Il finanziamento per questo lavoro è stato fornito dal NIH P20 GM103456, NIH RC2 AR058959, e NIH R56 AI063274

<ol>
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Gli autori di questo articolo non hanno concorrenti interessi finanziari da dichiarare.

Sono state utilizzate applicazioni di genotipizzazione su larga scala per comprendere meglio il meccanismo genetico alla base di molte malattie umane. La scoperta di una variante significativa attraverso un&#39;analisi di associazione genome-wide in grado di contrassegnare una regione candidato per ulteriori studi. Inoltre, i dati genotipo è un buon strumento per il controllo di qualità su progetti di sequenziamento. Per ottimizzare la velocità di campionamento, più lastre di esempio possono essere amplificati e conservati nei loro frammentati, stati risospeso. Otto piastre possono essere amplificati in un solo giorno, combinando la prima 24 ore di protocollo per più lotti e di fornire materiale sufficiente per ~ 2-8 giorni di chip di elaborazione. Se le piastre amplificati sono stoccate in anticipo, e se i nuovi campioni sono ibridate al chip subito dopo la scansione comincia in fuga precedente, trasformazione possono funzionare in continuo senza la necessità di una pausa per la preparazione del campione aggiuntivo. Pertanto, anche se i campioni avranno tre giorni per sottoporsi alla completasaggio, i dati possono essere generati giornalmente. Chip Assuming24 sono trattati ogni giorno, una settimana lavorativa di cinque giorni consente da oltre 1.000 campioni di DNA da eseguire su un chip tallone 12 campioni. Se un passaggio o reagente è venuto meno, tuttavia, più batch potrebbero essere a rischio per scarso rendimento prima di qualsiasi correzione può essere applicata. Gli errori possono sfuggire avviso fino a quando gli array sono scansionati o analizzati, pertanto, se la velocità è massimizzata, centinaia di campioni in varie fasi del protocollo potrebbero essere già ricevuto lo stesso trattamento difettoso al momento della scoperta. Come reagenti e dati persi non possono essere recuperati, l&#39;utente deve soppesare i rischi contro la necessità di un flusso di lavoro accelerato. Il software di analisi GenomeStudio è la prima occasione per misurare realmente il successo del processo di genotipizzazione. Se la norma-R vs Norm-Theta trame intensità siano correttamente raggruppati, il tasso medio di chiamata (per cento del totale SNPs digitato correttamente) dei campioni dovrebbe avvicinarsi al 99%, anche se questo valore varia slightly a seconda del tipo di matrice. I dati da qualsiasi campione con un tasso di chiamata inferiore al 85-90% non è affidabile e devono essere eliminati. Ai fini del controllo di qualità, i risultati devono essere confrontati con eventuali genotipi quando possibile già noti. Se non esistono tali dati, intenzionale duplicazione del campione è uno strumento utile per la verifica della targa o matrice posizionamenti. Queste coppie duplicati dovrebbero essere immessi sul chip separati, piatti, lotti, o progetti, i loro genotipi controllati dopo generazione. Mentre specifici vincoli QC variano a seconda della preferenza del ricercatore, i vincoli comuni SNP sono basati sul successo chiamata di esempio, Hardy-Weinberg, o dati mancanti tra casi e controlli, mentre i vincoli del campione comuni si basano sui tassi di chiamata, incoerenze mendeliana o riferimenti incrociati del cromosoma X eterozigosi ai dati clinici di genere [13]. Se qualunque problema si pone, Dashboard Controls, che si trova nella suite di analisi, può essere presentata alazienda al fine di determinare la causa. Questi controlli possono spesso restringere la questione alla fase più probabile o il fallimento del reagente. Se qualche SNPs di interesse possono essere individuate attraverso un esperimento di genotipizzazione Infinium, le loro trame intensità dovrebbero essere controllate in GenomeStudio per errori di clustering prima di un ulteriore ricerca è condotta. Un esperimento di genotipizzazione Infinium fallito è probabilmente dovuto a un errore umano o di trasformazione del DNA di ingresso di scarsa qualità. Esempio di quantificazione deve essere accurata e precisa. Per ottenere i migliori risultati, eventuali reagenti aggiunti a qualsiasi campione o chip devono essere dispensati al volume stabilito dal protocollo. Le pipette devono essere opportunamente tarati. I reagenti non devono essere eseguiti dopo la scadenza e non devono essere ricongelati una volta scongelati, tranne che per il reagente RA1. Al fine di minimizzare i possibili errori di colorazione e di estensione, la miscela formammide / EDTA deve essere preparato fresco ogni mese. Tutti i -20 ° C i reagenti devono essere conservati solo in congelatori manuale sbrinamento. Tutte le attrezzature utilizzate nel stAining, ampliamento e lavaggio parti del protocollo devono essere risciacquati abbondantemente con acqua e detergente neutro immediatamente dopo disuso. I serbatoi umidificazione nella camera hyb dovrebbero essere abbattuti con un pennello provetta e un detergente delicato. I vetrini devono essere lavati con candeggina al 10%, come indicato dal loro manuali d&#39;uso, una volta a settimana.

