Name: measuring the effects of bacteria on c. elegans behavior using an egg retention assay
Uploaded: 2013-10-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 36 s
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Gli autori desiderano ringraziare giugno Middleton per la fornitura di E. ceppi faecalis e di orientamento con coltura batterica. C. elegans sono stati forniti dal CGC, che è finanziato dal NIH Ufficio Programmi di un&#39;infrastruttura di ricerca (P40 OD010440).

1) Preparazione di nematodi Crescita media (NGM) <ol><li> Per fare 50 piatti, aggiungere 1,5 g di NaCl, 8,5 g Ultrapure Agar, e 1,25 g peptone a un 1 Lflask. </li><li> Aggiungere 487,5 ml di dH 2 O a pallone. Agitare delicatamente per mescolare e coprire l&#39;apertura del pallone con un pezzo di foglio di alluminio. </li><li> Sterilizzare la soluzione in autoclave a condizioni standard (121 psi, 120 ° C, 20 min). </li><li> Lasciar raffreddare la soluzione a 45 ° C in un bagno d&#39;acqua. </li><li> Per la soluzione, aggiungere quanto segue in ordine: colesterolo 500 microlitri di una 5 mg / ml soluzione madre (disciolto in etanolo), 500 microlitri 1 M CaCl 2, 500 ml 1 M MgSO4, e 12,5 ml KPO 4 tampone (54.15 g KH 2 PO 4 e 17,8 g di K 2 HPO 4 in 500 ml di dH 2 O), come descritto in 18. </li><li> Usando pipette sterili, aggiungere 10 ml di soluzione di agar per ogni polistirolo piastra di Petri di 60 mm. Lasciare i supporti a solidificare a temperatura ambiente overnight. </li></ol> 2) Preparazione di B Brodo E. coli media <ol><li> Per fare cinque culture 100 ml, aggiungere 5,0 g di Bacto Tryptone, 2,5 g di estratto di lievito, 5,0 g di NaCl in un recipiente. </li><li> Aggiungere sterile, acqua distillata fino ad un volume finale di 500 ml. Riscaldare la soluzione su una piastra calda, mescolando, finché i soluti sono dissolti. </li><li> Versare 100 ml di brodo B in cinque bottiglie di vetro (almeno 200 ml di volume). </li><li> Sterilizzare le soluzioni in autoclave a condizioni standard (121 psi, 120 ° C, 20 minuti). </li><li> Lasciare B brodo raffreddare a temperatura ambiente prima dell&#39;uso. </li></ol> 3) Semina C. elegans Piastre di manutenzione <ol><li> Dopo aver lasciato piastre NGM ad asciugare a temperatura ambiente per almeno una settimana, inoculare un 100 ml di brodo di coltura B con alcune colonie di E. coli (OP50). </li><li> Crescere E. coli coltura a 37 ° C per una notte. </li><li> Pipetta di one-two gocce (circa 10081; l) di OP50 cultura sul centro di ciascuna piastra NGM. Le piastre sono in genere accatastati coperchio verso l&#39;alto. Quando pipettaggio (semina), iniziare pipettando cultura sulla piastra in fondo alla pila. Il tuo lavoro su ogni pila. Cercare di non spostare le piastre dopo la semina, poiché è importante che la cultura non diventi troppo vicino ai bordi della lastra. </li><li> Lasciare le piastre seminate ad asciugare a temperatura ambiente per almeno una settimana prima di utilizzare. </li><li> Piastre seminate sono memorizzati (invertita) in contenitori di plastica sigillati a temperatura ambiente. </li></ol> 4) Il mantenimento di C. elegans Ceppi <ol><li> Per mantenere ben nutrito C. scorte elegans, un verme usano scegliere di spostare tre L4S o adulti gravide di una nuova, testa di serie NGM piastra ogni 3-4 giorni. </li><li> Conservare le piastre (invertito) preferibilmente all&#39;interno di un incubatore a 15 - 22 ° C. Culture in saggi descritti sono stati conservati a 20 ° C. C. sviluppo elegans è dipendente dalla temperatura. Come maintenance temperatura aumenta, il tempo tra fasi di sviluppo diminuisce. </li></ol> 5) Preparazione di Tryptic Soy Agar (TSA) E. faecalis cultura mediatica <ol><li> Per fare 50 piastre, misurare 500 ml di acqua distillata sterile in un pallone e portare ad ebollizione, mescolando, su una piastra. </li><li> Aggiungere 20 g di polvere di agar TSA a pallone e permettere la soluzione di sciogliere. </li><li> Sterilizzare le soluzioni in autoclave a condizioni standard (121 psi, 120 ° C, 20 minuti). </li><li> Lasciar raffreddare la soluzione a 45 ° C in un bagno d&#39;acqua. </li><li> Usando pipette sterili, aggiungere 10 ml di soluzione di agar per ogni polistirolo piastra di Petri di 60 mm. Lasciare i supporti a solidificare a temperatura ambiente per una notte. </li></ol> 6) Preparazione di Tryptic Soy Broth (TSB) E. faecalis cultura mediatica <ol><li> Per fare 250 provette di coltura, misurare 500 ml di acqua distillata sterile in un pallone e caldo su una piastra mescolando. </li&gt; <li> Aggiungere 15 g di agar-agar in polvere TSB al pallone e lasciare che la polvere si dissolva. </li><li> Sterilizzare le soluzioni in autoclave a condizioni standard (121 psi, 120 ° C, 20 minuti). </li><li> Lasciare raffreddare la soluzione a temperatura ambiente, poi pipetta 2 ml in provette, 5 ml sterili. </li></ol> 7) Preparazione di Brain Heart Infusion (BHI) media, con streptomicina, per E. faecalis Cultura <ol><li> Misurare 500 ml di acqua distillata sterile in un pallone e portare ad ebollizione, mescolando, su una piastra. </li><li> Aggiungere 26 g di BHI mezzo al pallone e riportare la soluzione a sciogliere. </li><li> Sterilizzare le soluzioni in autoclave a condizioni standard (121 psi, 120 ° C, 20 minuti). </li><li> Lasciare raffreddare la soluzione a 45 ° C in un bagno d&#39;acqua. </li><li> Usando una tecnica sterile, aggiungere 0,5 ml di una soluzione madre e mescolare streptomicina 10 mg / ml. </li><li> Aggiungere 10 ml della soluzione di polistirene ogni piastra di Petri di 60 mm. </li><li&gt; Consenti supporto a solidificare a temperatura ambiente per una notte. Conservare le piastre (invertito) a 4 ° C fino a poche ore prima dell&#39;uso. </li></ol> 8) Il mantenimento di E. faecalis <ol><li> Per mantenere E. scorte faecalis, usano un&#39;ansa sterile per striatura singole colonie su agar piatti separati di soia triptici (TSA). </li><li> Grow culture a 37 ° C durante la notte. Memorizzare piastre (invertito) in un sacchetto sigillato o scatola a temperatura ambiente per diverse settimane. </li></ol> 9) Preparazione E. Piastre faecalis per EIW Assay <ol><li> Seminare una cultura ml 2 TSB con una colonia di E. faecalis e incubare una notte a 37 ° C. </li><li> Pipettare 20 ml di E. cultura faecalis sul centro di una piastra BHI-streptomicina preparata, e incubare una notte a 37 ° C. </li></ol> 10) Preparazione E. Piastre coli per EIW Assay (placche di comando) <ol><li> Seminare una ml B-bro 100Th cultura con una colonia di E. coli OP50 e incubare una notte a 37 ° C </li><li> Pipettare 20 microlitri della cultura OP50 sul centro di una piastra non seminata NGM e permettono le piastre seminate ad asciugare a temperatura ambiente per una notte. </li></ol> 11) Uovo in Worm Assay <ol><li> Scegli 15 - 20 in scena-L4 C. elegans (Figura 1) sul centro di un prato di batteri su un preparato BHI-Strep-E. Piastra faecalis. Fare attenzione a non trasferire un sacco di OP50 alla piastra BHI. Scegliere lo stesso numero di l4s a un controllo NGM-OP50 piastra. </li><li> Incubare le piastre per 40 ore a 20 ° C. </li><li> Preparare una soluzione di candeggina al 20%. Mescolare un candeggina commerciale (6,0% ipoclorito di sodio) con l&#39;appropriato volume di acqua distillata. </li><li> Aggiungere 10 gocce microlitri di soluzione di candeggina a dieci posizioni distinte su un coperchio di plastica (di un worm o un piatto batterica). </li><li> Utilizzando un piccone verme, trasferire una vite senza fine in ogni goccia di candeggina. Agitare delicatamente la punta delprendere in gocce di candeggina per assicurarsi che il worm ha lavato via la fine del plettro (confermare osservando la goccia sotto un microscopio da dissezione). </li><li> Lasciare che la cuticola di sciogliere per circa 10 minuti o fino a quando i vermi si spalancò, espellendo le uova (Figura 2). Fare attenzione a non trasferire le uova dalla piastra. </li><li> Utilizzando un microscopio da dissezione, contare le uova in ogni goccia di candeggina. </li></ol>

