Gli autori vorrebbero riconoscere Detlef Schumann, Jennifer Sutton (Thermo Fisher Scientific) e Nathaniel Snyder (Università della Pennsylvania) per le discussioni importanti sul calibrazione di massa ed elaborazione dei dati. Ricerca riportata in questa pubblicazione è stato sostenuto dal National Cancer Institute dei National Institutes of Health nel quadro Premio Numero R00CA168997. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale del National Institutes of Health.

1. Preparazione di LC-MS Reagenti, Istituzione di un metodo cromatografico, e Istituzione di strumenti procedure operative <ol><li> Preparazione di solventi LC <ol><li> Preparare 500 ml fasi mobili. A è acetato di ammonio 20 mM e 15 mM idrossido di ammonio in 3% acetonitrile / acqua, pH finale 9.0; e B è 100% acetonitrile. </li><li> Liberamente tappo della bottiglia, metterla in un sonicatore bagnomaria, e sonicare per 10 minuti senza riscaldamento supplementare. (Questo passaggio è quello di garantire che tutti i sali di ammonio dissolvono completamente e che non ci siano bolle d&#39;aria residue.) </li><li> Trasferire 250 ml di solvente per una bottiglia di vetro da 250 ml per uso LC-MS, e mantenere il resto a 4 ° C. </li></ol></li><li> Preparare la soluzione di taratura gamma bassa di massa. E &#39;importante utilizzare una gamma bassa massa miscela personalizzata calibrazione per applicazioni metabolomica per garantire che masse accurate vengono rilevati a basso peso molecolare. <ol><li> Pesare 5 mg sia sodium fluoroacetate e acido omovanillico e sciogliere in 5 ml di acqua per fare una concentrazione finale di 1 mg / ml. Sciogliere diazinon in metanolo per effettuare una concentrazione finale di 10 mg / ml. </li><li> Per preparare 1 ml di soluzione negativa basso calibrazione di massa, mescolare 960 ml di soluzione negativa termo calibrazione con 20 ml di fluoroaceate sodio e soluzione di acido omovanillico. Per fare 1 ml di soluzione positiva a basso calibrazione di massa, mescolare 990 ml di termo soluzione di calibrazione positivo e 10 ml di soluzione diazinone. (La soluzione di taratura massa bassa deve essere conservato a 4 ° C ed essere preparato fresco ogni 2 mesi). </li></ol></li><li> Taratura di QE-MS ad una Messa Low Range <ol><li> Prima di eseguire la calibrazione gamma bassa massa, effettuare una calibrazione massa standard (m / z, 150-2,000) in modalità sia positivi che negativi in ​​base alle istruzioni del produttore. </li><li> Una volta che passa una calibrazione di massa regolare, regolare l&#39;intervallo di scansione a 60-900 m / z nel pannello di controllo dello strumentoe viene applicato un CID fonte di 25 eV per modalità positiva e 35 eV per modalità negativa. (Questo darà segnali stabili del frammento ione caffeina e lo ione solfato. L&#39;intervallo di scansione qui è fisso, perché l&#39;ultima m / z non deve essere maggiore di 15x del partendo m / z) </li><li> Una volta che la sorgente di ioni è stabile, quindi eseguire la calibrazione personalizzato. Nota: Una fonte stabile è definita come meno del 10% della variazione corrente ionica totale in modalità positiva, e meno del 15% in modo negativo. Gli ioni di calibrazione personalizzati e corrispondenti m / z sono elencati nella Tabella 1. </li></ol></li><li> Stabilire la strumentazione LC-MS per l&#39;analisi metabolita polare. LC è accoppiato ad un QE-MS per la separazione metabolita e rilevamento. <ol><li> Dotare il QE-MS con una sonda di ionizzazione elettrospray riscaldata (H-ESI). Impostare i parametri di ottimizzazione rilevanti per la sonda elencati: temperatura del riscaldatore, 120 ° C; gas guaina, 30; gas ausiliario, 10; spazzare gas, 3; spruzzo di tensione, 3,6 kV permodalità positiva e 2,5 kV per modalità negativa. Impostare la temperatura capillare a 320 ° C, e S-lente a 55. </li><li> Costruire un metodo di scansione completa come segue: Fascia Scansione completa: da 60 a 900 (m / z); Risoluzione: 70.000; tempo massimo di iniezione: 200 msec con