Digitando polimorfismi a singolo nucleotide (SNP) è un metodo fondamentale per identificare varianti di rischio connessi con la malattia. Storicamente, l&#39;ambito di esperimenti di genotipizzazione è stata limitata dalla tecnologia disponibile. Metodi di genotipizzazione basati su elettroforesi su gel sono limitati in-campione e SNP-capacità [1]. Lo sviluppo di questi saggi, spesso può essere alta intensità di lavoro, basandosi sulla composizione e la struttura della regione circostante la variante per l&#39;ottimizzazione [1]. Saggi TaqMan genotipizzazione, sviluppati da Life Technologies, possono eseguire un gran numero di campioni in modo rapido e con minimo coinvolgimento tecnico [2], ma restrizioni SNP multiplexing continuano a limitare il numero totale di genotipi di ben inferiore a un milione al giorno [3,4 ]. Piattaforma IPLEX di Sequenom può anche eseguire molti campioni in una sola volta, ma, come meno di un centinaio di SNPs possono essere multiplexati insieme, il throughput è relativamente basso nel complesso [5]. La tecnologia streaming SNP di Beckman Coulterpotrebbe teoricamente produrre oltre tre milioni di genotipi al giorno, ma questo intervallo progetto limiti tecnologici, fino ad un massimo di soli quarantotto SNPs per reazione [4,6]. Mentre il test GoldenGate in grado di elaborare quasi duecento campioni di DNA ogni giorno centinaia o migliaia di SNPs per campione, il prezzo per genotipo non è competitivo con tecniche ultra-high-throughput avanzate durante la digitazione di oltre tremila SNPs in una sola volta [4,7 ]. Al fine di elaborare diversi milioni di genotipi al giorno, la scala necessaria per i grandi studi di associazione genome-wide, saggi di array-ibridazione sono diventati l&#39;opzione più conveniente sul mercato. La linea di Affymetrix di array di ibridazione e la linea di Illumina di array-based Infinium consentono potenzialmente centinaia di campioni da digitate su centinaia di migliaia o milioni di SNPs in parallelo [4,8]. Questi SNPs possono essere sparsi su tutto il genoma, localizzata nelle regioni di interesse, come la exOMES, o personalizzato per preferenze dell&#39;utente. Queste matrici hanno il vantaggio non solo di essere in grado di genotipo con precisione un milione di SNPs per ogni campione in una volta, ma anche per misurare il numero di copie di variazione, anomalie cromosomiche potenzialmente svelare. Infinium-allineati array OMNI BeadChip attualmente hanno la capacità di genotipo fino a quasi cinque milioni di marcatori per campione, tra cui mezzo milione loci personalizzato, su un massimo di quasi un centinaio di campioni di ogni giorno. Poiché la maggior parte delle malattie hanno una componente genetica, questi esperimenti su larga scala possono essere cruciali nella ricerca di geni associati con la malattia. High-throughput genotipizzazione consente per la generazione di genotipo efficiente esempio imposta abbastanza grande per rilevare in maniera convincente associazione genetica a basse frequenze alleliche minori. Progetti di genotipizzazione intero genoma possono essere utilizzati per individuare le regioni con statisticamente significativa frequenza dell&#39;allele caso-controllo o le differenze del numero di copie [9,10,11]. Secondo il National Ge umanoNome Research Institute, studi di associazione genome-wide che hanno portato a 1.490 pubblicazioni separate tra 25 novembre 2008 e 25 gennaio 2013, derivanti dalla scoperta di 8.283 SNP con un p-value inferiore a 1 x 10 -5 (vedi http:// www.genome.gov/gwastudies/). Questi studi, che le condizioni che vanno da un&#39;altezza di cancro ai testicoli, ha beneficiato l&#39;approccio generale offerta da una analisi genome-wide ricercato. In casi come questi, intere regioni di interesse potrebbero essere sfuggito aveva lo scopo di battitura stato troppo restrittiva. Così, per le analisi di associazione su larga scala, una tecnica di genotipizzazione genoma di ampiezza è la tecnica di scelta. Esistono diverse versioni del saggio Infinium, ciascuno destinato all&#39;uso con specifici tipi di matrici. Il saggio InfiniumUltra, discusso in profondità sotto, è appropriato per molti 12 - o 24-chip matrice del campione. Questi spesso genotipo oltre un centinaio di migliaia di SNPs per ogni campione di DNA e concentrarsi su tregioni argeted, come ad esempio su pannelli exome o personalizzati. Altre versioni di saggio possono essere richieste per altri tipi di chip, come le matrici di genotipizzazione intero genoma. Tuttavia, come tutti i saggi Infinium condividono una base comune e differiscono principalmente solo dai nomi dei reagenti, i volumi di reagente, o l&#39;esatta procedura di reagente di colorazione, tecniche perfezionate su una versione test possono spesso essere universalmente applicata. Altri array, come array di metilazione, potrebbe utilizzare un protocollo pressoché identiche, pure. Bisogna fare attenzione a utilizzare solo la versione di dosaggio richiesto per il tipo di chip in uso. Alcuni tipi, come ad esempio quelli che misurano il livello di espressione genica, potrebbero richiedere l&#39;uso di un protocollo nonInfinium. I campioni devono essere elaborati in batch. Ad esempio, con il dosaggio InfiniumUltra, tubi dei reagenti prehybridization contengono un volume sufficiente per eseguire 96 campioni, ed i tubi non possono essere ricongelati. Pertanto, i campioni devono essere eseguiti in lotti di 96 campioni alla volta. I campioni saranno amplificati sui abetit giorno. Dopo circa 1 ora di benchwork, i campioni devono essere riscaldati in forno ventilato per 20-24 ore. Il giorno seguente, quasi 4 ore sarà speso la frammentazione, la precipitazione, e risospendere i campioni, al punto che i campioni possono sia essere congelati per un uso futuro o ibridati al chip. Caricamento chip prende quasi 2 ore, dopo di che i campioni saranno ibridati notte per 16-24 ore. Il terzo giorno, la fase di colorazione e l&#39;estensione prende ~ 4 ore. Un ulteriore ora saranno spesi lavaggio, verniciatura e l&#39;essiccazione le patatine. Infine, le matrici vengono analizzati, che può richiedere 15-60 min / chiave, a seconda del tipo utilizzato. Si applicano le misure di sicurezza di laboratorio e di pulizia standard. Sebbene non si basa PCR-amplificazione, sono necessarie postazioni separate per la pre-e postamplification procedure per ridurre al minimo la probabilità di contaminazione. Il numero di identificazione di ogni reagente kit fornito in uso deve essere registrato su un foglio di tracking. Reagenti Scongelare immediatamente prima dell&#39;uso e invertiti diverse volte prima erogazione. Il DNA deve essere digitato deve essere DNA genomico di alta qualità (260/280 Rapporto di assorbanza di 1,6-2,0, 260/230 il rapporto di assorbanza di sotto di 3,0), isolati con metodi standard e quantificati con un fluorimetro. Degradazione del DNA è spesso un fattore che contribuisce a risultati del saggio di bassa qualità. Tipicamente, è richiesta 200 ng di DNA, se questa quantità può variare per alcuni tipi di chip. A Tecan-liquido gestione robot è in grado di automatizzare molte fasi del protocollo e ridurre al minimo l&#39;errore umano come fattore.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="477">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="66">