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	<li>Horvitz, H. R., Chalfie, M., Trent, C., Sulston, J. E., Evans, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotonin+and+octopamine+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Serotonin and octopamine in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Science. 216, 1012-1014 (1982).</li><li>Sawin, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Genetic and cellular analysis of modulated behaviors in Caenorhabditis elegans [dissertation]. , (1996).</li><li>Trent, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Genetic and behavioral studies of the egg-laying system of Caenorhabditis elegans [dissertation]. , (1982).</li><li>Chase, D. L., Koelle, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+analysis+of+RGS+protein+function+in+Caenorhabditis+elegans.">Genetic analysis of RGS protein function in Caenorhabditis elegans.</a> Methods Enzymol. 389, 305-320 (2004).</li><li>Trent, C., Tsuing, N., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Egg-laying+defective+mutants+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Egg-laying defective mutants of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 104, 619-647 (1983).</li><li>Weinshenker, D., Garriga, G., Thomas, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+pharmacological+analysis+of+neurotransmitters+controlling+egg+laying+in+Caenorhabditis+elegans.">Genetic and pharmacological analysis of neurotransmitters controlling egg laying in Caenorhabditis elegans.</a> J. Neurosci. 15, 6975-6985 (1995).</li><li>Waggoner, L. E., Zhou, G. T., Schafer, R. W., Schafer, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+alternative+behavioral+states+by+serotonin+in+Caenorhabditis+elegans.">Control of alternative behavioral states by serotonin in Caenorhabditis elegans.</a> Neuron. 21, 203-214 (1998).</li><li>Bany, A., Dong, M., Koelle, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+cellular+basis+for+acetylcholine+inhibition+of+Caenorhabditis+elegans+egg-laying+behavior.">Genetic and cellular basis for acetylcholine inhibition of Caenorhabditis elegans egg-laying behavior.</a> J. Neurosci. 23, 8060-8069 (2003).</li><li>Dempsey, C. M., Mackenzie, S. M., Gargus, A., Blanco, G., Sze, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotonin+(5HT),+fluoxetine,+imipramine+and+dopamine+target+distinct+5HT+receptor+signaling+to+modulate+Caenorhabditis+elegans+egg-laying+behavior.">Serotonin (5HT), fluoxetine, imipramine and dopamine target distinct 5HT receptor signaling to modulate Caenorhabditis elegans egg-laying behavior.</a> Genetics. 169, 1425-1436 (2005).</li><li>Leung, M. C., Williams, P. L., Bennedetto, A., Au, C., Helmcke, K. J., Aschner, M., Meyer, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans:+an+emerging+model+in+biomedical+and+environmental+toxicology.">Caenorhabditis elegans: an emerging model in biomedical and environmental toxicology.</a> Toxicol. Sci. 106, 5-28 (2008).</li><li>Mylonakis, E., Aballay, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Worms+and+flies+as+genetically+tractable+animal+models+to+study+host-pathogen+interactions.">Worms and flies as genetically tractable animal models to study host-pathogen interactions.</a> Infect. Immun. 73, 3833-3841 (2005).</li><li>Schafer, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> WormBook. , (2005).</li><li>White, J., Southgate, E., Thomson, N., Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+Caenorhabditis+elegans+nervous+system.">The structure of the Caenorhabditis elegans nervous system.</a> Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 314, 1-340 (1986).</li><li>Desai, C., Garriga, G., McIntire, S. L., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+pathway+for+the+development+of+the+Caenorhabditis+elegans+HSN+motor+neurons.">A genetic pathway for the development of the Caenorhabditis elegans HSN motor neurons.</a> Nature. 336, 638-646 (1988).</li><li>Garsin, D. A., Sifri, C. D., Mylonakis, E., Qin, X., Singh, K. V., Murray, B. E., Calderwood, S. B., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+model+host+for+identifying+Gram-positive+virulence+factors.">A simple model host for identifying Gram-positive virulence factors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 10892-10897 (2001).</li><li>Aballay, A., Yorgey, P., Ausubel, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+typhmurium+proliferates+and+establishes+a+persistent+infection+in+the+intestine+of+Caenorhabditis+elegans.">Salmonella typhmurium proliferates and establishes a persistent infection in the intestine of Caenorhabditis elegans.</a> Curr. Biol. 10, 1539-1542 (2000).</li><li>O'Quinn, A. L., Wiegand, E. M., Jeddeloh, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Burkholderia+pseudomallei+kills+the+nematode+Caenorhabditis+elegans+using+an+endotoxin-mediated+paralysis.">Burkholderia pseudomallei kills the nematode Caenorhabditis elegans using an endotoxin-mediated paralysis.</a> Cell. Microbiol. 3, 381-393 (2001).</li><li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+Caenorhabditis+elegans.">Genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77, 71-94 (1974).</li><li>Harvey, S. C., Shorto, A., Orbidans, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+genetic+analysis+of+life-+history+traits+of+Caenorhabditis+elegans+in+stressful+environments.">Quantitative genetic analysis of life- history traits of Caenorhabditis elegans in stressful environments.</a> BMC Evol. Biol. 8, 15 (2008).</li><li>Harvey, S. C., Orbidans, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All+eggs+are+not+equal:+the+maternal+environment+affects+progeny+reproduction+and+developmental+fate+in+Caenorhabditis+elegans.">All eggs are not equal: the maternal environment affects progeny reproduction and developmental fate in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS One. 6, e25840 (2011).</li><li>Klass MR, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans:+major+biological+and+environmental+factors+influencing+life+span.">Aging in the nematode Caenorhabditis elegans: major biological and environmental factors influencing life span.</a> Mech. Ageing. Dev. 6, 413-429 (1977).</li></ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Le fasi più critiche eseguire con successo questo saggio sono: 1) utilizzando grammature ben nutriti di C. elegans, 2) coltivazione di singoli tipi di batteri sulla piastra saggio, 3) identificare accuratamente messo in scena L4 vermi per l&#39;esposizione a E. faecalis, 4) tenere il tempo di esposizione a E. faecalis coerente in tutte le prove e le 5) Tempo di sbiancanti non dovrebbe superare i dieci minuti per evitare la disintegrazione uovo. Per questo dosaggio...

