Ringraziamo il Dr. JL. Galzi (UMR7242 CNRS, Illkirch, Francia) per il suo sostegno. Questo lavoro è stato sostenuto dal CNRS, INSERM, Université de Strasbourg, Alsace BioValley e da sovvenzioni dal Conectus, Agence National de la Recherche (ANR 08 EBIO 014.02) Conseil Régional d&#39;Alsace (Pharmadol), Communauté Urbaine de Strasbourg (Pharmadol), ICFRC (Pharmadol), OSEO (Pharmadol), Direction Générale des Entreprises (Pharmadol).

Tutti gli esperimenti sono stati condotti in stretta conformità con le linee guida europee per la cura degli animali da laboratorio (Direttiva 86/609/ECC Comunità europee del Consiglio) e le linee guida etiche per le indagini del dolore sperimentale in animali coscienti 13. Maschio C57BL6 / N Tac topi (10 settimane, 25 - 30 g) sono stati alloggiati in una struttura animale istituzionale con uno staff cura incaricato di guidare la struttura in conformità alle norme ambientali. Gli animali sono stati alloggiati in gruppi (massimo cinque topi per gabbia) sotto un 12 h / 12 h luce / buio ciclo a temperatura costante (21 ± 1 ° C), con libero accesso a cibo e acqua. Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti nello stesso periodo della giornata (10:00-16:00) utilizzando una coorte di 16 topi. Materiali e attrezzature specifici sono indicati nella tabella materiali. Una procedura in cinque fasi per monitorare morfina indotta iperalgesia e tolleranza Il protocollo èsuddiviso in cinque fasi sequenziali (AE) per una durata di 15 giorni di Figura 1. . 1 Mice Handling (Fase A, d-7 al d-5) <ol><li> Maneggiare topi e abituarsi a entrare liberamente nel dispositivo di immobilizzazione. Questa fase preliminare riduce lo stress - minimizzando così qualsiasi confusione con analgesia indotta da stress - e permette agli animali di essere abituati al ricercatore, movimentazione e manipolazione nella immobilizzazione del mouse. Ogni mouse viene delicatamente trattati per 5 minuti ogni giorno. </li></ol> . 2 basale nocicettivo Response (Fase B; d-4 a d-1) <ol><li> Misurare latenze ritiro coda utilizzando il test di immersione coda (TIT): <ol><li> Impostare il termostato a 48 ° C. </li><li> Introdurre delicatamente il mouse nella immobilizzazione. Immergere il sporgente 2/3 fine della sua coda in bagno d&#39;acqua e avviare il cronometro. </li><li> Arrestare il cronometro non appena il mouse ritira la coda dall&#39;acqua calda e registrare il tempo di latenza (in sec). In the assenza di reazioni nocicettivo, 25 sec cut-off è usato per prevenire danni ai tessuti. </li><li> Sostituire il mouse nella sua gabbia e testare il successivo fino alla fine della serie. </li><li> Ripetere le misure di risposta nocicettiva altre due volte, prendendo le misure dagli animali nello stesso ordine. La latenza di risposta nocicettiva (sec) per ciascun topo è determinata come valore medio di tre determinazioni successive. </li></ol></li><li> Misurare risposte meccaniche utilizzando il test Tail pressione (TPT) <ol><li> Introdurre delicatamente il mouse nella immobilizzazione e posizionare la coda sotto la punta conica della analgesimeter. </li><li> Premere il pedale per applicare uniformemente crescente pressione sulla parte prossimale della coda fino alla prima reazione nocicettiva (lottando, cigolii) si verifica. Al momento l&#39;animale reagisce, registrare la forza corrente (in grammi) che provoca la risposta nocicettiva. In assenza di qualsiasi reazione, un valore di cut-off 600 g viene utilizzato per evitare temettere danni. </li><li> Ripetere questa misura sulle parti mediane e distali della coda del mouse stesso. Un intervallo di almeno 30 secondi si osserva tra le misure su un dato del mouse per evitare di adattamento o pregiudizi stress. Sostituire il mouse nella sua gabbia e testare l&#39;animale successivo fino alla fine della serie (cioè tutti i topi sono testati). Il valore nocicettivo (grammi) per ogni mouse viene considerata come valore medio di tre misurazioni (cioè prossimali, mediana e parti distali della coda di ciascun animale). </li></ol></li><li> Ripetere il test nocicettivo (tutte le procedure descritte dalla fase 2) nei giorni successivi, d-3 d-1. </li></ol> . 3 Misura della morfina Analgesia (Fase C; d0) <ol><li> Definire la migliore combinazione di animali che permette la selezione di due gruppi (n = 8 per gruppo) di topi con valori nocicettivi medi stabili e comparabili, a seconda di quale modalità nocicettivo (TIT o TPT) è considerato. Questo valore verrà preso come basalerisposta nocicettiva di riferimento per i gruppi &#39;Saline&#39; e &#39;morfina&#39; future. </li><li> Misurare il peso corporeo di ciascun animale. </li><li> Preparare una soluzione di morfina (0,5 mg di morfina per ml) in soluzione salina fisiologica sterile (NaCl 0,9%) per somministrazione sottocutanea (5 mg di morfina per kg di peso corporeo dell&#39;animale). </li><li> Misurare la latenza di risposta nocicettiva (preso come punto di tempo 0) per ogni mouse sia &#39;Saline&#39; e gruppi di morfina &#39;del TIT (tutti i passaggi sotto i 2.1 di cui sopra). Quindi misurare nocicezione in TPT (tutte le misure di cui al precedente 2.2). </li><li> Iniettare la morfina per via sottocutanea (tipicamente 0,25 ml di una / ml soluzione di morfina 0,5 mg per 25 g di peso del mouse) e soluzione salina (0,25 ml per 25 g di peso del mouse) per la &#39;morfina&#39; e gruppi saline &quot;, rispettivamente. </li><li> Misurare i valori nocicettivi sul TIT e TPT (tutte le procedure sopra descritte sotto i punti 2.1 e 2.2, rispettivamente) nel corso di un time-course (a 30 min intervanalgesia al) per valutare morfina (5 mg / kg) indotta: <ol><li> Dopo 30 minuti dopo l&#39;iniezione, misurare la risposta nocicettiva (singola determinazione) per ogni mouse del &#39;Saline&#39; e gruppi di morfina &#39;, utilizzando il TIT poi il TPT. </li><li> Quindi misurare valori di risposta nocicettiva (TIT e TPT) in tutti i topi a intervalli di tempo (in ore): 1-1.5-2-2.5-3 e 3.5 post-iniezione. </li></ol></li></ol> 4 Morphine trattamento cronico - Morphine indotta iperalgesia. (Step D; d1 a d6) <ol><li> Il giorno: d1 <ol><li> Misurare valori di risposta nocicettiva sul TIT e TPT come descritto sopra (punti 2.1 e 2.2). Annotare accuratamente latenze di prelievo ei limiti di pressione per ogni animale. </li><li> Preparare una soluzione di morfina fresca come descritto al punto 3.2. </li><li> Iniettare la morfina per via sottocutanea (5 mg / kg di peso corporeo) per tutto il gruppo &#39;morfina&#39; e soluzione fisiologica (0,25 ml per 25 g di peso del mouse) per il gruppo &#39;Saline&#39;. Lasciate the gli animali riposare fino al giorno successivo. </li></ol></li><li> Su Days: d2, d3, d4, d5 e d6 ripetere le operazioni descritte al paragrafo 4.1 </li></ol> . 5 Prove di tolleranza analgesica (Step E; d7) <ol><li> Valutare analgesia morfina indotta secondo il paradigma time-course già specificato nella Sezione 3. </li></ol> 6. Acquisizione dati e analisi statistiche <ol><li> Valutazione della basale nocicettive valori di risposta (Fase B) <ol><li> Calcolare per ogni giorno (il d-4-d 1 punto) la media ± valori SEM (n = 8) per le risposte nocicettive basali come accordata dal TIT e TPT all&#39;interno del &#39;Saline&#39; e gruppi Morphine &#39;. </li><li> Plot valori medi nocicettivi basali in funzione del tempo (giorni) per entrambi i gruppi Figura 2. </li></ol></li><li> Analisi dei Morphine Analgesia tempo portate presso Days d0 (punto C) e D7 (punto E) <ol><li> Calcolare, ad ogni punto dopo morfinainiezione, la media ± SEM valori (n = 8) per le risposte nocicettive come accordata dal TIT (in sec) e TPT (in g) in ciascun gruppo. </li><li> Plot valori medi di risposta nocicettiva in funzione del tempo per il &#39;Saline&#39; e gruppi morfina &#39;al giorno 0 Figura 3 e Figura 7 giorni 5. </li></ol></li><li> Sviluppo di morfina-indotta iperalgesia (Fase D) <ol><li> Calcolare per ogni giorno (per tutto il periodo di trattamento d0-d7) la media ± valori SEM (n = 8) per basali valori di risposta nocicettiva, come offerto dal TIT e TPT all&#39;interno del &#39;Saline trattato&#39; e gruppi di morfina trattati. </li><li> Trama significa basale valori di risposta nocicettiva in funzione del tempo (giorno) per il &#39;Saline trattato&#39; e gruppi di morfina trattati &quot;Figura 4. </li></ol></li><li> Prove per analgesica Tolleranza (Procedura C ed E) <ol><li> Determinare dalla morfina time-course eXperiment effettuata ad d0 figura 3 il valore di tempo (o intervallo di tempo) richiesto per morfina per indurre una risposta analgesica massima. </li><li> Prendete questo valore (di solito 30 min) come tempo di riferimento per stimare in d7 Figura 5 il valore nocicezione basale (gruppo soluzione salina-trattato) e la risposta analgesica attuale (gruppo morfina-trattato) alla morfina acuta. </li><li> I valori nocicettivo prese al punto di 30 minuti da morfina esperimenti volta portate eseguiti a d0 e D7 per i gruppi trattati con soluzione fisiologica e la morfina-trattati, sono presentati come istogrammi Figura 6. </li><li> Statistiche: Analizzare i dati utilizzando una via per misure ripetute ANOVA. I fattori di variazione sono stati trattamento (tra i soggetti) e l&#39;ora (nel raggio di soggetto). Per controllare le differenze separatamente in ciascun gruppo, misure ripetute ANOVA è stata eseguita. I confronti tra due gruppi sono state eseguite utilizzando il t-test per dati non appaiati o paired t-test quando appropriato. </li></ol></li><li> Il livello di significatività è fissato a P &lt;0,05. Tutte le analisi statistiche sono effettuate utilizzando il Software Statview. </li></ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