tempi di iniezione tipici intorno a 50 msec; controllo automatico del guadagno (AGC): 3.000.000 di ioni. Queste impostazioni determinano un ciclo di lavoro di circa 550 msec per eseguire scansioni in modalità sia positivi che negativi. </li><li> Stabilire il metodo cromatografico. Impiegare una colonna ammide (100 x 2,1 mm di diametro, 3.5 mm) per la separazione composto a temperatura ambiente 13,15. La fase mobile A è come sopra descritto, e la fase mobile B è acetonitrile. Utilizzare un gradiente lineare come segue: 0 min, 85% B; 1.5 min, 85% B, 5.5 min, 35% B; 10min, 35% B, 10.5 min, 35% B, 14.5 min, 35% B, 15 min, 85% B e 20 min, 85% B. La portata è di 0,15 ml / min tra 0 e 10 min e 15 per 20 min, e 0,3 ml / min 10,5-14,5 min. </li></ol></li></ol> 2. Preparation del metabolita Campioni <ol><li> Preparare un solvente di estrazione. Miscelare 40 ml di metanolo (LC-MS grado) e 10 ml di acqua (grado LC-MS) in un tubo da 50 ml, e tenerlo in freezer -80 ° C per almeno 1 ora prima dell&#39;uso. Nota: Questa procedura e alle fasi che seguono possono essere modificati per l&#39;estrazione di tessuto biologico e di campioni di fluido. <ol><li> Culture cancro colon HCT 8 cellule in tre 10 centimetri piatti o piastre da 6 pozzetti con terreno di coltura completo, RPMI 1640 supplementato con 10% inattivato al calore siero fetale bovino e 100.000 unità / L penicillina e 100 mg / L streptomicina. </li><li> Quando le cellule raggiungono l&#39;80% di confluenza, rimuovere rapidamente il mezzo, e posizionare il piatto o piatto sulla parte superiore del 13,15 ghiaccio secco. Aggiungere estrazione 1 ml di solvente immediatamente (80% metanolo / acqua), e trasferire la piastra al -80 ° C freezer. Per un piatto 10 cm e aggiungere 3 ml di solvente di estrazione per ciascun pozzetto. (Prova per rimuovere il mezzo più possibile per evitare l&#39;effetto di soppressione ionica causa di sali residui di mezzo.)</li><li> Lasciare la piastra per 15 min. Togliere dal freezer, e raschiare le cellule nel solvente in ghiaccio secco. Trasferire la soluzione in 1,7 ml provette Eppendorf e centrifugare con la velocità di 20.000 xga 4 ° C per 10 min. (Preparare metaboliti cellulari da tre piatti separati per fare tre campioni replicati. Lo scopo di mantenere due tubi è di avere uno come backup.) </li><li> Trasferire il supernatante in due nuove provette Eppendorf, e asciugarli nel vuoto velocità. Questo richiede circa 3-6 ore a seconda della velocità di aspirazione utilizzata. (I campioni possono anche essere essiccate per una notte sotto gas azoto.) </li><li> Dopo tubi di essiccazione, negozio di ciascun campione nel -80 ° C freezer. Quando si è pronti, ricostituire un campione in 20 ml di acqua (LC-MS grado), e iniettare 5 ml di LC-QE-MS per l&#39;analisi. </li></ol></li></ol> 3. Impostazione di Sequenza Campione <ol><li> Una volta che la taratura è stata correttamente effettuata sul QE-MS, LC colonna equilibrare per 5 minuti con il 85% e ad un flussovelocità di 0,15 ml / min, che è la condizione iniziale della sfumatura LC. </li><li> Impostare la sequenza di esempio in ordine casuale. Nota: In questo modo, distribuisce le fluttuazioni introdotte dal LC-MS per ogni campione e assicura confronto più accurato tra diversi campioni. Ogni 6 campioni, aggiungere una pista di lavaggio, che condivide lo stesso metodo MS, tranne il gradiente LC è 95% A per 10 min e seguita da un 5 min colonna equilibrazione al 85% A con una portata di 0,15 ml / min. Aggiungere campioni bianchi (100% acqua) dopo ogni corsa lavaggio di valutare lo sfondo del sistema e riportare i livelli. </li><li> Salvare la sequenza e una volta che la colonna LC mostra la pressione stabile, circa 400 psi, inizia la corsa sequenza. Se non c&#39;è altro campione è da eseguire dopo questa sequenza, quindi aggiungere una corsa di arresto alla fine della sequenza, che ha una portata di 0 ml / min alla fine del gradiente e scegliere &quot;stand-by&quot; dopo aver terminato