Caenorhabditis elegans, un microscopico, nematodi a vita libera, è un organismo modello tradizionalmente utilizzato per lo studio dello sviluppo delle cellule e dei processi di segnalazione per la sua anatomia trasparente, sviluppo ben caratterizzato, completamente sequenziato genoma, la generazione in tempo breve, e omologia genetica per l&#39;uomo . Più recentemente, C. elegans è diventato un organismo modello nel campo della tossicologia ambientale e di immunità innata 10, 11. Questi auto-fertilizzanti vermi ermafroditi diventano sessualmente maturi entro due o tre giorni di cova dall&#39;uovo. Durante il suo ciclo di vita, C. elegans passa attraverso quattro stadi larvali (L1-L4), prima di raggiungere l&#39;età adulta. Un isolato ermafrodita in grado di produrre, in media, 300 prole entro tre giorni di picco di fecondità. In riproduttivamente maturo C. elegans ermafroditi, uova fecondate vengono mantenuti all&#39;interno dell&#39;utero per diverse ore prima di essere licenziati. Glinormale numero di uova memorizzati in utero in qualsiasi momento (durante l&#39;alta fecondità) è tra i dieci ei quindici 12. Il numero di uova in utero è funzione sia del tasso di produzione di uova e il tasso di deposizione. Uova fecondate vengono espulsi dall&#39;utero dalla contrazione dei muscoli sedici vulval disposti intorno all&#39;apertura della vulva 13. Motoneuroni Ermafrodito-specifici (HSN di) e motoneuroni VC sinapsi sui muscoli vulvari influenzano la contrazione muscolare e quindi la deposizione delle uova comportamento 5,7,13,14. Espulsione di uova dal dell&#39;utero si verifica a causa di attività coordinata dei neuroni e muscoli. Culture Lab di C. elegans sono allevati con una dieta di non patogeno Escherichia coli OP50. In ambiente naturale, C. elegans entrano in contatto con una varietà di fonti di cibo, come batteri patogeni, che possono essere potenzialmente dannosi. Quando esposti a sostanze nocive inl&#39;ambiente, C. elegans conservano le uova fino a quando l&#39;ambiente diventa più favorevole. Presumibilmente questo ritenzione uovo è uno sforzo per proteggere la loro progenie. In questo uovo a vite senza fine (EIW) saggio, C. elegans sono esposti ai batteri potenzialmente patogeni, Enterococcus faecalis, che si trova nell&#39;ambiente. L&#39;esposizione a forme patogeni di E. faecalis possono causare infezione intestinale persistente e persino la morte in C. elegans 15. Esposizione ad altre forme di batteri patogeni hanno mostrato di influenzare la ritenzione dell&#39;uovo 16,17, tuttavia l&#39;effetto non è stato quantificato. Inoltre, l&#39;effetto di lieve patogeni ceppi di E. faecalis, i ceppi che non sono immediatamente letale, sul comportamento delle uova non è stato studiato. Saggi EIW coinvolgono contando il numero di uova trattenuto nell&#39;utero di C. elegans 4. Anche se C. eleganssono trasparenti, le uova si accumulano in utero possono essere difficili da quantificare in un animale intatto. Il saggio EIW coinvolge lo sbiancamento gravido adulto C. elegans che sono stati esposti ai batteri per un determinato periodo di tempo. La soluzione di candeggina scioglie la cuticola esterna lasciando dietro di sé le uova. Le uova sono refrattiva agli effetti della candeggina per la presenza di un guscio protettivo. Dopo sbianca, uno è molto facilmente in grado di contare il numero di uova rilasciate dall&#39;utero dei vermi su di imbianchimento. Il saggio descritto è un metodo semplice, economico e rapido per quantificare il numero di uova in utero in una sola volta, e quindi quantificare gli effetti di E. faecalis sulla ritenzione dell&#39;uovo. Il test può essere utilizzato per quantificare l&#39;effetto di altri tipi di batteri, tossine ambientali o farmaci sulla ritenzione uovo. Questa analisi ha anche il potenziale per essere utilizzato come schermo per la patogenicità batterica.

