Questo lavoro è stato supportato dal NCI Grants RO1CA157664 e RO1CA124515, e un premio Breast Cancer Alliance. Vorremmo ringraziare Jeffrey Faust, David Ambrose, e Scott Weiss dalla struttura Wistar Citometria a Flusso nucleo, James Hayden dalla struttura Wistar Imaging, e tutto il personale della Animal Fondo Wistar Institute per il loro prezioso supporto tecnico.

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dalla cura degli animali ed uso commissione Wistar Institute. 1. Generazione e manutenzione di topi transgenici <ol><li> Razza LSL-K-ras tm4Tyj 26 e Trp53 tm1Brn 27 (ottenuto da modelli murini di NCI consorzio cancro umano su uno sfondo misto) per un completo C57BL / 6 sfondo 28 backcrossing da almeno 10 generazioni con C57BL / 6 topi. Per tenere traccia di metastasi del tumore, razza B6.129X1-Gt (ROSA) 26Sor TM1 (EYFP) Cos / J (LSL-EYFP, ottenuto da The Jackson Laboratory a tempo pieno C57BL / 6 di fondo) con doppio transgenici LSL-K-ras G12D / + topi p53 loxP / loxP. Nota: topi transgenici LSL-K-ras G12D / + p53 loxP / loxP hanno siti loxP fiancheggiano un allele transcriptionally tacere di oncogeni K-ras e p53 locus endogeno, in modo che al momento escissione Cre-mediata, la sovraespressione di un oncogene K-ras mutante e ablazione di p53 è achieved. Nota: Il mouse LSL-EYFP contiene un codone di stop fiancheggianti un gene per la proteina migliorata giallo fluorescente (YFP) che sui risultati di escissione Cre-mediate nell&#39;espressione di YFP nei tessuti in cui la cassetta di arresto YFP viene asportato. <ol><li> Razza topi transgenici per ottenere LSL-K-ras G12D / + p53 topi loxP / loxP o LSL-K-ras G12D / + p53 loxP / loxP topi LSL-EYFP per preparazioni iniettabili intraduttali. Nota: I topi sono allevati come omozigote per p53 loxP / loxP e eterozigoti per LSL-K-ras G12D / + perché i topi con delezione omozigote di K-ras muoiono in utero. Utilizzare femmine vergini ingenue almeno sei settimane per preparazioni iniettabili intraduttali. Nota: I primer per la genotipizzazione omozigote floxed p53 allele sono p53 - T010-FWD (5&#39;-AAGGGGTATGAGGGACAAGG-3 &#39;) e p53-T011-rev (5&#39;-GAAGACAGAAAAGGGGAGGG-3&#39;). Essi producono un tipo di allele selvaggio a 391 bp e il p53 floxed allele a 461 bp 29,30. Nota: I primer per rilevare la forma mutante di K-ras sono oIMR8273 (5&#39;-CGCAGACTGTAGAGCAGCG-3 &#39;) e oIMR8274 (5&#39;-CCATGGCTTGAGTAAGTCTGC-3&#39;). Essi producono la band mutante rilevato a 600bp. Nota: Per i YFP giornalista triple topi transgenici, gli inneschi per rilevare la cassetta ROSA (5&#39;-AAGACCGCGAAGAGTTTGTC-3 &#39;), il tipo selvatico allele (5&#39;-GGAGCGGGAGAAATGGATATG-3&#39;), e un allele comune (5&#39;-AAAGTCGCTCTGAGTTGTTAT -3 &#39;) comporterà l&#39;amplificazione delle bande a 320 bp per l&#39;allele floxed e 600 bp per l&#39;allele selvatico. </li></ol></li></ol> 2. Preparazione chirurgica <ol><li> Materiali chirurgici puliti con il 75% EtOH e autoclave prima e dopo tutte le iniezioni. </li><li> Eseguire un intervento chirurgico su un banco da laboratorio pulito ordinato in una stanza sterilizzata all&#39;interno di una struttura animale. Pulire tutte le superfici, tra cui lo stadio e quadranti del microscopio operatorio con una soluzione disinfettante ad ampio spettro seguita dal 75% EtOH. </li><li> Pesare e anestetizzare topi mediante iniezione intraperitoneale di una miscela di ketamina (80-100 mg / kg) e xilazina (8-10 mg / kg) in soluzione fisiologica sterile. </li><li> Posizionare delicatamente topi nelle loro gabbie indisturbato per 5 minuti, mentre vanno sotto anestesia. Durante questo tempo generare precipitati virus (vedi protocollo 3). </li><li> Verificare la mancanza di risposta al dolore da pizzicare punta. Coprire delicatamente gli occhi dei topi anestetizzati con pomata veterinaria per evitare un eccessivo essiccamento della cornea. </li><li> Per prevenire l&#39;ipotermia, posizionare i topi anestetizzati su una piastra elettrica impostata su fuoco basso durante la procedura chirurgica e fino a che non iniziano a recuperare. </li><li> Per la gestione del dolore, amministrano i topi Meloxicam per via sottocutanea a 1 mg / kg prima della chirurgia e 24 ore dopo. </li></ol> 3. Generazione di precipitati virus ATTENZIONE: vettori Adenovirus, anche se sono stati modificati e sono in grado di replicare, comportano il rischio diinfezione. Maneggiare con cautela adenovirus. Tutto il personale deve essere adeguatamente addestrati secondo le linee guida dell&#39;ente per la manipolazione di agenti BSL2 Dopo l&#39;iniezione intraduttale, disporre di adenovirus in conformità alle linee guida BSL2. <ol><li> Il negozio adenovirus concentrate le riserve di virus a -80 ° C in aliquote congelate di 4 x 10 8 pfu ciascuna, sufficiente per iniettare 16 animali con 3 ml di 2,5 x 10 7 pfu di particelle di adenovirus. </li><li> Conservare aliquote adenovirus su ghiaccio secco fino a circa 15-20 minuti prima di iniziare le iniezioni. Nota: Evitare ripetuti cicli di congelamento e scongelamento, come titolo del virus diminuisce notevolmente tra un ciclo. Nota: precipitati Adenovirus sono formate modificando un protocollo descritto in precedenza 31. </li><li> Ricostituire 504 mg di MEM polvere con 50 ml di acqua grado molecolare sterile, supplemento con 244 mg di bicarbonato di sodio e il filtro in condizioni sterili e conservare a 4 ° C. <ol> &lt;li&gt; Preparare la soluzione di cloruro di calcio con l&#39;aggiunta di 1,5 g di cloruro di calcio a 50 ml di acqua ultrapura e filtro in condizioni sterili e conservare a 4 ° C. </li><li> Mescolare aliquote contenenti 4 x 10 8 pfu adenovirus-Cre con sufficiente 3% saccarosio in acqua sterile per un volume finale di 10 ml. Aggiungere 34 ml di MEM al virus e mescolare delicatamente. Poi aggiungere 4 ml di soluzione di CaCl 2, mescolare delicatamente e incubare a temperatura ambiente per 15-20 min. </li><li> Conservare adenovirus in ghiaccio secco fino al momento di formare precipitati. Evitare scongelamento del adenovirus e memorizzazione su ghiaccio oa temperatura ambiente per tempi prolungati, salvo si formano precipitati. Nota: È inoltre possibile mescolare il saccarosio, MEM e CaCl 2 prima degli interventi chirurgici se non è possibile scongelare l&#39;aliquota adenovirus e cominciare a fare precipita immediatamente dopo la rimozione da -80 ° C. Tale aliquota di saccarosio, MEM, e calcio può essere salvata in ghiaccio secco fino al momento di aggiungere l&#39;adenovirus. Nota: Le particelle virali sono stabili per circa 1 ora. </li><li> Prima di ogni iniezione, sfiora delicatamente il tubo per assicurarsi che le particelle virali sono mescolati. Elaborare 3 ml (2.5 x 10 7 PFU) di particelle virali nella siringa 10 ml e preparare il mouse per l&#39;iniezione intraduttale. </li></ol></li></ol> 4. Iniezione intraduttale di particelle virali <ol><li> Inserire delicatamente il mouse sulla sua schiena sul palco illuminato di un microscopio dissezione pulito. Illuminare la parte addominale con una fonte di luce e di individuare la partita 4 ° o 9 ° a destra della ghiandola mammaria inguinale dalle piccole macchie bianche di pelo (visibili sul C57BL / 6 femmine) che circondano ogni capezzolo. </li><li> Strofinare il capezzolo delicatamente con una sterile etanolo cotone imbevuto con punta applicatore per eliminare i capelli lontano dal capezzolo e di sterilizzare il sito di iniezione. Se sono difficili da individuare, applicare delicatamente uno spesso strato di cesoie una crema depilatoria o utilizzare per esporre i capezzoli. </li&gt; <li> Rimuovere il tappo di cheratina, uno strato di cellule morte densi, che copre il capezzolo. Una volta che il capezzolo è esposta, la spina cheratina deve essere facilmente visibili al microscopio di dissezione. </li><li> Fissare il capezzolo con ammenda pinze chirurgiche e tirare con forza la luce per staccare la spina cheratina. </li><li> Stabilizzare il capezzolo tra le pinze. </li><li> Inserire delicatamente l&#39;ago tra le pinze, cannulating il canale condotto a 90 °. Inserire il capezzolo leggermente oltre la smussatura dell&#39;ago (non più di 2 mm) per impedire la penetrazione attraverso il tessuto mammario e nelle membrane sierose della cavità corporea ventrale. <ol><li> Non inserire l&#39;ago troppo profonda. Per assicurare una corretta profondità di iniezione, estrarre delicatamente l&#39;ago dopo averlo inserito nel lume del condotto, disegnando il capezzolo lungo i bordi del dell&#39;ago come viene estratto. Nota: Visualizzazione del iniezione è difficile, quindi practice per questa fase è consigliabile usare trypan blu. </li></ol></li><li> Quando l&#39;ago è opportunamente posizionato nel condotto mammaria, rilasciare i 3 ml di precipitati virus (2,5 x 10 7 pfu di adenovirus-Cre) immergendo delicatamente la siringa con il pollice della mano che impugna la siringa. Il capezzolo deve gonfiare un po &#39;come si aggiunge il liquido. </li></ol> 5. Recupero dei topi <ol><li> Posizionare il mouse indietro sul pad di riscaldamento dopo l&#39;iniezione fino a quando non comincia a recuperare dall&#39;anestesia. </li><li> Una volta che il mouse viene recuperato, riposizionarlo in una gabbia pulita e monitor per il pieno recupero e movimento. </li><li> 24 ore dopo l&#39;iniezione intraduttale, per via sottocutanea amministrare meloxicam a 1 mg / kg. </li></ol> 6. Tumore Monitoring Progressione <ol><li> Palpare la ghiandola mammaria iniettato a 30 giorni per l&#39;allargamento e gonfiore. <ol><li> Monitorare la progressione del tumore ogni 5-7 giorni una volta al Glan mammaria gonfia e allargatad si osserva. </li></ol></li><li> Misurare volumi del tumore ogni 3-4 giorni per la cinetica di crescita del tumore una volta tumori palpabili appaiono (iniezione di circa 50-60 giorni dopo adenoviral). </li><li> Euthanize topi quando volumi del tumore superano il 10% del peso corporeo dei topi. </li></ol>

