La preparazione della fetta spinale MEA 4-AP descritta fornisce una piattaforma per studiare la connettività dei circuiti del corno dorsale e come queste reti interagiscono durante l'elaborazione sensoriale spinale. La metodologia presentata consente di studiare l'attività del circuito del corno dorsale a livello macroscopico regionale di risoluzione. Questa preparazione può essere utilizzata come strumento di screening rapido per valutare la capacità dei composti di interrompere la segnalazione nei circuiti sensoriali spinali.
Questo metodo aiuta a colmare il divario nella nostra comprensione di come l'attività di specifici tipi di cellule e piccoli micro circuiti influenzano grandi popolazioni di neuroni per modellare successivamente l'output delle risposte comportamentali del corno dorsale e, in definitiva, l'esperienza del dolore. Per iniziare, riempire bene il MEA con siero di cavallo per 30 minuti. Dopo aver rimosso il siero, sciacquare accuratamente il MEA cinque volte con acqua distillata fino a quando l'acqua distillata diventa non schiumosa.
Quindi, riempire il pozzo con liquido cerebrospinale artificiale. Dopo aver decapitato il topo anestetizzato, rimuovere la pelle sulla regione addominale facendo un piccolo taglio nella pelle a livello dei fianchi. Quindi, tirare la pelle su entrambi i lati del taglio rostralmente fino a quando tutta la pelle viene rimossa dalla parte superiore della gabbia toracica alla parte superiore del bacino, sia ventralmente che dorsalmente.
Dopo aver posizionato il corpo sul ghiaccio, utilizzare un approccio ventrale per esporre la colonna vertebrale rimuovendo i visceri e tagliando le costole lateralmente allo sterno. Rimuovere la gabbia toracica ventrale, entrambe le scapole, gli arti inferiori e il bacino. Trasferire la colonna vertebrale e la preparazione delle costole in un bagno di dissezione contenente liquido cerebroso artificiale ghiacciato.
Pin tutti e quattro gli angoli della preparazione posizionando i perni attraverso i muscoli della parte bassa della schiena e le costole superiori attaccate. Rimuovere tutti i muscoli e il tessuto connettivo sovrastanti la superficie ventrale delle vertebre con i rongeurs e identificare la regione vertebrale sopra l'allargamento lombo-sacrale, che si trova approssimativamente sotto i corpi vertebrali T12-L2. Rimuovere un corpo vertebrale caudale alla regione di allargamento lombo-sacrale per accedere al midollo spinale seduto sul canale vertebrale.
Usando forbici a molla curve, tagliare bilateralmente i frontoni vertebrali mentre si solleva e si tira il corpo vertebrale rostralmente per separare gli aspetti ventrali e dorsali delle vertebre ed esporre il midollo spinale. Una volta rimossi i corpi vertebrali per rivelare l'allargamento lombo-sacrale, cancellare con cura le radici rimanenti che ancorano il midollo spinale con forbici a molla fino a quando il cordone galleggia libero. Isolare il midollo spinale con tagli rostrali e caudali sopra e sotto l'allargamento lombo-sacrale per far galleggiare liberamente la regione target del cordone.
Per le fette trasversali, sollevare e posizionare il segmento lombo-sacrale per un percorso attaccato su un blocco di polistirene pretagliato con un canale poco profondo tagliato al centro. Quindi, utilizzare l'adesivo cianoacrilato per fissare il blocco e il cavo alla piattaforma di sezionamento e posizionarlo nel bagno di taglio contenente liquame artificiale CSF di saccarosio ghiacciato. Una volta ottenute le fette spesse 300 micrometri, trasferire le fette in una camera di incubazione dell'interfaccia d'aria contenente liquido cerebrospinale artificiale ossigenato e lasciare che le fette si equilibrino per un'ora a temperatura ambiente.
Per iniziare a registrare l'attività del corno dorsale, trasferire la fetta dall'incubatrice al pozzo MEA utilizzando una grande pipetta pasteur a punta riempita con liquido cerebrospinale artificiale e aggiungere ulteriore liquido cerebrospinale artificiale. Utilizzare un pennello per capelli corti per posizionare la fetta sopra l'array di registrazione a 60 elettrodi. Quindi, posizionare un collo pesato sul tessuto per tenerlo in posizione e promuovere un buon contatto con gli elettrodi MEA.
Posizionare il MEA nella fase di testa della registrazione. Controllare la posizione del tessuto sopra gli elettrodi utilizzando un microscopio invertito per confermare che il maggior numero possibile di elettrodi si trova sotto il DH superficiale. Assicurarsi che almeno due o sei elettrodi non entrino in contatto con la fetta. Dopo aver collegato la fotocamera al dispositivo, acquisire un'immagine di riferimento della fetta relativa al MEA da utilizzare durante l'analisi.