l&#39; sequenza. </li><li> Eseguire nuovamente lo stesso campione fissato 12 ore dopo la calibrazione. (Questo is per valutare la fluttuazione errore massa dopo la calibrazione.) </li></ol> 4. Post Analisi Strumento di pulizia e manutenzione <ol><li> Al termine della sequenza, lavare la colonna con 95% Un ad una portata di 0,2 ml / min per 2 h, e se necessario, invertire la colonna prima del lavaggio. </li><li> Rimuovere la colonna LC e collegare direttamente il LC alla sorgente di ioni da un sindacato. Preparare detergente, acqua / metanolo / acido formico (v: v: v, 90:10:0.2), impostare MS in modalità standby, e sistema di lavaggio LC-MS ad una portata di 0,1 ml / min per 1 ora per rimuovere il residuo precipitato sali o altre impurità. Abbassare la portata se c&#39;è pressione dell&#39;impianto troppo. </li><li> Impostare la temperatura capillare a 50 ° C, e rimuovere la gabbia ione. Estrarre con attenzione il cono ione sweep e il condotto di trasferimento ionico dopo che la temperatura capillare scende a 50 ° C. Utilizzare una maglia ruvida come carta vetrata, per rimuovere le impurità lasciati sulla superficie del cono ione sweep. </li><li> Posizionare il trasferimento di ionitubo in un tubo Falcon da 15 ml contenente 10 ml di 90% di acqua / metanolo contenente 0,1% di acido formico. Dopo sonicating la provetta in un bagno sonicatore acqua per 20 minuti, decantare il solvente all&#39;interno, sostituirlo con 10 ml di metanolo puro e con ultrasuoni per altri 20 min. (Se necessario, la sonicazione può essere effettuata a 40 ° C o una temperatura ancora più elevata per ottenere migliori risultati di lavaggio.) </li></ol> 5. Analisi LC-MS Data <ol><li> Per la sequenza del campione senza intoppi, dopo aver terminato i primi due campioni della sequenza, controllare i picchi di metaboliti sconosciuti. Utilizzare un file csv che elenca i nomi dei metaboliti, formula chimica neutro e modalità di rilevamento (positivo o negativo), come file di input, e il file di output contiene picchi estratti ed errori di massa in ppm. Se la forma del picco è anormale o l&#39;errore di massa è spento da più di 5 ppm, il resto della sequenza deve essere fermato e risoluzione di problemi deve essere fatto. </li><li> Scegliere il metodo di &quot;allineamento piccoed estrazione frame &quot;sul software disponibile in commercio. Selezionare i dati grezzi da LC-MS e di gruppo. Scegli campioni nel mezzo della sequenza di esecuzione come campione di riferimento cromatografia per l&#39;allineamento di picco. Carica un seme telaio compresi i metaboliti noti per l&#39;analisi dei metaboliti mirato con i dati raccolti e il relativo seme telaio. </li><li> Effettuare l&#39;analisi dei dati in modalità positiva e negativa separatamente. Utilizzare l&#39;impostazione predefinita per gli altri parametri. Disattivare la funzione di ricerca del database ed eseguire il flusso di lavoro. Esportare i dati elaborati da un foglio excel contenente area del picco di ogni frame. Il primo set di fotogrammi corrispondono ai metaboliti nel elenco mirato. Nota: Per un&#39;analisi metabolita mirata, le informazioni metaboliti è ottenuta sulla base degli studi precedenti 13,15. </li><li> Per un&#39;analisi metabolita non mirati, scegliere il metodo di &quot;estrazione componente&quot;. Caricare i campioni in bianco per sottrazione del fondo. Impostare picco di intensità soglia di unt 10 5, larghezza m / z di 10 ppm e rapporto segnale-rumore di 3. </li><li> Utilizzare il database metabolome umano per l&#39;identificazione di composti sconosciuti. Utilizzare un filtro CV a rimuovere i componenti con grandi curricula all&#39;interno di campioni replicati. Passare manualmente ogni componente e scegliere quelli con picchi ben definiti o relativamente grande differenza in diversi tipi di campioni per la ricerca nel database. I dati di esportazione con risultati in database. (Allineamento Peak potrebbe essere aggirato se il punteggio di allineamento picco è troppo bassa.) </li></ol>