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Gli autori dichiarano interessi finanziari concorrenti.

Il successo di questa procedura dipende da tecnica corretta durante le iniezioni intraduttale, che sarà difficile per sperimentatori non addestrato. Ricercatori esperti nel nostro laboratorio in genere ottengono seno masse tumorali 79% delle volte amministrano le iniezioni adenovirali. I problemi con l&#39;iniezione può causare significativo ritardo, variabile, o lo sviluppo del tumore assente. Se l&#39;ago viene inserito troppo in profondità o in un angolo inadeguato, il canale duttale può perdere. È importante immettere il capezzolo leggermente oltre la smussatura dell&#39;ago (non più di 2 mm), per impedire la penetrazione attraverso il tessuto mammario e nelle membrane sierose della cavità corporea ventrale. Inoltre, troppo superficiale posizionamento dell&#39;ago o l&#39;iniezione di maggiore di 3 ml di precipitati virus può causare fuoriuscite di preparazione virale di fuori della ghiandola mammaria e l&#39;induzione di tumori non intenzionali. Un modo per superare questi problemi è quello di inserire l&#39;ago nel capezzolo leggermente deeper a 3 mm, e lentamente disegnare la siringa backup dal condotto fino a 2 mm dalla punta del bisello. Questo farà sì che il tessuto mammario si rivolge invece del muscolo che circonda la cavità peritoneale di topi (Figura 1A). Ciò inoltre allungare il capezzolo lungo i bordi della siringa in modo che quando il virus viene espulso nel condotto, non c&#39;è fuoriuscita e perdita di precipitati virali. Visualizzazione dell&#39;iniezione è difficile e pratica per questo passaggio è consigliato. Abbiamo osservato un aumento iniezioni successo seguente pratica, con un conseguente penetranza superiore dello sviluppo del tumore. Poiché questa tecnica utilizza seno che non femmine vergini, è fondamentale per staccare la spina cheratina che copre il capezzolo per rivelare il canale condotta sottostante. Si consiglia di praticare questo passo iniettando trypan blu o qualche altro colorante tracciabile sterile all&#39;interno del condotto e preparare interi monti mammarie per confermare il targeting del tr duttaleee. Inoltre, altri protocolli che descrivono intraduttale iniezione di reagenti sono stati pubblicati 33,34, che può essere utile per sviluppare la tecnica corretta. Problemi con la preparazione virale o infezione del lume duttale possono essere indagati utilizzando un adenovirus che esprime mCherry. Topi nontransgenic possono essere usati per ciascuna delle finalità finché la tecnica di iniezione è ottimizzata. Sebbene qualsiasi ghiandola mammaria può essere utilizzato per avviare tumori, abbiamo raggiunto i tassi di crescita più consistenti mirando ghiandola mammaria 4 o 9, che riteniamo sia perché è più facile effettuare iniezioni corrette su queste ghiandole, con conseguente più efficiente mirati gli dotto. La vicinanza della sinistra 4 ° o destro 9 th inguinali ghiandole mammarie al linfonodo inguinale drenante è anche utile esaminare antitumorali risposte immunitarie durante diversi punti temporali di progressione tumorale. Per modellare e monitorare metastasi latente siti distali, ttopi ransgenic sono stati incrociati con i topi LSL-EYFP. Come il tumore progredisce, vascolarizzazione collega il tumore al linfonodo ascellare viene leggermente gonfio a circa 5 settimane prima che il tumore comincia a crescere in modo esponenziale (Figura 3A). Alla fine, dopo 7-8 settimane, invasione linfovascolare provocherà crescita tumorale all&#39;interno linfonodi ascellari (Figure 3A e 3B). Utilizzando topi transgenici e la tecnologia Cre-loxP, incorporazione di YFP crea una piattaforma per monitorare le cellule tumorali metastatizzanti ai siti distali tutta la progressione del tumore. Questo può facilitare gli studi volti a chiarire i meccanismi cellulari e epigenetici che promuovono la metastasi latente. Nelle nostre mani, linee cellulari tumorali della mammella espressi citocheratina-8, mesothelin, recettore estrogeno-α, e Her2/neu, confermando il targeting dell&#39;epitelio duttale. Tuttavia, a seconda delle mutazioni indotte e per la difficoltà e la variabilità delle iniezioni, si consigliacaratterizzazione istologica dei tumori una volta che il modello è ben consolidata in laboratorio. Poiché il cancro al seno è una malattia mortale e penetrante 1,2, è importante utilizzare modelli animali che ricapitolano precisione la complessa interazione tra tumore ed ospite. Qui si descrive completamente reincrociata C57BL / 6 modello murino di tumore al seno. In primo luogo, inducendo tumori da cellule native, lasciamo che il tumore di evolversi naturalmente in un microambiente immune completo. Il microambiente immune nei tumori avanzati seno di topo ricapitola le popolazioni di αβ e γδ cellule T, cellule mieloidi soppressori derivate e macrofagi comunemente osservati nel carcinoma mammario umano (Figura 4). Come abbiamo pubblicato in precedenza utilizzando adenovirus-Cre di indurre tumori ovarici, abbiamo scoperto che l&#39;iniezione virale ha avuto un effetto trascurabile sui corrispondenti infiltrati del tumore e la progressione del tumore 28. In secondo luogo, endocrino indipendenteespressione di oncogeni assicura che le cellule tumorali hanno persistentemente alti livelli di espressione del gene bersaglio. Terzo, sfruttando mutazioni latenti, possiamo controllare la temporizzazione della tumorigenesi facilitare preciso tracciamento temporale dell&#39;evoluzione tumorale. Le applicazioni di questo modello comprendono la ricerca sulla biologia delle cellule tumorali, studi sui fattori del microambiente tumorale, anti-tumorali risposte immunitarie, e anche la valutazione di efficacia di nuove terapie. Attraverso la disponibilità del sistema Cre-loxP, questa tecnica può essere utilizzata come una piattaforma per indagare una gamma diversificata di ulteriori mutazioni nell&#39;iniziazione e progressione dei tumori al seno. Speriamo che l&#39;uso di questo modello migliorerà la comprensione della biologia del cancro al seno e condurre a nuove terapie volte a trattamento del cancro al seno metastatico.

