Name: odelay: a large-scale method for multi-parameter quantification of yeast growth
Uploaded: 2017-07-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about ODELAY: A Large-scale Method for Multi-parameter Quantification of Yeast Growth at JoVE.com

Gli autori riconoscono il sostegno di questo lavoro con borse U54 RR022220 e P50 GM076547 a JDA presso gli Istituti Nazionali di Salute degli Stati Uniti. FDM è un collega postdoctoral con gli Istituti Canadesi per la Ricerca sulla Salute. Ringraziamo inoltre il Centro di Lussemburgo per la Sistemi Biomedicina e l&#39;Università di Lussemburgo per il supporto.

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il test ODELAY ha diversi punti critici per garantire misure fenotipiche riproducibili e affidabili. Il primo punto critico è la preparazione costante delle colture di lievito. Occorre prestare attenzione a raccogliere le cellule del lievito dalla crescita logaritmica. Se le culture sono saturate, la loro eterogeneità della popolazione sarà aumentata, che può offuscare l&#39;eterogeneità causata da fattori genetici o ambientali ( ad esempio, fonte di carbonio) 11 . Il secondo punto critico è la preparazione coerente dei supporti. In generale, è necessario generare un ampio volume di 10X media media solution e quindi utilizzare nel tempo per ridurre al minimo gli effetti batch. Formulare i supporti in peso, quando possibile, aiuta a migliorare la consistenza del mezzo nel tempo assicurando la densità di agar e il tenore totale dell&#39;acqua dell&#39;agarosio può essere strettamente monitorato. Il terzo punto critico comporta minimizzare o eliminare qualsiasi deformazione meccanica dell&#39;agarosio media. La deformazione meccanica dei supporti si verifica più frequentemente durante la separazione dell&#39;agarosio dalle vetrate. Come per molte tecniche di laboratorio, è necessaria la pratica per capire questo passo. La variazione del tempo di ritardo come mostrato nella figura 4 è spesso correlata a uno dei tre fattori: deformazione meccanica del mezzo agarosio, variazione dello spessore agarizzato o una sorgente luminosa instabile. Se il mezzo di agarosio varia in altezza Z attraverso l&#39;array spotted, la variazione di altezza può superare l&#39;intervallo della routine di autofocus, causando che le immagini iniziali siano leggermente fuori fuoco. Per questo motivo, controllare l&#39;altezza di messa a fuoco in più punti al centro e lungo i bordi della matrice macchiata per assicurare che la routine di autofocus abbia una sufficiente gamma di Z per trovare la messa a fuoco. Se necessario, utilizzare il pannello Autofocus per aumentare l&#39;intervallo di messa a fuoco e aumentare il numero di passi di messa a fuoco. Un terzo possibile conditIone che può portare a un cattivo fuoco è una sorgente luminosa instabile o sfarfallante che può interrompere il punteggio di focalizzazione calcolato per una specifica altezza Z. Le lampade alogene del tungsteno tendono a sfarfallare ben prima che le lampadine bruciano. L&#39;effetto di scarsa attenzione viene osservato in un esempio in cui le curve di crescita inumidiscono tra il primo e il secondo punto temporale ( Figura 5 A ), mentre il punto adiacente non ha lo stesso tuffo ( Figura 5 B ). In questo caso, la scarsa condizione di messa a fuoco è stata alleviata sostituendo la sorgente di luce alogena al tungsteno. In pratica, gli autori hanno scoperto che per ridurre il sfarfallio di lampadine alogene da 100W, le lampadine devono essere sostituite ogni 500 ore circa ogni due mesi quando i microscopi sono sotto uso pesante. Per evitare problemi di messa a fuoco poveri da una lampadina di sfarfallio, sostituire spesso la fonte di luce alogena al tungsteno o sostituire la lampada alogena con una sorgente luminosa a diodi. UnEsempio di un set di dati che mostra una scarsa variabilità dei tempi di raddoppiamento e tempi di ritardo più uniformi è mostrato in Figura 6 . Questo set di dati è stato scattato con un diodo illuminante che fornisce un&#39;illuminazione più stabile nel tempo durante l&#39;esecuzione dell&#39;autofocus. Mentre molti dei punti menzionati qui per ottimizzare la preparazione dei media potrebbero apparire evidenti, nella letteratura gli schermi di grandi dimensioni non si replicano bene tra loro 8 , 11 . Di conseguenza, abbiamo descritto con cura la preparazione di culture e agarosi in modo da generare schermature fenotipiche più riproducibili. Il test ODELAY è attualmente limitato nel throughput se confrontato con i test basati sul pinning come gli array genetici sintetici o il dosaggio Scan-O-Matic. Mentre questi metodi aumentano il numero di ceppi misurati, non hanno la capacità di risolvere singole cellule aE quindi non è possibile misurare l&#39;eterogeneità della popolazione che osserviamo nei ceppi di lievito clonale. L&#39;origine di questa eterogeneità della popolazione non è attualmente compresa, ma la fusione della tecnologia e del calcolo come qui dimostrato offre un&#39;opportunità per affrontare oggettivamente i meccanismi cellulari sottostanti 12 . Gli autori vogliono notare che ODELAY è attualmente ottimizzato solo per uno specifico marchio e tipo di corpo del microscopio. La modifica di ODELAY per altri sistemi di microscopio è diretta, ma richiede la conoscenza dell&#39;API open source 13 . Tuttavia, sia l&#39;API che gli script ODELAY sono scritti per essere facilmente adattati a diversi sistemi e test sperimentali. Mentre ODELAY è stato originariamente sviluppato per il lievito, siamo stati in grado di utilizzarlo senza modifiche per osservare la crescita di Mycobacterium smegmatis . Osservazione dell&#39;altra colonia che formano microrganismi èPossibile con modifiche al codice sorgente fornito 11 . In generale, ODELAY è uno strumento potente e flessibile per confrontare i microrganismi coltivati ​​in condizioni ambientali differenti e perturbazioni genetiche.

