Ringraziamo Adam Coster e tutti gli altri membri dei laboratori Altschuler e Wu per il feedback utili e discussioni. Questa ricerca è stata sostenuta dal National Institute of Health concede R01 GM085442 e CA133253 (SJA), R01 GM081549 (LFW), CPRIT RP10900 (LFW), e la Welch Fondazione I-1619 (SJA) e I-1644 (LFW).

1. Campioni Preparazione e Imaging <ol><li> Coltura cellulare <ol><li> Split culture di routine e mantenere al 20-70% di confluenza. Un giorno prima dell&#39;esperimento, crescere cellule HeLa in DMEM (Dulbecco Modified Eagle Medium, vedi Tabella dei Materiali) e completata con il 10% FBS (siero fetale bovino) e 1x penicillina / streptomicina. </li><li> Il giorno dell&#39;esperimento, le celle divise in crescita in coltura (circa il 50% confluenti). </li><li> Lavare le cellule con PBS (Phosphate Buffered Saline), esporre a circa 2 ml di tripsina / EDTA (Etilendiammintetraacetato) per alcuni secondi. Aspirare eccesso tripsina / EDTA e mantenere le cellule immerse in una sottile pellicola di tripsina / EDTA nella cappa a temperatura ambiente per ~ 3 min. </li><li> Meccanicamente scuotere fiaschi due volte e staccare le cellule con siero integrato dei media. Contare le celle e diluire a 5.000 cells/50 microlitri di media e piastra subito 50 microlitri / pozzetto su una piastra inferiore di vetro 384 pozzetti utilizzando una manipolazione liquido robot automatico (solo il 30 benes della piastra sono usati qui). </li><li> Incubare la piastra a temperatura ambiente per 30 minuti per minimizzare gli effetti di bordo in pozzetti 5. Dopo RT incubazione, posto piastre a 37 ° C 5% CO 2 incubatore / notte. </li><li> Ogni farmaco viene saggiata in duplicato. Aggiungere 25 ml di farmaco ai corrispondenti pozzetti sulla piastra già contenente supporti. </li><li> Fissare la piastra con una soluzione di paraformaldeide al 4% in PBS a 24 ore dopo trattamento farmacologico. </li></ol></li><li> Colorazione Gli anticorpi specifici primari, anticorpi secondari fluorescente-etichettati e altre macchie fluorescenti che sono stati utilizzati qui sono elencati nella Tabella dei Materiali. <ol><li> Permeabilize cellule fissate con 0,2% Triton X-100 soluzione in TBS (soluzione salina tamponata con Tris) per 3 minuti, e lavare con TBST (soluzione salina tamponata con Tris + Tween 20) 3x. Aggiungere la soluzione 5% BSA (Bovine Serum Albumin) in TBST per il blocco. </li><li> Incubare la piastra a temperatura ambiente per 2 ore e poi lavare con TBST 3x. </li><li> Fai dilut anticorpo primarioioni a 5% BSA in TBST (vedi Tabella dei Materiali) e aggiungere 10 microlitri / pozzetto. Incubare la piastra a temperatura ambiente per 2 ore, e poi lavare 3x con TBST. </li><li> Fai dilutionin anticorpo secondario 5% BSA in TBST (vedi Tabella dei Materiali) e aggiungere 10 microlitri / pozzetto. </li><li> Incubare la piastra al buio a temperatura ambiente per 2 ore e poi lavare due volte con TBST. </li><li> Preparare diluizioni per la Hoechst e falloidina (vedi Tabella dei Materiali) in PBS e aggiungere 10 microlitri / pozzetto. </li><li> Incubare la piastra al buio per 30 minuti a RT. </li><li> Dopo 2 lavaggi TBST, piastre di copertura in fogli e conservare a 4 ° CO / N. </li></ol></li><li> Imaging Acquisire le immagini utilizzando un microscopio a epifluorescenza con obiettivo 20X con la macchina fotografica 1x1 binning. Acquisire sedici immagini per ogni pozzetto, per un totale di 480 immagini (canali x3). </li></ol> 2. Analizzando Immagini Scaricare e installare PhenoRipper da phenoripper.org, e lanciare PhenoRipper per iniziare l&#39;analisi di imaGES. PhenoRipper attualmente supporta TIFF, PNG e JPEG e tutti gli altri formati supportati da MATLAB (software microscopio in genere supportano l&#39;esportazione in TIFF). 