A correction was made to <a href="/video/51171">Initiation of Metastatic Breast Carcinoma by Targeting of the Ductal Epithelium with Adenovirus-Cre: A Novel Transgenic Mouse Model of Breast Cancer</a>. Protocol sections 3.1, 3.3.2, 3.4, and 4.7 were updated. The materials table was also updated.
Protocol section 3.1 was updated from:
3.1) Store adenovirus concentrated virus stocks at -80&#176;C frozen in aliquots of 4 x 108 pfu each, sufficient for injecting 16 animals with 3 ml of 2.5 x 107 pfu of adenovirus particles.
to:
3.1) Store adenovirus concentrated virus stocks at -80&#176;C frozen in aliquots of 4 x 108 pfu each, sufficient for injecting 16 animals with 3 &#181;l of 2.5 x 107 pfu of adenovirus particles.
Protocol section 3.3.2 was updated from:
Mix aliquots containing 4 x 108 pfu adenovirus-Cre with sufficient 3% sucrose in sterile water for a final volume of 10 ml. Add 34 ml of MEM to the virus and gently mix. Then add 4 ml of the CaCl2 solution, gently mix, and incubate at room temperature for 15-20 min.
to:
Mix aliquots containing 4 x 108 pfu adenovirus-Cre with sufficient 3% sucrose in sterile water for a final volume of 10 &#181;l. Add 34 &#181;l of MEM to the virus and gently mix. Then add 4 &#181;l of the CaCl2 solution, gently mix, and incubate at room temperature for 15-20 min.
Protocol section 3.4 was updated from:
Prior to each injection, gently flick the tube to make sure virus particles are mixed. Draw up 3 ml (2.5 x 107 pfu) of virus particles into the 10 ml syringe and prepare the mouse for the intraductal injection.
to:
Prior to each injection, gently flick the tube to make sure virus particles are mixed. Draw up 3 &#181;l (2.5 x 107 pfu) of virus particles into the 10 &#181;l syringe and prepare the mouse for the intraductal injection.
Protocol section 4.7 was updated from:
When the needle is appropriately placed into the mammary duct, release the 3 ml of virus precipitates (2.5 x 107 pfu of adenovirus-Cre) by gently plunging the syringe with the thumb of the hand holding the syringe. The nipple should slightly inflate as the liquid is added.
to:
When the needle is appropriately placed into the mammary duct, release the 3 &#181;l of virus precipitates (2.5 x 107 pfu of adenovirus-Cre) by gently plunging the syringe with the thumb of the hand holding the syringe. The nipple should slightly inflate as the liquid is added.
Item 15 in the Materials table under Comments was updated from:
10ml syringe, RN series Autoclave before and after each use. Clean with PBS and 75% ethanol.
to:
10&#181;l syringe, RN series Autoclave before and after each use. Clean with PBS and 75% ethanol.

A correction was made to <a href="/video/51171">Initiation of Metastatic Breast Carcinoma by Targeting of the Ductal Epithelium with Adenovirus-Cre: A Novel Transgenic Mouse Model of Breast Cancer</a>. Protocol sections 3.1, 3.3.2, 3.4, and 4.7 were updated. The materials table was also updated.

Erratum: Initiation of Metastatic Breast Carcinoma by Targeting of the Ductal Epithelium with Adenovirus-Cre: A Novel Transgenic Mouse Model of Breast Cancer