I fenotipi di crescita dei microrganismi sono un forte indicatore della loro forma genetica sottostante a una determinata condizione ambientale. La crescita è classicamente segregata in 3 diversi regimi di crescita: la fase a ritardo, la fase log-fase e la fase stazionaria 1 . Ogni fase di crescita può rivelare diversi aspetti della forma fisica che dipendono da varie condizioni ambientali e genetiche. Ad esempio, il tempo di ritardo o la lunghezza di tempo che un organismo trascorre in fase di ritardo prima dell&#39;inizio della crescita esponenziale può essere indicativo della capacità di un organismo di rispondere alle condizioni ambientali alterate 2 . Il tempo di raddoppiamento durante la fase di fase log-phase, la metrica più comune di idoneità cellulare, rivela l&#39;efficienza complessiva dell&#39;abilità di un organismo di dividere metabolizzando e utilizzando materiali ambientali per la replica. La fase stazionaria, in cui la crescita dopo la fase log-fase è rapidamente ridotta, è un altro indicatore di idoneità, che è regolareUtilizzata come punto finale di crescita nei test di crescita del lievito a base di spot. Sono attualmente disponibili diversi test di crescita del lievito e considerati metodi standard per la valutazione dei fenotipi di crescita nel lievito 3 , 4 , 5 . Questi dosaggi sono basati principalmente sui metodi per la coltivazione di lieviti sia su supporti solidi che liquidi. Sui supporti solidi, i test di colonizzazione della colonia trasferiscono un piccolo numero di cellule su agar solido con un perno e le cellule di lievito sono lasciate crescere per un determinato periodo di tempo. Le colonie vengono poi visualizzate e le loro dimensioni vengono confrontate ad un terminale terminale 6 . Questi test di colonizzazione della colonia sono stati dimostrati robusti e scalabili per generare schermi di genoma. Più recentemente, in questi saggi sono state incorporate immagini periodiche con scanner a piatto e telecamere a riflessione a lenti singole (SLR) per registrare la crescita della colonia nel tempo 7 , 8, 9 . Tuttavia, la risoluzione di questi dispositivi impedisce loro di individuare singole celle e, di conseguenza, questi dosaggi della colonia non osservano direttamente il ritardo e non possono osservare variazioni tra le singole cellule che crescono in colonie. I test di crescita a base liquida sono stati impiegati anche per eseguire schermi a livello genomico 3 . Accoppiare un test di crescita liquido con la microscopia a tempo trascorso ha rivelato l&#39;eterogeneità della popolazione nel tempo di raddoppiamento delle cellule geneticamente identiche, che offre una prospettiva importante per comprendere la regolazione genetica e l&#39;adattamento ambientale. Tuttavia, questo dosaggio non misura altri aspetti della crescita, come il tempo di ritardo e la capacità di trasporto 10 . Qui presentiamo un metodo per caratterizzare tutte le tre fasi di crescita dei microrganismi che formano la colonia su supporti solidi usando un saggio di cui abbiamo termine ODELAY 11 . ODELAY consiste di utiliZing la microscopia ad alta velocità di throughput per registrare le immagini delle cellule singole che crescono in colonie su supporti solidi. Questa popolazione di singole cellule che crescono in colonie rivela l&#39;eterogeneità della popolazione che non è rilevata da altre misurazioni meno sensibili come il punteggio finale di terminale. Noi dimostriamo il metodo sul lievito, ma ODELAY può essere applicato a qualsiasi organismo che mostra il contrasto in microscopia a campo luminoso.