<html> Fasi critiche Scelta del modello animale per misure nocicezione La variabilità nella sensibilità nocicettiva e analgesico tra topi ceppi è stato esaminato (14-16) recensioni recensioni utilizzando diversi modelli di dolore differenti nella loro eziologia (nocicettivi, infiammatorio, neuropatico), modalità (termica, chimica, meccanica), la durata (acuta, tonico, cronica) e del sito di somministrazione (cutanea, sottocutanea, viscerale). Rispetto ad altri ceppi, C57BL/6J (&quot;J&quot; per Jackson Laboratory) topo è diventato un modello animale popolare per studi sul dolore in quanto presentano un elevato basale sensibilità nocicettiva 17,18 e una risposta analgesica moderata a oppiacei 14,19. Dopo il trattamento morfina cronico, ma anche sviluppare significativa tolleranza analgesica 20,21, iperalgesia 21,22 e dipendenza 20,23. nt &quot;&gt; Qui, gli esperimenti sono stati condotti su topi C57BL/6N Tac (&quot; N &quot;per il National Institute of Health e&quot; Tac &#39;per Taconics azienda) che appartengono a un ramo separato del lignaggio B6. Sebbene C57BL / 6 topi sono stati a lungo considerati intercambiabili, studi recenti hanno indicato significative differenze di comportamento dei C57BL/6J e C57BL/6N ceppi 24. In particolare, la minore sensibilità dei tre substrains C57BL/6N (compresa la Tac uno) per acuto dolore termico può essere considerato come un vantaggio per testare questo fenotipo. Topi maschi sono stati selezionati come la stragrande maggioranza degli studi di dolore, utilizzando topi come modello animale, eseguite sui maschi minorenni 25. Nelle nostre mani, hanno fornito dati affidabile e riproducibile, se esaminato da un analgesico o iperalgesia punti di vista. Occasionalmente, abbiamo notato una tendenza per le femmine C57BL/6N di fornire risposte più variabile, sia nel TIT e prove TPT. Anche se questa osservazione puòriflettere le variazioni naturali legati allo status ormonale delle femmine, meccanismi globali sottostanti differenze di sesso nel dolore e analgesia rimangono ancora oggetto di controversia. Alcuni aspetti di questo dibattito caldo saranno brevemente presentati nei prossimi &quot;Limiti della tecnica &#39;sezione. Assuefazione degli animali I topi sono stati autorizzati prima di abituarsi alla struttura animale durante una settimana. Simile a qualsiasi altro studio comportamentale, misurazione è stata eseguita dopo un periodo di 3 giorni acclimatazione (Figura 1, fase A). Come test nocicettivi sono sensibili allo stress, primi provvedimenti possono dare latenze più lunghe di quelle successive, soprattutto nel topo non abituati 26,27. Il passo assuefazione consente anche l&#39;ottenimento di valori di risposta nocicettivi più stabili nello stesso giorno e tra giorni Figure 2 e 4. Per ridurre gli effetti circadiani sulla nocicettivo e analgesicosensibilità 28,29, tutti i collaudi sono state condotte 10:00-04:00. Selezione di test nocicettivi Test nocicettivo utilizzano sia termica, meccanica, chimica o stimoli elettrici (revisione 26,27,30. La loro scelta è fondamentale in quanto diverse modalità nocicettivi possono essere trattati attraverso diversi nocicettori e fibre 18,31,32. Abbiamo scelto la prova di coda di immersione (TIT) 33, una versione modificata del test coda flick classico sviluppato da D&#39;amour e Smith 34, e la prova di pressione coda (TPT), adattato da Randall e Selitto 35, come esempi di termica e modalità di meccanici per studiare analgesia morfina-indotto, iperalgesia e la tolleranza nei topi. Entrambi i test sono stati ampiamente utilizzati nei ratti. Una volta tagliato è stato sistematicamente definito per evitare o limitare il rischio di danni ai tessuti. Morphine-induzioneed analgesia, iperalgesia e tolleranza La morfina, il prototipo mu-oppiaceo agonista, è stato scelto qui perché è un analgesico potente e OIH-induttore, sia negli esseri umani e nei topi 1,2,36. La morfina analgesico potenza è noto a variare con ceppi di topi, vie di somministrazione e modalità nocicettivi. In C57BL / 6 topi, analgesia affidabile è solitamente ottenuta dopo iniezioni sottocutanee di morfina nell&#39;intervallo 1-20 dosaggio mg / kg 14,21. Di conseguenza, abbiamo scelto di studiare analgesia acuta a seguito di una singola somministrazione (sc) di morfina a 5 mg / kg, vicino al suo valore ED 50 (7-20 mg / kg), valutato da nocicezione termica 19,21. Somministrazione di morfina ripetuta è spesso accompagnata con una tolleranza analgesica (attestata da uno spostamento verso destra della curva dose-risposta o da una diminuzione dell&#39;ampiezza della risposta analgesica o durata) e iperalgesia (una sensibilità esacerbata a dolorose StimulHo evidenziato da una diminuzione del valore basale nocicettivo). Entrambi i fenomeni negativi dipendono ceppi di ratti, dalla natura del composto oppiacei che viene selezionato e il suo dosaggio, sulla durata del trattamento e sulle modalità nocicettivi 21. Ad esempio, paradigmi sperimentali per studiare la tolleranza e iperalgesia consistono nella somministrazione giornaliera di elevata e costante (da 20 a 40 mg / kg al giorno) 22 o di crescenti (fino a 50 o anche 200 mg / kg) 20,21 dosi di morfina. Di conseguenza, abbiamo promosso lo sviluppo di iperalgesia e tolleranza in topi C57BL / 6 tramite somministrazione di morfina al giorno (5 mg / kg; sc) per un periodo di 8 giorni. Questa dose di morfina moderata è stato preferito rispetto a quelli più elevati per un migliore utilizzo clinica mimica. Imposta di finestra operativa TIT Una possibile trappola in TIT potrebbe essere correlato al ruolo della coda nella termoregolazione di roditori 26,37. Quando la temperatura ambiente è un fattore chiave per nociceptive variazioni di risposta, essa deve essere mantenuta costante (qui a 21 ° C) durante esperimenti 38. Intensità di calore in genere costituito da rilevare una risposta nocicettiva entro 5 a 10 sec 27. Infatti, maggiori latenze possono aumentare il rischio per il controllo dei movimenti di animali non correlati allo stimolo nocicettivo, mentre quelle più corte possono ridurre la potenza differenziale del test. Abbiamo effettuato le misurazioni TIT ad una temperatura fissa di 48 ° C. Latenze ritiro Tail erano vicini a 9 sec (valore basale nocicettivo) e varia da 4 sec (iperalgesia) per 25 sec (analgesia massima, tagliare). Oltre a ragioni pratiche, misurazioni di valori di risposta nocicettivi ad una temperatura fissa possono a priori coinvolgere lo stesso repertorio di nocicettori e circuiti, facilitando così l&#39;interpretazione dei dati. Possibili modifiche Ottimizzazione della finestra operativa TIT per l&#39;analgesia e OIH MeasureMenti Quando concentrandosi su una risposta analgesica, valori basali bassi (maggiore intensità di calore) possono favorire l&#39;individuazione di un ritardo nella risposta. A sua volta, per affrontare la conseguenza di uno stimolo doloroso o lo sviluppo di OIH, elevati valori basali (intensità di calore più bassa; qui 48 ° C) può facilitare l&#39;individuazione di risposte veloci Figura 4. Anche se abbiamo trovato morfina a 5 mg / kg una dose conveniente per indurre una risposta analgesica robusta figura 3 e di promuovere (somministrazione ripetuta) iperalgesia significativa Figura 4, il suo dosaggio può essere adattato come accennato prima (fase critica: analgesia morfina, iperalgesia e tolleranza). Ad esempio, dosi inferiori possono essere utilizzati per ridurre analgesia ampiezza (evitando limitazioni cut-off) che dosi più elevate possono essere scelti per accelerare iperalgesia insorgenza e aumentare la sua ampiezza. OveRall, ottimizzazione della &#39;finestra nocicettivo&#39; deve essere adattata alla background genetico dei topi in fase di studio e prendere in considerazione la possibilità per il coinvolgimento di matrici distinte di nocicettori e circuiti. Agonisti oppiacei alternativi (fentanil, remifentanyl) Sebbene oppiacei utilizzati clinicamente più bersaglio il recettore mu-oppioide come agonisti, differiscono notevolmente per quanto riguarda le loro proprietà farmacologiche sia in vitro che in vivo. Ad esempio, remifentanyl e fentanyl, in netto contrasto con la morfina, si comportano come agonisti completi e promuovere internalizzazione dei mu-oppioidi recettori 39. Analgesici oppiacei come la morfina e fentanil hanno emivita nel range di 40 ore, mentre remifentanyl ha un ultra-breve emivita di diversi minuti 41. Negli esseri umani, miglior prova per OIH è da pazienti che hanno ricevuto oppiacei durante l&#39;intervento, tra cui breve durata d&#39;azione compounds come remifentanyl 2,42. Così, fentanil e remifentanyl possono essere preziosi strumenti troppo per studiare lo sviluppo di iperalgesia e della tolleranza nei topi, sotto TIT e paradigmi TPT. Modi alternativi di induzione di OIH (cronica vs somministrazione acuta) OIH è visto negli esseri umani e modelli animali a seguito di somministrazione di oppiacei, anche a livelli molto bassi o estremamente alti dosaggi 1,2. Riportiamo qui sullo sviluppo OIH dopo il trattamento cronico di topi con dosi moderate di morfina. Diversi giorni di trattamento dei topi C57BL/6N erano necessari per evidenziare una chiara e riproducibile iperalgesico Figura Stato iniezioni di morfina 4 giornaliere potrebbero essere adeguatamente sostituiti con pellet morfina impiantati:. Alla loro rimozione, sia iperalgesia termica e allodinia meccanica sono stati già segnalati nei topi 43. L&#39;infusione di oppiacei attraverso una micro-pompa osmotica è un&#39;altra possibilità<html> 44. Nei roditori, iperalgesia duraturo è realizzabile anche dopo somministrazione acuta di fentanil usando un protocollo mimando l&#39;uso di questo agonista mu-oppioide in chirurgia umana 36,45,46. Limitazioni della Tecnica Specie animali e modelli per il dolore Studi comparativi di numerosi ceppi di topi fornito prove per grandi variazioni nelle risposte nocicettive a stimoli dolorosi 17,31,47 e nei livelli Oih a seguito di trattamento di 4 giorni morfina 22. Se i meccanismi alla base di elaborazione del dolore e modulazione in modelli animali (topi e ratti) sono rilevanti per i pazienti con dolore cronico rimane una domanda fondamentale e aperto. Quindi, molta cautela deve essere prestata l&#39;interpretazione dei dati animali e alla loro validità predittiva per gli esseri umani 16. Differenze di genere nel dolore e analgesia S copi &quot;&gt; sono stati condotti maggior parte degli studi preclinici su modelli animali di dolore su roditori maschi 16,25,48. Nonostante questo bias di selezione, la vista emergente è stato quello di considerare i maschi come responder migliori ai analgesici oppiacei 49,50, meno incline a sviluppare oppioidi iperalgesia 51,52 e più tollerante alla morfina analgesia 53 rispetto alle loro controparti femminili (revisione 54)-indotta. Tuttavia, le differenze di sesso in materia di nocicezione ed efficacia farmaci analgesici non riprendono in tale &#39;un one size fits all&#39; paradigma. Infatti, una ricchezza di dati indica ora che numerose variabili possono influenzare la grandezza e la direzione delle differenze di sesso, quali l&#39;efficacia degli oppioidi droga e selettività, test nocicettivo, background genetico, l&#39;età, lo stato gonado-ormonale o di interazione sociale 48,54. Negli esseri umani, il dolore clinico è più frequente nelle donne, ma se questo fatto rispecchia le reali differenze di sesso rimane una questione di dibattito 48,55,56. For esempio, l&#39;analisi globale di cinquanta studi clinici ha indicato differenze significative nelle proprietà analgesiche tra i generi che meta-analisi eseguita su argomenti pazienti-controllati evidenziato una significativa maggiore efficacia degli oppioidi nelle donne 57. Quest&#39;ultima osservazione, che contrasta nettamente con quello che è stato trovato in roditori, solleva di nuovo diverse domande riguardanti l&#39;origine di tale divergenze 16,48,55,57. Complessivamente, esistono differenze di sesso in analgesia e merito ulteriormente concentrarsi sui meccanismi sottostanti e implicazioni cliniche. A proposito di test nocicettivo Il test ritiro coda è un riflesso spinale, ma può essere soggetto a influenze sovraspinali 58. TIT è relativamente facile da eseguire su ratti ma richiede più competenze nei topi. Un potenziale difficoltà è di mantenere il mouse in una postura corretta senza indurre sollecitazioni indesiderate. Il protocollo proposto può essere regolata a secondadimensioni coorte. 16 animali (8 controllo e 8 trattati) sono facilmente gestibili per quanto riguarda la misurazione dei valori di risposta nocicettiva basali (utilizzando TIT prima, poi TPT per tutta la serie di topi) è sotto preoccupazione. Monitoraggio corsi a tempo analgesia richiede l&#39;istituzione di un calendario preciso e la valutazione del numero massimo di animali che possono essere testati (TIT, poi TPT) entro l&#39;intervallo di tempo impartita (qui 30 min). L&#39;intero gruppo di animali può quindi essere diviso in sottogruppi per consentire lo sperimentatore di rispettare limitazioni cinetiche. Importanza della Tecnica rispetto al / metodi alternativi esistenti OIH nei ratti contro topo I ratti sono stati ampiamente utilizzati per studiare l&#39;analgesia con oppioidi, iperalgesia e tolleranza, a seguito acuta o cronica somministrazione di oppiacei 46,59-61. Infatti, per diversi motivi pratici, essi possono essere considerati miglioritopi come modello animale per esperimenti di dolore 16,61. Tuttavia, fino a poco tempo, la generazione di topi geneticamente modificati non è una procedura semplice. Come numerosi ceppi di topi geneticamente modificati sono già disponibili, il nostro modello offre l&#39;opportunità di studiare il contributo di numerosi geni singoli OIH e sviluppo della tolleranza nei topi. TIT e TPT contro altri test nocicettivi TIT è una variante del test tail flick, la differenza più evidente è l&#39;area di stimolazione. In contrasto con calore radiante, immersione della coda in acqua calda porta ad un aumento rapido e uniforme della sua temperatura. Rispetto ad altre forme di test nocicezione termica (test di hot-piastra o Hargreaves), TIT fornisce risultati abbastanza riproducibili sia attraverso e all&#39;interno di soggetti. TPT è un test molto popolare per lo studio della nocicezione meccanica 26,27,35 che coinvolge probabilmentefibre nocicettive distinti e trasduttori molecolari poi TIT 32. Esso fornisce misure veloci e affidabili 59, ma richiede una certa perizia da sperimentatore e grandi coorti di animali. In alternativa alla analgesimeter utilizzato nel presente studio, altre procedure o apparecchi basandosi su estensimetri esistono (rassegna 27). TPT è più adatto per studiare l&#39;iperalgesia meccanica che filamenti di von Frey sono di solito prese per valutare allodinia meccanica (revisione 27). Le applicazioni future o arrivarci Dopo aver imparato questa tecnica Il modello sperimentale OIH / tolleranza presentiamo qui può essere adattato in modo simile a topi geneticamente modificati al fine di valutare il ruolo dei singoli geni nella modulazione del dolore. Fornisce inoltre un sistema modello per studiare l&#39;efficacia di potenziali agenti terapeutici per alleviare il dolore cronico.