			<td height="66" style="height:66px;width:145px;">Consumable or Equipment</td>
			<td style="width:121px;">Manufacturer&#160;</td>
			<td style="width:99px;">Part Number&#160;</td>
			<td style="width:113px;">Minimum Required for 96 Samples</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">0.8 ml Deep Well Plate</td>
			<td style="width:121px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:99px;">AB-0765</td>
			<td style="width:113px;">1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Plate Mats</td>
			<td style="width:121px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:99px;">AB-0674</td>
			<td style="width:113px;">2</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Reagent Basin</td>
			<td style="width:121px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:99px;">13-681-502</td>
			<td style="width:113px;">9</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Heat-seal Sheets</td>
			<td style="width:121px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:99px;">AB-0559</td>
			<td style="width:113px;">1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Flow-through Spacer</td>
			<td style="width:121px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:99px;">NC9563984</td>
			<td style="width:113px;">6</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Pipette tips - 200 &#956;l</td>
			<td style="width:121px;">Rainin</td>
			<td style="width:99px;">GP-L200F</td>
			<td style="width:113px;">192</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Pipette tips - 10 &#956;l</td>
			<td style="width:121px;">Rainin</td>
			<td style="width:99px;">GP-L10F</td>
			<td style="width:113px;">16</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Pipette tips - 1,000 &#956;l</td>
			<td style="width:121px;">Rainin</td>
			<td style="width:99px;">GP-L1000F</td>
			<td style="width:113px;">16</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">DNA Suspension Buffer</td>
			<td style="width:121px;">Teknova</td>
			<td style="width:99px;">T0220</td>
			<td style="width:113px;">0.5 ml</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">0.1 N NaOH</td>
			<td style="width:121px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:99px;">AC12419-0010</td>
			<td style="width:113px;">0.5 ml</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Isopropanol (HPLC grade)</td>
			<td style="width:121px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:99px;">A451</td>
			<td style="width:113px;">15 ml</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Ethanol (200-proof)</td>
			<td style="width:121px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:99px;">459836</td>
			<td style="width:113px;">330 ml</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Formamide (100%)</td>
			<td style="width:121px;">Thomas Scientific</td>
			<td style="width:99px;">C001K38</td>
			<td style="width:113px;">15 ml</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">EDTA (0.5 M)</td>
			<td style="width:121px;">Amresco</td>
			<td style="width:99px;">E177</td>
			<td style="width:113px;">0.2 ml</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">10 &#956;l 8-channel Pipette</td>
			<td style="width:121px;">Rainin</td>
			<td style="width:99px;">L8-10XLS</td>
			<td style="width:113px;">1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">200 &#956;l 8-channel Pipette</td>
			<td style="width:121px;">Rainin</td>
			<td style="width:99px;">L8-200XLS</td>
			<td style="width:113px;">2</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">1,000 &#956;l Single-channel Pipette</td>
			<td style="width:121px;">Rainin</td>
			<td style="width:99px;">L-1000XLS</td>
			<td style="width:113px;">1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Microplate Shaker</td>
			<td style="width:121px;">VWR</td>
			<td style="width:99px;">13500-890</td>
			<td style="width:113px;">1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Refrigerated Microplate Centrifuge</td>
			<td style="width:121px;">VWR</td>
			<td style="width:99px;">BK369434</td>
			<td style="width:113px;">1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Hybridization Oven</td>
			<td style="width:121px;">Illumina</td>
			<td style="width:99px;">SE-901-1001</td>
			<td style="width:113px;">1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Hybex Microsample Incubator</td>
			<td style="width:121px;">SciGene</td>
			<td style="width:99px;">1057-30-0</td>
			<td align="right" style="width:113px;">1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Hybex MIDI Heat Block Insert</td>
			<td style="width:121px;">Illumina</td>
			<td style="width:99px;">BD-60-601</td>
			<td style="width:113px;">1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Heat Sealer</td>
			<td style="width:121px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:99px;">AB-0384</td>
			<td style="width:113px;">1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Hyb Chamber w/ Insert and Mat</td>
			<td style="width:121px;">Illumina</td>
			<td style="width:99px;">BD-60-402</td>
			<td style="width:113px;">2</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Surgical Scissors</td>
			<td style="width:121px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:99px;">13-804-20</td>
			<td style="width:113px;">1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Flow Through Assembly Parts</td>
			<td style="width:121px;">Illumina</td>
			<td style="width:99px;">WG-10-202</td>
			<td style="width:113px;">8</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Wash Rack and Dish</td>
			<td style="width:121px;">Illumina</td>
			<td style="width:99px;">BD-60-450</td>
			<td style="width:113px;">1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Genepaint Chamber Rack</td>
			<td style="width:121px;">Tecan</td>
			<td style="width:99px;">760-800</td>
			<td style="width:113px;">1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Temperature Probe</td>
			<td style="width:121px;">Illumina</td>
			<td style="width:99px;">A1-99-109</td>
			<td style="width:113px;">1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Staining Rack and Dish</td>
			<td style="width:121px;">Illumina</td>
			<td style="width:99px;">WG-10-207</td>
			<td style="width:113px;">1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Self-Closing Tweezers</td>
			<td style="width:121px;">Ted Pella, Inc</td>
			<td style="width:99px;">5374-NM</td>
			<td style="width:113px;">1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Vacuum Manifold</td>
			<td style="width:121px;">Ted Pella, Inc&#160;</td>
			<td style="width:99px;">2240</td>
			<td style="width:113px;">1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">iScan or HiScan</td>
			<td style="width:121px;">Illumina</td>
			<td style="width:99px;">-</td>
			<td style="width:113px;">1</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