<table><tbody><tr><td>Agarose UltraPure</td><td>ThermoFisher</td><td>16500500</td><td>Gel Temp 36C, Gel Strength (1%) 1.2 g/sq cm</td></tr><tr><td>Yeast Extract Peptone (YEP)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1422-2</td><td></td></tr><tr><td>Complete Suplement Mixture (CSM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>MP114560222</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylene Glycol 3350 (av. mol. wt. 3000-3700)</td><td>SigmaAldrich</td><td>P2906</td><td></td></tr><tr><td>Yeast Strain BY4741</td><td>ThermoFisher</td><td>95400.BY4741</td><td></td></tr><tr><td>Yeast Strain BY4742</td><td>ThermoFisher</td><td>95400.BY4742</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Falcon tubes</td><td>Corning</td><td>430291</td><td>1 case</td></tr><tr><td>15 mL Falcon tubes</td><td>Corning</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>2 x 3 inch 1.0 mm thick slides 1/2 gross</td><td>VWR</td><td>48382-179</td><td></td></tr><tr><td>96-well plate flat bottom</td><td>Corning</td><td>353072</td><td></td></tr><tr><td>Hydra liquid handleing robot</td><td>Thermo</td><td>1096-DT-100</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton Microlab Star Liquid Handleing Robot</td><td>Hamilton</td><td></td><td></td></tr><tr><td>hydra 100 mL tips Extended Length DARTS</td><td>Thermo</td><td>5527</td><td></td></tr><tr><td>Synergy H4 Plate Reader</td><td>Biotek</td><td>H4MLFAD</td><td></td></tr><tr><td>Leica DMI6000 B Microscope</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica 10X/0.3NA objective</td><td>Leica</td><td>11506289</td><td></td></tr><tr><td>Hamamatsu ORCA Flash 4.0 Camera</td><td>Hamamatsu</td><td>C11440-22CU</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB with image processing tool box</td><td>Mathworks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MicroManager</td><td>Open Imaging</td><td></td><td>https://micro-manager.org/</td></tr><tr><td>ODELAY Microscope Control (MATLAB scripts and GUI)</td><td></td><td></td><td>www.aitchisonlab.com\ODELAY for Matlab scripts and software</td></tr><tr><td>ODELAY Microscope Chamber</td><td></td><td></td><td>www.aitchisonlab.com\ODELAY for Mechanincal Drawings</td></tr><tr><td>ODELAY Agar Molds</td><td></td><td></td><td>www.aitchisonlab.com\ODELAY for mold drawings</td></tr></tbody></table>

odelay: a large-scale method for multi-parameter quantification of yeast growth

I fenotipi di crescita dei microrganismi sono un indicatore forte della loro forma genetica sottostante e possono essere segregati in 3 regimi di crescita: fase a fase di fase, fase log-fase e fase stazionaria. Ogni fase di crescita può rivelare diversi aspetti della forma fisica che sono legati a varie condizioni ambientali e genetiche. Le misurazioni ad alta risoluzione e quantitativa di tutte e tre le fasi di crescita sono generalmente difficili da ottenere. Qui presentiamo un metodo dettagliato per caratterizzare tutte le tre fasi di crescita su supporti solidi usando un saggio chiamato Valutazione delle matrici viventi di lieviti (ODELAY) di una sola cellula. ODELAY ha quantificato i fenotipi di crescita di singole cellule che crescono in colonie su supporti solidi utilizzando microscopia a tempo trascorso. Questo metodo può osservare direttamente l&#39;eterogeneità della popolazione con ogni parametro di crescita in cellule geneticamente identiche che crescono in colonie. Questa eterogeneità della popolazione offre una prospettiva unica per comprendere la regolazione genetica e epigenetica, e le risposte aPerturbazioni genetiche e ambientali. Mentre il metodo ODELAY è dimostrato utilizzando il lievito, può essere utilizzato su qualsiasi microrganismo che produce la colonia che è visibile dalla microscopia a campo luminoso.