Indotta da oppioidi iperalgesia (OIH) e la tolleranza analgesico limitano l&#39;efficacia clinica di oppiacei negli animali e nell&#39;uomo 1-3. Il coinvolgimento delle pro-infiammatori 4,5 o di pro-nocicettivi (anti-oppioidi) 6,7 sistemi sono attualmente esplorate ipotesi. La delucidazione dei meccanismi alla base OIH e tolleranza richiede una combinazione di in vivo e in vitro approcci, utilizzando modelli animali appropriati, protocolli sperimentali e strumenti molecolari. Farmacologia comportamentale è il paradigma dominante per monitorare e quantificare gli stati analgesici e iperalgesiche negli animali da laboratorio (ratti, topi). L&#39;applicazione di uno stimolo nocivo (chimico termici, meccanici o) ad una parte del corpo comoda (zampa posteriore, coda) dell&#39;animale porta ad un ritiro nocifensive che può essere facilmente ottenuto. Proponiamo qui un approccio metodologico per l&#39;induzione, la registrazione e la quantificazione OIH etolleranza in topi wild-type, utilizzando i test di pressione coda immersione e di coda. La procedura consente una determinazione semplice, sensibile e riproducibile dei valori di risposta nocicettiva termica e meccanica nei topi. Come dimostrato nel protocollo video, C57BL / 6 topi significativa esperienza iperalgesia dopo somministrazione cronica di morfina e mantenere questo per diversi giorni. Entrambi i valori nocicettivi termiche e meccaniche sono significativamente ridotti, rispetto a misurazioni di base sugli animali naïve. Inoltre, il set-up sperimentale permette di monitorare, in aggiunta allo sviluppo di OIH, il declino della risposta analgesica di morfina (tolleranza). Dati presentati supportano l&#39;opinione che iperalgesia e la tolleranza possono comportare meccanismi cellulari e molecolari comuni 8,9, anche se questo è pacifico nella letteratura 1,10-12. Infine, questo protocollo può essere adattato in modo simile a topi geneticamente modificati al fine di valutare il ruolo dei singoli geni nella modulazionezione del dolore. Esso fornisce anche un sistema modello per valutare l&#39;efficacia dei potenziali agenti terapeutici per migliorare effetti analgesici oppiacei.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="879">
	<tbody>
		<tr height="17">
			<td height="34" rowspan="2" style="height:34px;width:220px;">Name</td>
			<td rowspan="2" style="width:231px;">Company</td>
			<td rowspan="2" style="width:139px;">Catalog Number</td>
			<td rowspan="2" style="width:291px;">Comments/description</td>
		</tr>
		<tr height="17">
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:220px;">C57BL/6N Tac mice</td>
			<td style="width:231px;">Taconic, Ry, Denmark</td>
			<td style="width:139px;">C57BL/6N Tac B6-M</td>
			<td style="width:291px;">Male mice (25-30g)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Morphine hydrochloride</td>
			<td style="width:231px;">Francopia, Paris, France</td>
			<td style="width:139px;">CAS n&#176; 52-26-6</td>
			<td style="width:291px;">Delivered with special authorization</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Syringes (Terumo)</td>
			<td style="width:231px;">Dutscher, Brumath, France</td>
			<td style="width:139px;">050000</td>
			<td style="width:291px;">Polypropylene; Sterile; Volume : 1 ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Needles (Terumo)</td>
			<td style="width:231px;">Dutscher, Brumath, France</td>
			<td style="width:139px;">050101</td>
			<td style="width:291px;">G26 &#189; (Terumo reference : NN2613RO1)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:220px;">Mouse restrainer</td>
			<td style="width:231px;">Home-made</td>
			<td style="width:139px;">-</td>
			<td style="width:291px;">Two metallic grids (5x11cm) assembled with adhesive tape and staples.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Thermostated water bath GR150</td>
			<td style="width:231px;">Grant Instruments, Cambridge, UK</td>
			<td style="width:139px;">GP 0540003</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Analgesimeter</td>
			<td style="width:231px;">Panlab, Barcelona, Spain</td>
			<td style="width:139px;">LE 7306</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:220px;">Kaleidagraph software</td>
			<td style="width:231px;">Synergy software, Reading, PA, USA</td>
			<td style="width:139px;">Kaleidagraph 4.03&#160;</td>
			<td style="width:291px;">Scientific graphing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">STATview software</td>
			<td style="width:231px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:291px;">Free download; Statistics</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of morphine-induced hyperalgesia and analgesic tolerance in mice using thermal and mechanical nociceptive modalities