infinium assay for large-scale snp genotyping applications

Varianti di genotipizzazione del genoma umano ha dimostrato di essere un metodo efficace per identificare associazioni genetiche con fenotipi. La distribuzione delle varianti all&#39;interno delle famiglie o delle popolazioni può facilitare l&#39;identificazione dei fattori genetici della malattia. Pannello di Illumina di BeadChips genotipizzazione consente agli investigatori di genotipo migliaia o milioni di polimorfismi a singolo nucleotide (SNP) o per analizzare altre varianti genomiche, come numero di copie, attraverso un gran numero di campioni di DNA. Questi SNPs possono essere diffuse in tutto il genoma o mirati in regioni specifiche al fine di massimizzare il potenziale di scoperta. Il dosaggio Infinium è stato ottimizzato per produrre alta qualità, risultati precisi rapidamente. Con opportuna configurazione, un singolo tecnico può elaborare da poche centinaia a oltre mille campioni di DNA alla settimana, a seconda del tipo di matrice. Questo saggio guida gli utenti attraverso ogni passo, partendo con il DNA genomico e termina con la scansione della matrice. Utilizzo di correttezza Reagenti, i campioni sono amplificati, frammentato, precipitato, risospese, ibridata al chip, prorogato di un unico basamento, macchiato, e scansionata né su di un sistema di imaging ottico ad alta risoluzione iScan o Hi Scan. Un passo durante la notte è necessaria per amplificare il DNA. Il DNA è denaturato e isotermicamente amplificata da tutto il genoma di amplificazione, pertanto, non è richiesta alcuna PCR. I campioni sono ibridate agli array durante una seconda fase durante la notte. Entro il terzo giorno, i campioni sono pronti per essere analizzati e analizzati. DNA amplificato può essere stoccato in grandi quantità, consentendo matrici tallone da trasformare ogni giorno della settimana, in modo da massimizzare il throughput.