Il carcinoma della mammella è il tumore maligno più comunemente si verificano in donne in tutto il mondo, 1,2 e la seconda causa di decessi per cancro 2. Complesso genetica 3,4, istologiche 5, e fenotipi clinici 6 sono utilizzati per caratterizzare i vari sottotipi di cancro al seno e spesso sono utilizzati come mezzo per predire la sopravvivenza. Analisi di un&#39;ampia coorte di donne con tumore al seno ha indicato che la maggior parte (circa l&#39;80%) dei pazienti che sono morti avevano recidivato entro 10 anni rimozione postale del tumore primario 7. Per la maggior parte dei carcinomi mammari invasivi, invasione linfovascolare ha dimostrato di essere fortemente correlata ad una prognosi sfavorevole e decorso clinico più aggressivo della malattia 8. A causa della complessità genetica e fenotipica di cancro al seno, non esiste un modello animale che riassume l&#39;intero corso della malattia. Linee di cellule tumorali mammarie umane sono state spessoutilizzato come xenotrapianto o ortotopici 9 modelli di carcinoma mammario invasivo e metastatico in topi immunodeficienti. Sebbene informativo, questi modelli si verificano in assenza di pressione immunitario e perché è una specie innesto croce, distorcere gli effetti dell&#39;intero microambiente tumorale. Mutazioni genetiche inducibili guidati da specifici promotori mammarie come il virus murino di tumore mammario (MMTV) e siero proteina acida (WAP) hanno contribuito con un enorme quantità di conoscenze circa la natura genetica di cancro al seno. Tuttavia, l&#39;espressione tessuto specifica di questi promotori è compromessa dalla loro reattività al sistema endocrino 10-16, causando la variabile espressione di mutazioni genetiche indotte che non rispecchiano l&#39;espressione di oncogeni tipicamente overexpressed nel cancro al seno umano. Per superare il controllo endocrino di espressione MMTV guidato di oncogeni, Moody et al. Ha generato una, doxiciclina modello inducibile condizionale sovraespressione Neu nel senoepitelio 17. Questo modello è utile per deinducing Neu dopo la formazione del tumore a studiare la regressione e la ricorrenza, ma richiede la somministrazione di doxiciclina costante per coerenza, l&#39;espressione dell&#39;oncogene-lungo termine. Una discussione completa dei tanti modelli di tumore al seno pertinenti disponibili può essere trovata nella recensione di Vargo-Gogola et al. 10 Il nostro obiettivo era di sviluppare un modello murino di cancro al seno tracciabile su un pieno C57BL / 6 di fondo che, dopo l&#39;induzione permanente degli eventi mutazionali modelli, la formazione di un tumore nascente in presenza di pressione immunitario. Abbiamo introdotto un adenovirus che esprimono Cre-ricombinasi nei dotti mammari di topi transgenici contenenti alleli floxed di TP53 e una forma oncogenica di K-ras e YFP. Espressione Cre ablates Tp53, un gene frequentemente mutato in molti cancri al seno 18 e induce un allele oncogenica di K-ras oltre alla espressione YFP specificamentenell&#39;epitelio duttale mammario. Sebbene mutazioni in K-ras sono frequenti nel cancro al seno, che si verificano solo nel 6,5% dei pazienti con carcinoma mammario 19,20, la sovraespressione della chinasi a monte come Her2/neu e EGFR risultato in attivazione costitutiva della via di segnalazione Ras nei tumori della mammella umani 21-23. L&#39;attivazione della via di segnalazione di Ras in molte linee cellulari tumorali della mammella è stata riportata anche 24,25. Descriveremo l&#39;avvio della formazione del tumore e la tecnica di iniezione intraduttale di un adenovirus che esprimono Cre-ricombinasi in sessualmente maturi, vergini topi femmina. Questo modello di cancro al seno si sviluppa lesioni evidenti che crescono in modo esponenziale dopo circa 8 settimane di progressione del tumore lento, con l&#39;invasione linfovascolare e metastasi a linfonodi ascellari da 7-8 settimane. Poiché questi topi sono su un pieno C57BL / 6 di fondo e le cellule tumorali che esprimono YFP sono rintracciabili in linfonodi distali, questo modello fornisce uno strumento rilevante per studiare la cemeccanismi llular e immunologici di metastasi latente e aiuteranno a sviluppare nuovi approcci terapeutici per il trattamento del carcinoma mammario duttale metastatico.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="825">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:251px;">Trp53tm1Brn transgenic mice 
			Krastm4Tyj transgenic mice</td>
			<td style="width:145px;">Obtained from NCI mouse models of human cancer consortium</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td style="width:289px;">Mice were backcrossed ten times to a full C57BL/6 background</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:251px;">B6.129X1-Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/J Transgenic mice</td>
			<td style="width:145px;">Jackson labs</td>
			<td style="width:141px;">006148</td>
			<td style="width:289px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:251px;">Primers p53loxp/loxp</td>
			<td style="width:145px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td style="width:289px;">5&#39;-AAGGGGTATGAGGGACAAGG-3&#39; 
			5&#39;-GAAGACAGAAAAGGGGAGGG-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:251px;">Primers LSL-K-ras G12D/+</td>
			<td style="width:145px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td style="width:289px;">5&#39;-CGCAGACTGTAGAGCAGCG-3&#39; 
			5&#39;-CCATGGCTTGAGTAAGTCTGC-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:251px;">Primers for LSL-EYFP to detect Rosa promoter</td>
			<td style="width:145px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td style="width:289px;">5&#39;-AAGACCGCGAAGAGTTTGTC-3&#39; 
			5&#39;-GGAGCGGGAGAAATGGATATG-3&#39; 
			5&#39;-AAAGTCGCTCTGAGTTGTTAT-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:251px;">Primers for detection of 
			Mesothelin expression</td>
			<td style="width:145px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td style="width:289px;">5&#39;-TTGGGTGGATACCACGTCTG-3&#39; 
			5&#39;-CGGAGTGTAATGTTCTTCTGTC-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:251px;">Primers for detection of 
			Progesterone Receptor expression</td>
			<td style="width:145px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td style="width:289px;">5&#39;-GCAATGGAAGGGCAGCATAA-3&#39; 
			5&#39;-TGGCGGGACCAGTTGAATTT-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:251px;">Primers for detection of 
			Cytokeratin 8 expression</td>
			<td style="width:145px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td style="width:289px;">5&#39;-ATCAGCTCTTCCAGCTTTTCCC-3&#39; 
			5&#39;-GAAGCGCACCTTGTCAATGAAGG-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:251px;">Primers for detection of 
			Erbb2 expression</td>
			<td style="width:145px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td style="width:289px;">5&#39;-ACCTGCCCCTACAACTACCT-3&#39; 
			5&#39;-AAATGCCAGGCTCCCAAAGA-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:251px;">Primers for detection of 
			Estrogen Receptor A expression</td>
			<td style="width:145px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td style="width:289px;">5&#39;-ATGAAAGGCGGCATACGGAA-3&#39; 
			5&#39;-GCGGTTCAGCATCCAACAAG-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:251px;">Primers for detection of 
			Estrogen Receptor B expression</td>
			<td style="width:145px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td style="width:289px;">5&#39;-ACCCAATGTGCTAGTGAGCC-3&#39; 
			5&#39;-TGAGGACCTGTCCAGAACGA-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:251px;">Primers for detection of 
			B-Actin expression</td>
			<td style="width:145px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td style="width:289px;">5&#39;-GCCTTCCTTCTTGGGTATGG-3&#39; 
			5&#39;-CAGCTCAGTAACAGTCCGCC-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:251px;">Adenovirus-CRE</td>
			<td style="width:145px;">Gene Transfer Vector Core from the University of Iowa</td>
			<td style="width:141px;">Ad5CMVCre</td>
			<td style="width:289px;">Store aliquots of virus (4 x 108 pfu/aliquot) at -80C to avoid repeated freeze thaw cycles</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:251px;">Adenovirus-mCherry</td>
			<td style="width:145px;">Gene Transfer Vector Core from the University of Iowa</td>
			<td style="width:141px;">Ad5CMVmCherry</td>
			<td style="width:289px;">Store aliquots of virus (4 x 108 pfu/aliquot) at -80C to avoid repeated freeze thaw cycles</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:251px;">Hamilton syringe</td>
			<td style="width:145px;">Hamilton company</td>
			<td style="width:141px;">701RN</td>
			<td style="width:289px;">10ml syringe, RN series 
			Autoclave before and after each use. Clean with PBS and 75% ethanol.</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:251px;">Custom needle</td>
			<td style="width:145px;">Hamilton company</td>
			<td style="width:141px;">7803-05</td>
			<td style="width:289px;">33 gauge 0.5 inch long RN needle, with a 12 degree bevel. Autoclave before and after each use. Clean with PBS and 75% ethanol.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:251px;">Surgical forceps</td>
			<td style="width:145px;">Dumont</td>
			<td style="width:141px;">52100-58</td>
			<td style="width:289px;">Dumostar No5 forceps. Clean with 75% ethanol after each use, followed by autoclaving</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:251px;">MEM powder</td>
			<td style="width:145px;">Cellgro</td>
			<td style="width:141px;">50 012 PB</td>
			<td style="width:289px;">Store at 4C in powder and reconstituted form</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:251px;">Sodium Bicarbonate</td>
			<td style="width:145px;">Fisher</td>
			<td style="width:141px;">S233</td>
			<td style="width:289px;">Add to MEM and filter stearilize</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:251px;">Calcium Chloride</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td style="width:141px;">C4901</td>
			<td style="width:289px;">Minimum 96%, anhydrous</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

initiation of metastatic breast carcinoma by targeting of the ductal epithelium with adenovirus-cre: a novel transgenic mouse model of breast cancer