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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+metabolic+profiling+procedures+for+urine+using+UPLC-MS.">Global metabolic profiling procedures for urine using UPLC-MS.</a> Nature Protocols. 5 (6), 1005-1018 (2010).</li></ol>

Gli autori dichiarano assenza di conflitti di interesse.

I passaggi più critici per successo profiling metabolita in cellule usando questo protocollo sono: 1) controllo del mezzo di crescita e attenta estrazione delle cellule; 2) regolazione del metodo LC basato su MS configurazione metodo per assicurarsi che ci sia un numero sufficiente (di solito almeno 10) punti dati attraverso un picco per la quantificazione; 3) fare una calibrazione bassa massa prima di eseguire campioni; 4) l&#39;iniezione non più di 5 ml di evitare tempi di ritenzione spostamento e allargamento della...

Metabolomica, definiti come un esperimento che misura più metaboliti contemporaneamente, è stata una zona di forte interesse. Metabolomica fornisce una lettura diretta di fisiologia molecolare e ha fornito intuizioni in sviluppo e malattie come il cancro 1-4. Risonanza magnetica nucleare (NMR) e spettrometria cromatografia-massa del gas (GC-MS) sono tra gli strumenti più comunemente utilizzati 5-9. NMR, in particolare è stato utilizzato per esperimenti di flusso in quanto composti marcati con isotopi pesanti, come ad esempio 13 metaboliti C etichettati, sono NMR attivo 10,11. Tuttavia, questa strategia richiede relativamente elevata purezza del campione e grandi quantità di campione, il che limita le sue applicazioni in metabolomica. Nel frattempo, i dati raccolti da NMR analisi delle esigenze intensiva e assegnazione composta di spettri NMR complesso è difficile. GC-MS è stato ampiamente utilizzato per metaboliti polari e studi lipidici, ma richiede componen volatilids e quindi spesso derivatizzazione dei metaboliti, che a volte coinvolge la chimica complessa che può richiedere molto tempo e introduce rumore sperimentale. Cromatografia liquida (LC) accoppiato a tripla spettrometria di massa a quadrupolo utilizza il primo quadrupolo per selezionare gli ioni madri intatte, che vengono poi frammentate nel secondo quadrupolo, mentre il terzo quadrupolo viene utilizzato per selezionare frammenti caratteristici o ioni figlia. Questo metodo, che registra il passaggio da ioni madri a specifici ioni figlia, è denominata multiple reaction monitoring (MRM). MRM è un metodo molto sensibile, preciso e robusto sia per piccole molecole e proteine ​​quantificazione 12-15,21. Tuttavia, MRM ha i suoi limiti. Per ottenere un&#39;elevata specificità di un metodo MRM deve essere costruita per ogni metabolita. Questo metodo consiste nell&#39;identificare un frammento specifico e corrispondente energia di collisione ottimizzata, che richiede pre-conoscenza della propeproprietā dei metaboliti di interesse, come ad esempio informazioni di struttura chimica. Pertanto, con alcune eccezioni che comportano la perdita neutro di frammenti comuni, non è possibile identificare metaboliti non noti con questo metodo. Negli ultimi anni, la spettrometria di massa ad alta risoluzione (HRMS) strumenti sono stati rilasciati, come la serie LTQ-Orbitrap e Exactive, il QuanTof, e TripleTOF 5600 16-18,22. HRMS possono fornire una massa rapporto carica (m / z) degli ioni intatto, per un errore di pochi ppm. Pertanto, uno strumento HRMS operato da rilevare tutti gli ioni precursori (cioè modalità di scansione completa) può ottenere informazioni strutturali diretto dalla massa esatta e la composizione elementare risultante dell&#39;analita, e queste informazioni possono essere utilizzate per identificare potenziali metaboliti. Infatti, tutte le informazioni relative ad un composto può essere ottenuta con una massa esatta, fino al livello di isomeri strutturali. Inoltre, una completametodo di scansione non richiede conoscenza precedente dei metaboliti e non richiede l&#39;ottimizzazione metodo. Inoltre, poiché tutti gli ioni con m / z compreso nel range di scansione possono essere analizzati, HRMS ha una capacità praticamente illimitata in termini di numero di metaboliti che possono essere quantificati in una sola passata rispetto al metodo MRM. HRMS è paragonabile ad un MRM triplo quadrupolo capacità quantitativa causa del breve ciclo di lavoro con un conseguente numero paragonabile di punti di dati che possono essere ottenuti in una MS scansione completa. Pertanto, HRMS offre un approccio alternativo per metabolomica quantitativi. Recentemente, una versione migliorata del HRMS chiamato spettrometria di massa Q-Exactive (QE-MS) può essere utilizzato sotto la commutazione tra i modi positivi e negativi con tempi di ciclo sufficientemente veloce in un unico metodo, che amplia il campo di rilevamento 19. Qui si descrive la nostra strategia metabolomica utilizzando il QE-MS.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="600">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Positive calibration mix</td>
			<td style="width:117px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:120px;">#88323</td>
			<td style="width:207px;">It is light sensitive. Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Negative calibration mix</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#88324</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Diazinon</td>
			<td style="width:117px;">Sant Cruz Biotechnology</td>
			<td>#C0413</td>
			<td style="width:207px;">It causes eyes irritation, so work in hood. Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;">H-ESI needle insert</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>#1303200</td>
			<td style="width:207px;">This could be replaced or cleaned with 5 % Formic acid/water (remove rubber ring) if clogged.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Xbridge amide column</td>
			<td>Waters</td>
			<td>#186004860</td>
			<td style="width:207px;">Guard column is recommend to increase column lifetime.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a strategy for sensitive, large scale quantitative metabolomics

