Questo lavoro è stato finanziato dalla American Diabetes Association (ADA), Grant JF1-10-14 (MDiF). Vorremmo ringraziare il personale del Laboratorio delle Risorse Animali presso WSU. Gli autori ringraziano l&#39;assistenza con l&#39;analisi statistica dei dati da Neil Paton, Ph.D.

TNTs di topi e ratti sono determinati utilizzando il incrementale piastra riscaldante analgesia metro [iHPAM, IITC Inc. Life Science (Woodland Hills, CA)]. L&#39;apparecchiatura consiste di diversi componenti: una piastra di alluminio (10 x 20 cm) con il sistema di riscaldamento sotto osservazione e una camera di plexiglass sopra, una unità di controllo termico, software di acquisizione dati (Serie # IITC parte morbida 8), un PC (personal computer) e un pedale per l&#39;avviamento a distanza, fermare o ripristinare il controllo dell&#39;unità. Il sistema di riscaldamento consente inoltre start / stop / reset del processo di riscaldamento manualmente tramite una tastiera di fronte dell&#39;apparecchiatura. Il iHPAM può essere impostato per varie velocità di riscaldamento, standby / cutoff temperature. 1. Attrezzature Set-up <ol><li> Prima di test sugli animali, ispezionare visivamente l&#39;unità di confermare i tassi di riscaldamento scelto (ad esempio, 6 ° C / min), le temperature iniziali standby e Final Cut-off (ad esempio, 28 ° C e 55 ° C, rispettivamente). </li><li> Verificare tutti i collegamenti. Per conservare copia elettronica dei risultati, l&#39;unità deve essere collegata ad un computer che esegue software serie 8. In alternativa, copie cartacee dei risultati possono essere stampati tramite la porta seriale dell&#39;unità. </li><li> Provare il materiale. Premete l&#39;interruttore a pedale una volta per assicurarsi che il software serie 8 record: i dati iniziali in stand-by, le temperature di taglio finale e della durata in secondi necessari per raggiungere il cut-off della temperatura. </li><li> Come prova ulteriore controllo, i ricercatori coinvolti negli esperimenti può avere bisogno di provare il dispositivo su se stessi. Ritirare la mano dalla piastra metallica al momento della percezione del dolore (46-48 ° C) non deve causare danni alla pelle e non produce alcun disagio più tardi. </li><li> Una volta che l&#39;unità è stata impostata e dei risultati delle fasi 1.3 e 1.4 registrate possono essere confrontati. Questo è utile per rilevare potenziali problemi che potrebbero inficiare l&#39;uso dell&#39;apparecchio. Per esempio, le divergenze tra standby iniziale / finale cut-off tempeperature e la lettura effettiva del gruppo, e / o le differenze tra le temperature visualizzate dal gruppo e la temperatura della piastra effettivo richiesto per il ritiro a mano. </li></ol> 2. Test animali normali Giovane o adulto ratti Wistar [post-natale (p) età 21-25 giorni], o topi p21-25) di qualsiasi background genetico o di genere può essere utilizzato. I topi utilizzati nei nostri esperimenti sono del C57BL/6J ceppo. <ol><li> La notte prima degli esperimenti da eseguire, abituare gli animali mettendo loro gabbie sulla panchina dove è collocato il iHPAM. Due ore prima di eseguire i test, accendere il iHPAM per familiarizzare gli animali con il rumore di fondo del gruppo. A questo punto, il iHPAM può essere impostato e testato per verificare il corretto funzionamento (cfr. punti 1). Cibo e acqua viene fornita ad libitum durante tutto il test, tranne quando l&#39;animale è nella camera di osservazione (vedi punto 2.1). Nota: è important non dare per scontato che le condizioni di laboratorio in esperimenti comportamentali sono controllati per impostazione predefinita. Particolare attenzione dovrebbe essere prestata a fattori genetici e ambientali che possono influenzare l&#39;esito degli studi comportamentali (recensione in 7). </li><li> Delicatamente posizionare un topo normale / ratto nella camera di plexiglass osservazione sopra la piastra riscaldante dell&#39;apparecchio. Permettere agli animali di acclimatarsi alla superficie riscaldata (fissata a 28 ° C) fino a quando l&#39;animale mostra un comportamento confortevole. Nota: In queste condizioni ratti adulti normali mostrano un comportamento esplorativa iniziale, di tanto in