Iperalgesia indotta da oppioidi e tolleranza impatto gravemente l&#39;efficacia clinica di oppiacei come antidolorifici negli animali e nell&#39;uomo. I meccanismi molecolari alla base di entrambi i fenomeni non sono ben compresi e la loro spiegazione dovrebbero beneficiare dallo studio di modelli animali e per l&#39;elaborazione di adeguati protocolli sperimentali. Descriviamo qui un approccio metodologico per l&#39;induzione, la registrazione e la quantificazione iperalgesia indotta dalla morfina, così come per mettere in evidenza la tolleranza analgesica, utilizzando i test di pressione coda immersione e di coda in topi wild-type. Come mostrato nel video, il protocollo è diviso in cinque fasi sequenziali. Fasi di movimentazione e assuefazione permettono una sicura determinazione della risposta nocicettiva basale degli animali. Somministrazione cronica di morfina induce significativa iperalgesia come dimostrato da un aumento sia della sensibilità termica e meccanica, mentre il confronto di analgesia temporali corsi dopo acuta o reptrattamento con morfina eated indica chiaramente lo sviluppo di tolleranza si manifesta con un calo di ampiezza risposta analgesica. Questo protocollo può essere adattato in modo simile a topi geneticamente modificati al fine di valutare il ruolo dei singoli geni nella modulazione della nocicezione e morfina analgesia. Esso fornisce anche un sistema modello per studiare l&#39;efficacia di potenziali agenti terapeutici per migliorare l&#39;efficacia analgesica oppiacei.