<table><tbody><tr><td>Agar, ultrapure</td><td>Affymetrix</td><td>10906</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Peptone</td><td>Becton Dickinson</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Tryptone</td><td>Becton Dickinson</td><td>211705</td><td></td></tr><tr><td>Brain Heart Infusion dehydrated medium</td><td>Carolina Biological Supply</td><td>781781</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;C. elegans&lt;/em&gt;, N2 strain</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td></td><td>http://www.cbs.umn.edu/cgc</td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Alfa Aesar</td><td>A11470</td><td></td></tr><tr><td>Culture plates for &lt;em&gt;C. elegans&lt;/em&gt;</td><td>Tritech Research Inc.</td><td>T3308</td><td></td></tr><tr><td>Culture plates for &lt;em&gt;E. faecalis&lt;/em&gt;</td><td>Fisher Scientific-Fisherbrand</td><td>875713</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli &lt;/em&gt;(OP50)</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td></td><td>http://www.cbs.umn.edu/cgc</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. faecalis&lt;/em&gt; strains</td><td></td><td></td><td>provided by J. Middleton. All isolates were confirmed as enterococci</td></tr><tr><td colspan="4">by observing growth on enterococcosel agar (BBL) and in 6% NaCl broth;</td></tr><tr><td colspan="4"> &lt;p&gt;all strains grew at 44.5 &amp;ordm;C and were catalase negative and hydrolyzed esculin. A simplified&amp;nbsp;&lt;span style=&quot;line-height: 1.6em;&quot;&gt;dichotomous key based on pigmentation and fermentation reactions for six sugars&amp;nbsp;&lt;/span&gt;&lt;span style=&quot;line-height: 1.6em;&quot;&gt;(arabinose, mannitol, methyl-&amp;alpha;-D-glucopyranoside (MGP), ribose, sorbose and sorbitol) allowed&amp;nbsp;&lt;/span&gt;&lt;span style=&quot;line-height: 1.6em;&quot;&gt;presumptive identification of all &lt;em&gt;E&lt;/em&gt;. &lt;em&gt;faecalis&lt;/em&gt; strains (Efs lacks pigmentation and is arabinose, MGP&amp;nbsp;&lt;/span&gt;&lt;span style=&quot;line-height: 1.6em;&quot;&gt;and sorbose negative and sorbitol, mannitol and ribose positive). All presumptive Efs strains&amp;nbsp;&lt;/span&gt;&lt;span style=&quot;line-height: 1.6em;&quot;&gt;were confirmed using the API 20 STREP system (Biomerieux).&lt;/span&gt;&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Motic</td><td>SMZ 168B</td><td>any microscope with transmitted illumination and 50X magnification should be sufficient</td></tr><tr><td>Streptomycin sulfate</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP910-50</td><td></td></tr><tr><td>Tryptic Soy Agar (Soybean-Casein Digest Agar Medium), Difco</td><td>Becton Dickinson</td><td>236950</td><td></td></tr><tr><td>Trypticase Soy Broth (Soybean-Casein Digest Medium), BBL</td><td>Becton Dickinson</td><td>211768</td><td></td></tr><tr><td>Yeast extract</td><td>Acros</td><td>61180-1000</td><td></td></tr></tbody></table>