Il cancro al seno è una malattia eterogenea che coinvolge interazioni cellulari complesse tra tumore e sviluppo sistema immunitario, eventualmente con conseguente crescita esponenziale tumorale e metastasi ai tessuti distali e il crollo di immunità anti-tumorale. Esistono molti modelli animali utili per studiare il cancro al seno, ma nessuno ricapitolano completamente la progressione della malattia che si verifica negli esseri umani. Al fine di ottenere una migliore comprensione delle interazioni cellulari che provocano la formazione di metastasi latente e riduzione della sopravvivenza, abbiamo generato un modello di topo transgenico inducibile di YFP esprimenti carcinoma duttale che si sviluppa dopo la maturità sessuale in topi immuno-competenti ed è guidato by coerente, espressione dell&#39;oncogene endocrino-indipendente. Attivazione di YFP, ablazione di p53, e l&#39;espressione di una forma oncogenica di K-ras è stato raggiunto con la consegna di un adenovirus che esprime Cre-ricombinasi nel condotto mammaria di sessualmente maturi, vergini topi femmina. Tumoricominciano ad apparire sei settimane dopo l&#39;inizio degli eventi oncogenici. Dopo tumori diventano evidenti, che progrediscono lentamente per circa due settimane prima di iniziare a crescere in modo esponenziale. Dopo 7-8 settimane post-iniezione di adenovirus, vascolare si osserva che collega la massa tumorale ai linfonodi distali, con eventuale invasione linfovascolare delle cellule tumorali YFP + ai linfonodi ascellari distali. Infiltranti popolazioni leucocitarie sono simili a quelli trovati nei carcinomi mammari umani, tra cui la presenza di cellule αβ e γδ T, macrofagi e MDSCs. Questo modello unico faciliterà lo studio dei meccanismi cellulari e immunologici coinvolti nella metastasi latente e dormienza oltre ad essere utile per la progettazione di nuovi interventi di immunoterapia per il trattamento di cancro mammario invasivo.

Successo il targeting dell&#39;albero duttale mammaria può essere visualizzato da preparare supporti interi della ghiandola mammaria come precedentemente descritto 32 dopo l&#39;iniezione di blu tripano (per verificare la corretta tecnica di iniezione (Figura 1A) o un adenovirus esprimere mCherry (per verificare la corretta preparazione virale e l&#39;infezione di cellule epiteliali duttali, Figura 1B). <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51171/51171fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51171/51171fig1.jpg" /> Figura 1. Intraduttale il targeting delle ghiandole mammarie per iniezione con trypan blu o adenovirus-mCherry. A) Un intero monte, come riportato in precedenza 32, della ghiandola mammaria dopo l&#39;iniezione di ghiandola mammaria # 4 con trypan blu è stato preparato 3 ore dopo l&#39;iniezione di visualizzare / conferma di mira l&#39;intero duttalealbero. Le immagini sono di zoom digitale 4X. B) L&#39;infezione dell&#39;epitelio duttale con adenovirus iniettando 2,5 x 10 7 pfu di adenovirus esprimere mCherry. I topi sono stati iniettati intraductally, e 4 giorni dopo l&#39;iniezione, un intero monte della ghiandola mammaria è stato preparato per confermare l&#39;infezione virale dell&#39;albero duttale. L&#39;immagine è 4X ingrandimento. MG è ghiandola mammaria, LD è il galattofori o condotto principale, e TD è il condotto terminale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51171/51171fig1highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita.</a> Quando i tumori sono indotti a p53 loxP / loxP LSL-K-ras G12D / + topi transgenici, i tumori non saranno evidenti fino a circa 40 giorni quando le ghiandole mammarie diventeranno allargata e gonfie. È necessario iniziare palpations quando questo si osserva, il monitoraggio della crescita tumorale ogni 5-7 giorni. Nelle nostre mani, indurimento della ghiandola mammaria precede sempre l&#39;inizio dello sviluppo del tumore. Tumori progredirà lentamente per altre 2 settimane. Inizio intorno al giorno 56, i tumori cominceranno a crescere in modo esponenziale (Figura 2B). A questo punto, è fondamentale per misurare volumi del tumore ogni 3 giorni se studi cinetici sono desiderati perché ci sarà leggera mouse variabilità mouse nella progressione tumorale, che è normale (Figure 2A e 3A). Grandi masse addominali saranno evidenti per giorno 80 (Figura 2A, 2B e 3A), dopo di che i topi dovrebbero essere sacrificati se tumori superare il 10% del loro peso corporeo. analisi cDNA di tre cloni da un topo portatore di tumore rivelato espressione di mesotelina, citocheratina-8, Her2/neu e recettore estrogeno-α (Figura 2C). <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51171/51171fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51171/51171fig2.jpg" /> &gt; Figura 2. Sviluppo del tumore p53 in loxP / loxP LSL-K-ras G12D / + topi iniettati intraductally con adenovirus-Cre. A) Due esempi di tumori 80 giorni dopo l&#39;iniezione con adenovirus che esprimono Cre. I topi sono stati dati 2,5 x 10 7 PFU di adenovirus esprimere Cre e 80 giorni dopo tumore-iniziazione, grandi masse palpabili possono essere visualizzati sporgente dal lato addominale dell&#39;animale. B) cinetica tumorali Tipica e periodicità palpazione per tumori indotti in p53 loxP / loxP LSL-K-ras G12D + / topi. C) Caratterizzazione di tre cloni cellulari tumorali derivate dallo stesso tumore omogeneizzato di un loxP p53 / loxP LSL-K-ras G12D / + mouse. RNA è stato estratto e cDNA sintetizzati per l&#39;analisi RT-PCR utilizzando primer specifici per β-actina, mesotelina, citocheratina-8, Her2/neu, recettore del progesterone, estrogeno-recettore α e β-recettore estrogeno.tps :/ / www.jove.com/files/ftp_upload/51171/51171fig2highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita. Simile al microambiente cellulare nel cancro al seno umano, abbiamo osservato infiltrazione di cellule T αβ e γδ nonché mieloidi derivate cellule soppressori e macrofagi nel tumore (Figura 4). Vascolare gocciolatoio a linfonodi ascellari inizierà a engorge prima tumori sono cresciuti fino a comprendere l&#39;intero tessuto mammario in cui è stata eseguita l&#39;iniezione (Figura 3A). Linfovascolare invasione e metastasi delle cellule tumorali possono essere rintracciati incrociando topi LSL-K-ras G12D / + p53 loxP / loxP con i topi LSL-EYFP. Dopo l&#39;escissione Cre-mediata, le cellule tumorali che esprimono YFP (alta e bassa), vengono rilevati nel tumore e possono essere ricondotte metastasi al drenaggio linfonodi ascellari (Figura 3B). Metastasi linfonodi ascellari distale è stata confermatada successo coltura di una linea di cellule tumorali da questo sito in un tumore-cuscinetto LSL-K-ras G12D / + p53 loxP / loxP mouse (dati non mostrati). <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51171/51171fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51171/51171fig3.jpg" /> Figura 3. Formazione di tumori e metastasi latente al linfonodo ascellare. A) Esempio di tre tumori avanzati della mammella con differenti velocità di progressione tumorale. Una massa solida, indicata dalla freccia, forme e cresce alla fine alla dimensione dell&#39;intero tessuto mammario addominale. Il tumore resta confinato al tessuto mammario e non si osserva per invadere e attaccare al muscolo che copre la cavità peritoneale. C&#39;è ingorgo evidente della vena epigastrica superficiale tra i linfonodi inguinali e ascellari, indicati con frecce bianche. Dopo 7-8 settimane, the linfonodo ascellare comincia a diventare allargata causa linfovascolare invasione delle cellule tumorali, indicato dalla freccia. B) metastasi delle cellule tumorali positive YFP può essere visualizzato nella linfonodi ascellari mediante citometria a flusso. Topi LSL-K-ras G12D / + p53 loxP / loxP LSL-EYFP sono stati usati per indurre tumori e l&#39;attivazione di YFP mediante consegna intraduttale di adenovirus-Cre. Per verificare l&#39;invasione linfovascolare delle cellule tumorali nel linfonodo ascellare, 80 giorni dopo l&#39;iniezione adenoviral, i linfonodi e degli organi indicati sono stati raccolti e colorate per i marcatori di linfociti ed esaminati per l&#39;espressione YFP. CL rappresenta non tumorali controlaterale drenante linfonodo. I risultati rappresentano gating sulle cellule tumorali negativi CD45, indicando le cellule tumorali stanno invadendo il linfonodi ascellari distale. Numeri rappresentano per cento YFP cellule positive dalla popolazione totale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51171/51171fig3highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere larg</a>Immagine er. <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51171/51171fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51171/51171fig4.jpg" /> Figura 4. Immune infiltra nei tumori della mammella di topi transgenici. Tumori al seno mouse sono stati omogeneizzati e colorate per CD45, CD3, γδTCR, CD11b e GR1. Numeri rappresentano per cento dei leucociti positivi intero tumore (63,5), totale CD3 + (46,7), totale CD3 negative (40.1), totale CD3 + γδ + (γδ cellule T, 13), CD3 + γδnegative (24), GR1 totale alta CD11b (MDSC, 28.6) e totali CD11b GR1 basse (macrofagi, 18.5). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51171/51171fig4highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita.</a> A causa della anatomia del mouse e tecnica di iniezioni intraduttale, troviamo il targeting of ghiandole mammarie 4 e 9 (Figura 5) produce i risultati più coerenti e iniezioni affidabili. Tuttavia, ogni ghiandola può essere mirata a seconda della preferenza del tecnico esegue l&#39;intervento chirurgico. <img alt="Figura 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51171/51171fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51171/51171fig5.jpg" /> Figura 5. Numerazione dei dotti mammari. Dotti mammari 4 e 9 sono evidenziati in rosso sul diagramma e indicato con le frecce sul mouse. Nelle nostre mani, abbiamo scoperto che le iniezioni sono più facili da eseguire su questi dotti mammari, però tutti gli altri tessuti mammari che abbiamo mirato i tumori sviluppate con cinetiche simili. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51171/51171fig5highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita.</a>