Valutazione della basale nocicettive Valori di Mice Naïve (Fase B) TIT e TPT sono stati applicati in sequenza a tutta la coorte di topi (n = 16), fornendo valori di risposta nocicettivi medi. Migliore combinazione di animali ha permesso una definizione a posteriori dei due gruppi (n = 8) dei topi, denominato Saline e morfina, che mostrano valori basali nocicettivi simili e stabili Figura 2. L&#39;equivalenza di entrambi i gruppi è valida qualunque sia il test nocicettivo ( TIT: Figura 2A; TPT: Figura 2B) selezionato. Time-corso per Morphine Analgesia in occasione della Giornata 0 (Fase C) Morfina analgesia è stata valutata dopo una singola iniezione (sc) di morfina (5 mg / kg) nei topi naive utilizzando sia TIT Figura 3A e TPT Figura 3B. In entrambe le prove, analisi statistiche con un modo misure ripetute ANOVA reveal che vi è una significativa interazione tra il trattamento e il tempo per TIT (F (7, 98) = 72, p &lt;0.001) e TPT (F (7, 98) = 31, p &lt;0.001). TIT e dati TPT analisi mediante misure ripetute ANOVA indica che non vi è alcun effetto di soluzione fisiologica iniettabile (F (7, 49) = 0.49, p&gt; 0.05) e F (7, 49) = 1.85, p&gt; 0.05, rispettivamente, per TIT e TPT test), mentre le iniezioni morfina induce una forte analgesia nei topi (F (7, 49) = 92.46, p &lt;0.001) e F (7, 49) = 34.37, p &lt;0.001 rispettivamente per TIT e prove TPT). L&#39;effetto analgesico della morfina massima è stata raggiunta dopo 30 min in TIT e dopo 60 min in TPT rispetto ai controlli con soluzione salina iniettata (p &lt;0,001, t-test per dati non appaiati). Ripetute Amministrazioni morfina Induce iperalgesia nei topi (fase D) Valori basali nocicettivi sono stati misurati ogni giornoprima salina o morfina amministrazione (vedi protocollo). Come mostrato in Figura 4, le amministrazioni morfina volta al giorno per un periodo di trattamento di 6 giorni indotto un significativo e progressivo abbassamento termico (F (7, 56) = 11,6, p &lt;0.001, misure ripetute ANOVA; la figura 4A) e meccanica (F ( 7,56) = 15,55, p &lt;0.001, misure ripetute ANOVA; la figura 4B) nocicettivi valori basali. Iperalgesia sviluppato rapidamente come cominciò ad essere significativo al giorno 1 in TIT (p &lt;0,01, t-test per dati non appaiati, rispetto ai controlli con soluzione salina iniettata) e al giorno 2 in TPT (p &lt;0,05, t-test per dati non appaiati, rispetto alla soluzione salina controlli-iniettata). Time-corso per Morphine Analgesia al 7 ° giorno, dopo il trattamento cronico Morphine (Fase E) Il giorno 7, i topi che hanno ricevuto iniezioni di morfina o salini giornaliere per un periodo di 7 giorni (d0 a d6) sono stati esaminati in TIT Figura 5A e TPT Figura 5B prima per i valori basali nocicettivi e quindi per la loro risposta analgesica di morfina acuta (5 mg / kg, sc.). In accordo con lo sviluppo di iperalgesia mostrato in Figura 4, il valore nocicettivo basale (tempo 0) di topi che sono stati trattati cronicamente con morfina era significativamente inferiore a quella di una soluzione salina iniettata topi di controllo (p &lt;0,001, t-test per dati non appaiati). Seguendo morfina acuta, la risposta nocicettiva del gruppo trattato con morfina cronica significativamente aumentata, ma solo leggermente superiore al valore basale nocicettivo di topi di controllo soluzione salina iniettata misurata a 30 min in TIT e TPT (p &lt;0,01 e p &lt;0,05, t spaiato -test, rispettivamente) e in 60 min in TIT (p &lt;0.05; t-test per dati non appaiati). Da 2 ore dopo il trattamento morfina fino alla fine dell&#39;esperimento, risposte nocicettive restituiti a valori inferiori a quelli dei topi di controllo (p&lt;0,001, spaiato t-test). Confronto delle risposte massime analgesico della morfina topi per prima (giorno 0) e dopo Morphine trattamento cronico (Giorno 7). Valori soglia nocicettiva presentati in Figura 6 sono da TIT (A) e TPT (B) effettuati 30 min dopo l&#39;iniezione salina o morfina come illustrato nelle figure 3 (giorno 0) e 5 (giorno 7). Una forte diminuzione della morfina analgesia è stata osservata in topi dopo un trattamento cronico morfina per 7 giorni in confronto con la loro risposta iniziale analgesia al giorno 0 in entrambi i test nocicettivi (p &lt;0,001 paired t-test). Questi dati dimostrano che la tolleranza si è sviluppata nel dolore degli animali ipersensibili. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51264/51264fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1. Un professionista in cinque fasiprocedura per monitorare morfina-indotto iperalgesia e tolleranza. Il protocollo è suddiviso in cinque fasi sequenziali (AE) per una durata totale di 15 giorni. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51264/51264fig2highres.jpg" width="500" /> . Figura 2 Definizione dei valori basali di risposta nocicettiva (Fase B, D-4 per d-1). L&#39;immersione coda (TIT) (A) e la pressione di coda (TPT) (B) le prove vengono applicati a tutta la serie di animali al fine di valutare i loro valori basali nocicettivi. Successivamente, due gruppi di topi (n = 8), denominato &#39;Saline&#39; e gruppi di &#39;Morfina&#39;, sono definite in modo tale da presentare valori nocicettivi medi stabili e comparabili, qualunque sia la modalità nocicettivo che è considerato. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src = &quot;/ files/ftp_upload/51264/51264fig3highres.jpg&quot; width = &quot;500&quot; /&gt; Figura 3. Tempo portate per analgesia morfina al giorno 0 (Fase C) in TIT (A) e TPT (B). Il valore di risposta nocicettiva basale di topi è stata determinata ogni 30 min dopo singola morfina (5 mg / kg, sc. ) o iniezioni di soluzione salina. I dati sono espressi come media ± SEM, n = 8 topi per gruppo. * P &lt;0.05, ** P &lt;0.01, *** P &lt;0,001, t-test per dati non appaiati rispetto al gruppo di controllo. <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51264/51264fig4highres.jpg" width="500" /> . Figura 4 sviluppo di iperalgesia dopo somministrazione ripetuta di morfina (Fase D; D1 a D6). Nocicettivo Il valore basale di topi è stata determinata mediante TIT (A) e TPT (B) una volta al giorno prima morfina (5 mg / kg,sc.) o la somministrazione di soluzione salina. I dati sono espressi come valori medi ± SEM, n = 8 topi per gruppo. * P &lt;0.05, ** P &lt;0.01, *** P &lt;0.001 da t-test per dati non appaiati rispetto al gruppo di controllo trattato con soluzione salina. <img alt="Figura 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51264/51264fig5highres.jpg" width="500" /> Figura 5. Tempo portate per morfina analgesia in cronico-morfina topi trattati al giorno 7 (fase e) in TIT (A) e TPT (B). I topi che sono stati trattati cronicamente con morfina (punti neri) o salina (triangoli bianchi) dal giorno 0 al giorno 6, ricevuta il giorno 7 una singola iniezione di morfina (5 mg / kg, sc.) o soluzione salina, rispettivamente. La risposta nocicettiva di topi è stata determinata ogni 30 min dopo morfina o iniezione salina. I dati sono espressi come media ± SEM, n = 8 topi per gruppo. * P &lt;0.05, ** P &amp; #60; 0.01 da t-test per dati non appaiati rispetto al gruppo di controllo trattato con soluzione salina. Le barre di errore che non superano le dimensioni simboli sono nascosti. <img alt="Figura 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51264/51264fig6highres.jpg" width="500" /> Figura 6. Confronto delle risposte massime analgesici della morfina a topi (5 mg / kg, sc.) Prima (giorno 0) e dopo il trattamento morfina cronica (giorno 7). I valori riportati sono da esperimenti mostrati in Figura 3 e Figura 5. nocicettivi valori sono stati misurati utilizzando TIT (A) e TPT (B) 30 min dopo morfina o iniezione salina. I dati sono espressi come media ± SEM, n = 8 topi per gruppo. *** P &lt;0.001 per paired t-test.