2.1 Caricamento dei dati <ol><li> Non esiste alcuna convenzione di denominazione / organizzazione standard per immagini di microscopia, che possono rendere il caricamento delle immagini e metadati associazione (vale a dire annotazione sperimentale come il tipo di trattamento, anche il numero e così via) la parte più impegnativa del flusso di lavoro. Scegliere uno dei metodi presentati (descritto di seguito). <ol><li> PhenoLoader: Scegliere questa opzione per semi-automatico caricare i dati quando il nome del file e / o la struttura di directory contengono informazioni sufficienti per immagini di gruppo, se lo desideri (es. B16 HeLa_Drug5-DAPI.png potrebbe indicare che l&#39;immagine è di ben B16, le cellule vengono trattate con il farmaco il cui ID è 5, e l&#39;immagine cattura la macchia DAPI nucleare - con questa convenzione di denominazione, tutte le immagini di ben A1 o trattati con Droga 5 potrebbe essere facilmente raggruppati). La procedura guidataguidare l&#39;utente passo passo per associare metadati con gruppi di immagini e definire i marcatori come segue: <ol><li> Clicca su &quot;Struttura del file&quot; per accedere alla finestra PhenoLoader. </li><li> Clicca su &quot;Definisci Directory Root&quot; per selezionare la directory che contiene il set di dati immagine. Poi filtrare i file che non vengono utilizzati (inutilizzato File) per l&#39;analisi (opzionale, può essere lasciato vuoto). </li><li> Clicca su &quot;Definire indicatori&quot; per specificare i biomarcatori utilizzati nell&#39;esperimento e associarli con le immagini. In particolare, fare clic su un file di immagine, quindi selezionare una parte del nome del file che identifica in modo univoco i biomarcatori. Infine, immettere un nome per ogni biomarker. </li><li> Clicca su &quot;Definisci metadati&quot; per associare le informazioni di ciascuna immagine. In particolare, fare clic su un file di immagine, e quindi selezionare una parte del nome del file informazioni identificative immagine (ad esempio &quot;B16&quot; per il nome bene). Una finestra chiedendo il nome del gruppo (ad esempio, &quot;Noill &quot;) si aprirà, inserire un nome. membri del gruppo estratto dal nome del file sarà mostrato sul tavolo di gruppo (ad esempio l&#39;elenco completo dei nomi e). Per aggiungere ulteriori informazioni non presenti nel nome del file, fare clic su&quot; (opzionale) Avanti &quot;. Clicca su&quot; Aggiungi Metadata Group &quot;, inserire il nome del gruppo aggiuntivo (ad esempio&quot; Drug &quot;) e per ogni valore del gruppo predefinito (ad esempio,&quot; Well &quot;), immettere il relativo valore (ad esempio&quot; Taxol &quot;) . Non c&#39;è limite al numero di gruppi aggiuntivi che possono essere aggiunti. </li><li> Infine, fare clic su &quot;Crea MetaDataFile&quot; per generare il file di metadati e continuare l&#39;analisi. Se un file di metadati è stato generato in precedenza, i passaggi di cui sopra possono essere evitati caricando direttamente il file utilizzando l&#39;opzione &quot;File Metadata&quot; (descritto al punto 3). </li></ol></li><li> Modelli Regular Expression base: espressioni regolari sono un approccio standard per la corrispondenza modellinel testo. Scegliere questa opzione se il nome del file e / o la struttura di directory contengono informazioni sufficienti per immagini di gruppo e la convenzione di denominazione corrisponde uno dei modelli pre-esistenti. I modelli personalizzati basati su espressioni regolari possono anche essere definiti e riutilizzati manualmente. Questa opzione avanzata è consigliata solo per gli utenti che hanno familiarità con le espressioni regolari. </li><li> Metadati File: Scegliere questa opzione per personalizzazione finale. Definire e caricare un file di valori separati da virgola (CSV) contenente i nomi dei file e dei metadati associati ad ogni immagine. Un esempio del formato è disponibile da parte di download del sito web (phenoripper.org). Basta caricare il file tramite l&#39;interfaccia per visualizzare le informazioni in esso contenute. </li></ol></li><li> Selezionare il campo metadati che definiscono repliche nell&#39;esperimento per evitare campionamento ridondante. Per i set di dati che contengono repliche (ad esempio, tutte le immagini in un pozzo dovrebbero essere simili), raggruppandole (ad esempio bene) può improve le prestazioni. Nella maggior parte dei casi è ragionevole scegliere l&#39;opzione di default &quot;Random (non so)&quot; che seleziona un sottoinsieme casuale. </li></ol> 2.2 Impostazione Parametri di analisi Clicca su &quot;Impostazione dei parametri&quot; per definire i parametri necessari per elaborare il dataset. I parametri da definire sono sul pannello di sinistra. Il pannello di destra mostra un esempio dalla fusione del dataset. Clicca sulle frecce sinistra / destra