Un chip tallone adeguatamente trasformati dovrebbe mostrare intensità della luce laser rosso e verde brillante e distinti durante la scansione. Nella Figura 6, il software di scansione iScan visualizza un campione di DNA genomico di serie ibridato con successo in una matrice di SNP genotipizzazione custom-panel. I nucleotidi marcati che sono stati attaccati durante le fasi di ampliamento e di colorazione fluorescenti sotto le luci dei due laser. Poiché questi nucleotidi selettivamente estendono catena oligonucleotide del tallone ibridato al filamento di DNA frammentato, e come le catene oligonucleotidiche sono progettati per terminare al sito della variante, il colore e l&#39;intensità del segnale risultante può essere utilizzato per determinare gli alleli presenti alla sito SNP. Un foglio user-generated campione che corrisponde ID dei campioni e le informazioni cliniche per ChipID e la posizione, e SNP manifesto specifico array, ottenuto direttamente dalla società, sono entrambi necessari per importare la scafile di output NNER nel software di analisi GenomeStudio. Fogli Esempio di esempio si possono trovare sul sito web della società. Una volta che il progetto GenomeStudio è costruito, genotipi possono essere ottenuti dai grappoli di intensità risultanti generati automaticamente dal software. Anche se esistono diverse opzioni di visualizzazione, la visualizzazione predefinita, Norm-R (un valore di intensità normalizzato) vs Norm-Theta (un rapporto di intensità allelica), è spesso la trama più semplice per distinguere tre gruppi distinti. La maggior parte degli SNPs dovrebbero mostrare una, due, o tre gruppi, a seconda della frequenza dell&#39;allele minore. I tre cluster rappresentano esempi che dimostrano AA, AB, o alleli BB (vedi Figura 7). Questi gruppi possono essere assegnati genotipi sia importando un modello di posizione di clustering di serie direttamente dalla società, selezionando &quot;cluster All SNPs&quot; dalla barra degli strumenti di analisi del software, o cliccando e trascinando i cerchi colorati nelle piazzole intensità di edi manualmente<html> t chiamate. Il colore del campione sul terreno intensità (rosso, viola o blu) indica la chiamata (AA, AB o BB, rispettivamente); nero indica nessuna chiamata. Scorrendo gli SNPs elencati nel riquadro Dati completa del software, il raggruppamento per ogni SNP può essere visualizzato o richiamato. Una volta che i grappoli vengono assegnati chiamate soddisfacenti, il riquadro Dati completi del software elenca i genotipi per ogni singolo campione a ogni particolare SNP. L&#39;opzione Scelta colonne sopra il tavolo può commutare formati di dati. I dati possono essere esportati tramite la barra degli strumenti di analisi o direttamente dalla tabella dei dati completi per un&#39;analisi approfondita. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50683/50683fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50683/50683fig1.jpg" width="600px" /> Figura 1. Panoramica - Infinium Assay protocollo.683/50683fig1highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50683/50683fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50683/50683fig2.jpg" width="600px" /> Figura 2. Completa Hyb Camera base e mat, più coperchio. [12] <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50683/50683fig2highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita</a> . <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50683/50683fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50683/50683fig3.jpg" width="600px" /> Figura 3 Caricamento di un BeadChip -.. Versare il campione sulle porte di ingresso [12] <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50683/50683fig3highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire</a><html> immagine. <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50683/50683fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50683/50683fig4.jpg" width="600px" /> Figura 4 Rimozione della BeadChip Coverseal -.. Afferrare la tenuta in un angolo e staccare delicatamente diagonale [12] <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50683/50683fig4highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita</a> . <img alt="Figura 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50683/50683fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50683/50683fig5.jpg" width="600px" /> Figura 5. Complete Assembly BeadChip Flow-through - Il BeadChip è separata da un vetrino con un distanziale e legato con fermagli.&gt; Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita. <img alt="Figura 6" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50683/50683fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50683/50683fig6.jpg" width="600px" /> Figura 6. Successo Scan BeadChip - A) La BeadChip viene scansionato sia con un laser rosso e verde, i display software di scansione entrambi contemporaneamente. Le sezioni di passaggio QC intensità evidenzieranno verde sul display BeadChip a sinistra. Sezioni mancanza QC intensità si evidenziano rosso sul display BeadChip. B) Una volta completata la scansione, il software sovrapporre i display rosso e verde. Viene mostrato un immagine ingrandita. Il colore e l&#39;intensità di ogni singolo cordone indica l&#39;allele presente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50683/50683fig6highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita</a> . <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = &quot;always&quot;&gt; <img alt="Figura 7" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50683/50683fig7highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50683/50683fig7.jpg" width="500px" /> Figura 7. SNP NORM-R vs NORM-THETA Profili cluster - A) Un valido SNP con tre gruppi distinti che rappresentano AA, AB, e genotipi BB, rosso, viola e blu colorato B) A SNP modifica richiede.. Il cluster centrale, che dovrebbe essere omozigote AB, viene lasciato un-chiamato. Il cluster BB è erroneamente chiamato AB. C) Un povero prestazioni SNP. Non genotipi possono essere ottenuti da questa trama di intensità, come non esistono gruppi distinti. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50683/50683fig7highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita</a> .