Metabolita profiling è stato un bene prezioso per lo studio del metabolismo in salute e malattia. Tuttavia, piattaforme attuali hanno diversi fattori limitanti, come il lavoro intensivo preparazione del campione, limiti di rilevabilità bassi, velocità di scansione lenta, ottimizzazione del metodo intensivo per ciascun metabolita, e l&#39;incapacità di misurare sia positivamente e ioni negativi in ​​singoli esperimenti. Pertanto, un nuovo protocollo metabolomica potrebbe avanzare gli studi di metabolomica. Cromatografia idrofilo a base di ammide consente analisi metabolita polare senza derivatizzazione chimica. Alta risoluzione MS utilizzando il Q-Exactive (QE-MS) ha migliorato ottica ionica, maggiore velocità di scansione (256 msec alla risoluzione di 70.000), e ha la capacità di svolgere / commutazione positiva e negativa. Utilizzando una strategia di estrazione metanolo freddo, e accoppiando una colonna ammide con QE-MS consente robusta rilevamento di 168 metaboliti polari mirati e migliaia di funzionalità aggiuntive contemporaneamente. Datun trattamento avviene con il software disponibile in commercio in un modo altamente efficiente, e caratteristiche sconosciute estratte dagli spettri di massa può essere interrogato in database.

L&#39;accuratezza dei dati metabolomica dipende molto dalle prestazioni LC-QE-MS strumento. Per valutare se lo strumento funziona in buone condizioni, e se il metodo applicato è corretto, diversi metaboliti noto picchi LC sono estratte dal cromatografia ionica totale (TIC), come mostrato nella Figura 1. Metaboliti polari inclusi amminoacidi, intermedi glicolisi , intermedi TCA, nucleotidi, vitamine, ATP, NADP + e così via hanno una buona conservazione delle colonne e buon picco di forme nel...

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A Strategy for Sensitive, Large Scale Quantitative Metabolomics

Metabolita profiling è stato un bene prezioso per lo studio del metabolismo in salute e malattia. Utilizzando cromatografia normale fasi liquida accoppiata alla spettrometria di massa ad alta risoluzione con commutazione di polarità e un ciclo rapido, si descrive un protocollo per analizzare la composizione metabolica polare di materiale biologico con elevata sensibilità, precisione e risoluzione.

Una strategia per sensibili, su larga scala quantitative Metabolomica

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. However, current platforms have different limiting ...

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Research

JoVE Journal

Biology

20.8K Views.  Cornell University.  Metabolita profiling è stato un bene prezioso per lo studio del metabolismo in salute e malattia. Utilizzando cromatografia normale fasi liquida accoppiata alla spettrometria di massa ad alta risoluzione con commutazione di polarità e un ciclo rapido, si descrive un protocollo per analizzare la composizione metabolica polare di materiale biologico con elevata sensibilità, precisione e risoluzione. 