per passare tra le diverse immagini. <ol><li> Soglia Intensità: Scegliere un valore di soglia appropriato per identificare grossolanamente le porzioni cellulari (anziché i precedenti, regioni non cellulari) di immagini. Una soglia viene precalcolata da PhenoRipper, ma può essere modificata per migliorare evidenziazione di regioni cellulari utilizzando la barra di scorrimento disponibili sopra l&#39;immagine. Se una soglia scelta non funziona tra tutte le immagini, abbassare la soglia in modo da includere regioni non cellulari anziché cadere regioni cellulari. </li><li> Block Size: Scegli una dimensione del blocco appropriata (in pixel) alla rete l&#39;immagine. Blocchi di dimensioni specificate verranno sovrapposte sull&#39;immagine. Regolare la dimensione del blocco per ottenere una media di 20-30 blocchi / cell. Per sovrapporre la griglia sopra l&#39;immagine clicca sulla casella di controllo davanti al campo &quot;Block Size&quot;. </li><li> Parametri facoltativi: Se le immagini di auto in scala non visualizzano marcatori con intensità relative desiderato (ad esempio un colore è saturo) o se i marcatori devono essere caduto dall&#39;analisi, usa l&#39;opzione &quot;Regola Intensità Channel&quot;. Per identificare regioni cellulari su un sottoinsieme di marcatori utilizzare i &quot;Canali utilizzati soglia di&quot; opzione. Le scelte di default di altri parametri sono di solito sufficienti, ma se necessario, regolare utilizzando le &quot;Opzioni di analisi avanzate&quot;. </li><li> Eseguire l&#39;analisi premendo il tasto &quot;PhenoRip&quot; sul pannello principale dell&#39;applicazione. PhenoRipper identifica automaticamente i tipi di blocco ricorrenti nelle immagini. Verranno generati i profili fenotipici perciascuna immagine a seconda delle frazioni dei diversi tipi di blocco in esso. </li></ol> 3. Risultati Esplorare <ol><li> Esplorare le relazioni tra i profili fenotipici delle immagini utilizzando la PhenoBrowser (Figura 1). L&#39;interfaccia PhenoBrowser si compone di quattro pannelli: il pannello in alto a sinistra è una rappresentazione grafica (scatter plot) della relativa somiglianza tra immagini diverse / condizioni, i due pannelli a destra immagini campione visualizzazione di condizioni selezionate, e il pannello finale (grafico a barre ) mette a confronto i loro profili fenotipici. </li><li> &quot;Scartare Frames vuote&quot; utilizzando il menu &quot;Data Processing&quot;. </li><li> Rimuovere immagini di scarsa qualità: in primo luogo, per studiare le singole immagini spegnere raggruppamento dal menu &quot;elaborazione dati&quot;. Successivamente, fare clic attraverso i punti outlier nel grafico a dispersione ed eliminare immagini di bassa qualità (ad esempio, fuori fuoco, artefatto colorazione). </li><li> Esplorare i dati: Decidere quale metadati definisce campouna unità di base di confronto (ad esempio per confrontare farmaci, immagine con lo stesso valore del campo metadati &quot;farmaco&quot; devono essere raggruppati). Chiudi tutte le immagini con lo stesso valore di questo campo metadati in un singolo punto di dati con &quot;Raggruppamento&quot;. Ad esempio, il raggruppamento da farmaco media le immagini all&#39;interno di ciascun farmaco a cedere un punto per droga. Punti del diagramma a dispersione nelle vicinanze (o lontani) riflettono le condizioni che provocano fenotipi cellulari simili (o dissimili). Colori o etichette punti (menu di visualizzazione dei dati) basato su metadati disponibili per aiutare interpretabilità. La trama 3D è ruotabile facendo clic sulla casella di controllo &quot;ruotabile&quot; e cliccando sul tasto sinistro e trascinando il mouse su di esso. </li><li> Selezionare due punti diversi per confrontarli direttamente. I pannelli di immagini verranno visualizzate immagini di esempio per ogni punto, e il pannello grafico a barre mostreranno i tipi di blocco le cui frequenze evento sono più differente tra i due punti. </li><li> Avviare il clustergram dal menu &quot;Clustergram&quot; per fornire una visione più globale del rapporto tra i tipi di blocco e le condizioni sperimentali. Raggruppando entrambi i tipi e le condizioni di blocco, questa rappresentazione evidenzia i fenotipi cellulari che meglio distinguono gruppi di condizioni (Figura 5). </li></ol>