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Infinium Assay for Large-scale SNP Genotyping Applications

Un protocollo è descritto che utilizza saggi di Illumina Infinium effettuare genotipizzazione su larga scala. Questi test possono genotipo affidabile milioni di SNPs su centinaia di singoli campioni di DNA in tre giorni. Una volta generata, questi genotipi possono essere usate per controllare le associazioni con una varietà di malattie o fenotipi differenti.

Infinium Assay per i grandi SNP genotipizzazione Applicazioni

Genotyping variants in the human genome has proven to be an efficient method to identify genetic associations with phenotypes. The distribution of ...

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38.7K Views.  Oklahoma Medical Research Foundation.  Un protocollo è descritto che utilizza saggi di Illumina Infinium effettuare genotipizzazione su larga scala. Questi test possono genotipo affidabile milioni di SNPs su centinaia di singoli campioni di DNA in tre giorni. Una volta generata, questi genotipi possono essere usate per controllare le associazioni con una varietà di malattie o fenotipi differenti. 

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Large-Scale Screens of Metagenomic Libraries

Metagenomic libraries archive large fragments of contiguous genomic sequences from microorganisms without requiring prior cultivation. Generating a streamlined procedure for creating and screening metagenomic libraries is therefore useful for efficient high-throughput investigations into the genetic and metabolic properties of uncultured microbial assemblages. Here, key protocols are presented on video, which we propose is the most useful format for accurately describing a long process that alternately depends on robotic instrumentation and (human) manual interventions. First, we employed robotics to spot library clones onto high-density macroarray membranes, each of which can contain duplicate colonies from twenty-four 384-well library plates. Automation is essential for this procedure not only for accuracy and speed, but also due to the miniaturization of scale required to fit the large number of library clones into highly dense spatial arrangements. Once generated, we next demonstrated how the macroarray membranes can be screened for genes of interest using modified versions of standard protocols for probe labeling, membrane hybridization, and signal detection. We complemented the visual demonstration of these procedures with detailed written descriptions of the steps involved and the materials required, all of which are available online alongside the video.

Su larga scala Schermi di librerie metagenomiche

Metagenomic libraries archive large fragments of contiguous genomic sequences from microorganisms without requiring prior cultivation.  Generating a ...

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Biologia

Pyrosequencing: A Simple Method for Accurate Genotyping

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a tremendous amount of data available comes an explosion of genotyping methods. Pyrosequencing(R) is one of the most thorough yet simple methods to date used to analyze polymorphisms. It also has the ability to identify tri-allelic, indels, short-repeat polymorphisms, along with determining allele percentages for methylation or pooled sample assessment. In addition, there is a standardized control sequence that provides internal quality control. This method has led to rapid and efficient single-nucleotide polymorphism evaluation including many clinically relevant polymorphisms. The technique and methodology of Pyrosequencing is explained.


Pyrosequencing(R) is one of the most thorough yet simple methods to date used to analyze polymorphisms. This method has led to rapid and efficient single-nucleotide polymorphism evaluation including many clinically relevant polymorphisms. The technique and methodology of Pyrosequencing is explained.

Pirosequenziamento: un metodo semplice per genotipizzazione accurata

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a ...

Batch Immunostaining for Large-Scale Protein Detection in the Whole Monkey Brain

Immunohistochemistry (IHC) is one of the most widely used laboratory techniques for the detection of target proteins in situ. Questions concerning the expression pattern of a target protein across the entire brain are relatively easy to answer when using IHC in small brains, such as those of rodents. However, answering the same questions in large and convoluted brains, such as those of primates presents a number of challenges. Here we present a systematic approach for immunodetection of target proteins in an adult monkey brain. This approach relies on the tissue embedding and sectioning methodology of NeuroScience Associates (NSA) as well as tools developed specifically for batch-staining of free-floating sections. It results in uniform staining of a set of sections which, at a particular interval, represents the entire brain. The resulting stained sections can be subjected to a wide variety of analytical procedures in order to measure protein levels, the population of neurons expressing a certain protein.

Large-scale immunodetection of target proteins across the entire primate brain is possible by employing novel tissue embedding and sectioning methods combined with the use of creative apparatus for batch staining of multiple free-floating sections at a given time.

Immunostaining lotto per la grande rivelazione di proteine ​​nel cervello della scimmia Whole

Immunohistochemistry (IHC) is one of the most widely used laboratory techniques for the detection of target proteins in situ. Questions concerning the ...

Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult human peripheral blood within a mean of 12 days. After large scale expansion &gt;1x108 ECFCs can be obtained for further tests. Advantageously by using pHPL the contact of human cells with bovine serum antigens can be excluded. By flow cytometry and immunohistochemistry the isolated cells can be characterized as ECFC and their in vitro functionality to form vascular like structures can be tested in a matrigel assay. Further these cells can be subcutaneously injected in a mouse model to form functional, perfused vessels in vivo. After long term expansion and cryopreservation proliferation, function and genomic stability appear to be preserved. 3,4
This animal-protein free isolation and expansion method is easily applicable to generate a large quantity of ECFCs.

Endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) are a promising tool to study vascular homeostasis and repair.1,2 This paper introduces a novel animal-serum free method for isolation and expansion of ECFC from heparinised adult human peripheral blood with pooled human platelet lysate (pHPL) diminishing the risk of anti-bovine immunisation.

Isolamento e di espansione su vasta scala di umano adulto cellule progenitrici endoteliali che formano colonie

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult ...

Large Scale Zebrafish-Based In vivo Small Molecule Screen

Given their small embryo size, rapid development, transparency, fecundity, and numerous molecular, morphological and physiological similarities to mammals, zebrafish has emerged as a powerful in vivo platform for phenotype-based drug screens and chemical genetic analysis. Here, we demonstrate a simple, practical method for large-scale screening of small molecules using zebrafish embryos.

Large Scale Zebrafish-Based In vivo Small Molecule Screen

Zebrafish has emerged as a powerful in vivo platform for phenotype-based drug screens and chemical genetic analysis. Here, we demonstrate a simple, practical method for large-scale screening of small molecules using zebrafish embryos.

Large Scale Zebrafish-Based In vivo Screen piccole molecole

Given their small embryo size, rapid development, transparency, fecundity, and numerous molecular, morphological and physiological similarities to ...

A Strategy for Sensitive, Large Scale Quantitative Metabolomics

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. However, current platforms have different limiting factors, such as labor intensive sample preparations, low detection limits, slow scan speeds, intensive method optimization for each metabolite, and the inability to measure both positively and negatively charged ions in single experiments. Therefore, a novel metabolomics protocol could advance metabolomics studies. Amide-based hydrophilic chromatography enables polar metabolite analysis without any chemical derivatization. High resolution MS using the Q-Exactive (QE-MS) has improved ion optics, increased scan speeds (256 msec at resolution 70,000), and has the capability of carrying out positive/negative switching. Using a cold methanol extraction strategy, and coupling an amide column with QE-MS enables robust detection of 168 targeted polar metabolites and thousands of additional features simultaneously.&#160; Data processing is carried out with commercially available software in a highly efficient way, and unknown features extracted from the mass spectra can be queried in databases.

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. Utilizing normal-phased liquid chromatography coupled to high-resolution mass spectrometry with polarity switching and a rapid duty cycle, we describe a protocol to analyze the polar metabolic composition of biological material with high sensitivity, accuracy, and resolution.

Una strategia per sensibili, su larga scala quantitative Metabolomica

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. However, current platforms have different limiting ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic chromosome, synIII1, and one synthetic chromosome arm, synIXR2, have been constructed and their in vivo function validated in the absence of the corresponding wild type chromosomes. An important design feature of Sc2.0 chromosomes is the introduction of PCRTags, which are short, re-coded sequences within open reading frames (ORFs) that enable differentiation of synthetic chromosomes from their wild type counterparts. PCRTag primers anneal selectively to either synthetic or wild type chromosomes and the presence/absence of each type of DNA can be tested using a simple PCR assay. The standard readout of the PCRTag assay is to assess presence/absence of amplicons by agarose gel electrophoresis. However, with an average PCRTag amplicon density of one per 1.5 kb and a genome size of ~12 Mb, the completed Sc2.0 genome will encode roughly 8,000 PCRTags. To improve throughput, we have developed a real time PCR-based detection assay for PCRTag genotyping that we call qPCRTag analysis. The workflow specifies 500 nl reactions in a 1,536 multiwell plate, allowing us to test up to 768 PCRTags with both synthetic and wild type primer pairs in a single experiment.

Designer chromosomes of the Synthetic Yeast Genome project, Sc2.0, can be distinguished from their native counterparts using a PCR-based genotyping assay called PCRTagging, which has a presence/absence endpoint. Here we describe a high-throughput real time PCR detection method for PCRTag genotyping.

Analisi qPCRTag - A High Throughput, Real Time PCR Assay per Sc2.0 genotipizzazione

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...

