFU) uses ultrasonic pulsations at lower intensities than ultrasound and is being tested as a reversible and precise neuromodulatory technology. Although LIFU-mediated blood-brain barrier (BBB) opening has been explored in detail, no standardized technique for blood-spinal cord barrier (BSCB) opening has been established to date. Therefore, this protocol presents a method for successful BSCB disruption using LIFU sonication in a rat model, including descriptions of animal preparation, microbubble administration, target selection&#160;and localization, as well as BSCB disruption visualization and confirmation. The approach reported here is particularly useful for researchers who need a fast and cost-effective method to test and confirm target localization and precise BSCB disruption in a small animal model with a focused ultrasound transducer, evaluate the BSCB efficacy of sonication parameters, or explore applications for LIFU at the spinal cord, such as drug delivery, immunomodulation, and neuromodulation. Optimizing this protocol for individual use is recommended, especially for advancing future preclinical, clinical, and translational work.

Disruption of the blood-spinal cord barrier (BSCB) can be successfully achieved with the intravenous administration of microbubbles and the application of low-intensity focused ultrasound (LIFU). This protocol details the opening of the BSCB using LIFU in a rodent model, including equipment setup, microbubble injection, target localization, and BSCB disruption visualization.

Rottura della barriera emato-spinale utilizzando ultrasuoni focalizzati a bassa intensità in un modello di ratto

Low-intensity focused ultrasound (LIFU) uses ultrasonic pulsations at lower intensities than ultrasound and is being tested as a reversible and precise ...

Valutazione dei cambiamenti di comportamento delle celle indotte da MOF mediante rilevamento del substrato della cella elettrica

Electric Cell-Substrate Sensing for Real-Time Evaluation of Metal-Organic Framework Toxicological Profiles

Metal-organic frameworks (MOFs) are hybrids formed through the coordination of metal ions and organic linkers in organic solvents. The implementation of MOFs in biomedical and industrial applications has led to concerns regarding their safety. Herein, the profile of a selected MOF, a zeolitic imidazole framework, was evaluated upon exposure to human lung epithelial cells. The platform for evaluation was a real-time technique (i.e., electric cell-substrate impedance sensing [ECIS]). This study identifies and discusses some of the deleterious effects of the selected MOF on the exposed cells. Furthermore, this study demonstrates the benefits of using the real-time method versus other biochemical assays for comprehensive cell evaluations. The study concludes that observed changes in cell behavior could hint at possible toxicity induced upon exposure&#160;to MOFs of different physicochemical characteristics and the dosage of those frameworks being used. By understanding changes in cell behavior, one foresees the ability to improve safe-by-design strategies of MOFs to be used for biomedical applications by specifically tailoring their physicochemical characteristics.

Autore in primo piano: Progressi nella valutazione della risposta delle cellule epiteliali polmonari umane alle strutture metallo-organiche 

The following study evaluates the toxicological profile of a selected metal-organic framework utilizing electric cell-substrate impedance sensing (ECIS), a real-time, high-throughput screening technique.

Rilevamento elettrico cellula-substrato per la valutazione in tempo reale dei profili tossicologici della struttura metallo-organica

Metal-organic frameworks (MOFs) are hybrids formed through the coordination of metal ions and organic linkers in organic solvents. The implementation of ...