measuring the effects of bacteria on c. elegans behavior using an egg retention assay

C. elegans comportamento di deposizione delle uova è influenzato da stimoli ambientali come osmolarità 1 e vibrazioni 2. In totale assenza di cibo C. elegans cessano anche ovodeposizione e conservano le uova fecondate nel loro utero 3. Tuttavia, l&#39;effetto di diverse fonti alimentari, in particolare i batteri patogeni e in particolare Enterococcus faecalis, sul comportamento ovodeposizione non è ben caratterizzata. L&#39;uovo-a-vite senza fine (EIW) saggio è uno strumento utile per quantificare gli effetti di diversi tipi di batteri, in questo caso E. faecalis, il comportamento di deposizione delle uova. Saggi EIW coinvolgono contando il numero di uova trattenuto nell&#39;utero di C. elegans 4. Il saggio EIW coinvolge lo sbiancamento in scena, gravido adulto C. elegans per rimuovere la cuticola e separare le uova trattenuti dal animale. Prima di sbianca, vermi sono esposti a batteri (o qualsiasi tipo di stimolo ambientale) Per un determinato periodo di tempo. Dopo lo sbiancamento, uno è molto facilmente in grado di contare il numero di uova trattenuti all&#39;interno dell&#39;utero dei vermi. In questo saggio, un incremento quantificabile in ritenzione di uova dopo la E. esposizione faecalis può essere facilmente misurato. Il saggio è un saggio EIW comportamentale che può essere usato per individuare batteri potenzialmente patogeni o la presenza di tossine ambientali. Inoltre, il saggio EIW può essere uno strumento per lo screening per i farmaci che influenzano neurotrasmettitore segnalazione dal comportamento di deposizione delle uova è modulato da neurotrasmettitori come la serotonina e acetilcolina 5-9.

Questo test permette di quantificare il numero di uova trattenuti all&#39;interno C. elegans dopo esposizione a E. faecalis. L4 scena vermi (caratterizzati da trasparente spazi al di sopra loro vulva, Figura 1) sono stati esposti a E. faecalis fino all&#39;età adulta. Dopo 40 ore di esposizione a E. faecalis, lo sbiancamento è stata eseguita. Come la cuticola disintegrato nel droplet candeggina, le uova divennero più evidenti (Figura 2). Il numero ...

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Misurazione degli effetti dei batteri sul comportamento di C. Elegans utilizzando un test di ritenzione delle uova | Biologia | Video

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

Un uovo-in-worm (EIW) saggio è un metodo utile per quantificare la deposizione delle uova comportamento. Alterazioni nella deposizione delle uova può essere una risposta comportamentale del modello di organismo<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; A sostanze ambientali potenzialmente nocivi come quelli prodotti da batteri patogeni.

Misurare gli effetti dei batteri su<em&gt; C. Elegans</em&gt; Comportamento utilizzando un saggio di ritenzione dell&#39;uovo

C. elegans egg-laying behavior is  affected by environmental cues such as osmolarity1 and  vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease ...