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Assessment of Morphine-induced Hyperalgesia and Analgesic Tolerance in Mice Using Thermal and Mechanical Nociceptive Modalities

Descriviamo un protocollo di esaminare lo sviluppo di iperalgesia indotta da oppioidi e tolleranza nei topi. Sulla base della misurazione di risposte nocicettive termica e meccanica di capre e morfina-trattata, consente di quantificare l&#39;aumento della sensibilità al dolore (iperalgesia) e diminuire in analgesia (tolleranza) associati alla somministrazione cronica di oppiacei.

Valutazione della morfina-indotta iperalgesia e analgesico tolleranza nei topi mediante nocicettive termica e meccanica Modalità

Opioid-induced hyperalgesia and tolerance severely impact the clinical efficacy of opiates as pain relievers in animals and humans. The molecular ...

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Drugs for Pain Management: Opioid Analgesics and General Anesthetics

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33.0K Views.  Université de Strasbourg.  Descriviamo un protocollo di esaminare lo sviluppo di iperalgesia indotta da oppioidi e tolleranza nei topi. Sulla base della misurazione di risposte nocicettive termica e meccanica di capre e morfina-trattata, consente di quantificare l'aumento della sensibilità al dolore (iperalgesia) e diminuire in analgesia (tolleranza) associati alla somministrazione cronica di oppiacei. 

Video: Assessment of Morphine-induced Hyperalgesia and Analgesic Tolerance in Mice Using Thermal and Mechanical Nociceptive Modalities

Assessment of Motor Balance and Coordination in Mice using the Balance Beam

Brain injury, genetic manipulations, and pharmacological treatments can result in alterations of motor skills in mice. Fine motor coordination and balance can be assessed by the beam walking assay. The goal of this test is for the mouse to stay upright and walk across an elevated narrow beam to a safe platform. This test takes place over 3 consecutive days: 2 days of training and 1 day of testing. Performance on the beam is quantified by measuring the time it takes for the mouse to traverse the beam and the number of paw slips that occur in the process. Here we report the protocol used in our laboratory, and representative results from a cohort of C57BL/6 mice. This task is particularly useful for detecting subtle deficits in motor skills and balance that may not be detected by other motor tests, such as the Rotarod.

Deficits in fine motor coordination can be assessed with the balance beam test. Performance on the beam is quantified by the speed at which the beam is traversed and the number of times the mouse slips on the beam.

Valutazione del bilanciamento del motore e di coordinamento nei topi utilizzando la Balance Beam

Brain injury, genetic manipulations, and pharmacological treatments can result in alterations of motor skills in mice.  Fine motor coordination and ...

Ricerca

Neuroscienze

Rapid Determination of the Thermal Nociceptive Threshold in Diabetic Rats

Painful diabetic neuropathy (PDN) is characterized by hyperalgesia i.e., increased sensitivity to noxious stimulus, and allodynia i.e., hypersensitivity to normally innocuous stimuli1. Hyperalgesia and allodynia have been studied in many different rodent models of diabetes mellitus2. However, as stated by B&ouml;lcskei et al, determination of "pain" in animal models is challenging due to its subjective nature3. Moreover, the traditional methods used to determine behavioral responses to noxious thermal stimuli usually lack reproducibility and pharmacological sensitivity3. For instance, by using the hot-plate method of Ankier4, flinch, withdrawal and/or licking of either hind- and/or fore-paws is quantified as reflex latencies at constant high thermal stimuli (52-55 &deg;C). However, animals that are hyperalgesic to thermal stimulus do not reproducibly show differences in reflex latencies using those supra-threshold temperatures3,5. As the recently described method of B&ouml;lcskei et al.6, the procedures described here allows for the rapid, sensitive and reproducible determination of thermal nociceptive thresholds (TNTs) in mice and rats. The method uses slowly increasing thermal stimulus applied mostly to the skin of mouse/rat plantar surface. The method is particularly sensitive to study anti-nociception during hyperalgesic states such as PDN. The procedures described bellow are based on the ones published in detail by Alm&aacute;si et al 5 and B&ouml;lcskei et al 3. The procedures described here have been approved the Laboratory Animal Care and Use Committee (LACUC), Wright State University.

