Concessione di aiuti: NIH CA165263, CA150197 NIH, NIH CA150197S1 (HJ Kung), NIH CA150197S1 (CA Changou), NSF PHY-0.120.999 Centro per Biofotonica Science &amp; Technology (DL Wolfson, FYS Chuang), DOD PC073420 (RJ grassetto), la ricerca Consiglio di Norvegia, Leiv Eiriksson viaggio di Grant 209286/F11 (BS Ahluwalia). HJ Kung riconosce anche il sostegno della Auburn Comunità Cancer Fondo di dotazione. RJ Grassetto riconosce anche il sostegno della J. McDonald dotazione. Ringraziamo il Dr. Jenny Wei-Jen Kung e il dottor Bor-Wen Wu a DesigneRx per la generosa offerta di ADI.

1. Parte 1: coltura cellulare ed Etichettatura Immuno-fluorescenza <ol><li> Crescere CWR22 RV1 cellule tumorali della prostata umana su vetro coprioggetto (# 1.5 o 170 micron di spessore) posti in piastre da 6 pozzetti, con RPMI (Mediatech, VA) contenente il 10% di siero fetale bovino (FBS) e 1% di penicillina / streptomicina / glutammina. </li><li> Indurre l&#39;autofagia trattando campioni selezionati con arginina deiminasi (ADI, 0.3 mg / ml) in tampone fosfato salino (PBS). </li><li> Fissare le cellule con paraformaldeide al 4% (PFA, Fisher Scientific, NH) diluita in PBS; 100 microlitri per coprioggetto, per 10 min a RT. </li><li> Lavare le cellule 3 volte con 1 ml HBS / BSA. </li><li> Permeabilize cellule con 0,05% saponina (Sigma, MO) in HEPES (HBS) / BSA, 100 microlitri per coprioggetto, per 15 minuti a RT. </li><li> Prima di immuno-etichettatura, i campioni di blocco con il 2,5% di caseina (Sigma, MO) in HBS / BSA, 100 microlitri per coprioggetto, per 1 ora a temperatura ambiente. </li><li> Incubare le cellule fissate con anticorpi primari diluiti in 2,5% caseina / HBS / BSA, 100 microlitri per coverslip, O / N a 4 ° C. </li><li> Lavare le cellule 3 volte con 1 ml HBS / BSA. </li><li> Incubare le cellule fissate con anticorpi secondari diluiti in 2,5% caseina / HBS / BSA, 100 microlitri per coprioggetto, per 1 ora a temperatura ambiente. </li><li> Lavare le cellule 3 volte con 1 ml HBS / BSA. </li><li> Montare vetrini preparati su regolari vetrini da microscopio in vetro con oro SlowFade o Prolungare reagente antifade Gold (Invitrogen, CA) contenente 4 &#39;,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI). </li><li> Sigillare i bordi coprioggetto con smalto. Per ottenere i migliori risultati di imaging, dare il tempo (idealmente O / N) per i supporti anti-sbiadimento di permeare completamente le cellule. </li><li> Superficie coprioggetto pulito con metanolo e / o cloroformio. </li><li> Aggiungere l&#39;olio di immersione (indice di rifrazione 1.520 quando l&#39;imaging a 37 ° C, o 1.516 se l&#39;imaging a RT) al 1,42 NA lente dell&#39;obiettivo 60X (Olympus, Giappone). </li><li> Posizione della slitta sul palco microscopio e stabilire fuoco con le cellule di interesse. </li></ol> 2. Parte 2: Preparazione di cellule per Live Imaging <ol><li> Crescere CWR22 RV1 cellule esprimenti green fluorescent protein-coupled Catena luce 3 (LC3-GFP) in terreni di coltura RPMI contenente 10% FBS e 1% antibiotici da 35 mm rivestite piastre di coltura con fondo poli-D-lisina (MatTek, MA). Le cellule devono essere piastrate a densità sufficiente di facilitare una rapida proliferazione, ma non così tanto che le cellule sono ricoperte e clumped al tempo di imaging. </li><li> Trattare campioni di cellule selezionate con ADI (0,3 mcg / ml) in PBS. </li><li> Circa 1 ora prima di imaging, diluire 1,5 ml di LysoTracker Red ND-99 (Invitrogen, CA) con 20 ml di RPMI. contenente 10% FBS e 1% antibiotici. Utilizzare soluzioni contenenti ADI per i campioni selezionati. Riscaldare tutti i media a 37 ° C prima di aggiungere nel piatto cultura. </li><li> Incubare le cellule con RPMI contenente LysoTracker Red ND-99 per 15-45 minuti a 37 ° C. </li><li> Circa 30 minuti prima di imaging, accendere il contenitore ambientale WeatherStation e lasciare equilibrare a 37 ° C e 5% di CO 2 (con Humidifaria ied). </li><li> Lavare le cellule con PBS e sostituire il supporto con lo standard RPMI contenente solo il 10% FBS e 1% di antibiotici. Aggiungi ADI a campioni come indicato. </li><li> Monte 35 millimetri coverglass-bottom piatti della cultura in adattatore personalizzato (Applied