Quindi, premere start DAQ nel software di registrazione e confermare che tutti gli elettrodi ricevano un segnale chiaro. Quindi, collegare le linee di ingresso e uscita della perfusione al MEA ben riempito con liquido cerebrospinale artificiale e accendere il sistema di perfusione. Controllare la portata e assicurarsi che il deflusso sia sufficiente per evitare il trabocco del superfusato.
Dopo aver equilibrato il tessuto per cinque minuti, registrare i dati grezzi di base per cinque minuti. Spostare la linea di ingresso della perfusione dal liquido cerebrospinale artificiale a una soluzione di 4-aminopiridina e attendere 12 minuti affinché l'attività ritmica indotta dalla 4-aminopiridina raggiunga lo stato stazionario. Quindi, registrare cinque minuti di attività indotta da 4-aminopiridina ed essere preparati per le registrazioni successive per testare i farmaci o verificare la stabilità della 4-aminopiridina.
Dopo ogni sessione di registrazione, sciacquare le linee con liquido cerebrospinale artificiale. Dopo aver rimosso il MEA dallo stadio di testa e rimosso la rete e il tessuto dal pozzo MEA, sciacquare il MEA e la rete con CSF artificiale e ripetere l'intero processo con una nuova fetta. Aprire il software di analisi e caricare il layout di analisi predefinito.
Aprire il file di interesse e deselezionare l'elettrodo di riferimento e gli eventuali elettrodi ritenuti eccessivamente rumorosi. Impostare la finestra temporale per l'analisi. Quindi, passare alla scheda filtro tra canali.
Selezionare gli elettrodi di riferimento e di riferimento complessi in base all'immagine scattata e alle note prese durante l'esperimento e premere Esplora prima di continuare. Passare alla scheda Filtro EAP e applicare un filtro Butterworth passa-alto di secondo ordine per rimuovere l'attività LFP. Passare alla scheda Filtro LFP e applicare un filtro Butterworth passa banda di secondo ordine per rimuovere l'attività EAP.
Nella scheda Rilevatore EAP, assicurarsi di selezionare la soglia automatica, selezionare le caselle del bordo ascendente e discendente e impostare il tempo morto su tre millisecondi. Per impostare soglie positive e negative, ispezionare i dati tornando alla schermata dell'analizzatore di dati non elaborati, spostando l'indicatore temporale, tornando alla scheda del rilevatore EAP e premendo esplora. Ripetere il processo fino a quando la soglia di rilevamento impostata acquisisce gli EAP senza catturare il rumore o l'attività non fisiologica.
Nella scheda Del rilevatore LFP, assicurarsi di selezionare la soglia manuale, selezionare le caselle del bordo ascendente e discendente e impostare il tempo morto su tre millisecondi. Impostare la soglia per un elettrodo e, una volta soddisfatto, selezionare applica a tutti e quindi premere avvia analisi. L'applicazione in bagno dell'antagonista del canale del sodio voltaggio-dipendente tetrodotossina ha abolito sia l'attività EAP che LFP, confermando la dipendenza da picchi di questi segnali.
La stabilità dei parametri di attività indotta da 4-aminopiridina è stata caratterizzata per EAP o LFP. Tutte le caratteristiche di attività più la coincidenza di attività per le LFP erano stabili in base alla somiglianza dell'attività indotta da 4-aminopiridina a 12 minuti dopo l'applicazione di 4-aminopiridina e 15 minuti dopo. Gli EAP o LFP della funzione sono stati caratterizzati da un aumento del numero di eventi coincidenti rilevati su più elettrodi.
Il numero di elettrodi adiacenti collegati e la forza dei collegamenti tra elettrodi adiacenti e LFP dopo stimolazione della 4-aminopiridina e quindi stabilità relativa. L'orientamento della fetta è una considerazione importante per i preparati in vitro. La stimolazione della 4-aminopiridina ha indotto un'attività ritmica simile nell'SDH indipendentemente dall'orientamento della fetta.
Infine, per far ulteriore luce sulla rilevanza dell'attivazione della 4-aminopiridina delle reti DH, è stata applicata una soluzione di CSF artificiale di potassio elevata e ha dimostrato di evocare una risposta DH simile alla stimolazione della 4-aminopiridina. I passaggi chiave del protocollo sono nella preparazione del tessuto e nel posizionamento delle sezioni, assicurando che il tessuto sia sano attraverso un'attenta, ma tempestiva, dissezione, nonché un delicato posizionamento ottimale del tessuto sul MEA aiuteranno a ottenere risultati di qualità.