<ol>
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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il flusso di lavoro qui descritto consente la caratterizzazione e comparazione di immagini di microscopia facile e veloce. In primo luogo abbiamo dimostrato come questo flusso di lavoro può aiutare l&#39;ottimizzazione esperimento, per esempio eseguire rapidamente il controllo di qualità sulle immagini di microscopia. Successivamente, abbiamo dimostrato il suo potenziale per l&#39;analisi high-throughput dati di screening: siamo stati in grado di droghe raggruppare in base al loro meccanismo d&#39;azione. Il raggruppa...

Negli ultimi dieci anni, i rapidi progressi nella tecnologia di imaging hanno dato molti laboratori la capacità di effettuare la microscopia high-throughput. La sfida è ora spostato da una delle immagini di una delle analisi. Come possiamo caratterizzare, confrontare ed esplorare il torrente di complessi fenotipi ancora sottili generati da uno schermo di immagini high-throughput tipico? Un certo numero di piattaforme di image-analisi e informatici hanno dato degli utenti toolbox sofisticati 1-3 per l&#39;estrazione di informazioni biologiche da grandi raccolte di immagini. Eppure molti ostacoli significativi rimangono in analisi dei dati da schermi basati su immagine high-throughput. Difficoltà coinvolti con la scelta di opportune caratterizzazioni delle immagini e messa a punto dei parametri algoritmici (il sistema di interessi) spesso sfociano in lunghi tempi di installazione, in particolare per l&#39;utente meno esperto l&#39;analisi delle immagini. In particolare, la segmentazione delle cellule, il processo di identificazione di cellule individuali in unimmagine n, è un serio ostacolo al riguardo. La segmentazione può essere molto sensibili a parametri sperimentali, quali tipo di cellula, densità cellulare e bio-marcatori, e richiede frequentemente regolazione ripetuta per un grande insieme di dati. Per queste ragioni, analisi di immagine è spesso un passo terminale indipendente eseguita da specialisti piuttosto che una parte integrata del flusso di lavoro sperimentale. Questo preclude il ciclo di feedback rapido tra analisi e sperimentazione, una parte cruciale di sviluppo di analisi. Qui si descrive un flusso di lavoro alternativo che è ottimizzato per high-throughput microscopia a fluorescenza ed evita molte delle difficoltà di cui sopra. A tal fine, ci avvaliamo di PhenoRipper 4, una piattaforma software open-source per una rapida esplorazione e l&#39;analisi di immagini di microscopia. Significativamente, PhenoRipper evita molti dei problemi connessi con la segmentazione delle cellule, non tentare di identificare le singole cellule. Invece, PhenoRipper divide le immagini in pixelblocchi di dimensione subcellulare e caratterizza immagini in termini di blocchi che contengono. In particolare, PhenoRipper profili blocchi in termini di-base di colocalizzazione-marcatori caratteristiche e automaticamente identifica 4 tipi più rappresentativi di blocco nelle immagini di formazione. PhenoRipper poi assegna a ciascun blocco il tipo di blocco rappresentante più simile, e caratterizza finalmente immagini basate sui tipi di blocchi che contengono. Rispetto agli approcci basati su celle singole-più tradizionali, questo approccio richiede la messa a punto minimo e competenza. Come tale, gli utenti devono solo impostare due parametri: la dimensione del blocco e una intensità soglia (per eliminare le parti non cellulari di un&#39;immagine), entrambi i quali sono fissato con feedback grafico. È importante sottolineare che il flusso di lavoro qui descritto è stato dimostrato da 4 a scalare facilmente ai set di dati molto più grandi, dove la velocità e la messa a punto minima fornisce grande tempo e guadagni di affidabilità. In pratica, troviamo che questa appscarafaggio riduce il tempo necessario sia per la configurazione e l&#39;esecuzione da parte di più ordini di grandezza 4. L&#39;output primario di PhenoRipper è una rappresentazione visiva di immagine somiglianza, che consente all&#39;utente di identificare gruppi di condizioni sperimentali che inducono le cellule da visualizzare fenotipi simili. I raggruppamenti PhenoRipper reperti hanno in genere comparabile &quot;interpretabilità biologico&quot; per quelli generati da più in termini di tempo, a base di cellule metodi 4. In pratica, ciò significa che spesso, nel giro di mezz&#39;ora di eseguire un tipico esperimento di microscopia a fluorescenza a 96 pozzetti, uno sperimentatore, senza esperienza immagine-analisi preventiva può ottenere una lettura affidabile sulle prestazioni del suo esperimento. Lo sperimentatore può quindi iniziare ad esplorare le relazioni tra diverse condizioni sperimentali e relative tali relazioni per fenotipi di immagine. Dimostriamo questo flusso di lavoro qui analizzando gli effettidi farmaci in diverse classi meccanicistiche sulle cellule HeLa colorati per DNA e del citoscheletro marcatori. Immagini di cellule trattate con la stessa classe di farmaci sono stati raggruppati insieme, e le immagini di scarsa qualità (artefatti di colorazione, su cellule di fuoco e così via) è apparso come valori anomali, che li rende facili da identificare e potenzialmente scartare. Mentre questo flusso di lavoro è utile per un gran numero di saggi basati su immagini, ci sono chiaramente molte situazioni in cui un approccio diverso potrebbe potenzialmente essere più informativo. Per esempio, l&#39;uscita dal PhenoRipper è principalmente un rapporto relativo di pattern di fluorescenza di tutti condizioni sperimentali. Se una caratterizzazione assoluta di uno specifico tratto della cellula singolo è stato invece richiesto (ad esempio il numero di macchiettature in una cella), una singola base di cellule analisi sarebbe necessario. Tuttavia, anche in questo tipo di situazione, PhenoRipper rischia di rilevare variazioni di questi fenotipi monocellulari e quindi essere un utile strumento per dosaggio ottimalezazione.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="855">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM, High Glucose</td>
			<td style="width:116px;">Invitrogen</td>
			<td align="right" style="width:119px;">11965</td>
			<td style="width:404px;">High Glucose, L-Glutamine</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;"></td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Marker Hoechst 33342</td>
			<td style="width:116px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:119px;">H1399</td>
			<td style="width:404px;">DNA stain, dilution 1:2000 of 5mg/ml stock</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Marker phalloidin-Alexa488</td>
			<td style="width:116px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:119px;">A12379</td>
			<td style="width:404px;">Conjugated phallotoxin, dilution 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Primary Antibody &#945;-tubulin</td>
			<td style="width:116px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">T9026</td>
			<td style="width:404px;">Primary Ab, mouse monoclonal, dilution 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Secondary Antivody anti-Mouse TRITC</td>
			<td style="width:116px;">Jackson&#160;</td>
			<td style="width:119px;">115-025-166</td>
			<td style="width:404px;">Conjugated secondary Ab, 0.5mg in 1ml PBS + 1ml glycerol</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Aldosterone</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.2 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Apicidin</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :20 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Colchicine</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.16 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cortisol</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.2 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dexamethasone</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.2 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Docetaxel</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.2 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">M344</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :20 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MS-275</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :5 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nocodazole</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.3 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Prednisolone</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.2 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">RU486</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.2 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Scriptaid</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :70 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Taxol</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.3 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trichostatin A</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.2 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vinorelbine</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.3 &#956;M</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid analysis and exploration of fluorescence microscopy images