tanto in piedi verso il coperchio della camera di osservazione durante lo sniffing. Dopo pochi minuti, i ratti possono mostrare attacchi casuali di governare e di un comportamento rilassato. A volte, i ratti giacque con una postura del corpo rilassato (estensione prona), mentre casualmente annusare i dintorni. I topi normali sono in genere più attivi rispetto ai ratti. Tuttavia, i topi mostrano un comportamento esplorativo rilassata dopo pochi minuti in camera di osservazione. E &#39;eccezionalmente raro osservare comportamenti sia in fuga (ad esempio, saltando, cercando di scappare dalla camera di osservazione) o atteggiamenti difensivi (per esempio, strillando). È altresì importante notare che i topi possono comunicare il dolore da un topo all&#39;altro 8. Pertanto, può essere importante per i topi di prova collocati in gabbie separate. </li><li> Posizionare rispecchia nella parte posteriore della camera di osservazione, per consentire osservazioni a tutti gli angoli. Un treppiede in possesso di un videocamera digitale può essere di aiuto per determinare il momento esatto in cui nocifensive (evitando il dolore), il comportamento si era verificato. </li><li> Una volta che l&#39;animale è comodo nel calore della camera di osservazione la piastra premendo il pedale. Quando la temperatura della piastra si riscalda ad una velocità di 6 ° C / minuto, gli animali normali presentano un comportamento che coinvolge sia nocifensive-zampa posteriore * Di solito le temperature imperversano 46-48 ° C 3,5,9,10. Così, l&#39;animale è tipica forma rimosso il osservabilizione della camera dopo circa 3 minuti. Nota: Osservando la risposta tipica di un nocifensive cioè ratto o topo, zampa posteriore-lecca, agitando e / o di sollevamento, è sufficiente a interrompere lo stimolo termico. Ciò si ottiene premendo il pedale. In questo momento, il software registra la temperatura della piastra e la piastra raffredda immediatamente standby fino a quando la temperatura (28 ° C) viene raggiunta (~ 0,5 min). Questa temperatura, il che evoca qualsiasi reazione nocifensive viene considerata come soglia calore nocivo (TNT) del normale (controllo) animale. * A volte, in particolare nei topi, il comportamento nocifensive a temperatura nocivi possono in primo luogo rilevare una o entrambe le zampe anteriori (ad esempio, leccare seduti), pochi secondi prima che le zampe posteriori. Tuttavia, zampa anteriore leccare è un normale componente del comportamento governare. Quindi, solo posteriori-zampa reazioni sono valutate. In occasioni topi possono accudire i loro dietro le zampe pure. Tuttavia, fare grooming normale not durano più di pochi secondi, non comporta intensive leccare e termina di solito dopo aver pulito i suoi artigli. </li><li> Rimuovere delicatamente l&#39;animale dalla piastra e inserirlo nella sua gabbia corrispondente. La misurazione della soglia di calore viene quindi ripetuto per altro controllo (normale) animale. Nota: TNTs può essere determinata in un singolo animale a intervalli di 1-2 minuti senza rimuovere l&#39;animale dalla camera di osservazione. Determinazioni TNT in ratti o topi possono essere ripetuto più volte durante parecchi giorni. Ciò è particolarmente utile per determinare la media TNT di un singolo animale, nonché la sua variazione con l&#39;età. </li><li> La TNT di animali di controllo viene espressa come media di tre o più soglie ± SEM. </li><li> L&#39;analisi statistica dei dati ottenuti viene eseguita per confrontare i diversi gruppi di trattamento di topi o ratti. Procedure parametriche compresa l&#39;analisi della varianza può essere utilizzato in modo appropriato i cui dati sono distribuiti normalmente e dove i gruppi di trattamento sono homoskedastic, quando queste condizioni sono state soddisfatte le seguenti approcci può essere applicata. Analisi della varianza seguita dal test di Newman-Keuls per rilevare le differenze di misurazioni multiple cioè, ripetute TNTs individuali con / senza trattamento o in tempi diversi (ad esempio, i dati della figura 3). Il Student per dati appaiati t-test può essere utilizzato per confrontare due gruppi di dati cioè TNTs prima vs dopo trattamento farmacologico, il t-test