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Initiation of Metastatic Breast Carcinoma by Targeting of the Ductal Epithelium with Adenovirus-Cre: A Novel Transgenic Mouse Model of Breast Cancer

Attivazione di mutazioni latenti con adenovirus-Cre nei risultati mammarie sistema duttale in un carcinoma mammario metastatico clinicamente rilevante. Incorporazione di un promotore YFP consente di tenere traccia di cellule tumorali metastatiche distali. Questo modello è utile per studiare metastasi latente, immunità anti-tumorale, e per la progettazione di nuove immunoterapie per trattare il cancro al seno.

Avvio del carcinoma metastatico della mammella dalla Targeting del duttale con Adenovirus-Cre: A Novel modello di topo transgenico di cancro al seno

Breast cancer is a heterogeneous disease involving complex cellular interactions between the developing tumor and immune system, eventually resulting in ...

initiation-metastatic-breast-carcinoma-targeting-ductal-epithelium

Research

JoVE Journal

Medicine

23.1K Views.  Wistar Institute.  Attivazione di mutazioni latenti con adenovirus-Cre nei risultati mammarie sistema duttale in un carcinoma mammario metastatico clinicamente rilevante. Incorporazione di un promotore YFP consente di tenere traccia di cellule tumorali metastatiche distali. Questo modello è utile per studiare metastasi latente, immunità anti-tumorale, e per la progettazione di nuove immunoterapie per trattare il cancro al seno. 

Video: Initiation of Metastatic Breast Carcinoma by Targeting of the Ductal Epithelium with Adenovirus-Cre: A Novel Transgenic Mouse Model of Breast Cancer

An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

Recurrence of breast cancer often follows a long latent period in which there are no signs of cancer, and metastases may not become clinically apparent until many years after removal of the primary tumor and adjuvant therapy. A likely explanation of this phenomenon is that tumor cells have seeded metastatic sites, are resistant to conventional therapies, and remain dormant for long periods of time 1-4.
The existence of dormant cancer cells at secondary sites has been described previously as quiescent solitary cells that neither proliferate nor undergo apoptosis 5-7. Moreover, these solitary cells has been shown to disseminate from the primary tumor at an early stage of disease progression 8-10 and reside growth-arrested in the patients' bone marrow, blood and lymph nodes 1,4,11. Therefore, understanding mechanisms that regulate dormancy or the switch to a proliferative state is critical for discovering novel targets and interventions to prevent disease recurrence. However, unraveling the mechanisms regulating the switch from tumor dormancy to metastatic growth has been hampered by the lack of available model systems.
in vivo and ex vivo model systems to study metastatic progression of tumor cells have been described previously 1,12-14. However these model systems have not provided in real time and in a high throughput manner mechanistic insights into what triggers the emergence of solitary dormant tumor cells to proliferate as metastatic disease. We have recently developed a 3D in vitro system to model the in vivo growth characteristics of cells that exhibit either dormant (D2.OR, MCF7, K7M2-AS.46) or proliferative (D2A1, MDA-MB-231, K7M2) metastatic behavior in vivo . We demonstrated that tumor cells that exhibit dormancy in vivo at a metastatic site remain quiescent when cultured in a 3-dimension (3D) basement membrane extract (BME), whereas cells highly metastatic in vivo readily proliferate in 3D culture after variable, but relatively short periods of quiescence. Importantly by utilizing the 3D in vitro model system we demonstrated for the first time that the ECM composition plays an important role in regulating whether dormant tumor cells will switch to a proliferative state and have confirmed this in in vivo studies15-17. Hence, the model system described in this report provides an in vitro method to model tumor dormancy and study the transition to proliferative growth induced by the microenvironment.