Nonostante i rapidi progressi nella microscopia a high-throughput, saggi basati su immagini quantitativi pongono ancora sfide significative. Mentre una varietà di strumenti di analisi di immagine specializzati sono disponibili, la maggior parte dei flussi di lavoro basati-image-analisi tradizionali hanno curve di apprendimento ripide (per la messa a punto dei parametri di analisi) e determinano tempi lunghi di consegna tra imaging e di analisi. In particolare, la segmentazione delle cellule, il processo di identificazione di cellule individuali in un&#39;immagine, è un serio ostacolo al riguardo. Qui vi presentiamo un supplente, workflow cellulare privo di segmentazione basata su PhenoRipper, una piattaforma software open-source progettato per l&#39;analisi rapida ed esplorazione di immagini di microscopia. Il gasdotto qui presentato è ottimizzato per le immagini di microscopia di immunofluorescenza su colture cellulari e richiede un intervento minimo da parte dell&#39;utente. Dopo mezz&#39;ora, PhenoRipper può analizzare i dati da un tipico esperimento 96 pozzetti e generare profili immagine. Gli utenti possonopoi esplorare visivamente i dati, effettuare il controllo di qualità sul loro esperimento, garantire una risposta alle perturbazioni e verificare la riproducibilità dei replicati. Questo facilita un ciclo di feedback rapido tra analisi e sperimentazione, che è fondamentale durante l&#39;ottimizzazione del dosaggio. Questo protocollo è utile non solo come una prima analisi pass per il controllo di qualità, ma anche può essere usato come una soluzione end-to-end, in particolare per lo screening. Il flusso di lavoro qui descritto scalabile per grandi insiemi di dati come quelli generati da schermi high-throughput, e ha dimostrato di condizioni sperimentali raggruppare fenotipo con precisione su una vasta gamma di sistemi biologici. L&#39;interfaccia PhenoBrowser fornisce un quadro intuitivo per esplorare lo spazio fenotipica e si riferiscono immagine proprietà alle annotazioni biologiche. Nel loro insieme, il protocollo qui descritto abbasserà le barriere per l&#39;adozione di analisi quantitativa di schermi immagini based.

Qui abbiamo testato la capacità di questo flusso di lavoro per i farmaci del gruppo in base al loro meccanismo d&#39;azione. Cellule HeLa sono state seminate in 30 pozzetti di una piastra da 384 pozzetti e colorate per DNA / actina / α-tubulina. Gli anticorpi specifici primari, anticorpi secondari fluorescenti marcate, e altre macchie fluorescenti che sono stati utilizzati sono elencati nella Tabella dei Materiali. Wells sono stati trattati con 15 farmaci appartenenti a tre classi meccanicistici (istone deacetilasi in...

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Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Qui si descrive un flusso di lavoro per la rapida analizzare ed esplorare le collezioni di immagini di microscopia a fluorescenza utilizzando PhenoRipper, una piattaforma di analisi delle immagini sviluppato di recente.

Analisi rapida ed esplorazione di microscopia a fluorescenza Immagini

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

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Research

JoVE Journal

Biology

12.1K Views.  UT Southwestern Medical Center.  Qui si descrive un flusso di lavoro per la rapida analizzare ed esplorare le collezioni di immagini di microscopia a fluorescenza utilizzando PhenoRipper, una piattaforma di analisi delle immagini sviluppato di recente. 

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Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

Time-lapse imaging di mitosi dopo la trasfezione di siRNA

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Ricerca

Biologia

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using fluorochromes like Green Fluorescent Protein (GFP) directly attached to the protein of interest has become increasingly popular 1. Using GFP and similar fluorochromes the subcellular localisations and movements of proteins can be detected in a fluorescent microscope. Moreover, also the subnuclear localisation of a certain region of a chromosome can be studied using this technique. GFP is fused to the Lac Repressor protein (LacR) and ectopically expressed in the cell where tandem repeats of the lacO sequence has been inserted into the region of interest on the chromosome2. The LacR-GFP will bind to the lacO repeats and that area of the genome will be visible as a green dot in the fluorescence microscope. Yeast is especially suited for this type of manipulation since homologous recombination is very efficient and thereby enables targeted integration of the lacO repeats and engineered fusion proteins with GFP 3. Here we describe a quantitative method for live cell analysis of fission yeast. Additional protocols for live cell analysis of fission yeast can be found, for example on how to make a movie of the meiotic chromosomal behaviour 4. In this particular experiment we focus on subnuclear organisation and how it is affected during gene induction. We have labelled a gene cluster, named Chr1, by the introduction of lacO binding sites in the vicinity of the genes. The gene cluster is enriched for genes that are induced early during nitrogen starvation of fission yeast 5. In the strain the nuclear membrane (NM) is labelled by the attachment of mCherry to the NM protein Cut11 giving rise to a red fluorescent signal. The Spindle Pole body (SPB) compound Sid4 is fused to Red Fluorescent Protein (Sid4-mRFP) 6. In vegetatively growing yeast cells the centromeres are always attached to the SPB that is embedded in the NM 7. The SPB is identified as a large round structure in the NM. By imaging before and 20 minutes after depletion of the nitrogen source we can determine the distance between the gene cluster (GFP) and the NM/SPB. The mean or median distances before and after nitrogen depletion are compared and we can thus quantify whether or not there is a shift in subcellular localisation of the gene cluster after nitrogen depletion.

The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, is a good model system to study basic cellular processes. Here we describe a method to perform quantitative live cell analysis of fission yeast. In this particular experiment we focus on organisation of the genome within the cell nucleus, but the method can also be used to study cytosolic factors.