Precision, Inc., WA), e la posizione sul palco microscopio. Usare olio di immersione (indice di rifrazione 1.520) sul 60X 1.42 NA lente dell&#39;obiettivo, e posizionare il piatto cultura montato sul palco. </li></ol> 3. Parte 3: Deconvoluzione Microscopia e analisi Il protocollo in questa sezione presuppone l&#39;uso del Personal DeltaVision DV deconvoluzione microscopio e associati Softworx Application Suite (Applied Precision, Inc., WA). <ol><li> Accendere il sistema di microscopio, compreso stazione di acquisizione e di controllo dello strumento. Aprire l&#39;applicazione Resolve3D per inizializzare il palco microscopio e accendere la sorgente di luce allo xeno. Lasciare 10 minuti per la sorgente luminosa per riscaldarsi e raggiungere condizioni stabili. </li><li> Aggiungere ungoccia di olio di immersione (indice di rifrazione 1.520 per campioni scena a 37 ° C o 1.516 per campioni fissati a RT) sul 60X 1,42 NA lente obiettivo, e campione su vetrino centro (copertura antiscivolo faccia in giù) sopra la lente obiettivo. </li><li> Utilizzando illuminazione in campo chiaro o esterno ed il fuoco grossolana manopola regolare, sollevare lentamente la lente obiettivo finché il tallone di olio di immersione a contatto con il vetro coperchio rovesciato. (Da questo punto, lo strato di cellule dovrebbe entrare in centro in pochi giri di messa a fuoco fine regolare la manopola). Quando si lavora con campioni fissati sui vetrini, si raccomanda di evitare di cellule all&#39;interno o in prossimità di aree con le bollicine. Quando si visualizzano con i campioni dal vivo sul piatto fondo di vetro, evitare di spostare la lente dell&#39;obiettivo di fuori del confine del coprioggetto di vetro. </li><li> Autophagosomes possono essere identificati tramite segnale eGFP (verde). Lisosomi sono identificati da LysoTracker Red (campione dal vivo) o anticorpi fluorescenti anti-Lampada1 (campione fisso). Nuclei delle cellule sono identificate da DAPI staining (campione fisso). </li><li> Selezionare il campo di vista desiderato. Idealmente, le cellule dovrebbero mostrare buon segnale fluorescente in tutti i canali appropriati, e sufficientemente attaccati e sparsi sulla superficie del vetrino in modo che i contenuti intracellulari sono facili da visualizzare. Piccoli aggiustamenti in x laterali, Y e Z-messa a fuoco possono essere controllati dal computer utilizzando l&#39;interfaccia Acquire3D. Impostare binning di 1x1 o 2x2, a seconda campo di vista desiderato (più celle possono essere visti in campo quando binning è impostato su 2x2). </li><li> Per una data immagine attraverso il tronco di una cella, impostare i parametri di esposizione (ad esempio, la potenza di trasmissione% e tempo di esposizione) in modo che l&#39;intensità massima dei pixel non supera i 3.000 conteggi. Generalmente, la trasmissione% dovrebbe essere impostato più basso possibile, senza aumentare il corrispondente tempo di esposizione più di 1 sec. Ripetere questa procedura per ogni colore di fluorescenza per essere ripreso e per ogni campo separato di vista di ottenere immagini di altissima qualità. </li><li> Impostare l&#39;upper limiti inferiore e dello Z-stack regolando il focus solo leggermente sopra la parte superiore e inferiore del campione cellulare, rispettivamente. Il numero totale di immagini in un determinato stack Z sarà pertanto determinato da questi limiti e dalla spaziatura tra strati (valore di default: 0,2 micron). </li><li> Per ridurre al minimo gli artefatti di movimento durante l&#39;acquisizione delle immagini, si consiglia di impostare la modalità di acquisizione delle immagini a &quot;lunghezza d&#39;onda allora z-stack&quot; per campioni fissati, e &quot;z-stack quindi lunghezza d&#39;onda&quot; per i campioni dal vivo. </li><li> Immagini di fluorescenza sono deconvolved utilizzando Softworx (Applied Precision, WA) e successivamente analizzati utilizzando Volocity (Improvision, ora Perkin Elmer, MA). </li></ol> 4. Parte 4: Super-risoluzione, Strutturato illuminazione (OMX) Microscopia Il protocollo in questa sezione si applica all&#39;uso della OMX Structured Illumination Microscope (Applied Precision, WA). <ol><li> Accendere l&#39;alimentazione principale e laser