Video: A Strategy for Sensitive, Large Scale Quantitative Metabolomics

Large-Scale Screens of Metagenomic Libraries

Metagenomic libraries archive large fragments of contiguous genomic sequences from microorganisms without requiring prior cultivation. Generating a streamlined procedure for creating and screening metagenomic libraries is therefore useful for efficient high-throughput investigations into the genetic and metabolic properties of uncultured microbial assemblages. Here, key protocols are presented on video, which we propose is the most useful format for accurately describing a long process that alternately depends on robotic instrumentation and (human) manual interventions. First, we employed robotics to spot library clones onto high-density macroarray membranes, each of which can contain duplicate colonies from twenty-four 384-well library plates. Automation is essential for this procedure not only for accuracy and speed, but also due to the miniaturization of scale required to fit the large number of library clones into highly dense spatial arrangements. Once generated, we next demonstrated how the macroarray membranes can be screened for genes of interest using modified versions of standard protocols for probe labeling, membrane hybridization, and signal detection. We complemented the visual demonstration of these procedures with detailed written descriptions of the steps involved and the materials required, all of which are available online alongside the video.

Su larga scala Schermi di librerie metagenomiche

Metagenomic libraries archive large fragments of contiguous genomic sequences from microorganisms without requiring prior cultivation.  Generating a ...

Ricerca

Biologia

Batch Immunostaining for Large-Scale Protein Detection in the Whole Monkey Brain

Immunohistochemistry (IHC) is one of the most widely used laboratory techniques for the detection of target proteins in situ. Questions concerning the expression pattern of a target protein across the entire brain are relatively easy to answer when using IHC in small brains, such as those of rodents. However, answering the same questions in large and convoluted brains, such as those of primates presents a number of challenges. Here we present a systematic approach for immunodetection of target proteins in an adult monkey brain. This approach relies on the tissue embedding and sectioning methodology of NeuroScience Associates (NSA) as well as tools developed specifically for batch-staining of free-floating sections. It results in uniform staining of a set of sections which, at a particular interval, represents the entire brain. The resulting stained sections can be subjected to a wide variety of analytical procedures in order to measure protein levels, the population of neurons expressing a certain protein.

Large-scale immunodetection of target proteins across the entire primate brain is possible by employing novel tissue embedding and sectioning methods combined with the use of creative apparatus for batch staining of multiple free-floating sections at a given time.

Immunostaining lotto per la grande rivelazione di proteine ​​nel cervello della scimmia Whole

Immunohistochemistry (IHC) is one of the most widely used laboratory techniques for the detection of target proteins in situ. Questions concerning the ...

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground using a cryolysis procedure in a ball mill grinder and the resulting grindate brought into solution by urea solubilization. This procedure allows for the lysis of the cells in a metabolically inactive state, preserving phosphorylation and preventing reorientation of the phosphoproteome during cell lysis.  Following reduction, alkylation, trypsin digestion of the proteins, the samples are desalted on C18 columns and the sample complexity reduced by fractionation using hydrophilic interaction chromatography (HILIC). HILIC columns preferentially retain hydrophilic molecules which is well suited for phosphoproteomics.  Phosphorylated peptides tend to elute later in the chromatographic profile than the non phosphorylated counterparts. After fractionation, phosphopeptides are enriched using immobilized metal chromatography, which relies on charge-based affinities for phosphopeptide enrichment. At the end of this procedure the samples are ready to be quantitatively analyzed by mass spectrometry.

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Description of a quantitative phosphorylation procedure using cryolysis, urea solubilziation, HILIC fractionation and IMAC enrichment of phosphorylated peptides.

Fosfoproteomica quantitativa in acidi grassi Stimolati Saccharomyces cerevisiae</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult human peripheral blood within a mean of 12 days. After large scale expansion &gt;1x108 ECFCs can be obtained for further tests. Advantageously by using pHPL the contact of human cells with bovine serum antigens can be excluded. By flow cytometry and immunohistochemistry the isolated cells can be characterized as ECFC and their in vitro functionality to form vascular like structures can be tested in a matrigel assay. Further these cells can be subcutaneously injected in a mouse model to form functional, perfused vessels in vivo. After long term expansion and cryopreservation proliferation, function and genomic stability appear to be preserved. 3,4
This animal-protein free isolation and expansion method is easily applicable to generate a large quantity of ECFCs.

Endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) are a promising tool to study vascular homeostasis and repair.1,2 This paper introduces a novel animal-serum free method for isolation and expansion of ECFC from heparinised adult human peripheral blood with pooled human platelet lysate (pHPL) diminishing the risk of anti-bovine immunisation.

Isolamento e di espansione su vasta scala di umano adulto cellule progenitrici endoteliali che formano colonie

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult ...