Quantitativa vivo cellulare-microscopio a fluorescenza Analisi di lievito Fission

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

An Analytical Tool that Quantifies Cellular Morphology Changes from Three-dimensional Fluorescence Images

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for inclusion and exclusion of data points, and computer-aided pattern recognition to support the interpretation and findings of the analysis. It has become increasingly important to be able to measure fluorescence images constructed from three-dimensional (3D) datasets in order to be able to capture the complexity of cellular dynamics and understand the basis of cellular plasticity within biological systems. Sophisticated microscopy instruments have permitted the visualization of 3D fluorescence images through the acquisition of multispectral fluorescence images and powerful analytical software that reconstructs the images from confocal stacks that then provide a 3D representation of the collected 2D images. Advanced design-based stereology methods have progressed from the approximation and assumptions of the original model-based stereology1 even in complex tissue sections2. Despite these scientific advances in microscopy, a need remains for an automated analytic method that fully exploits the intrinsic 3D data to allow for the analysis and quantification of the complex changes in cell morphology, protein localization and receptor trafficking. 
Current techniques available to quantify fluorescence images include Meta-Morph (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) and Image J (NIH) which provide manual analysis. Imaris (Andor Technology, Belfast, Northern Ireland) software provides the feature MeasurementPro, which allows the manual creation of measurement points that can be placed in a volume image or drawn on a series of 2D slices to create a 3D object. This method is useful for single-click point measurements to measure a line distance between two objects or to create a polygon that encloses a region of interest, but it is difficult to apply to complex cellular network structures. Filament Tracer (Andor) allows automatic detection of the 3D neuronal filament-like however, this module has been developed to measure defined structures such as neurons, which are comprised of dendrites, axons and spines (tree-like structure). This module has been ingeniously utilized to make morphological measurements to non-neuronal cells3, however, the output data provide information of an extended cellular network by using a software that depends on a defined cell shape rather than being an amorphous-shaped cellular model. To overcome the issue of analyzing amorphous-shaped cells and making the software more suitable to a biological application, Imaris developed Imaris Cell. This was a scientific project with the Eidgen&ouml;ssische Technische Hochschule, which has been developed to calculate the relationship between cells and organelles. While the software enables the detection of biological constraints, by forcing one nucleus per cell and using cell membranes to segment cells, it cannot be utilized to analyze fluorescence data that are not continuous because ideally it builds cell surface without void spaces. To our knowledge, at present no user-modifiable automated approach that provides morphometric information from 3D fluorescence images has been developed that achieves cellular spatial information of an undefined shape (Figure 1). 
We have developed an analytical platform using the Imaris core software module and Imaris XT interfaced to MATLAB (Mat Works, Inc.). These tools allow the 3D measurement of cells without a pre-defined shape and with inconsistent fluorescence network components. Furthermore, this method will allow researchers who have extended expertise in biological systems, but not familiarity to computer applications, to perform quantification of morphological changes in cell dynamics.

We developed a software platform that utilizes Imaris Neuroscience, ImarisXT and MATLAB to measure the changes in morphology of an undefined shape taken from three-dimensional confocal fluorescence of single cells. This novel approach can be used to quantify changes in cell shape following receptor activation and therefore represents a possible additional tool for drug discovery.

Uno strumento di analisi che quantifica Modifiche morfologia cellulare dalle immagini a fluorescenza tridimensionali

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for ...

Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, traditional chemotherapeutic approaches have been largely unsuccessful. Hormone therapy is effective at early stage, but often fails with the eventual development of hormone-refractory tumors. We have been interested in developing therapeutics targeting specific metabolic deficiency of tumor cells. We recently showed that prostate tumor cells specifically lack an enzyme (argininosuccinate synthase, or ASS) involved in the synthesis of the amino acid arginine1. This condition causes the tumor cells to become dependent on exogenous arginine, and they undergo metabolic stress when free arginine is depleted by arginine deiminase (ADI)1,10. Indeed, we have shown that human prostate cancer cells CWR22Rv1 are effectively killed by ADI with caspase-independent apoptosis and aggressive autophagy (or macroautophagy)1,2,3. Autophagy is an evolutionarily-conserved process that allows cells to metabolize unwanted proteins by lysosomal breakdown during nutritional starvation4,5. Although the essential components of this pathway are well-characterized6,7,8,9, many aspects of the molecular mechanism are still unclear - in particular, what is the role of autophagy in the death-response of prostate cancer cells after ADI treatment? In order to address this question, we required an experimental method to measure the level and extent of autophagic response in cells - and since there are no known molecular markers that can accurately track this process, we chose to develop an imaging-based approach, using quantitative 3D fluorescence microscopy11,12.
Using CWR22Rv1 cells specifically-labeled with fluorescent probes for autophagosomes and lysosomes, we show that 3D image stacks acquired with either widefield deconvolution microscopy (and later, with super-resolution, structured-illumination microscopy) can clearly capture the early stages of autophagy induction. With commercially available digital image analysis applications, we can readily obtain statistical information about autophagosome and lysosome number, size, distribution, and degree of colocalization from any imaged cell. This information allows us to precisely track the progress of autophagy in living cells and enables our continued investigation into the role of autophagy in cancer chemotherapy.

Autophagy is a ubiquitous process that enables cells to degrade and recycle proteins and organelles. We apply advanced fluorescence microscopy to visualize and quantify the small, but essential, physical changes associated with the induction of autophagy, including the formation and distribution of autophagosomes and lysosomes, and their fusion into autolysosomes.