desiderati (410 nm, 488 nm e / o 532 nm). Attendere 20 min per i laser da stabilizzare termicamente. </li><li> Aggiungere l&#39;olio di immersione (indice di rifrazione 1,516 per campioni fissati a RT) sul 60X 1.42 NA lente dell&#39;obiettivo. Se le bolle sono visti nella goccia d&#39;olio, pulire l&#39;obiettivo e aggiungere ancora olio. </li><li> Collocare il campione vetrino sul tavolo e, se necessario, lasciare 10 minuti per le cellule di stabilirsi su vetrino. </li><li> Inizializzare il programma di acquisizione. Utilizzare illuminazione a fluorescenza per regolare la messa a fuoco fino un netto contorno della cella può essere visto. (Si deve prestare attenzione a tutte le ore per ridurre al minimo l&#39;esposizione delle cellule ad eccitazione di fluorescenza, fino a quando l&#39;acquisizione effettiva dell&#39;immagine). </li><li> Una scansione mosaico spirale può essere acquisita per vedere in anteprima le aree più grandi del campione per selezionare le celle o regioni di interesse. Si raccomanda di utilizzare tempi di esposizione brevi (1-10 msec) e bassa potenza di eccitazione (0,1-1% di trasmissione) durante la scansione del campione o la ricerca di bersagli. </li><li> Identificare autophagosomes da GFP-LC3 fluorescenza. Identificare lisosomi da Alexa Fluor 555 anti-LAMP(Proteina di membrana lisosomiale associata) e nuclei di cellule utilizzando DAPI (campioni fissi). </li><li> Scegli condizioni sperimentali tra cui lunghezza d&#39;onda di eccitazione, area dell&#39;immagine (ad esempio 512x512), spessore pila, tempo di esposizione, e la percentuale di trasmissione laser. Per le immagini eccellenti risolte, assicurarsi che l&#39;opzione di illuminazione strutturata è abilitata. Per la microscopia a deconvoluzione sul OMX, selezionare l&#39;opzione di illuminazione convenzionale. </li><li> Per ottenere i migliori risultati di ricostruzione, selezionare condizioni sperimentali tali che il numero massimo di intensità è compresa tra 10.000 e 15.000 durante l&#39;acquisizione. Se fotodecolorazione è un problema, l&#39;imaging ad una esposizione inferiore (conta tra 5.000 e 10.000) può essere utilizzato. Idealmente, i conti non dovrebbero diminuire più di un fattore di due durante l&#39;intera acquisizione, e diminuisce di più di un fattore di quattro dovrebbero essere evitati. Se necessario, ridurre lo spessore pila di garantire un conteggio intensità continua. La fotocamera satura a 64.000 conteggi, quindi massimo inintensità non deve mai superare questo. Per i buoni campioni, abbiamo trovato le condizioni sperimentali da 10 ~ 50 msec di tempo di esposizione con la trasmissione del laser 1%. Campioni luminosi e fotostabili che può essere ripreso più volte sono preferite. Una stabile macchia è richiesto per time-lapse, immagini eccellenti risolti. </li><li> Per ridurre il rumore, una velocità di lettura 95MHz (opzione Media velocità) e tempo di acquisizione di 2 msec o più è raccomandato. Aumento dei manufatti sono ottenuti nel immaginata ricostruito, quando campione si muove durante l&#39;acquisizione. A causa di questo effetto, brevi esposizioni sono raccomandati per le cellule non aderenti o in rapido movimento. </li><li> Imaging multicanale può essere eseguita simultaneamente o in sequenza. Rendimenti modalità sequenziale meno cross-talk ed è quindi raccomandato. </li><li> Per ridurre photobleaching, si raccomanda generalmente di immagine con lunghezze d&#39;onda più lunghe di eccitazione prima (532 nm, 488 nm, e poi 410 Nm). Tuttavia, per i risultati sperimentali mostrati in figura 3, tale ordine era inversod (cioè 48 nm, 532 nm e 410 nm) a causa della fotostabilità di questo particolare campione. </li><li> Impostare il limite superiore / inferiore della Z-stack spostando il tavolino del microscopio fino a quando la parte superiore / inferiore delle celle è leggermente fuori fuoco. La distanza desiderata tra ogni immagine deve essere tenuto costante a 0.125 micron per super risoluzione di imaging, come software di ricostruzione prendere questo valore come impostazione predefinita. </li><li> Ricostruire stack di immagini utilizzando Softworx (Applied Precision, WA) e analizzare con 6,0 Volocity (Perkin Elmer, MA). </li></ol>

