Il nostro protocollo prevede una mappatura 2D dettagliata della durata della fosforescenza e della concentrazione di ossigeno in oggetti macroscopici, in particolare tessuti animali vivi e animali interi, mediante sonde e materiali di rilevamento dedicati. Questa informazione è importante per molte aree di ricerca. Il nostro protocollo utilizza un modulo di imaging integrato e compatto che opera in modalità TCSPC e fornisce una visualizzazione facile e accurata della durata e della distribuzione dell'ossigeno in campioni biologici complessi, come il tessuto vitale.
Prendi l'adattatore Cricket e ispezionalo da diversi lati. Rimuovere l'adattatore C-mount frontale per mostrare l'intensificatore di PP0360EF Photonis alloggiato nel Cricket, quindi rimettere l'adattatore C-mount. Rimuovere l'adattatore C-mount frontale del Cricket e inserire il filtro di emissione 650 più/meno 50 nanometri.
Risolvilo rimettendo il C-mount. Quindi, collegare il modulo fotocamera a tre camme TPX sul retro del modulo Cricket tramite i loro adattatori ad anello. Collegare l'obiettivo al lato anteriore del modulo Cricket tramite l'adattatore C-mount.
Collegare il LED a un alimentatore e a un generatore di impulsi. Ora, monta il LED super luminoso a 390 nanometri su un palo attaccato a una breadboard all'interno della scatola nera. Accendere il LED e metterlo a fuoco per garantire un'eccitazione efficace e uniforme del campione ripreso.
Montare il gruppo telecamera sulla parte superiore della scatola nera ottica rivolta verso il basso verso il palco in cui verranno ripresi i campioni. Collegare la telecamera e il LED a generatori a due impulsi e a un oscilloscopio a quattro canali. Utilizzando le impostazioni dell'oscilloscopio e dei generatori di impulsi, sincronizzare gli impulsi inviati alla telecamera e al LED.
Utilizzare il cavo speciale e la presa sull'unità Cricket per collegare l'intensificatore a un alimentatore standard e impostare il guadagno a 2,7 volt. Posizionare il campione prima dell'obiettivo della fotocamera. Quindi, accendere la fotocamera e tutti i moduli elettrici, tranne l'intensificatore.
Attivare il software SOFI per regolare i parametri operativi, come la messa a fuoco e l'allineamento del campione. Nei moduli, impostate l'esposizione del fotogramma su 0,01 secondi. Selezionate Fotogrammi infiniti e impostate la modalità operativa pixel su tempo oltre soglia.
Quindi, vai su Anteprima e seleziona Modulo attivo per aprire la finestra dei frame Medipix / Timepix. Nel passaggio successivo, dopo aver avviato la registrazione, regolare la scala dei colori e ruotare l'immagine nell'orientamento desiderato. Successivamente, spegni le luci nella stanza e accendi l'intensificatore.
Metti a fuoco l'ottica della fotocamera sulla fase campione con le capacità di messa a fuoco dell'obiettivo e dell'adattatore Cricket per generare immagini nitide dei campioni con buon contrasto e luminosità. Una volta completato lo stato attivo, chiudere il software SOFI. Quindi, vai al terminale, esegui i comandi del software di progettazione personalizzata per acquisire i dati grezzi nel formato binario e chiudi il terminale.
Aprire un nuovo terminale per elaborare i dati acquisiti. Caricare il file di dati ed eseguire il riduttore di dati. Analizza i dati di post-elaborazione con un programma dedicato scritto in linguaggio C che scriverà i dati in un file immagine ICS.
Successivamente, aprire i file di immagine ICS utilizzando il software Time Resolved Imaging disponibile gratuitamente e utilizzare due funzioni esponenziali per adattarsi ai decadimenti della fosforescenza. Infine, apri il Fitted. ICS con il software di analisi delle immagini disponibile.
Genera immagini a vita di fosforescenza utilizzando tabelle di ricerca e codificale in pseudo scala di colori. Utilizzare la funzione Misura per calcolare i valori di durata media per l'intera immagine o le regioni di interesse. Vengono mostrate le immagini al microscopio di imaging a vita della fosforescenza e della microscopia a vita della fosforescenza dello spot del sensore di colorante ottaetilporfirina di platino negli stati ossigenato e deossigenato.
Assicurarsi che il filtro di emissione corretto sia montato all'interno del Cricket e che vengano utilizzati i giusti LED, i collegamenti dei cavi e le impostazioni degli impulsi. Attualmente, questo protocollo è limitato ai modelli animali, ma potenzialmente può essere applicato per diagnosticare e trattare stati patologici associati all'ipossia tissutale, come cancro, ictus e infiammazione.