non appaiati possono essere utilizzati per determinare le differenze nei cambiamenti in TNT farmaco-veicolo trattati vs animali trattati (ad es , dati in Figura 4). </li></ol> 3. Test animali diabetici La streptozotocina (STZ) indotta ratti diabetici è il modello animale più comunemente usato per studiare i meccanismi di PDN e di valutare i farmaci analgesici e terapie 11,12. Ratti diabetici realizzato da una singola dose intraperitoneale di STZ (60 mg / kg) può be testato per iperalgesia termica durante il 3 ° settimana dopo la comparsa del diabete 11. È importante notare che non tutti i ratti diabetici sviluppano PDN. Tuttavia, gli animali che si sviluppano iperalgesia (~ 50%) può essere facilmente identificato. Infatti, i loro TNTs sono inferiori * normale. * Per determinare TNTs di STZ-ratti diabetici, una temperatura piastra iniziale di 15 ° C invece di 28 ° C viene usata. La ragione di questi cambiamenti è che la maggior parte degli animali diabetici con neuropatia diabetica dolorosa dovrebbero essere iperalgesico 2,11. Pertanto, avranno minore normali soglie di calore nocivi (ad esempio, &lt;45 ° C). <ol><li> Un ratto diabetico viene posta nella camera di osservazione dall&#39;alto dell&#39;apparecchiatura di prova. L&#39;animale è consentito si adatti alla superficie della piastra finché l&#39;animale mostra un comportamento confortevole. Nota: in genere, un topo diabetico non mostra gran parte del comportamento normale. Ratti diabetici sono di solito ipoattivo, letargico, che spesso mostrai movimenti limitati e governare lento. È raro osservare classifica verso il coperchio della camera di osservazione. Dopo pochi minuti, ratti diabetici possono tranquillamente stare in un angolo della camera con casuale sniffing dei dintorni. </li><li> Una volta che l&#39;animale diabetica è confortevole nella camera di osservazione, la piastra viene riscaldata come nella Fase 2,3 ratto diabetico può esibire un comportamento nocifensive coinvolge o posteriore / anteriore zampa. Ciò accade solitamente a temperature non nocivi piastra (ad esempio, &lt;45 ° C), o dopo non più di 5 minuti nella camera con il ° C / min 6 aumento della temperatura. Nota: La risposta nocifensive di un giovane topo diabetico adulto non differisce da quella di un topo normale. Tuttavia, la temperatura più bassa che evoca un tale comportamento è notevolmente abbassata. </li><li> Osservate il Passo 2,4 </li><li> La media di più di tre soglie nel giorno dell&#39;esperimento espresso in ° C ± SEM è considerata la soglia calore nocivo del diabetic animale. Nota: Un paradigma simile a quello descritto per ratti normali e diabetici può essere seguito per determinare la termica anti-nocifensive effetto di analgesici a soglie di calore. </li></ol> 4. Test Analgesia Le proprietà anti-nocicettivi di farmaci (ad esempio, analgesici), nonché la determinazione dei parametri farmacologici come la dose minima efficace può essere facilmente ottenuto utilizzando i passi spiegati sopra. Si prevede che le dosi adeguate di un analgesico somministrato ai ratti / topi finirebbe per aumentare significativamente i loro TNTs. Questo è particolarmente sensibile negli animali con iperalgesia termica 3. Tuttavia, per evitare distorsioni nell&#39;interpretazione dei risultati, i ricercatori coinvolti nella osservazione del comportamento di un gruppo animale non deve sapere o conoscere se gli animali erano stati trattati o meno. Inoltre, i farmaci da iniettare da un osservatore può essere preparata da un altro ricercatore ed etichettateA, B, C, ecc dosaggio viene fornito in una stampa, elencando dosi individuali per animale identificato. A seconda del farmaco da testare, diverse dosi di un analgesico potenziale possono essere somministrati agli animali normali o diabetici 5-15 min prove preliminari comportamentali. Opportuni controlli devono essere inclusi (cioè, di pari età animali iniettati con il solo veicolo e / o ratti diabetici senza PDN) e testato usando condizioni identiche (per esempio, stessa temperatura di partenza della piastra). Gli effetti cronici di farmaci possono essere testati. 