Large Scale Zebrafish-Based In vivo Small Molecule Screen

Given their small embryo size, rapid development, transparency, fecundity, and numerous molecular, morphological and physiological similarities to mammals, zebrafish has emerged as a powerful in vivo platform for phenotype-based drug screens and chemical genetic analysis. Here, we demonstrate a simple, practical method for large-scale screening of small molecules using zebrafish embryos.

Large Scale Zebrafish-Based In vivo Small Molecule Screen

Zebrafish has emerged as a powerful in vivo platform for phenotype-based drug screens and chemical genetic analysis. Here, we demonstrate a simple, practical method for large-scale screening of small molecules using zebrafish embryos.

Large Scale Zebrafish-Based In vivo Screen piccole molecole

Given their small embryo size, rapid development, transparency, fecundity, and numerous molecular, morphological and physiological similarities to ...

Infinium Assay for Large-scale SNP Genotyping Applications

Genotyping variants in the human genome has proven to be an efficient method to identify genetic associations with phenotypes. The distribution of variants within families or populations can facilitate identification of the genetic factors of disease. Illumina&#39;s panel of genotyping BeadChips allows investigators to genotype thousands or millions of single nucleotide polymorphisms (SNPs) or to analyze other genomic variants, such as copy number, across a large number of DNA samples. These SNPs can be spread throughout the genome or targeted in specific regions in order to maximize potential discovery. The Infinium assay has been optimized to yield high-quality, accurate results quickly. With proper setup, a single technician can process from a few hundred to over a thousand DNA samples per week, depending on the type of array. This assay guides users through every step, starting with genomic DNA and ending with the scanning of the array. Using propriety reagents, samples are amplified, fragmented, precipitated, resuspended, hybridized to the chip, extended by a single base, stained, and scanned on either an iScan or Hi Scan high-resolution optical imaging system. One overnight step is required to amplify the DNA. The DNA is denatured and isothermally amplified by whole-genome amplification; therefore, no PCR is required. Samples are hybridized to the arrays during a second overnight step. By the third day, the samples are ready to be scanned and analyzed. Amplified DNA may be stockpiled in large quantities, allowing bead arrays to be processed every day of the week, thereby maximizing throughput.

A protocol is described that uses Illumina&#39;s Infinium assays to perform large-scale genotyping. These assays can reliably genotype millions of SNPs across hundreds of individual DNA samples in three days. Once generated, these genotypes can be used to check for associations with a variety of different diseases or phenotypes.

Infinium Assay per i grandi SNP genotipizzazione Applicazioni

Genotyping variants in the human genome has proven to be an efficient method to identify genetic associations with phenotypes. The distribution of ...

ODELAY: A Large-scale Method for Multi-parameter Quantification of Yeast Growth

Growth phenotypes of microorganisms are a strong indicator of their underlying genetic fitness and can be segregated into 3 growth regimes: lag-phase, log-phase, and stationary-phase. Each growth phase can reveal different aspects of fitness that are related to various environmental and genetic conditions. High-resolution and quantitative measurements of all 3 phases of growth are generally difficult to obtain. Here we present a detailed method to characterize all 3 growth phases on solid media using an assay called One-cell Doubling Evaluation of Living Arrays of Yeast (ODELAY). ODELAY quantifies growth phenotypes of individual cells growing into colonies on solid media using time-lapse microscopy. This method can directly observe population heterogeneity with each growth parameter in genetically identical cells growing into colonies. This population heterogeneity offers a unique perspective for understanding genetic and epigenetic regulation, and responses to genetic and environmental perturbations. While the ODELAY method is demonstrated using yeast, it can be utilized on any colony forming microorganism that is visible by bright field microscopy.

We present a method for quantifying growth phenotypes of individual yeast cells as they grow into colonies on solid media using time-lapse microscopy termed, One-cell Doubling Evaluation of Living Arrays of Yeast (ODELAY). Population heterogeneity of genetically identical cells growing into colonies can be directly observed and quantified.

ODELAY: Metodo su vasta scala per la quantificazione multiparametrica della crescita del lievito

Growth phenotypes of microorganisms are a strong indicator of their underlying genetic fitness and can be segregated into 3 growth regimes: lag-phase, ...