<ol>
	<li>Kim, R. H., Coates, J. M., Bowles, T. L., McNerney, G. P., Sutcliffe, J., Jung, J. U., Gandour-Edwards, R., Chuang, F. Y., Bold, R. J., Kung, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arginine+deiminase+as+a+novel+therapy+for+prostate+cancer+induces+autophagy+and+caspase-independent+apoptosis.">Arginine deiminase as a novel therapy for prostate cancer induces autophagy and caspase-independent apoptosis.</a> Cancer Res. 69 (2), 700-708 (2009).</li><li>Miyazaki, K., Takaku, H., Umeda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+growth+inhibition+of+human+tumor+cells+in+culture+by+arginine+deiminase+purified+from+a+culture+medium+of+a+Mycoplasma-infected+cell+line.">Potent growth inhibition of human tumor cells in culture by arginine deiminase purified from a culture medium of a Mycoplasma-infected cell line.</a> Cancer Res. 50, 4522-4527 (1990).</li><li>Takaku, H., Matsumoto, M., Misawa, S., Miyazaki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-tumor+activity+of+arginine+deiminase+from+Mycoplasma+argini+and+its+growth-inhibitory+mechanism.">Anti-tumor activity of arginine deiminase from Mycoplasma argini and its growth-inhibitory mechanism.</a> Jpn. J. Cancer Res. 86, 840-846 (1995).</li><li>Levine, B., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+by+self-digestion:+molecular+mechanisms+and+biological+functions+of+autophagy.">Development by self-digestion: molecular mechanisms and biological functions of autophagy.</a> Dev. Cell. 6, 463-477 (2004).</li><li>Mizushima, N., Levine, B., Cuervo, A. M., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+fights+disease+through+cellular+self-digestion.">Autophagy fights disease through cellular self-digestion.</a> Nature. 451, 1069-1075 (2008).</li><li>Kabeya, Y., Mizushima, N., Ueno, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LC3,+a+mammalian+homologue+of+yeast+Apg8p,+is+localized+in+autophagosome+membranes+after+processing.">LC3, a mammalian homologue of yeast Apg8p, is localized in autophagosome membranes after processing.</a> EMBO J. 19, 5720-5728 (2000).</li><li>Pattingre, S., Espert, L., Biard-Piechaczyk, M., Codogno, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+macroautophagy+by+mTOR+and+Beclin+1+complexes.">Regulation of macroautophagy by mTOR and Beclin 1 complexes.</a> Biochimie. 90, 313-323 (2008).</li><li>Maiuri, M. C., Criollo, A., Tasdemir, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BH3-only+proteins+and+BH3mimetics+induce+autophagy+by+competitively+disrupting+the+interaction+between+Beclin+1+and+Bcl-2/Bcl-X(L).">BH3-only proteins and BH3mimetics induce autophagy by competitively disrupting the interaction between Beclin 1 and Bcl-2/Bcl-X(L).</a> Autophagy. 3, 374-376 (2007).</li><li>Crighton, D., Wilkinson, S., O'Prey, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DRAM,+a+p53-induced+modulator+of+autophagy,+is+critical+for+apoptosis.">DRAM, a p53-induced modulator of autophagy, is critical for apoptosis.</a> Cell. 126, 121-134 (2008).</li><li>Dillon, B. J., Prieto, V. G., Curley, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incidence+and+distribution+of+argininosuccinate+synthetase+deficiency+in+human+cancers:+a+method+for+identifying+cancers+sensitive+to+arginine+deprivation.">Incidence and distribution of argininosuccinate synthetase deficiency in human cancers: a method for identifying cancers sensitive to arginine deprivation.</a> Cancer. 100, 826-833 (2004).</li><li>Dale, B. M., McNerney, G. P., Thompson, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-to-cell+transfer+of+HIV-1+via+virological+synapses+leads+to+endosomal+virion+maturation+that+activates+viral+membrane+fusion.">Cell-to-cell transfer of HIV-1 via virological synapses leads to endosomal virion maturation that activates viral membrane fusion.</a> Cell Host &amp; Microbe. 10 (6), 551-562 (2011).</li><li>Cogger, V. C., McNerney, G. P., Nyunt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+structured+illumination+microscopy+of+liver+sinusoidal+endothelial+cell+fenestrations.">Three-dimensional structured illumination microscopy of liver sinusoidal endothelial cell fenestrations.</a> J. Struct. Biol. 171 (3), 382-388 (2010).</li><li>York, A. G., Parekh, S. H., Nogare, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolution+doubling+in+live,+multicellular+organisms+via+multifocal+structured+illumination+microscopy.">Resolution doubling in live, multicellular organisms via multifocal structured illumination microscopy.</a> Nat. Methods. 9 (7), 749-754 (2012).</li><li>Gustafsson, M. G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surpassing+the+lateral+resolution+limit+by+factor+of+two+using+structured+illumination+microscopy.">Surpassing the lateral resolution limit by factor of two using structured illumination microscopy.</a> Journal of Microscopy. 198, 82-87 (2000).</li><li>Shao, L., Kner, P., Rego, E. H., Gustaffson, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+3D+microscopy+of+live+whole+cells+using+structured+illumination.">Super-resolution 3D microscopy of live whole cells using structured illumination.</a> Nat. Method. 8 (12), 1044-1046 (2011).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Mentre l&#39;osservazione diretta di cellule marcate con sonde fluorescenti contro LC3 è ampiamente accettata come un metodo standard per confermare la risposta autophagic 6, l&#39;imaging 3D quantitativa dello stesso sistema (come abbiamo fatto) fornisce informazioni senza precedenti e di dettaglio circa il complesso processo di autofagia cellulare . In particolare, si osserva che centinaia (se non migliaia) di autophagosomes in cellule vive sono formate all&#39;interno di 80 min di induzione di autofagia. ...