Here, we describe a rapid reliable and simple procedure to determine the lowest temperature at which rats or mice show nocifensive behavior, i.e. the thermal nociceptive threshold (TNT). This method applies a slowly increasing thermal stimulus allowing precise and reproducible estimation of TNTs with minimum, if any, stress to the animals.

Rapida determinazione della soglia termica nocicettivo in ratti diabetici

Painful diabetic neuropathy (PDN) is characterized by hyperalgesia i.e., increased sensitivity to noxious stimulus, and allodynia i.e., hypersensitivity ...

A Simple and Inexpensive Method for Determining Cold Sensitivity and Adaptation in Mice

Cold hypersensitivity is a serious clinical problem, affecting a broad subset of patients and causing significant decreases in quality of life. The cold plantar assay allows the objective and inexpensive assessment of cold sensitivity in mice, and can quantify both analgesia and hypersensitivity. Mice are acclimated on a glass plate, and a compressed dry ice pellet is held against the glass surface underneath the hindpaw. The latency to withdrawal from the cooling glass is used as a measure of cold sensitivity.
Cold sensation is also important for survival in regions with seasonal temperature shifts, and in order to maintain sensitivity animals must be able to adjust their thermal response thresholds to match the ambient temperature. The Cold Plantar Assay (CPA) also allows the study of adaptation to changes in ambient temperature by testing the cold sensitivity of mice at temperatures ranging from 30 &#176;C to 5 &#176;C. Mice are acclimated as described above, but the glass plate is cooled to the desired starting temperature using aluminum boxes (or aluminum foil packets) filled with hot water, wet ice, or dry ice. The temperature of the plate is measured at the center using a filament T-type thermocouple probe. Once the plate has reached the desired starting temperature, the animals are tested as described above.
This assay allows testing of mice at temperatures ranging from innocuous to noxious. The CPA yields unambiguous and consistent behavioral responses in uninjured mice and can be used to quantify both hypersensitivity and analgesia. This protocol describes how to use the CPA to measure cold hypersensitivity, analgesia, and adaptation in mice.

The Cold Plantar Assay (CPA) measures cold responsiveness between 30 &#176;C and 5 &#176;C, and can also measure cold adaptation. This protocol describes how to use the CPA to measure cold hypersensitivity, analgesia, and adaptation in mice.

Un metodo semplice e poco costoso per la determinazione fredda sensibilità e adattamento nei topi

Cold hypersensitivity is a serious clinical problem, affecting a broad subset of patients and causing significant decreases in quality of life.  The cold ...

Assessment of Hippocampal Dendritic Complexity in Aged Mice Using the Golgi-Cox Method

Dendritic spines are the protuberances from the neuronal dendritic shafts that contain&#160; excitatory synapses. The morphological and branching variations of the neuronal dendrites within the hippocampus are implicated in cognition and memory formation. There are several approaches to Golgi staining, all of which have been useful for determining the morphological characteristics of dendritic arbors and produce a clear background. The present Golgi-Cox method, (a slight variation of the protocol that is provided with a commercial Golgi staining kit), was designed to assess how a relatively low dose of the chemotherapeutic drug 5-flurouracil (5-Fu) would affect dendritic morphology, the number of spines, and the complexity of arborization within the hippocampus. The 5-Fu significantly modulated the dendritic complexity and decreased the spine density throughout the hippocampus in a region-specific manner. The data presented show that the Golgi staining method effectively stained the mature neurons in the CA1, the CA3, and the dentate gyrus (DG) of the hippocampus. This protocol reports the details for each step so that other researchers can reliably stain tissue throughout the brain with high quality results and minimal troubleshooting.

Here we present a Golgi-Cox protocol in extensive detail. This reliable tissue stain method allows for a high-quality assessment of the cytoarchitecture in the hippocampus, and throughout the entire brain, with minimal troubleshooting.

Valutazione della complessità dendritica ippocampale nei topi invecchiati utilizzando il metodo Golgi-Cox

Dendritic spines are the protuberances from the neuronal dendritic shafts that contain&#160; excitatory synapses. The morphological and branching ...

Assessment of Dopaminergic Homeostasis in Mice by Use of High-performance Liquid Chromatography Analysis and Synaptosomal Dopamine Uptake

Dopamine (DA) is a modulatory neurotransmitter controlling motor activity, reward processes and cognitive function. Impairment of dopaminergic (DAergic) neurotransmission is strongly associated with several central nervous system-associated diseases such as Parkinson&#39;s disease, attention-deficit-hyperactivity disorder and drug addiction1,2,3,4. Delineating disease mechanisms involving DA imbalance is critically dependent on animal models to mimic aspects of the diseases, and thus protocols that assess specific parts of the DA homeostasis are important to provide novel insights and possible therapeutic targets for these diseases.
Here, we present two useful experimental protocols that when combined provide a functional read-out of the DAergic system in mice. Biochemical and functional parameters on DA homeostasis are obtained through assessment of DA levels and dopamine transporter (DAT) functionality5. When investigating the DA system, the ability to reliably measure endogenous levels of DA from adult brain is essential. Therefore, we present how to perform high-performance liquid chromatography (HPLC) on brain tissue from mice to determine levels of DA. We perform the experiment on tissue from dorsal striatum (dStr) and nucleus accumbens (NAc), but the method is also suitable for other DA-innervated brain areas.
DAT is essential for reuptake of DA into the presynaptic terminal, thereby controlling the temporal and spatial activity of released DA. Knowing the levels and functionality of DAT in the striatum is of major importance when assessing DA homeostasis. Here, we provide a protocol that allows to simultaneously deduce information on surface levels and function using a synaptosomal6 DA uptake assay.
Current methods combined with standard immunoblotting protocols provide the researcher with relevant tools to characterize the DAergic system.

Synaptosomal dopamine uptake and high-performance liquid chromatography analysis represent experimental tools to investigate dopamine homeostasis in mice by assessing the function of the dopamine transporter and levels of dopamine in striatal tissue, respectively. Here we present protocols to measure dopamine tissue content and assess the functionality of the dopamine transporter.

Valutazione dell'omeostasi dopaminergici in topi tramite l'uso di analisi di cromatografia liquida ad alte prestazioni e assorbimento della dopamina sinaptosomiali

Dopamine (DA) is a modulatory neurotransmitter controlling motor activity, reward processes and cognitive function. Impairment of dopaminergic (DAergic) ...

Visual Evoked Potential Recordings in Mice Using a Dry Non-invasive Multi-channel Scalp EEG Sensor

For scalp EEG research environments with laboratory mice, we designed a dry-type 16 channel EEG sensor which is non-invasive, deformable, and re-usable because of the plunger-spring-barrel structural facet and mechanical strengths resulting from metal materials. The whole process for acquiring the VEP responses in vivo from a mouse consists of four steps: (1) sensor assembly, (2) animal preparation, (3) VEP measurement, and (4) signal processing. This paper presents representative measurements of VEP responses from multiple mice with a submicro-voltage signal resolution and sub-hundred millisecond temporal resolution. Although the proposed method is safer and more convenient compared to other previously reported animal EEG acquiring methods, there are remaining issues including how to enhance the signal-to-noise ratio and how to apply this technique with freely moving animals. The proposed method utilizes easily available resources and shows a repetitive VEP response with a satisfactory signal quality. Therefore, this method could be utilized for longitudinal experimental studies and reliable translational research exploiting non-invasive paradigms.

We designed a dry-type 16 channel EEG sensor which is non-invasive, deformable, and re-usable. This paper describes the whole process from manufacturing the proposed EEG electrode to signal processing of visual evoked potential (VEP) signals measured on a mouse scalp using a dry non-invasive multi-channel EEG sensor.