Analisi quantitativa di autofagia usando 3D avanzato microscopia a fluorescenza

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, ...

Visualizing Stromule Frequency with Fluorescence Microscopy

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but whose functions remain mysterious. Alongside growing attention on the role of chloroplasts in coordinating plant responses to stress, interest in stromules and their relationship to chloroplast signaling dynamics has increased in recent years, aided by advances in fluorescence microscopy and protein fluorophores that allow for rapid, accurate visualization of stromule dynamics. Here, we provide detailed protocols to assay stromule frequency in the epidermal chloroplasts of Nicotiana benthamiana, an excellent model system for investigating chloroplast stromule biology. We also provide methods for visualizing chloroplast stromules in vitro by extracting chloroplasts from leaves. Finally, we outline sampling strategies and statistical approaches to analyze differences in stromule frequencies in response to stimuli, such as environmental stress, chemical treatments, or gene silencing. Researchers can use these protocols as a starting point to develop new methods for innovative experiments to explore how and why chloroplasts make stromules.

Protocols to investigate the dynamics of chloroplast stromules, the stroma-filled tubules that extend from the surface of chloroplasts, are described.

Visualizzazione Frequenza Stromule con microscopia a fluorescenza

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but ...

Open Source High Content Analysis Utilizing Automated Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) based readouts of fixed or live cells in multiwell plates. This provides a means to screen for cell signaling processes read out using intramolecular FRET biosensors or intermolecular FRET of protein interactions such as oligomerization or heterodimerization, which can be used to identify binding partners. We describe here the functionality of this automated multiwell plate FLIM instrumentation and present exemplar data from our studies of HIV Gag protein oligomerization and a time course of a FRET biosensor in live cells. A detailed description of the practical implementation is then provided with reference to a list of hardware components and a description of the open source data acquisition software written in &#181;Manager. The application of FLIMfit, an open source MATLAB-based client for the OMERO platform, to analyze arrays of multiwell plate FLIM data is also presented. The protocols for imaging fixed and live cells are outlined and a demonstration of an automated multiwell plate FLIM experiment using cells expressing fluorescent protein-based FRET constructs is presented. This is complemented by a walk-through of the data analysis for this specific FLIM FRET data set.

We present an open source high content analysis (HCA) instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) based readouts. Data acquisition for this openFLIM-HCA instrument is controlled by software written in &#181;Manager and data analysis is undertaken in FLIMfit.

Open Source alto contenuto di analisi Utilizzando Automated Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions ...

Oligomerization Dynamics of Cell Surface Receptors in Living Cells by Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy Combined with Number and Brightness Analysis

Despite the importance and ubiquity of receptor oligomerization, few methods are applicable for detecting clustering events and measuring the degree of clustering. Here, we describe an imaging approach to determine the average oligomeric state of mEGFP-tagged-receptor homocomplexes in the membrane of living cells. The protocol is based on Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy combined with Number and Brightness (N&#38;B) analysis. N&#38;B is a method similar to fluorescence-correlation spectroscopy (FCS) and photon counting histogram (PCH), which are based on the statistical analysis of the fluctuations of the fluorescence intensity of fluorophores diffusing in and out of an illumination volume during an observation time. In particular, N&#38;B is a simplification of PCH to obtain information on the average number of proteins in oligomeric mixtures. The intensity fluctuation amplitudes are described by the molecular brightness of the fluorophore and the average number of fluorophores within the illumination volume. Thus, N&#38;B considers only the first and second moments of the amplitude distribution, namely, the mean intensity and the variance. This is, at the same time, the strength and the weakness of the method. Because only two moments are considered, N&#38;B cannot determine the molar fraction of unknown oligomers in a mixture, but it only estimates the average oligomerization state of the mixture. Nevertheless, it can be applied to relatively small time series (compared to other moment methods) of images of live cells on a pixel-by-pixel basis, simply by monitoring the time fluctuations of the fluorescence intensity. It reduces the effective time-per-pixel to a few microseconds, allowing acquisition in the time range of seconds to milliseconds, which is necessary for fast oligomerization kinetics. Finally, large cell areas as well as sub-cellular compartments can be explored.

We describe an imaging approach for the determination of the average oligomeric state of mEGFP-tagged-receptor oligomers induced by ligand binding in the plasma membrane of living cells. The protocol is based on Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy combined with Number and Brightness (N&#38;B) analysis.

Dinamica di oligomerizzazione dei recettori delle superfici cellulari nelle cellule viventi mediante microscopia a fluorescenza totale di riflessione interna combinata con l'analisi del numero e della luminosità

Despite the importance and ubiquity of receptor oligomerization, few methods are applicable for detecting clustering events and measuring the degree of ...

In Situ Exploration of Murine Megakaryopoiesis using Transmission Electron Microscopy

Differentiation and maturation of megakaryocytes occur in close association with the cellular and extracellular components of the bone marrow. These processes are characterized by the gradual appearance of essential structures in the megakaryocyte cytoplasm such as a polyploid and polylobulated nucleus, an internal membrane network called demarcation membrane system (DMS) and the dense and alpha granules that will be found in circulating platelets. In this article, we describe a standardized protocol for the in situ ultrastructural study of murine megakaryocytes using transmission electron microscopy (TEM), allowing for the identification of key characteristics defining their maturation stage and cellular density in the bone marrow. Bone marrows are flushed, fixed, dehydrated in ethanol, embedded in plastic resin, and mounted for generating cross-sections. Semi-thin and thin sections are prepared for histological and TEM observations, respectively. This method can be used for any bone marrow cell, in any EM facility and has the advantage of using small sample sizes allowing for the combination of several imaging approaches on the same mouse.