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arginine Deiminase (ADI)</td>
			<td>DesigneRx</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4034</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casein</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5890</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>4042</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S4521</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa anti-mouse 555</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21422</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa anti-rabbit 647</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21244</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LysoTracker Red DND-99</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L7528</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Lamp1</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>H4A3</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Cadherin</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>#3195</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SlowFade Gold</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S36936</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm poly-d-lysine coated glass bottom plate</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35GC-1.5-1.4-C</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>No.1, 22 mm coverslip</td>
			<td>Corning</td>
			<td>#2865-22</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>1324G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative analysis of autophagy using advanced 3d fluorescence microscopy

Il cancro della prostata è la forma principale di tumori maligni tra gli uomini negli Stati Uniti Mentre la chirurgia comporta un rischio significativo di impotenza e incontinenza, gli approcci tradizionali chemioterapici sono stati in gran parte senza successo. La terapia ormonale è efficace in fase iniziale, ma spesso non riesce con l&#39;eventuale sviluppo di tumori ormone-refrattario. Siamo stati interessati a sviluppo di terapie mirate specifica carenza metabolica delle cellule tumorali. Recentemente abbiamo dimostrato che le cellule tumorali prostatiche specificamente privi di un enzima (sintasi argininosuccinate, o ASS) coinvolti nella sintesi dell&#39;amminoacido arginina 1. Questa condizione fa sì che le cellule tumorali di diventare dipendente da arginina esogena, e subiscono lo stress metabolico quando arginina libera è esaurito da arginina deiminase (ADI) 1,10. Infatti, abbiamo dimostrato che le cellule del cancro alla prostata umano CWR22 RV1 sono effettivamente uccisi da ADI con apoptosi caspasi-indipendente e autopha aggressivogy (o macroautofagia) 1,2,3. L&#39;autofagia è un processo evolutivamente conservato che permette alle cellule di metabolizzare le proteine ​​indesiderate ripartizione lisosomiale durante il digiuno alimentare 4,5. Anche se i componenti essenziali di questo percorso sono ben caratterizzati 6,7,8,9, molti aspetti del meccanismo molecolare sono ancora poco chiari - in particolare, qual è il ruolo dell&#39;autofagia nella morte-risposta delle cellule tumorali della prostata dopo il trattamento ADI ? Per far fronte a questa domanda, abbiamo richiesto un metodo sperimentale per misurare il livello e la portata della risposta autophagic nelle cellule - e poiché non ci sono marcatori molecolari noti che possono tracciare accuratamente questo processo, abbiamo scelto di sviluppare un approccio di imaging-based, utilizzando quantitativa 3D microscopia a fluorescenza 11,12. Utilizzando CWR22Rv1 cellule specificamente marcati con sonde fluorescenti per autophagosomes e lisosomi, dimostriamo che gli stack di immagini 3D acquisiti sia con widefield deconvoluzione microscopia (e più tardi, con la super-risoluzione, microscopia strutturato-illuminazione) in grado di catturare in modo chiaro le prime fasi di induzione di autofagia. Con le applicazioni di analisi delle immagini digitali disponibili in commercio, possiamo facilmente ricavare informazioni statistiche sul numero autofagosoma e lisosomi, le dimensioni, la distribuzione, e il grado di colocalizzazione da qualsiasi cellula creata l&#39;immagine. Questa informazione ci permette di tracciare con precisione i progressi di autofagia nelle cellule viventi e consente di continuare la nostra indagine sul ruolo dell&#39;autofagia nella chemioterapia del cancro.

La sequenza di immagini mostrato in Figura 1 mostra i cambiamenti fisici che si verificano in CWR22 cellule durante il primo 80 min dell&#39;induzione autofagia. In questo ed altri studi (non mostrato) abbiamo costantemente osservato: (1) lo spostamento del nucleo di distanza dal centro della cella; (2) riduzione dei punti di adesione focale, e (3) traslocazione generale autophagosomes e lisosomi verso il centro del cella. Inoltre, abbiamo anche osservato un piccolo aumento della co-localizzazione (indi...