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17.0K Views.  Fairleigh Dickinson University. Un uovo-in-worm (EIW) saggio è un metodo utile per quantificare la deposizione delle uova comportamento. Alterazioni nella deposizione delle uova può essere una risposta comportamentale del modello di organismo Caenorhabditis elegans A sostanze ambientali potenzialmente nocivi come quelli prodotti da batteri patogeni.

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The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

We demonstrate a method using Caenorhabditis elegans as a model host to study microbial interaction. Microbes are introduced via the diet making the intestine the primary location for disease. The nematode intestine structurally and functionally mimics mammalian intestines and is transparent making it amenable to microscopic study of colonization. Here we show that pathogens can cause disease and death. We are able to identify microbial mutants that show altered virulence. Its conserved innate response to biotic stresses makes C. elegans an excellent system to probe facets of host innate immune interactions. We show that hosts with mutations in the dual oxidase gene cannot produce reactive oxygen species and are unable to resist microbial insult. We further demonstrate the versatility of the presented survival assay by showing that it can be used to study the effects of inhibitors of microbial growth. This assay may also be used to discover fungal virulence factors as targets for the development of novel antifungal agents, as well as provide an opportunity to further uncover host-microbe interactions. The design of this assay lends itself well to high throughput whole-genome screens, while the ability to cryo-preserve worms for future use makes it a cost-effective and attractive whole animal model to study.

The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

Here, we present the nematode Caenorhabditis elegans as a versatile host model to study microbial interaction.

Il Nematode Caenorhabditis Elegans - un modello Versatile In Vivo per studiare le interazioni ospite-microbo

We demonstrate a method using Caenorhabditis elegans as a model host to study microbial interaction. Microbes are introduced via the diet making the ...

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Automated Analysis of a Nematode Population-based Chemosensory Preference Assay

The nematode, Caenorhabditis elegans' compact nervous system of only 302 neurons underlies a diverse repertoire of behaviors. To facilitate the dissection of the neural circuits underlying these behaviors, the development of robust and reproducible behavioral assays is necessary. Previous C. elegans behavioral studies have used variations of a "drop test", a "chemotaxis assay", and a "retention assay" to investigate the response of C. elegans to soluble compounds. The method described in this article seeks to combine the complementary strengths of the three aforementioned assays. Briefly, a small circle in the middle of each assay plate is divided into four quadrants with the control and experimental solutions alternately placed. After the addition of the worms, the assay plates are loaded into a behavior chamber where microscope cameras record the worms' encounters with the treated regions. Automated video analysis is then performed and a preference index (PI) value for each video is generated. The video acquisition and automated analysis features of this method minimizes the experimenter's involvement and any associated errors. Furthermore, minute amounts of the experimental compound are used per assay and the behavior chamber's multi-camera setup increases experimental throughput. This method is particularly useful for conducting behavioral screens of genetic mutants and novel chemical compounds. However, this method is not appropriate for studying stimulus gradient navigation due to the close proximity of the control and experimental solution regions. It should also not be used when only a small population of worms is available. While suitable for assaying responses only to soluble compounds in its current form, this method can be easily modified to accommodate multimodal sensory interaction and optogenetic studies. This method can also be adapted to assay the chemosensory responses of other nematode species.

We present a behavior recording setup and protocol that enables automated analysis of the nematode, Caenorhabditis elegans' preference for soluble compounds in a population-based assay. This article describes the construction of a behavior chamber, the behavioral assay protocol, and video analysis software usage.

Analisi automatizzata di un esame preferenziale di Chemosensory basato sulla popolazione di Nematode

The nematode, Caenorhabditis elegans' compact nervous system of only 302 neurons underlies a diverse repertoire of behaviors. To facilitate the dissection ...

Comportamento

Imaging basato su smartphone per il saggio di evitamento del prato di C. elegans

A Smartphone-Based Imaging Method for C. elegans Lawn Avoidance Assay

When exposed to toxic or pathogenic bacteria, the nematode Caenorhabditis elegans displays a learned lawn avoidance behavior, in which the worms gradually leave their food source and prefer to remain outside the bacterial lawn. The assay is an easy way to test the worms' ability to sense external or internal cues to properly respond to harmful conditions. Though a simple assay, counting is time consuming, particularly with multiple samples, and assay durations that span overnight are inconvenient for researchers. An imaging system that can image many plates over a long period is useful but costly. Here, we describe a smartphone-based imaging method to record lawn avoidance in C. elegans. The method requires only a smartphone and a light emitting diode (LED) light box, to serve as a transmitted light source. Using free time-lapse camera applications, each phone can image up to six plates, with sufficient sharpness and contrast to manually count worms outside the lawn. The resulting movies are processed into 10 s audio video interleave (AVI) files for every hourly time point, then cropped to show each single plate to make them more amenable for counting. This method is a cost-effective way for those looking to examine avoidance defects and can potentially be extended to other C. elegans assays.

Autore in primo piano: un metodo di imaging basato su smartphone per il saggio di evitamento del prato di C. elegans  

This article describes a simple, low-cost method of recording the lawn avoidance behavior of Caenorhabditis elegans, using readily available items such as a smartphone and a light emitting diode (LED) light box. We also provide a Python script to process the video file into a format more amenable for counting.