5. Risultati rappresentativi La temperatura più bassa piastra di evocare reazioni nocifensive in entrambi i posteriori-zampa di giovani adulti normali non trattati ratti o topi sono stati determinati seguenti passaggi 2-1 a 2-6. Come mostrato in figura 1, TNT di ratti giovani adulti normali e topi erano 47,2 ± 0,2 ° C e 47,5 ± 0,5 ° C, rispettivamente. Abbiamo obserestano riservati non significativa variazione giornaliera di TNTs dell&#39;individuo (Figura 2A), né cambiamenti significativi di TNTs tra individui della stessa età (Figura 2B). TNT differenze dovute al genere non sono stati osservati (non mostrato). TNTs di giovani adulti STZ-diabetici ratti sono stati determinati in modo simile per ratti normali (passi da 3.1 a 3.3). Tuttavia, la temperatura della piastra di partenza è stato impostato a 15 ° C invece di 28 ° C. Il comportamento di nocifensive STZ-ratti diabetici è stata valutata almeno tre volte in un individuo e in modo giornaliera a partire undici giorni post-iniezione STZ. Come mostrato in figura 3, un calo significativo (p &lt;0,01) in TNT di STZ-ratti diabetici diventa evidente due settimane post-iniezione STZ. La TNT media di STZ-ratti diabetici era 45,6 ± 0,1 ° C (n = 16, i valori raccolti da giorni 14-23). Ratti diabetici presentano significativamente più basso rispetto TNT Normal sono stati considerati di avere PDN. Questi topi sono stati usati per testare le acute anti-nocicettivi proprietà di un analgesico (composto A). TNTs sono stati determinati in ratti normali e diabetici iniettati con una dose singola del composto o solo veicolo cinque minuti prima del test. Come mostrato in figura 4, un singolo intra-peritoneale dose del composto aumentato significativamente TNTs di ratti diabetici rispetto a ratti trattati con solo veicolo (45,6 ° C vs 47,6 ° C, rispettivamente). L&#39;anti-nocifensive effetto del composto A è stata anche osservata in ratti normali, sebbene significativa (p &lt;0,01), era meno pronunciato (47,4 ° C vs 48,0 ° C, rispettivamente). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3785/3785fig1.jpg" /> Figura 1. Determinazione del TNTs di ratti normali giovani adulti o topi: Le TNTs di ratti giovani adulti (p21-24) (o topi p20-21) sono stati testati nel iHPAM seguendo la procedura descritta above. Un totale di 12 ratti e 25 topi sono stati testati. Le misurazioni sono state eseguite durante diversi giorni ed i risultati sono stati raccolti. I risultati sono espressi come media ± SEM. Il valori minimo e massimo TNT registrata in questi ratti erano 46,2 ° C e 48,6 ° C rispettivamente. Nel caso di topi, i valori massimo e minimo TNT registrati erano 48,8 ° C e 44,9 ° C, rispettivamente. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3785/3785fig2.jpg" /> Figura 2. Età-dipendenza di TNTs in ratti e topi: A) tracciati sono i TNTs di quattro ratti normali (n = 4) di 21 giorni di età determinato almeno tre volte al giorno per 5 giorni B) TNTs di topi figliata determinata una volta indicato. età. I numeri sopra determinazione ciascun punto rappresenta il numero di cucciolata utilizzati. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3785/3785fig3.jpg" /> Figura 3. Ratti diabetici diventano 3 iperalgesico noieks dopo la comparsa del diabete: TNTs di sei (n = 6) pari età giovani-adulte STZ ratti diabetici sono stati determinati tutti i giorni a partire 11 giorni dopo l&#39;induzione del diabete. Vengono mostrati giornaliere medie TNT (media ± SEM). TNTs diabetici stati fissati tra 11-13 giorni dopo l&#39;iniezione di STZ erano all&#39;interno del range di normalità (linea rossa). Due settimane dopo l&#39;iniezione di STZ TNTs notevole calo a 45,1 ± 0,4 ° C, (p &lt;0,05). <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3785/3785fig4.jpg" /> Figura 4. Acuta anti-nocifensive effetti di composto B in STZ-ratti diabetici. Giovani ratti adulti normali (blu gruppo di n = 12) e l&#39;età corrispondente STZ-ratti diabetici iperalgesiche verde (gruppo n = 6) sono stati testati nel iHPAM dopo l&#39;iniezione intraperitoneale di veicolo (barre scure) o composti A (barre chiare). La media ± SEM TNT per ciascun trattamento (controllo del veicolo o il composto A-trattato) sono mostrati. Gli asterischi indicano differenze statistiche(P &lt;0,05).