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Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy

L&#39;autofagia è un processo onnipresente che permette alle cellule di degradare e riciclare le proteine ​​e organelli. Applichiamo la microscopia a fluorescenza avanzata per visualizzare e quantificare il piccolo, ma, cambiamenti fisici essenziali connessi con l&#39;induzione di autofagia, tra cui la formazione e la distribuzione di autophagosomes e lisosomi, e la loro fusione in autolysosomes.

Analisi quantitativa di autofagia usando 3D avanzato microscopia a fluorescenza

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, ...

quantitative-analysis-autophagy-using-advanced-3d-fluorescence

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Biology

Unit 1

Cell Death

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17.8K Views.  University of California, Davis. L'autofagia è un processo onnipresente che permette alle cellule di degradare e riciclare le proteine ​​e organelli. Applichiamo la microscopia a fluorescenza avanzata per visualizzare e quantificare il piccolo, ma, cambiamenti fisici essenziali connessi con l'induzione di autofagia, tra cui la formazione e la distribuzione di autophagosomes e lisosomi, e la loro fusione in autolysosomes.

Video: Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Full insight into the mechanisms of living cells can be achieved only by investigating the key processes that elicit and direct events at a cellular level. To date the shear complexity of biological systems has caused precise single-molecule experimentation to be far too demanding, instead focusing on studies of single systems using relatively crude bulk ensemble-average measurements. However, many important processes occur in the living cell at the level of just one or a few molecules; ensemble measurements generally mask the stochastic and heterogeneous nature of these events. Here, using advanced optical microscopy and analytical image analysis tools we demonstrate how to monitor proteins within a single living bacterial cell to a precision of single molecules and how we can observe dynamics within molecular complexes in functioning biological machines. The techniques are directly relevant physiologically. They are minimally-perturbative and non-invasive to the biological sample under study and are fully attuned for investigations in living material, features not readily available to other single-molecule approaches of biophysics. In addition, the biological specimens studied all produce fluorescently-tagged protein at levels which are almost identical to the unmodified cell strains ("genomic encoding"), as opposed to the more common but less ideal approach for generating significantly more protein than would occur naturally ('plasmid expression'). Thus, the actual biological samples which will be investigated are significantly closer to the natural organisms, and therefore the observations more relevant to real physiological processes.

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Here we demonstrate the protocols for performing single-molecule fluorescence microscopy on living bacterial cells to enable functional molecular complexes to be detected, tracked and quantified.

Visualizzazione singola complessi molecolari In Vivo Utilizzo avanzato microscopia a fluorescenza

Full insight into the mechanisms of living cells can be achieved only by investigating the key processes that elicit and direct events at a cellular ...

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Biologia

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

Time-lapse imaging di mitosi dopo la trasfezione di siRNA

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using fluorochromes like Green Fluorescent Protein (GFP) directly attached to the protein of interest has become increasingly popular 1. Using GFP and similar fluorochromes the subcellular localisations and movements of proteins can be detected in a fluorescent microscope. Moreover, also the subnuclear localisation of a certain region of a chromosome can be studied using this technique. GFP is fused to the Lac Repressor protein (LacR) and ectopically expressed in the cell where tandem repeats of the lacO sequence has been inserted into the region of interest on the chromosome2. The LacR-GFP will bind to the lacO repeats and that area of the genome will be visible as a green dot in the fluorescence microscope. Yeast is especially suited for this type of manipulation since homologous recombination is very efficient and thereby enables targeted integration of the lacO repeats and engineered fusion proteins with GFP 3. Here we describe a quantitative method for live cell analysis of fission yeast. Additional protocols for live cell analysis of fission yeast can be found, for example on how to make a movie of the meiotic chromosomal behaviour 4. In this particular experiment we focus on subnuclear organisation and how it is affected during gene induction. We have labelled a gene cluster, named Chr1, by the introduction of lacO binding sites in the vicinity of the genes. The gene cluster is enriched for genes that are induced early during nitrogen starvation of fission yeast 5. In the strain the nuclear membrane (NM) is labelled by the attachment of mCherry to the NM protein Cut11 giving rise to a red fluorescent signal. The Spindle Pole body (SPB) compound Sid4 is fused to Red Fluorescent Protein (Sid4-mRFP) 6. In vegetatively growing yeast cells the centromeres are always attached to the SPB that is embedded in the NM 7. The SPB is identified as a large round structure in the NM. By imaging before and 20 minutes after depletion of the nitrogen source we can determine the distance between the gene cluster (GFP) and the NM/SPB. The mean or median distances before and after nitrogen depletion are compared and we can thus quantify whether or not there is a shift in subcellular localisation of the gene cluster after nitrogen depletion.