Un metodo di imaging basato su smartphone per il saggio di evitamento del prato di C. elegans

When exposed to toxic or pathogenic bacteria, the nematode Caenorhabditis elegans displays a learned lawn avoidance behavior, in which the worms gradually ...

An Assay for Measuring the Effects of Ethanol on the Locomotion Speed of Caenorhabditis elegans

Alcohol use disorders are a significant public health concern, for which there are few effective treatment strategies. One difficulty that has delayed the development of more effective treatments is the relative lack of understanding of the molecular underpinnings of the effects of ethanol on behavior. The nematode, Caenorhabditis elegans (C.&#160;elegans), provides a useful model in which to generate and test hypotheses about the molecular effects of ethanol. Here, we describe an assay that has been developed and used to examine the roles of particular genes and environmental factors in behavioral responses to ethanol, in which locomotion is the behavioral output. Ethanol dose-dependently causes an acute depression of crawling on an agar surface. The effects are dynamic; animals exposed to a high concentration demonstrate an initial strong depression of crawling, referred to here as initial sensitivity, and then partially recover locomotion speed despite the continued presence of the drug. This ethanol-induced behavioral plasticity is referred to here as the development of acute functional tolerance. This assay has been used to demonstrate that these two phenotypes are distinct and genetically separable. The straightforward locomotion assay described here is suitable for examining the effects of both genetic and environmental manipulations on these acute behavioral responses to ethanol in C.&#160;elegans.

An Assay for Measuring the Effects of Ethanol on the Locomotion Speed of Caenorhabditis elegans

C. elegans is a useful model for studying the effects of ethanol on behavior. We present a behavioral assay that quantifies the effects of ethanol on the locomotion speed of crawling worms; both initial sensitivity and the development of acute functional tolerance to ethanol can be measured with this assay.

Un test per misurare gli effetti di etanolo sulla velocità di Locomotion<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Alcohol use disorders are a significant public health concern, for which there are few effective treatment strategies. One difficulty that has delayed the ...

Neuroscienze

A Caenorhabditis elegans Nutritional-status Based Copper Aversion Assay

To ensure survival, organisms must be capable of avoiding unfavorable habitats while ensuring a consistent food source. Caenorhabditis elegans alter their locomotory patterns upon detection of diverse environmental stimuli and can modulate their suite of behavioral responses in response to starvation conditions. Nematodes typically exhibit a decreased aversive response when removed from a food source for over 30 min. Observation of behavioral changes in response to a changing nutritional status can provide insight into the mechanisms that regulate the transition from a well-fed to starved state.
We have developed an assay that measures a nematode&#39;s ability to cross an aversive barrier (i.e. copper) then reach a food source over a prolonged period of time. This protocol builds upon previous work by integrating multiple variables in a manner that allows for continued data collection as the organisms shift towards an increasingly starved condition. Moreover, this assay permits an increased sample size so that larger populations of nematodes can be simultaneously evaluated.
Organisms defective for the ability to detect or respond to copper immediately cross the chemical barrier, while wild type nematodes are initially repelled. As wild type worms are increasingly starved, they begin to cross the barrier and reach the food source. We designed this assay to evaluate a mutant that is incapable of responding to diverse environmental cues, including food sensation or detection of aversive chemicals. When evaluated via this protocol, the defective organisms immediately crossed the barrier, but were also incapable of detecting a food source. Hence, these mutants repeatedly cross the chemical barrier despite temporarily reaching a food source. This assay can straightforwardly test populations of worms to evaluate potential pathway defects related to aversion and starvation.

A Caenorhabditis elegans Nutritional-status Based Copper Aversion Assay

Here, we present a Caenorhabditis elegans-specific assay designed to evaluate changes in copper aversion behavior and the ability to locate a common food source, as the organism progresses from a well-fed to starved nutritional state.

UN<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Analisi di Aversione di rame basata sullo stato nutrizionale

To ensure survival, organisms must be capable of avoiding unfavorable habitats while ensuring a consistent food source. Caenorhabditis elegans alter their ...

Measuring the Effect of Chemicals on the Growth and Reproduction of Caenorhabditis elegans

Toxicological evaluation is crucial for understanding the effects of chemicals on living organisms in basic and applied biological science fields. A non-mammalian soil round worm, Caenorhabditis elegans, is a valuable model organism for toxicology studies due to its convenience and lack of animal ethics issues compared with mammalian animal systems. In this protocol, a detailed procedure of toxicological evaluation of chemicals in C. elegans is described. A clinical anticancer drug, etoposide, which targets human topoisomerase II and inhibits DNA replication of human cancer cells, was selected as a model testing chemical. Age-synchronized C. elegans eggs were exposed to either dimethyl sulfoxide (DMSO) or etoposide, and then the growth of C. elegans was monitored every day for 4 days by the stereo microscope observation. The total number of eggs laid from C. elegans treated with DMSO or etoposide was also counted by using the stereo microscope. Etoposide treatment significantly affected the growth and reproduction of C. elegans. By comparison of the total number of eggs laid from worms with different treatment periods of chemicals, it can be decided that the reproductive toxicity of chemicals on C. elegans reproduction is reversible or irreversible. These protocols may be helpful for both the development of various drugs and risk assessment of environmental toxicants.