In Situ Exploration of Murine Megakaryopoiesis using Transmission Electron Microscopy

Here, we present a protocol to analyze ultrastructure of the megakaryocytes in situ using transmission electron microscopy (TEM). Murine bone marrows are collected, fixed, embedded in epoxy resin and cut in ultrathin sections. After contrast staining, the bone marrow is observed under a TEM microscope at 120 kV.

Sul posto Esplorazione della megacariopoiesi murina usando la microscopia elettronica a trasmissione

Differentiation and maturation of megakaryocytes occur in close association with the cellular and extracellular components of the bone marrow. These ...

Rapid In Vivo Fixation and Isolation of Translational Complexes from Eukaryotic Cells

Rapid responses involving fast redistribution of messenger(m)RNA and alterations of mRNA translation are pertinent to ongoing homeostatic adjustments of the cells. These adjustments are critical to eukaryotic cell survivability and &#39;damage control&#39; during fluctuating nutrient and salinity levels, temperature, and various chemical and radiation stresses. Due to the highly dynamic nature of the RNA-level responses, and the instability of many of the RNA:RNA and RNA:protein intermediates, obtaining a meaningful snapshot of the cytoplasmic RNA state is only possible with a limited number of methods. Transcriptome-wide, RNA-seq-based ribosome profiling-type experiments are among the most informative sources of data for the control of translation. However, absence of a uniform RNA and RNA:protein intermediate stabilization can lead to different biases, particularly in the fast-paced cellular response pathways. In this article, we provide a detailed protocol of rapid fixation applicable to eukaryotic cells of different permeability, to aid in RNA and RNA:protein intermediate stabilization. We further provide examples of isolation of the stabilized RNA:protein complexes based on their co-sedimentation with ribosomal and poly(ribo)somal fractions. The separated stabilized material can be subsequently used as part of ribosome profiling-type experiments, such as in Translation Complex Profile sequencing (TCP-seq) approach and its derivatives. Versatility of the TCP-seq-style methods has now been demonstrated by the applications in a variety of organisms and cell types. The stabilized complexes can also be additionally affinity-purified and imaged using electron microscopy, separated into different poly(ribo)somal fractions and subjected to RNA sequencing, owing to the ease of the crosslink reversal. Therefore, methods based on snap-chilling and formaldehyde fixation, followed by the sedimentation-based or other type of RNA:protein complex enrichment, can be of particular interest in investigating finer details of rapid RNA:protein complex dynamics in live cells.

Rapid In Vivo Fixation and Isolation of Translational Complexes from Eukaryotic Cells

We present a technique to rapidly stabilize translational (protein biosynthesis) complexes with formaldehyde crosslinking in live yeast and mammalian cells. The approach enables dissecting transient intermediates and dynamic RNA:protein interactions. The crosslinked complexes can be used in multiple downstream applications such as in deep sequencing-based profiling methods, microscopy, and mass-spectrometry.

Rapida fissazione in vivo e isolamento dei complessi traslazionali dalle cellule eucariotiche

Rapid responses involving fast redistribution of messenger(m)RNA and alterations of mRNA translation are pertinent to ongoing homeostatic adjustments of ...

Fluorescence Lifetime Macro Imager for Biomedical Applications

This paper presents a new photoluminescence lifetime imager designed to map the molecular oxygen (O2) concentration in different phosphorescent samples ranging from solid-state, O2-sensitive coatings to live animal tissue samples stained with soluble O2-sensitive probes. In particular, the nanoparticle-based near-infrared probe NanO2-IR, which is excitable with a 625 nm light-emitting diode (LED) and emits at 760 nm, was used. The imaging system is based on the Timepix3 camera (Tpx3Cam) and the opto-mechanical adaptor, which also houses an image intensifier. O2 phosphorescence lifetime imaging microscopy (PLIM) is commonly required for various studies, but current platforms have limitations in their accuracy, general flexibility, and usability.
The system presented here is a fast and highly sensitive imager, which is built on an integrated optical sensor and readout chip module, Tpx3Cam. It is shown to produce high-intensity phosphorescence signals and stable lifetime values from surface-stained intestinal tissue samples or intraluminally stained fragments of the large intestine and allows the detailed mapping of tissue O2 levels in about 20 s or less. Initial experiments on the imaging of hypoxia in grafted tumors in unconscious animals are also presented. We also describe how the imager can be re-configured for use with O2-sensitive materials based on Pt-porphyrin dyes using a 390 nm LED for the excitation and a bandpass 650 nm filter for emission. Overall, the PLIM imager was found to produce accurate quantitative measurements of lifetime values for the probes used and respective two-dimensional maps of the O2 concentration. It is also useful for the metabolic imaging of ex vivo tissue models and live animals.

This paper describes the use of a new, fast optical imager for the macroscopic photoluminescence lifetime imaging of long decay emitting samples. The integration, image acquisition, and analysis procedures are described, along with the preparation and characterization of the sensor materials for the imaging and the application of the imager in studying biological samples.

Imager macro a fluorescenza per applicazioni biomediche

This paper presents a new photoluminescence lifetime imager designed to map the molecular oxygen (O2) concentration in different phosphorescent samples ...