The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, is a good model system to study basic cellular processes. Here we describe a method to perform quantitative live cell analysis of fission yeast. In this particular experiment we focus on organisation of the genome within the cell nucleus, but the method can also be used to study cytosolic factors.

Quantitativa vivo cellulare-microscopio a fluorescenza Analisi di lievito Fission

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

Quantitative Analysis of Random Migration of Cells Using Time-lapse Video Microscopy

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During directional migration, cells move rapidly in response to an extracellular chemotactic signal, or in response to intrinsic cues 3 provided by the basic motility machinery. Random migration occurs when a cell possesses low intrinsic directionality, allowing the cells to explore their local environment.
Cell migration is a complex process, in the initial response cell undergoes polarization and extends protrusions in the direction of migration 2. Traditional methods to measure migration such as the Boyden chamber migration assay is an easy method to measure chemotaxis in vitro, which allows measuring migration as an end point result. However, this approach neither allows measurement of individual migration parameters, nor does it allow to visualization of morphological changes that cell undergoes during migration.
Here, we present a method that allows us to monitor migrating cells in real time using video - time lapse microscopy. Since cell migration and invasion are hallmarks of cancer, this method will be applicable in studying cancer cell migration and invasion in vitro. Random migration of platelets has been considered as one of the parameters of platelet function 4, hence this method could also be helpful in studying platelet functions. This assay has the advantage of being rapid, reliable, reproducible, and does not require optimization of cell numbers. In order to maintain physiologically suitable conditions for cells, the microscope is equipped with CO2 supply and temperature thermostat. Cell movement is monitored by taking pictures using a camera fitted to the microscope at regular intervals. Cell migration can be calculated by measuring average speed and average displacement, which is calculated by Slidebook software.

This method allows monitoring of cells in real time and quantitative measurements of different cell migration parameters such as speed, displacement, and velocity. Unlike the traditional methods, this real time approach is not based on endpoint quantitative migration measurements; instead it allows monitoring and calculating different parameters continuously.

Analisi quantitativa della migrazione casuale di celle usando Time-lapse Microscopia Video

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualizzazione e l&#39;analisi di molecole di mRNA mediante fluorescenza<em&gt; In Situ</em&gt; Ibridazione in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized image analysis tools are available, most traditional image-analysis-based workflows have steep learning curves (for fine tuning of analysis parameters) and result in long turnaround times between imaging and analysis. In particular, cell segmentation, the process of identifying individual cells in an image, is a major bottleneck in this regard.
Here we present an alternate, cell-segmentation-free workflow based on PhenoRipper, an open-source software platform designed for the rapid analysis and exploration of microscopy images. The pipeline presented here is optimized for immunofluorescence microscopy images of cell cultures and requires minimal user intervention. Within half an hour, PhenoRipper can analyze data from a typical 96-well experiment and generate image profiles. Users can then visually explore their data, perform quality control on their experiment, ensure response to perturbations and check reproducibility of replicates. This facilitates a rapid feedback cycle between analysis and experiment, which is crucial during assay optimization. This protocol is useful not just as a first pass analysis for quality control, but also may be used as an end-to-end solution, especially for screening. The workflow described here scales to large data sets such as those generated by high-throughput screens, and has been shown to group experimental conditions by phenotype accurately over a wide range of biological systems. The PhenoBrowser interface provides an intuitive framework to explore the phenotypic space and relate image properties to biological annotations. Taken together, the protocol described here will lower the barriers to adopting quantitative analysis of image based screens.

Here we describe a workflow for rapidly analyzing and exploring collections of fluorescence microscopy images using PhenoRipper, a recently developed image-analysis platform.

Analisi rapida ed esplorazione di microscopia a fluorescenza Immagini

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

The study of cellular quality control systems has emerged as a highly dynamic and relevant field of contemporary research. It has become clear that cells possess several lines of defense against damage to biologically relevant molecules like nucleic acids, lipids and proteins. In addition to organelle dynamics (fusion/fission/motility/inheritance) and tightly controlled protease activity, the degradation of surplus, damaged or compromised organelles by autophagy (cellular &#8216;self-eating&#8217;) has received much attention from the scientific community. The regulation of autophagy is quite complex and depends on genetic and environmental factors, many of which have so far not been elucidated. Here a novel method is presented that allows the convenient study of autophagy in the filamentous fungus Penicillium chrysogenum. It is based on growth of the fungus on so-called &#8216;starvation pads&#8217; for stimulation of autophagy in a reproducible manner. Samples are directly assayed by microscopy and evaluated for autophagy induction / progress. The protocol presented here is not limited for use with P. chrysogenum and can be easily adapted for use in other filamentous fungi.