<ol>
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Abbiamo deciso di non rivelare l&#39;identità del analgesica utilizzata in questi esperimenti. Parte dei risultati riportati qui è stato presentato nei 71 st Sessioni Scientifiche della American Diabetes Association (San Diego CA) e il 47 ° Meeting annuale dell&#39;Associazione Europea per lo Studio del Diabete (Lisbona, Portogallo).

Analogamente al test classico piatto caldo per quantificare iperalgesia termica 4,13, il dosaggio di nocicezione qui descritto consente in modo rapido e affidabile per quantificare il comportamento nocifensive in ratti e topi. Tuttavia, contrariamente a test classico, il incrementale hot-plate metodo è non invasivo e praticamente priva di stress. Sebbene alcuni trattenere è necessario eseguire il test (cioè, l&#39;animale deve essere nella camera di osservazione), ratti o topi sono abituati ad are...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> Incrementale Hot-Plate Analgesia Meter </td><td> IITC Inc. Life Science </td><td> Part # PE34 </td></tr><tr><td> Serie soft 8 </td><td> IITC Inc. Life Science </td><td> Part # Series8 </td></tr><tr><td> Streptozotocina </td><td> Calbiochem </td><td> 572201 </td></tr></tbody></table>

rapid determination of the thermal nociceptive threshold in diabetic rats

Neuropatia diabetica dolorosa (PDN) è caratterizzata da iperalgesia cioè, aumento della sensibilità agli stimoli nocivi, e cioè allodinia, ipersensibilità a stimoli normalmente innocui 1. Iperalgesia e allodinia sono stati studiati in molti modelli di roditori diversi di diabete mellito 2. Tuttavia, come affermato da Bölcskei et al, la determinazione del &quot;dolore&quot; in modelli animali è difficile a causa della sua natura soggettiva 3. Inoltre, i metodi tradizionali utilizzati per determinare le risposte comportamentali a stimoli termici nocivi di solito mancano di riproducibilità e 3 sensibilità farmacologica. Per esempio, utilizzando il metodo della piastra calda di Ankier 4, sussulto, ritiro e / o leccare di una posteriore e / o le zampe anteriori è quantificato come latenze reflex a costanti stimoli termici elevati (52-55 ° C). Tuttavia, gli animali che sono iperalgesico di stimolo termico non riproducibile mostrato differenze di relatenze Flex utilizzando le sovra-temperature soglia 3,5. Come il metodo descritto di recente Bölcskei et al. 6, le procedure descritte qui consente la determinazione rapida, sensibile e riproducibile di soglie nocicettivi termici (TNTs) in topi e ratti. Il metodo utilizza aumentando lentamente stimolo termico applicato soprattutto alla pelle di topo / ratto superficie plantare. Il metodo è particolarmente sensibile per studiare anti-nocicezione durante stati iperalgesiche come PDN. Le procedure descritte sotto sono basate su quelle pubblicate in dettaglio da Almasi et al 5 e Bölcskei et al 3. Le procedure descritte qui sono stati approvati la cura degli animali da laboratorio e Comitato uso (LACUC), Wright State University.

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Rapid Determination of the Thermal Nociceptive Threshold in Diabetic Rats

Qui, descriviamo una procedura rapida, semplice e affidabile per determinare la temperatura minima alla quale i ratti o topi mostrare un comportamento nocifensive,<em&gt; Ie</em&gt; Il<em&gt; Soglia termica nocicettiva</em&gt; (TNT). Questo metodo si applica uno stimolo lento aumento termico permettendo stima preciso e riproducibile di TNTs con minimo eventuali sollecitazioni agli animali.

Rapida determinazione della soglia termica nocicettivo in ratti diabetici

Painful diabetic neuropathy (PDN) is characterized by hyperalgesia i.e., increased sensitivity to noxious stimulus, and allodynia i.e., hypersensitivity ...

rapid-determination-thermal-nociceptive-threshold-diabetic

Research

JoVE Journal

Neuroscience

27.4K Views.  Wright State University. Qui, descriviamo una procedura rapida, semplice e affidabile per determinare la temperatura minima alla quale i ratti o topi mostrare un comportamento nocifensive, Ie Il Soglia termica nocicettiva (TNT). Questo metodo si applica uno stimolo lento aumento termico permettendo stima preciso e riproducibile di TNTs con minimo eventuali sollecitazioni agli animali.

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A General Method for Evaluating Incubation of Sucrose Craving in Rats

For someone on a food-restricted diet, food craving in response to food-paired cues may serve as a key behavioral transition point between abstinence and relapse to food taking 1. Food craving conceptualized in this way is akin to drug craving in response to drug-paired cues. A rich literature has been developed around understanding the behavioral and neurobiological determinants of drug craving; we and others have been focusing recently on translating techniques from basic addiction research to better understand addiction-like behaviors related to food 2-4.
As done in previous studies of drug craving, we examine sucrose craving behavior by utilizing a rat model of relapse. In this model, rats self-administer either drug or food in sessions over several days. In a session, lever responding delivers the reward along with a tone+light stimulus. Craving behavior is then operationally defined as responding in a subsequent session where the reward is not available. Rats will reliably respond for the tone+light stimulus, likely due to its acquired conditioned reinforcing properties 5. This behavior is sometimes referred to as sucrose seeking or cue reactivity. In the present discussion we will use the term "sucrose craving" to subsume both of these constructs.
In the past decade, we have focused on how the length of time following reward self-administration influences reward craving. Interestingly, rats increase responding for the reward-paired cue over the course of several weeks of a period of forced-abstinence. This "incubation of craving" is observed in rats that have self-administered either food or drugs of abuse 4,6. This time-dependent increase in craving we have identified in the animal model may have great potential relevance to human drug and food addiction behaviors.
Here we present a protocol for assessing incubation of sucrose craving in rats. Variants of the procedure will be indicated where craving is assessed as responding for a discrete sucrose-paired cue following extinction of lever pressing within the sucrose self-administration context (Extinction without cues) or as responding for sucrose-paired cues in a general extinction context (Extinction with cues).