A Semiautomated ChIP-Seq Procedure for Large-scale Epigenetic Studies

Chromatin immunoprecipitation followed by sequencing (ChIP-Seq) is a powerful and widely used approach to profile chromatin DNA associated with specific histone modifications, such as H3K27ac, to help identify cis-regulatory DNA elements. The manual process to complete a ChIP-Seq is labor intensive, technically challenging, and often requires large-cell numbers (&#62;100,000 cells). The method described here helps to overcome those challenges. A complete semiautomated, microscaled H3K27ac ChIP-Seq procedure including cell fixation, chromatin shearing, immunoprecipitation, and sequencing library preparation, for batch of 48 samples for cell number inputs less than 100,000 cells is described in detail. The semiautonomous platform reduces technical variability, improves signal-to-noise ratios, and drastically reduces labor. The system can thereby reduce costs by allowing for reduced reaction volumes, limiting the number of expensive reagents such as enzymes, magnetic beads, antibodies, and hands-on time required. These improvements to the ChIP-Seq method suit perfectly for large-scale epigenetic studies of clinical samples with limited cell numbers in a highly reproducible manner.

This paper describes a semiautomated, microscaled ChIP-Seq protocol of DNA regions associated with a specific histone modification (H3K27ac) using a ChIP liquid-handler platform, followed by library preparation using tagmentation. The procedure includes control assessment for quality and quantity purposes and can be adopted to other histone modifications or transcription factors.

Una procedura ChIP-Seq semiautomatica per studi epigenetici su larga scala

Chromatin immunoprecipitation followed by sequencing (ChIP-Seq) is a powerful and widely used approach to profile chromatin DNA associated with specific ...

Large-Scale Preparation of Synovial Fluid Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes by 3D Bioreactor Culture

Exosomes secreted by mesenchymal stem cells (MSCs) have been suggested as promising candidates for cartilage injuries and osteoarthritis treatment. Exosomes for clinical application require large-scale production. To this aim, human synovial fluid MSCs (hSF-MSCs) were grown on microcarrier beads, and then cultured in a dynamic three-dimension (3D) culture system. Through utilizing 3D dynamic culture, this protocol successfully obtained large-scale exosomes from SF-MSC culture supernatants. Exosomes were harvested by ultracentrifugation and verified by a transmission electron microscope, nanoparticle transmission assay, and western blotting. Also, the microbiological safety of exosomes was detected. Results of exosome detection suggest that this approach can produce a large number of good manufacturing practices (GMP)-grade exosomes. These exosomes could be utilized in exosome biology research and clinical osteoarthritis treatment.

Here, we present a protocol to produce a large number of GMP-grade exosomes from synovial fluid mesenchymal stem cells using a 3D bioreactor.

Preparazione su larga scala di esosomi derivati da cellule staminali mesenchimali con liquido sinoviale mediante coltura di bioreattori 3D

Exosomes secreted by mesenchymal stem cells (MSCs) have been suggested as promising candidates for cartilage injuries and osteoarthritis treatment. ...

A Robust Method for the Large-Scale Production of Spheroids for High-Content Screening and Analysis Applications

High-content screening (HCS) and high-content analysis (HCA) are technologies that provide researchers with the ability to extract large-scale quantitative phenotypic measurements from cells. This approach has proved powerful for deepening our understanding of a wide range of both fundamental and applied events in cell biology. To date, the majority of applications for this technology have relied on the use of cells grown in monolayers, although it is increasingly realized that such models do not recapitulate many of the interactions and processes that occur in tissues. As such, there has been an emergence in the development and use of 3-dimensional (3D) cell assemblies, such as spheroids and organoids. Although these 3D models are particularly powerful in the context of cancer biology and drug delivery studies, their production and analysis in a reproducible manner suitable for HCS and HCA present a number of challenges. The protocol detailed here describes a method for the generation of multicellular tumor spheroids (MCTS), and demonstrates that it can be applied to three different cell lines in a manner that is compatible with HCS and HCA. The method facilitates the production of several hundred spheroids per well, providing the specific advantage that when used in a screening regime, data can be obtained from several hundred structures per well, all treated in an identical manner. Examples are also provided, which detail how to process the spheroids for high-resolution fluorescence imaging and how HCA can extract quantitative features at both the spheroid level as well as from individual cells within each spheroid. This protocol could easily be applied to answer a wide range of important questions in cell biology.

This protocol details a method for the production of three different types of spheroids in a manner that makes them suitable for large-scale high-content screening and analysis. In addition, examples are presented showing how they can be analyzed at spheroid and individual cell levels.