Measuring the Effect of Chemicals on the Growth and Reproduction of Caenorhabditis elegans

A basic protocol to evaluate the toxicity of chemicals in a model animal, Caenorhabditis elegans, is described. The method is convenient and useful for the development of pharmaceuticals as well as for the risk assessment of various environmental pollutants.

Misurare l'effetto delle sostanze chimiche sulla crescita e sulla riproduzione di Caenorhabditis elegans

Toxicological evaluation is crucial for understanding the effects of chemicals on living organisms in basic and applied biological science fields. A ...

Medicina

C. elegans Chemotaxis Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates. Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis behavior.
 The premise behind testing the response of the worms to an odorant is to place them in an area and observe the movement evoked in response to an odorant. Even with the many available assays, optimizing worm starting location relative to both the control and test areas, while minimizing the interaction of worms with each other, while maintaining a significant sample size remains a work in progress 1-10. The method described here aims to address these issues by modifying the assay developed by Bargmann et al.1. A Petri dish is divided into four quadrants, two opposite quadrants marked "Test" and two are designated "Control". Anesthetic is placed in all test and control sites. The worms are placed in the center of the plate with a circle marked around the origin to ensure that non-motile worms will be ignored. Utilizing a four-quadrant system rather than one 2 or two 1 eliminates bias in the movement of the worms, as they are equidistant from test and control samples, regardless of which side of the origin they began. This circumvents the problem of worms being forced to travel through a cluster of other worms to respond to an odorant, which can delay worms or force them to take a more circuitous route, yielding an incorrect interpretation of their intended path. This method also shows practical advantages by having a larger sample size and allowing the researcher to run the assay unattended and score the worms once the allotted time has expired.

C. elegans Chemotaxis Assay

A method of quantitatively evaluating the chemotactic response of Caenorhabditis elegans is described. A chemotactic index (CI) was employed as a way to precisely evaluate the response of worms to certain targets, and serve as a platform of comparison between strains and compounds of interest.

C. elegans Chemiotassi Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

Biologia

Inattivazione metabolica batterica in Caenorhabditis elegans mediante paraformaldeide

Methodology to Metabolically Inactivate Bacteria for Caenorhabditis elegans Research

Caenorhabditis elegans is a common model organism for research in genetics, development, aging, metabolism, and behavior. Because C. elegans consume a diet of live bacteria, the metabolic activity of their food source can confound experiments looking for the direct effects of various interventions on the worm. To avoid the confounding effects of bacterial metabolism, C. elegans researchers have used multiple methods to metabolically inactivate bacteria, including ultraviolet (UV)-irradiation, heat-killing, and antibiotics. UV treatment is relatively low-throughput and cannot be used in liquid culture because each plate must be examined for successful bacterial killing. A second treatment method, heat-killing, negatively affects the texture and nutritional quality of the bacteria, leading to the developmental arrest of C. elegans. Finally, antibiotic treatment can directly alter C. elegans physiology in addition to preventing bacterial growth. This manuscript describes an alternative method to metabolically inactivate bacteria using paraformaldehyde (PFA). PFA treatment cross-links proteins within bacterial cells to prevent metabolic activity while preserving cellular structure and nutritional content. This method is high-throughput and can be used in liquid culture or solid plates, as testing one plate of PFA-treated bacteria for growth validates the whole batch. Metabolic inactivation through PFA treatment can be used to eliminate the confounding effects of bacterial metabolism on studies of drug or metabolite supplementation, stress resistance, metabolomics, and behavior in C. elegans.

Autore in primo piano: Avanzamento della ricerca su Caenorhabditis elegans utilizzando batteri trattati con paraformaldeide 

The food source for Caenorhabditis elegans in the lab is live Escherichia coli. Since bacteria are metabolically active, they present a confounding variable in metabolic and drug studies in C. elegans. A detailed protocol to metabolically inactivate bacteria using paraformaldehyde is described here.

Metodologia per inattivare metabolicamente i batteri per la ricerca su Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is a common model organism for research in genetics, development, aging, metabolism, and behavior. Because C. elegans consume a ...

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Il Nematode Caenorhabditis Elegans - un modello Versatile In Vivo per studiare le interazioni ospite-microbo

Analisi automatizzata di un esame preferenziale di Chemosensory basato sulla popolazione di Nematode

Un metodo di imaging basato su smartphone per il saggio di evitamento del prato di C. elegans

Un metodo di imaging basato su smartphone per il saggio di evitamento del prato di C. elegans

Un metodo di imaging basato su smartphone per il saggio di evitamento del prato di C. elegans

Un test per misurare gli effetti di etanolo sulla velocità di Locomotion

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Misurare l'effetto delle sostanze chimiche sulla crescita e sulla riproduzione di Caenorhabditis elegans

C. elegans Chemiotassi Assay

Metodologia per inattivare metabolicamente i batteri per la ricerca su Caenorhabditis elegans