Responding for food or drug-paired cues increases over the course of a period of abstinence and this may relate to an increased susceptibility to relapse behaviors. Here we detail a procedure for evaluating this "incubation of craving" in rats that have self-administered sucrose.

Un metodo generale per la valutazione di incubazione della brama di saccarosio in ratti

For someone on a food-restricted diet, food craving in response to food-paired cues may serve as a key behavioral transition point between abstinence and ...

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Neuroscienze

Local and Global Methods of Assessing Thermal Nociception in Drosophila Larvae

In this article, we demonstrate assays to study thermal nociception in Drosophila larvae. One assay involves spatially-restricted (local) stimulation of thermal nociceptors1,2 while the second involves a wholesale (global) activation of most or all such neurons3. Together, these techniques allow visualization and quantification of the behavioral functions of Drosophila nociceptive sensory neurons.
The Drosophila larva is an established model system to study thermal nociception, a sensory response to potentially harmful temperatures that is evolutionarily conserved across species1,2. The advantages of Drosophila for such studies are the relative simplicity of its nervous system and the sophistication of the genetic techniques that can be used to dissect the molecular basis of the underlying biology4-6 In Drosophila, as in all metazoans, the response to noxious thermal stimuli generally involves a "nocifensive" aversive withdrawal to the presented stimulus7. Such stimuli are detected through free nerve endings or nociceptors and the amplitude of the organismal response depends on the number of nociceptors receiving the noxious stimulus8. In Drosophila, it is the class IV dendritic arborization sensory neurons that detect noxious thermal and mechanical stimuli9 in addition to their recently discovered role as photoreceptors10. These neurons, which have been very well studied at the developmental level, arborize over the barrier epidermal sheet and make contacts with nearly all epidermal cells11,12. The single axon of each class IV neuron projects into the ventral nerve cord of the central nervous system11 where they may connect to second-order neurons that project to the brain.
Under baseline conditions, nociceptive sensory neurons will not fire until a relatively high threshold is reached. The assays described here allow the investigator to quantify baseline behavioral responses or, presumably, the sensitization that ensues following tissue damage. Each assay provokes distinct but related locomotory behavioral responses to noxious thermal stimuli and permits the researcher to visualize and quantify various aspects of thermal nociception in Drosophila larvae. The assays can be applied to larvae of desired genotypes or to larvae raised under different environmental conditions that might impact nociception. Since thermal nociception is conserved across species, the findings gleaned from genetic dissection in Drosophila will likely inform our understanding of thermal nociception in other species, including vertebrates.

Local and Global Methods of Assessing Thermal Nociception in Drosophila Larvae

In this article, we demonstrate assays to study thermal nociception in Drosophila larvae. One assay involves spatially-restricted (local) stimulation of thermal nociceptors1,2 while the second involves a wholesale (global) activation of most or all such neurons3. Together, these techniques allow visualization and quantification of the behavioral functions of Drosophila nociceptive sensory neurons.

Metodi locale e globale valutazione nocicezione termica in<em&gt; Drosophila</em&gt; Le larve

In this article, we demonstrate assays to study thermal nociception in Drosophila larvae. One assay involves spatially-restricted (local) stimulation of ...

Assessment of Morphine-induced Hyperalgesia and Analgesic Tolerance in Mice Using Thermal and Mechanical Nociceptive Modalities

Opioid-induced hyperalgesia and tolerance severely impact the clinical efficacy of opiates as pain relievers in animals and humans. The molecular mechanisms underlying both phenomena are not well understood and their elucidation should benefit from the study of animal models and from the design of appropriate experimental protocols. 
We describe here a methodological approach for inducing, recording and quantifying morphine-induced hyperalgesia as well as for evidencing analgesic tolerance, using the tail-immersion and tail pressure tests in wild-type mice. As shown in the video, the protocol is divided into five sequential steps. Handling and habituation phases allow a safe determination of the basal nociceptive response of the animals. Chronic morphine administration induces significant hyperalgesia as shown by an increase in both thermal and mechanical sensitivity, whereas the comparison of analgesia time-courses after acute or repeated morphine treatment clearly indicates the development of tolerance manifested by a decline in analgesic response amplitude. This protocol may be similarly adapted to genetically modified mice in order to evaluate the role of individual genes in the modulation of nociception and morphine analgesia. It also provides a model system to investigate the effectiveness of potential therapeutic agents to improve opiate analgesic efficacy.

We describe a protocol to examine the development of opioid-induced hyperalgesia and tolerance in mice. Based on the measurement of thermal and mechanical nociceptive responses of na&#239;ve and morphine-treated animals, it allows to quantify the increase in pain sensitivity (hyperalgesia) and decrease in analgesia (tolerance) associated with chronic opiate administration.