Registrazioni di potenziali evocate visive nei topi utilizzando un multicanale Non invasiva a secco del cuoio capelluto EEG sensore

For scalp EEG research environments with laboratory mice, we designed a dry-type 16 channel EEG sensor which is non-invasive, deformable, and re-usable ...

Assessment of Sensory Thresholds in Dogs Using Mechanical and Hot Thermal Quantitative Sensory Testing

Quantitative sensory testing (QST) is used to evaluate the function of the somatosensory system in dogs by assessing the response to applied mechanical and thermal stimuli. QST is used to determine normal dogs&#39; sensory thresholds and evaluate alterations in peripheral and central sensory pathways caused by various disease states, including osteoarthritis, spinal cord injury, and cranial cruciate ligament rupture. Mechanical sensory thresholds are measured by electronic von Frey anesthesiometers and pressure algometers. They are determined as the force at which the dog exhibits a response indicating conscious stimulus perception. Hot thermal sensory thresholds are the latency to respond to a fixed or ramped temperature stimulus applied by a contact thermode.
Following a consistent protocol for performing QST and paying attention to details of the testing environment, procedure, and individual study subjects are critical for obtaining accurate QST results for dogs. Protocols for the standardized collection of QST data in dogs have not been described in detail. QST should be performed in a quiet, distraction-free environment that is comfortable for the dog, the QST operator, and the handler. Ensuring that the dog is calm, relaxed, and properly positioned for each measurement helps produce reliable, consistent responses to the stimuli and makes the testing process more manageable. The QST operator and handler should be familiar and comfortable with handling dogs and interpreting dogs&#39; behavioral responses to potentially painful stimuli to determine the endpoint of testing, reduce stress, and maintain safety during the testing process.

This work describes a standard protocol for mechanical and hot thermal quantitative sensory testing to evaluate the somatosensory system in dogs. Sensory thresholds are measured using an electronic von Frey anesthesiometer, pressure algometer, and hot contact thermode.

Valutazione delle soglie sensoriali nei cani mediante test sensoriali quantitativi meccanici e termici caldi

Quantitative sensory testing (QST) is used to evaluate the function of the somatosensory system in dogs by assessing the response to applied mechanical ...

Recording Network Activity in Spinal Nociceptive Circuits Using Microelectrode Arrays

The roles and connectivity of specific types of neurons within the spinal cord dorsal horn (DH) are being delineated at a rapid rate to provide an increasingly detailed view of the circuits underpinning spinal pain processing. However, the effects of these connections for broader network activity in the DH remain less well understood because most studies focus on the activity of single neurons and small microcircuits. Alternatively, the use of microelectrode arrays (MEAs), which can monitor electrical activity across many cells, provides high spatial and temporal resolution of neural activity. Here, the use of MEAs with mouse spinal cord slices to study DH activity induced by chemically stimulating DH circuits with 4-aminopyridine (4-AP) is described. The resulting rhythmic activity is restricted to the superficial DH, stable over time, blocked by tetrodotoxin, and can be investigated in different slice orientations. Together, this preparation provides a platform to investigate DH circuit activity in tissue from na&#239;ve animals, animal models of chronic pain, and mice with genetically altered nociceptive function. Furthermore, MEA recordings in 4-AP-stimulated spinal cord slices can be used as a rapid screening tool to assess the capacity of novel antinociceptive compounds to disrupt activity in the spinal cord DH.

The combined use of microelectrode array technology and 4-aminopyridine-induced chemical stimulation for investigating network-level nociceptive activity in the spinal cord dorsal horn is outlined.

Registrazione dell'attività di rete nei circuiti nocicettivi spinali utilizzando array di microelettrodi

The roles and connectivity of specific types of neurons within the spinal cord dorsal horn (DH) are being delineated at a rapid rate to provide an ...

Mechanical Conflict-Avoidance Assay to Measure Pain Behavior in Mice

Pain comprises of both sensory (nociceptive) and affective (unpleasant) dimensions. In preclinical models, pain has traditionally been assessed using reflexive tests that allow inferences regarding pain's nociceptive component but provide little information about the affective or motivational component of pain. Developing tests that capture these components of pain are therefore translationally important. Hence, researchers need to use non-reflexive behavioral assays to study pain perception at that level. Mechanical conflict-avoidance (MCA) is an established voluntary non-reflexive behavior assay, for studying motivational responses to a noxious mechanical stimulus in a 3 chamber paradigm. A change in a mouse's location preference, when faced with competing noxious stimuli, is used to infer the perceived unpleasantness of bright light versus tactile stimulation of the paws. This protocol outlines a modified version of the MCA assay which pain researchers can use to understand affective-motivational responses in a variety of mouse pain models. Though not specifically described here, our example MCA data use the intraplantar complete Freund's adjuvant (CFA), spared nerve injury (SNI), and a fracture/casting model as pain models to illustrate the MCA procedure.

The mechanical conflict-avoidance assay is used as a non-reflexive readout of pain sensitivity in mice which can be used to better understand affective-motivational responses in a variety of mouse pain models.

Saggio meccanico di prevenzione dei conflitti per misurare il comportamento del dolore nei topi

Pain comprises of both sensory (nociceptive) and affective (unpleasant) dimensions. In preclinical models, pain has traditionally been assessed using ...

Assessment of Thermal Damage from Robot-Drilled Craniotomy for Cranial Window Surgery in Mice

Cranial window surgery allows for the imaging of brain tissue in live mice with the use of multiphoton or other intravital imaging techniques. However, when performing any craniotomy by hand, there is often thermal damage to brain tissue, which is inherently variable surgery-to-surgery and may be dependent on individual surgeon technique. Implementing a surgical robot can standardize surgery and lead to a decrease in thermal damage associated with surgery. In this study, three methods of robotic drilling were tested to evaluate thermal damage: horizontal, point-by-point, and pulsed point-by-point. Horizontal drilling utilizes a continuous drilling schematic, while point-by-point drills several holes encompassing the cranial window. Pulsed point-by-point adds a &#34;2 s on, 2 s off&#34; drilling scheme to allow for cooling in between drilling. Fluorescent imaging of Evans Blue (EB) dye injected intravenously measures damage to brain tissue, while a thermocouple placed under the drilling site measures thermal damage. Thermocouple results indicate a significant decrease in temperature change in the pulsed point-by-point (6.90 &#176;C &#177; 1.35 &#176;C) group compared to the horizontal (16.66 &#176;C &#177; 2.08 &#176;C) and point-by-point (18.69 &#176;C &#177; 1.75 &#176;C) groups. Similarly, the pulsed point-by-point group also showed significantly less EB presence after cranial window drilling compared to the horizontal method, indicating less damage to blood vessels in the brain. Thus, a pulsed point-by-point drilling method appears to be the optimal scheme for reducing thermal damage. A robotic drill is a useful tool to help minimize training, variability, and reduce thermal damage. With the expanding use of multiphoton imaging across research labs, it is important to improve the rigor and reproducibility of results. The methods addressed here will help inform others of how to better use these surgical robots to further advance the field.

Cranial windows have become a ubiquitously implemented surgical technique to allow for intravital imaging in transgenic mice. This protocol describes the use of a surgical robot that performs semi-automated bone drilling of cranial windows and can help reduce surgeon-to-surgeon variability and partially mitigate thermal blood-brain barrier damage.

Valutazione del danno termico da craniotomia robotizzata per la chirurgia della finestra cranica nei topi

Cranial window surgery allows for the imaging of brain tissue in live mice with the use of multiphoton or other intravital imaging techniques. However, ...