ODELAY: A Large-scale Method for Multi-parameter Quantification of Yeast Growth

Growth phenotypes of microorganisms are a strong indicator of their underlying genetic fitness and can be segregated into 3 growth regimes: lag-phase, log-phase, and stationary-phase. Each growth phase can reveal different aspects of fitness that are related to various environmental and genetic conditions. High-resolution and quantitative measurements of all 3 phases of growth are generally difficult to obtain. Here we present a detailed method to characterize all 3 growth phases on solid media using an assay called One-cell Doubling Evaluation of Living Arrays of Yeast (ODELAY). ODELAY quantifies growth phenotypes of individual cells growing into colonies on solid media using time-lapse microscopy. This method can directly observe population heterogeneity with each growth parameter in genetically identical cells growing into colonies. This population heterogeneity offers a unique perspective for understanding genetic and epigenetic regulation, and responses to genetic and environmental perturbations. While the ODELAY method is demonstrated using yeast, it can be utilized on any colony forming microorganism that is visible by bright field microscopy.

We present a method for quantifying growth phenotypes of individual yeast cells as they grow into colonies on solid media using time-lapse microscopy termed, One-cell Doubling Evaluation of Living Arrays of Yeast (ODELAY). Population heterogeneity of genetically identical cells growing into colonies can be directly observed and quantified.

ODELAY: Metodo su vasta scala per la quantificazione multiparametrica della crescita del lievito

Growth phenotypes of microorganisms are a strong indicator of their underlying genetic fitness and can be segregated into 3 growth regimes: lag-phase, ...

Identification of Novel Regulators of Plant Transpiration by Large-Scale Thermal Imaging Screening in Helianthus Annuus

Plant adaptation to biotic and abiotic stresses is governed by a variety of factors, among which the regulation of stomatal aperture in response to water deficit or pathogens plays a crucial role. Identifying small molecules that regulate stomatal movement can therefore contribute to understanding the physiological basis by which plants adapt to their environment. Large-scale screening approaches that have been used to identify regulators of stomatal movement have potential limitations: some rely heavily on the abscisic acid (ABA) hormone signaling pathway, therefore excluding ABA-independent mechanisms, while others rely on the observation of indirect, long-term physiological effects such as plant growth and development. The screening method presented here allows the large-scale treatment of plants with a library of chemicals coupled with a direct quantification of their transpiration by thermal imaging. Since evaporation of water through transpiration results in leaf surface cooling, thermal imaging provides a non-invasive approach to investigate changes in stomatal conductance over time. In this protocol, Helianthus annuus seedlings are grown hydroponically and then treated by root feeding, in which the primary root is cut and dipped into the chemical being tested. Thermal imaging followed by statistical analysis of cotyledonary temperature changes over time allows for the identification of bioactive molecules modulating stomatal aperture. Our proof-of-concept experiments demonstrate that a chemical can be carried from the cut root to the cotyledon of the sunflower seedling within 10 minutes. In addition, when plants are treated with ABA as a positive control, an increase in leaf surface temperature can be detected within minutes. Our method thus allows the efficient and rapid identification of novel molecules regulating stomatal aperture.

Identification of Novel Regulators of Plant Transpiration by Large-Scale Thermal Imaging Screening in Helianthus Annuus

We provide a method for identifying modulators of foliar transpiration by large-scale screening of a compound library.

Identificazione di nuovi regolatori della traspirazione vegetale mediante screening termico su larga scala in Helianthus Annuus

Plant adaptation to biotic and abiotic stresses is governed by a variety of factors, among which the regulation of stomatal aperture in response to water ...

A Semiautomated ChIP-Seq Procedure for Large-scale Epigenetic Studies

Chromatin immunoprecipitation followed by sequencing (ChIP-Seq) is a powerful and widely used approach to profile chromatin DNA associated with specific histone modifications, such as H3K27ac, to help identify cis-regulatory DNA elements. The manual process to complete a ChIP-Seq is labor intensive, technically challenging, and often requires large-cell numbers (&#62;100,000 cells). The method described here helps to overcome those challenges. A complete semiautomated, microscaled H3K27ac ChIP-Seq procedure including cell fixation, chromatin shearing, immunoprecipitation, and sequencing library preparation, for batch of 48 samples for cell number inputs less than 100,000 cells is described in detail. The semiautonomous platform reduces technical variability, improves signal-to-noise ratios, and drastically reduces labor. The system can thereby reduce costs by allowing for reduced reaction volumes, limiting the number of expensive reagents such as enzymes, magnetic beads, antibodies, and hands-on time required. These improvements to the ChIP-Seq method suit perfectly for large-scale epigenetic studies of clinical samples with limited cell numbers in a highly reproducible manner.

This paper describes a semiautomated, microscaled ChIP-Seq protocol of DNA regions associated with a specific histone modification (H3K27ac) using a ChIP liquid-handler platform, followed by library preparation using tagmentation. The procedure includes control assessment for quality and quantity purposes and can be adopted to other histone modifications or transcription factors.

Una procedura ChIP-Seq semiautomatica per studi epigenetici su larga scala

Chromatin immunoprecipitation followed by sequencing (ChIP-Seq) is a powerful and widely used approach to profile chromatin DNA associated with specific ...

Methods Article

Infinium Assay per i grandi SNP genotipizzazione Applicazioni