Valutazione della morfina-indotta iperalgesia e analgesico tolleranza nei topi mediante nocicettive termica e meccanica Modalità

Opioid-induced hyperalgesia and tolerance severely impact the clinical efficacy of opiates as pain relievers in animals and humans. The molecular ...

Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster has been used as an excellent model organism to study environmental and genetic manipulations that affect behavior. One such behavior is spontaneous locomotor activity. Here we describe our protocol that utilizes Drosophila population monitors and a tracking system that allows continuous monitoring of the spontaneous locomotor activity of flies for several days at a time. This method is simple, reliable, and objective and can be used to examine the effects of aging, sex, changes in caloric content of food, addition of drugs, or genetic manipulations that mimic human diseases.

Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster are useful in studying genetic or environmental manipulations that affect behaviors such as spontaneous locomotor activity.&#160; Here we describe a protocol that utilizes monitors with infrared beams and data analysis software to quantify spontaneous locomotor activity.&#160;

Determinazione del locomotore attività spontanea in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Drosophila melanogaster has been used as an excellent model organism to study environmental and genetic manipulations that affect behavior. One such ...

Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome

3,4-Methylenedioxymethamphetamine (MDMA; ecstasy) toxicity may cause region-specific changes in serotonergic mRNA expression due to acute serotonin (5-hydroxytryptamine; 5-HT) syndrome. This hypothesis can be tested using in situ hybridization to detect the serotonin 5-HT2A receptor gene htr2a. In the past, such procedures, utilizing radioactive riboprobe, were difficult because of the complicated workflow that needs several days to perform and the added difficulty that the technique required the use of fresh frozen tissues maintained in an RNase-free environment. Recently, the development of short oligonucleotide probes has simplified in situ hybridization procedures and allowed the use of paraformaldehyde-prefixed brain sections, which are more widely available in laboratories. Here, we describe a detailed protocol using non-radioactive oligonucleotide probes on the prefixed brain tissues. Hybridization probes used for this study include dapB (a bacterial gene coding for dihydrodipicolinate reductase), ppiB (a housekeeping gene coding for peptidylprolyl isomerase B), and htr2a (a serotonin gene coding for 5-HT2A receptors). This method is relatively simply, cheap, reproducible and requires less than two days to complete.

Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome

This protocol describes a rapid and simplified in situ hybridization method ideal forparaformaldehyde-prefixed brain, thus reducing the need for prolonged complex steps while using fresh frozen tissues. The method is validated using the identification of the serotonin 5-HT2A receptor gene htr2a in rats.

Rapido<em&gt; In Situ</em&gt; Ibridazione utilizzando oligonucleotidi sonde su Paraformaldeide prefissa cervello di ratti con Sindrome serotoninergica

3,4-Methylenedioxymethamphetamine (MDMA; ecstasy) toxicity may cause region-specific changes in serotonergic mRNA expression due to acute serotonin ...

Measurement &amp; Analysis of the Temporal Discrimination Threshold Applied to Cervical Dystonia

The temporal discrimination threshold (TDT) is the shortest time interval at which an observer can discriminate two sequential stimuli as being asynchronous (typically 30-50 ms). It has been shown to be abnormal (prolonged) in neurological disorders, including cervical dystonia, a phenotype of adult onset idiopathic isolated focal dystonia. The TDT is a quantitative measure of the ability to perceive rapid changes in the environment and is considered indicative of the behavior of the visual neurons in the superior colliculus, a key node in covert attentional orienting. This article sets out methods for measuring the TDT (including two hardware options and two modes of stimuli presentation). We also explore two approaches of data analysis and TDT calculation. The application of the assessment of temporal discrimination to the understanding of the pathogenesis of cervical dystonia and adult onset idiopathic isolated focal dystonia is also discussed.

Methods for the measurement and analysis of the temporal discrimination threshold are presented, and its application to the study of the pathogenesis of cervical dystonia are discussed.

La misura e l'analisi della soglia di discriminazione temporale applicata alla distonia cervicale

The temporal discrimination threshold (TDT) is the shortest time interval at which an observer can discriminate two sequential stimuli as being ...