An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

A modified 3-D in vitro system is presented in which growth characteristics of several tumor cell lines in reconstituted basement membrane correlate with the dormant or proliferative behavior of the tumor cells at a metastatic secondary site in vivo.

Un In Vitro Sistema per studio dormienza tumorale e l&#39;interruttore di crescita metastatica

Recurrence of breast cancer often follows a long latent period in which there are no signs of cancer, and metastases may not become clinically apparent ...

Ricerca

Medicina

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There is little knowledge about in situ, in vivo, tumor hypoxia during intracranial development of malignant brain tumors because of lack of efficient means to monitor it in these deep-seated orthotopic tumors. Bioluminescence imaging (BLI), based on the detection of light emitted by living cells expressing a luciferase gene, has been rapidly adopted for cancer research, in particular, to evaluate tumor growth or tumor size changes in response to treatment in preclinical animal studies. Moreover, by expressing a reporter gene under the control of a promoter sequence, the specific gene expression can be monitored non-invasively by BLI. Under hypoxic stress, signaling responses are mediated mainly via the hypoxia inducible factor-1&alpha; (HIF-1&alpha;) to drive transcription of various genes. Therefore, we have used a HIF-1&alpha; reporter construct, 5HRE-ODD-luc, stably transfected into human breast cancer MDA-MB231 cells (MDA-MB231/5HRE-ODD-luc). In vitro HIF-1&alpha; bioluminescence assay is performed by incubating the transfected cells in a hypoxic chamber (0.1% O2) for 24 hr before BLI, while the cells in normoxia (21% O2) serve as a control. Significantly higher photon flux observed for the cells under hypoxia suggests an increased HIF-1&alpha; binding to its promoter (HRE elements), as compared to those in normoxia. Cells are injected directly into the mouse brain to establish a breast cancer brain metastasis model. In vivo bioluminescence imaging of tumor hypoxia dynamics is initiated 2 wks after implantation and repeated once a week. BLI reveals increasing light signals from the brain as the tumor progresses, indicating increased intracranial tumor hypoxia. Histological and immunohistochemical studies are used to confirm the in vivo imaging results. Here, we will introduce approaches of in vitro HIF-1&alpha; bioluminescence assay, surgical establishment of a breast cancer brain metastasis in a nude mouse and application of in vivo bioluminescence imaging to monitor intracranial tumor hypoxia.

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

Bioluminescence imaging of hypoxia inducible factor-1&alpha; activity is applied to monitor intracranial tumor hypoxia development in a breast cancer brain metastasis mouse model.

In Imaging bioluminescenza in vivo di Dinamica Tumore ipossia di metastasi cerebrali cancro al seno in un modello murino

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There ...

Live Imaging of Drug Responses in the Tumor Microenvironment in Mouse Models of Breast Cancer

The tumor microenvironment plays a pivotal role in tumor initiation, progression, metastasis, and the response to anti-cancer therapies. Three-dimensional co-culture systems are frequently used to explicate tumor-stroma interactions, including their role in drug responses. However, many of the interactions that occur in vivo in the intact microenvironment cannot be completely replicated in these in vitro settings. Thus, direct visualization of these processes in real-time has become an important tool in understanding tumor responses to therapies and identifying the interactions between cancer cells and the stroma that can influence these responses. Here we provide a method for using spinning disk confocal microscopy of live, anesthetized mice to directly observe drug distribution, cancer cell responses and changes in tumor-stroma interactions following administration of systemic therapy in breast cancer models. We describe procedures for labeling different tumor components, treatment of animals for observing therapeutic responses, and the surgical procedure for exposing tumor tissues for imaging up to 40 hours. The results obtained from this protocol are time-lapse movies, in which such processes as drug infiltration, cancer cell death and stromal cell migration can be evaluated using image analysis software.

We describe a method for imaging response to anti-cancer treatment in vivo and at single cell resolution.

Vivo Imaging di risposte droga nel microambiente tumorale in modelli murini di cancro al seno

The tumor microenvironment plays a pivotal role in tumor initiation, progression, metastasis, and the response to anti-cancer therapies. Three-dimensional ...

Ultrasound Imaging-guided Intracardiac Injection to Develop a Mouse Model of Breast Cancer Brain Metastases Followed by Longitudinal MRI

Breast cancer brain metastasis, occurring in 30% of breast cancer patients at stage IV, is associated with high mortality. The median survival is only 6 months. It is critical to have suitable animal models to mimic the hemodynamic spread of the metastatic cells in the clinical scenario. Here, we are introducing the use of small animal ultrasound imaging to guide an accurate injection of brain tropical breast cancer cells into the left ventricle of athymic nude mice. Longitudinal MRI is used to assessing intracranial initiation and growth of brain metastases. Ultrasound-guided intracardiac injection ensures not only an accurate injection and hereby a higher successful rate but also significantly decreased mortality rate, as compared to our previous manual procedure. In vivo high resolution MRI allows the visualization of hyperintense multifocal lesions, as small as 310 &#181;m in diameter on T2-weighted images at 3 weeks post injection. Follow-up MRI reveals intracranial tumor growth and increased number of metastases that distribute throughout the whole brain.

A breast cancer brain metastasis mouse model is established with ultrasound imaging-guided intracardiac injection of MDA-MB231/Br-GFP cells. Development of multifocal intracranial metastases has been monitored longitudinally using high-resolution 9.4 T MRI.

Ultrasound Imaging guidata intracardiaca iniezione di sviluppare un modello murino di Breast Cancer metastasi cerebrali Seguito da longitudinale MRI

Breast cancer brain metastasis, occurring in 30% of breast cancer patients at stage IV, is associated with high mortality. The median survival is only 6 ...

Quantification of Breast Cancer Cell Invasiveness Using a Three-dimensional (3D) Model

It is now well known that the cellular and tissue microenvironment are critical regulators influencing tumor initiation and progression. Moreover, the extracellular matrix (ECM) has been demonstrated to be a critical regulator of cell behavior in culture and homeostasis in vivo. The current approach of culturing cells on two-dimensional (2D), plastic surfaces results in the disturbance and loss of complex interactions between cells and their microenvironment. Through the use of three-dimensional (3D) culture assays, the conditions for cell-microenvironment interaction are established resembling the in vivo microenvironment. This article provides a detailed methodology to grow breast cancer cells in a 3D basement membrane protein matrix, exemplifying the potential of 3D culture in the assessment of cell invasion into the surrounding environment. In addition, we discuss how these 3D assays have the potential to examine the loss of signaling molecules that regulate epithelial morphology by immunostaining procedures. These studies aid to identify important mechanistic details into the processes regulating invasion, required for the spread of breast cancer.

Quantification of Breast Cancer Cell Invasiveness Using a Three-dimensional 3D Model

This article provides detailed methodologies for the use of three-dimensional (3D) assays to quantify breast cancer cell invasion. Specifically, we discuss the procedures required to set up such assays, quantification, and data analysis, as well as methods to examine the loss of membrane integrity that occurs when cells invade.

Quantificazione del cancro al seno Cellula Invasività Utilizzando una tridimensionale (3D) Modello

It is now well known that the cellular and tissue microenvironment are critical regulators influencing tumor initiation and progression. Moreover, the ...