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

A convenient and powerful method for studying autophagy in Penicillium chrysogenum by using starvation pads (mixtures of agarose and tap water in a microscope slide containing a central cavity) is presented here.

Analisi di autofagia in<em&gt; Penicillium chrysogenum</em&gt; Utilizzando Starvation Pads in combinazione con microscopia a fluorescenza

The study of cellular quality control systems has emerged as a highly dynamic and relevant field of contemporary research. It has become clear that cells ...

Identification of Kinesin-1 Cargos Using Fluorescence Microscopy

Fluorescence microscopy is employed to identify Kinesin-1 cargos. Recently, the heavy chain of Kinesin-1 (KIF5B) was shown to transport the nuclear transcription factor c-MYC for proteosomal degradation in the cytoplasm. The method described here involves the study of a motorless KIF5B mutant for fluorescence microscopy. The wild-type and motorless KIF5B proteins are tagged with the fluorescent protein tdTomato. The wild-type tdTomato-KIF5B appears homogenously in the cytoplasm, while the motorless tdTomato-KIF5B mutant forms aggregates in the cytoplasm. Aggregation of the motorless KIF5B mutant induces aggregation of its cargo c-MYC in the cytoplasm. Hence, this method provides a visual means to identify the cargos of Kinesin-1. A similar strategy can be utilized to identify cargos of other motor proteins.

Here, a protocol is presented to identify Kinesin-1 cargos. A motorless mutant of the Kinesin-1 heavy chain (KIF5B) aggregates in the cytoplasm and induces aggregation of its cargos. Both aggregates are detected under fluorescence microscopy. A similar strategy can be employed to identify cargos of other motor proteins.

Identificazione Kinesin-1 Cargos Utilizzando la microscopia a fluorescenza

Fluorescence microscopy is employed to identify Kinesin-1 cargos. Recently, the heavy chain of Kinesin-1 (KIF5B) was shown to transport the nuclear ...

Open Source High Content Analysis Utilizing Automated Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) based readouts of fixed or live cells in multiwell plates. This provides a means to screen for cell signaling processes read out using intramolecular FRET biosensors or intermolecular FRET of protein interactions such as oligomerization or heterodimerization, which can be used to identify binding partners. We describe here the functionality of this automated multiwell plate FLIM instrumentation and present exemplar data from our studies of HIV Gag protein oligomerization and a time course of a FRET biosensor in live cells. A detailed description of the practical implementation is then provided with reference to a list of hardware components and a description of the open source data acquisition software written in &#181;Manager. The application of FLIMfit, an open source MATLAB-based client for the OMERO platform, to analyze arrays of multiwell plate FLIM data is also presented. The protocols for imaging fixed and live cells are outlined and a demonstration of an automated multiwell plate FLIM experiment using cells expressing fluorescent protein-based FRET constructs is presented. This is complemented by a walk-through of the data analysis for this specific FLIM FRET data set.

We present an open source high content analysis (HCA) instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) based readouts. Data acquisition for this openFLIM-HCA instrument is controlled by software written in &#181;Manager and data analysis is undertaken in FLIMfit.

Open Source alto contenuto di analisi Utilizzando Automated Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions ...

Functional Imaging of Viral Transcription Factories Using 3D Fluorescence Microscopy

It is well known that spatial and temporal regulation of genes is an integral part of governing proper gene expression. Consequently, it is invaluable to understand where and when transcription is taking place within nuclear space and to visualize the relationship between episomes infected within the same cell's nucleus. Here, both immunofluorescence (IFA) and RNA-FISH have been combinedto identify actively transcribing Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus (KSHV) episomes. By staining KSHV latency-associated nuclear antigen (LANA), it is possible to locate where viral episomes exist within the nucleus. In addition, by designing RNA-FISH probes to target the intron region of a viral gene, which is expressed only during productive infection, nascent RNA transcripts can be located. Using this combination of molecular probes, it is possible to visualize the assembly of large viral transcription factories and analyze the spatial regulation of viral gene expression during KSHV reactivation. By including anti-RNA polymerase II antibody staining, one can also visualize the association between RNA polymerase II (RNAPII) aggregation and KSHV transcription during reactivation.

Viral transcriptional factories are discrete structures that are enriched with cellular RNA polymerase II to increase viral gene transcription during reactivation. Here, a method to locate sites of actively transcribing viral chromatin in 3D nuclear space by a combination of immunofluorescence staining and in situ RNA hybridization is described.

Imaging funzionale delle fabbriche di trascrizione virale utilizzando la microscopia a fluorescenza 3D

It is well known that spatial and temporal regulation of genes is an integral part of governing proper gene expression. Consequently, it is invaluable to ...