Rapid and Specific Immunomagnetic Isolation of Mouse Primary Oligodendrocytes

The efficient and robust isolation and culture of primary oligodendrocytes (OLs) is a valuable tool for the in vitro study of the development of oligodendroglia as well as the biology of demyelinating diseases such as multiple sclerosis and Pelizaeus-Merzbacher-like disease (PMLD). Here, we present a simple and efficient selection method for the immunomagnetic isolation of stage three O4+ preoligodendrocytes cells from neonatal mice pups. Since immature OL constitute more than 80% of the rodent-brain white matter at postnatal day 7 (P7) this isolation method not only ensures high cellular yield, but also the specific isolation of OLs already committed to the oligodendroglial lineage, decreasing the possibility of isolating contaminating cells such as astrocytes and other cells from the mouse brain. This method is a modification of the techniques reported previously, and provides oligodendrocyte preparation purity above 80% in about 4 h.

We describe the immunomagnetic isolation of primary mouse oligodendrocytes, which allows the rapid and specific isolation of the cells for in vitro culture.

Rapido e specifico immunomagnetica isolamento degli oligodendrociti primario del Mouse

The efficient and robust isolation and culture of primary oligodendrocytes (OLs) is a valuable tool for the in vitro study of the development of ...

Establishment of Acute Pontine Infarction in Rats by Electrical Stimulation

Pontine infarction is the most common stroke subtype in the posterior circulation, while there lacks a rodent model mimicking pontine infarction. Provided here is a protocol for successfully establishing a rat model of acute pontine infarction. Rats weighing about 250 g are used, and a probe with an insulated sheath is injected into the pons using a stereotaxic apparatus. A lesion is produced by the electrical stimulation with a single pulse. The Longa score, Berderson score, and beam balance test are used to assess neurological deficits. Additionally, the adhesive-removal somatosensory test is used to determine sensorimotor function, and the limb placement test is used to evaluate proprioception. MRI scans are then used to assess the infarction in vivo, and TTC staining is used to confirm the infarction in vitro. Here, a successful infarction is identified that is located in the anterolateral basis of the rostral pons. In conclusion, a new method is described to establish an acute pontine infarction rat model.

Presented here is a protocol for establishing acute pontine infarction in a rat model via electrical stimulation with a single pulse.

Istituzione dell'infarto pontino acuto nei ratti mediante stimolazione elettrica

Pontine infarction is the most common stroke subtype in the posterior circulation, while there lacks a rodent model mimicking pontine infarction. Provided ...

Laser-Induced Brain Injury in the Motor Cortex of Rats

A common technique for inducing stroke in experimental rodent models involves the transient (often denoted as MCAO-t) or permanent (designated as MCAO-p) occlusion of the middle cerebral artery (MCA) using a catheter. This generally accepted technique, however, has some limitations, thereby limiting its extensive use. Stroke induction by this method is often characterized by high variability in the localization and size of the ischemic area, periodical occurrences of hemorrhage, and high death rates. Also, the successful completion of any of the transient or permanent procedures requires expertise and often lasts for about 30 minutes. In this protocol, a laser irradiation technique is presented that can serve as an alternative method for inducing and studying brain injury in rodent models.
When compared to rats in the control and MCAO groups, the brain injury by laser induction showed reduced variability in body temperature, infarct volume, brain edema, intracranial hemorrhage, and mortality. Furthermore, the use of a laser-induced injury caused damage to the brain tissues only in the motor cortex unlike in the MCAO experiments where destruction of both the motor cortex and striatal tissues is observed.
Findings from this investigation suggest that laser irradiation could serve as an alternative and effective technique for inducing brain injury in the motor cortex. The method also shortens the time for completing the procedure and does not require expert handlers.

The protocol presented here shows a technique to create a rodent model of brain injury. The method described here uses laser irradiation and targets motor cortex.

Lesione cerebrale indotta dal laser nella Corteccia Motoria dei Ratti

A common technique for inducing stroke in experimental rodent models involves the transient (often denoted as MCAO-t) or permanent (designated as MCAO-p) ...

Induction of Diffuse Axonal Brain Injury in Rats Based on Rotational Acceleration

Traumatic brain injury (TBI) is a major cause of death and disability. Diffuse axonal injury (DAI) is the predominant mechanism of injury in a large percentage of TBI patients requiring hospitalization. DAI involves widespread axonal damage from shaking, rotation or blast injury, leading to rapid axonal stretch injury and secondary axonal changes that are associated with a long-lasting impact on functional recovery. Historically, experimental models of DAI without focal injury have been difficult to design. Here we validate a simple, reproducible and reliable rodent model of DAI that causes widespread white matter damage without skull fractures or contusions.

This protocol validates a reliable, easy-to-perform and reproducible rodent model of brain diffuse axonal injury (DAI) that induces widespread white matter damage without skull fractures or contusions.

Induzione di lesioni cerebrali assonali diffuse nei ratti in base all'accelerazione rotazionale

Traumatic brain injury (TBI) is a major cause of death and disability. Diffuse axonal injury (DAI) is the predominant mechanism of injury in a large ...