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial cells tend to lose hormone receptor expression. Widely used hormone receptor positive breast cancer cell lines are of limited relevance to the in vivo situation. Here, we describe an ex vivo model to study hormone action in the human breast. Fresh human breast tissue specimens from surgical discard material such as reduction mammoplasties or mammectomies are mechanically and enzymatically digested to obtain tissue fragments containing ducts and lobules and multiple stromal cell types. These tissue microstructures kept in basal medium without growth factors preserve their intercellular contacts, the tissue architecture, and remain hormone responsive for several days. They are readily processed for RNA and protein extraction, histological analysis or stored in freezing medium. Fluorescence activated cell sorting (FACS) can be used to enrich for specific cell populations. This protocol provides a straightforward, standard approach for translational studies with highly complex, varied human specimens.

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

We have developed a novel ex vivo model to study hormone action in the human breast. It is based on tissue microstructures isolated from surgical breast tissue specimens which preserve tissue architecture, intercellular interactions, and paracrine signaling.

Un<em&gt; Ex vivo</em&gt; Modello per studiare Hormone azione in seno umano

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial ...

Methods for Culturing Human Femur Tissue Explants to Study Breast Cancer Cell Colonization of the Metastatic Niche

Bone is the most common site of breast cancer metastasis. Although it is widely accepted that the microenvironment influences cancer cell behavior, little is known about breast cancer cell properties and behaviors within the native microenvironment of human bone tissue.We have developed approaches to track, quantify and modulate human breast cancer cells within the microenvironment of cultured human bone tissue fragments isolated from discarded femoral heads following total hip replacement surgeries. Using breast cancer cells engineered for luciferase and enhanced green fluorescent protein (EGFP) expression, we are able to reproducibly quantitate migration and proliferation patterns using bioluminescence imaging (BLI), track cell interactions within the bone fragments using fluorescence microscopy, and evaluate breast cells after colonization with flow cytometry. The key advantages of this model include: 1) a native, architecturally intact tissue microenvironment that includes relevant human cell types, and 2) direct access to the microenvironment, which facilitates rapid quantitative and qualitative monitoring and perturbation of breast and bone cell properties, behaviors and interactions. A primary limitation, at present, is the finite viability of the tissue fragments, which confines the window of study to short-term culture. Applications of the model system include studying the basic biology of&#160;breast cancer and other bone-seeking malignancies within the metastatic niche, and developing therapeutic strategies to effectively target breast cancer cells in bone tissues.

Protocols are described for studying breast cancer cell migration, proliferation and colonization in a human bone tissue explant model system.

Metodi per la coltura di femore umano espianti di tessuto di studio sul carcinoma della mammella cellulare colonizzazione della nicchia metastatico

Bone is the most common site of breast cancer metastasis. Although it is widely accepted that the microenvironment influences cancer cell behavior, little ...

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

High-grade serous ovarian cancer (HGSC), the cause of widespread peritoneal metastases, continues to have an extremely poor prognosis; fewer than 30% of women are alive 5 years after diagnosis. The omentum is a preferred site of HGSC metastasis formation. Despite the clinical importance of this microenvironment, the contribution of omental adipose tissue to ovarian cancer progression remains understudied. Omental adipose is unusual in that it contains structures known as milky spots, which are comprised of B, T, and NK cells, macrophages, and progenitor cells surrounding dense nests of vasculature. Milky spots play a key role in the physiologic functions of the omentum, which are required for peritoneal homeostasis. We have shown that milky spots also promote ovarian cancer metastatic colonization of peritoneal adipose, a key step in the development of peritoneal metastases. Here we describe the approaches we developed to evaluate and quantify milky spots in peritoneal adipose and study their functional contribution to ovarian cancer cell metastatic colonization of omental tissues both in vivo and ex vivo. These approaches are generalizable to additional mouse models and cell lines, thus enabling the study of ovarian cancer metastasis formation from initial localization of cells to milky spot structures to the development of widespread peritoneal metastases.

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

We outline a protocol that implements both in vivo and ex vivo approaches to study ovarian cancer colonization of peritoneal adipose tissues, particularly the omentum. Furthermore, we present a protocol to quantitate and analyze immune cell-structures in the omentum known as milky spots, which promote metastases of peritoneal adipose.

In vivo ed ex vivo approcci per studiare il cancro ovarico metastatico colonizzazione delle strutture Lattea Spot in peritoneale adiposo

High-grade serous ovarian cancer (HGSC), the cause of widespread peritoneal metastases, continues to have an extremely poor prognosis; fewer than 30% of ...

Utilization of the Soft Agar Colony Formation Assay to Identify Inhibitors of Tumorigenicity in Breast Cancer Cells

Given the inherent difficulties in investigating the mechanisms of tumor progression in vivo, cell-based assays such as the soft agar colony formation assay (hereafter called soft agar assay), which measures the ability of cells to proliferate in semi-solid matrices, remain a hallmark of cancer research. A key advantage of this technique over conventional 2D monolayer or 3D spheroid cell culture assays is the close mimicry of the 3D cellular environment to that seen in vivo. Importantly, the soft agar assay also provides an ideal tool to rigorously test the effects of novel compounds or treatment conditions on cell proliferation and migration. Additionally, this assay enables the quantitative assessment of cell transformation potential within the context of genetic perturbations. We recently identified peptidylarginine deiminase 2 (PADI2) as a potential breast cancer biomarker and therapeutic target. Here we highlight the utility of the soft agar assay for preclinical anti-cancer studies by testing the effects of the PADI inhibitor, BB-Cl-amidine (BB-CLA), on the tumorigenicity of human ductal carcinoma in situ (MCF10DCIS) cells.

Here, we document the use of the soft agar colony formation assay to test the effects of a peptidylarginine deiminase (PADI) enzyme inhibitor, BB-Cl-amidine, on breast cancer tumorigenicity in vitro.

Utilizzo del saggio soft Agar Colony Formazione per identificare inibitori di tumorigenicità in cellule di carcinoma mammario

Given the inherent difficulties in investigating the mechanisms of tumor progression in vivo, cell-based assays such as the soft agar colony formation ...

Systems Biology of Metabolic Regulation by Estrogen Receptor Signaling in Breast Cancer

With the advent of the -omics approaches our understanding of the chronic diseases like cancer and metabolic syndrome has improved. However, effective mining of the information in the large-scale datasets that are obtained from gene expression microarrays, deep sequencing experiments or metabolic profiling is essential to uncover and then effectively target the critical regulators of diseased cell phenotypes. Estrogen Receptor &#945; (ER&#945;) is one of the master transcription factors regulating the gene programs that are important for estrogen responsive breast cancers. In order to understand to role of ER&#945; signaling in breast cancer metabolism we utilized transcriptomic, cistromic and metabolomic data from MCF-7 cells treated with estradiol. In this report we described generation of samples for RNA-Seq, ChIP-Seq and metabolomics experiments and the integrative computational analysis of the obtained data. This approach is useful in delineating novel molecular mechanisms and gene regulatory circuits that are regulated by a particular transcription factor which impacts metabolism of normal or diseased cells.

Integration of data from genome-wide sequencing experiments and metabolomics experiments is a challenge. In this paper we report, for the first time, generation, analysis and integration of transcriptome, cistrome and metabolome data from breast cancer cells treated with estradiol.

Systems Biology di regolazione metabolica da Estrogen Receptor Signaling nel cancro al seno

With the advent of the -omics approaches our understanding of the chronic diseases like cancer and metabolic syndrome has improved. However, effective ...