<html> Le immagini esemplari di lieviti che crescono in microscopia a tempo trascorso sono mostrate nella Figura 3B . Dopo aver elaborato le immagini di time-lapse, è mostrato in Figura 4 un insieme di dati rappresentativo che confronta i ceppi di lievito BY4741 &amp; BY4742. In questo set di dati di esempio, vi è una scarsa variazione nel tempo di raddoppiamento tra diverse posizioni sulla piastra. Se il mezzo agarosio è preparato male, allora una evidente deviazione sia nel tempo di raddoppiamento che nel tempo di ritardo sarebbe apparente nelle posizioni di scatto che coincidono con la regione deformata del gel agarosio. Mentre i tempi di raddoppiamento sembrano essere relativamente uniformi, questo esempio mostra variazioni nelle misurazioni del tempo di ritardo. Un insieme di dati più coerente è mostrato in Figura 6 . In questo set di dati, sia il tempo di ritardo che il tempo di raddoppiamento sono uniformi. File / ftp_upload / 55879 / 55879fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1: Assemblaggio della muffa di agar. I componenti dello stampo agar sono mostrati in ( A ). Montare la base come illustrato in ( B ) e quindi fissare la base con piccoli fermi di legante. Posizionare i pezzi più in posizione longitudinale nella cavità della base ( C ) e quindi incollare le diapositive nello stampo come mostrato in ( D ). Una vista laterale che mostra l&#39;angolo dello stampo e l&#39;orientamento del cerchio di stampo necessario per una separazione uniforme dell&#39;agar dalla slitta di vetro ( E ). Notare la posizione del pollice e dei forefingers, così come la linea retta dell&#39;agar che separa dalla diapositiva ( F ) e nota la freccia orizzontale. La linea di separazione deve spostarsi uniformemente in direzione delle frecce verticali. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55879/55879fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> = &quot;Jove_content&quot; per: keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; <img alt="figura 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55879/55879fig2.jpg" /> Figura 2: Metodo di Sonication e Spotting. Sonicare la piastra in acqua di ghiaccio e utilizzare un supporto per secchi di centrifuga per aiutare a sostenere la piastra ( A ). Posare le piastre dalle fasi 3.8.1 fuori per la macchia sulla piastra agarosa ( B ). Inoltre, predisporre le punte in modo che la scatola sinistra più punta ha una punta nella posizione C10 e poi quattro altri punta con le loro estremità tagliate in modo che non rompino il supporto piastra ( C ). Posizionare i rimanenti rimanenti in quattro scatole in modo che le posizioni interne 24 punte siano occupate ( D ). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55879/55879fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> 55879fig3.jpg &quot;/&gt; Figura 3: Interfaccia utente grafica ODELAY. Un colpo di schermo dell&#39;interfaccia grafica per &quot;ODELAY_Microscopecontrol.m&quot; ( A ). Questa interfaccia consente di monitorare la fotocamera e di regolare le impostazioni di illuminazione del microscopio per le modalità epifluorescenti e quelle a campo luminoso. Le frecce rosse puntano sui pulsanti Focus e Transmitted che attivano la fotocamera per acquisire rapidamente le immagini e aprire rispettivamente l&#39;otturatore luminoso trasmesso. Le frecce blu vengono utilizzate per spostare lo stadio per l&#39;origine e quindi impostare l&#39;origine con il pulsante &quot;Go Origin&quot; e il pulsante &quot;Set&quot;. Le frecce verdi puntano a &quot;Reset&quot; e &quot;ODELAY !!!&quot; Pulsanti che ripristina le modalità di immagine ODELAY alle condizioni attuali e inizia la collezione di immagini ODELAY. Immagini di lieviti che si coltivano su un mezzo solido a 0, 3, 6 e 9 ore dopo la comparsa ( B ). Un colpo di schermo dell&#39;interfaccia grafica per &quot;ODELAY_IPT.m&quot; o th<html> E ODELAY Strumento di elaborazione delle immagini ( C ). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55879/55879fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55879/55879fig4.jpg" /> Figura 4: Esempio ODELAY Output. Questo insieme di dati confronta i ceppi BY4741 e BY4742 su supporti YPD. Questa figura è un esempio di uno scivolo agarosico ben preparato; Tuttavia, le impostazioni di autofocus non sono ottimali. I dati presentati in ciascuna colonna, da sinistra a destra, sono: la capacità di carico nel log 2 dell&#39;area colonia; Il tempo di raddoppiamento, dato in min; E tempi di ritardo, dati in min. In questo esempio, i tempi di raddoppiamento di tutti i punti sulla linea di agar si allineano bene con una piccola quantità di tempo di raddoppiamento aumentato verso la colonna. Tuttavia, i tempi di ritardo variano notevolmente in questo set di dati._upload / 55879 / 55879fig4large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. <img alt="Figura 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55879/55879fig5.jpg" /> Figura 5: Esempi di curva di crescita. Questo esempio dimostra come la focalizzazione iniziale scarsa può causare il tempo di ritardo stimato (t lag ) per aumentare ( A ), mentre la posizione adiacente mostra un tempo di ritardo più breve ( B ). T d è il tempo di raddoppiamento in min e t lag è il tempo di ritardo in min. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55879/55879fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55879/55879fig6.jpg" /> Figura 6: Esempio di esperimento di prova eseguito bene. Un eEsemplare del ceppo BY4742 testato dopo aver sostituito una lampadina alogena al tungsteno con un diodo illuminante e assicurando che l&#39;autofocus sia impostato correttamente. Tutti i tempi di raddoppiamento sembrano sovrapporsi bene ei tempi di ritardo sembrano essere coerenti. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55879/55879fig6large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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ODELAY: A Large-scale Method for Multi-parameter Quantification of Yeast Growth

Presentiamo un metodo per quantificare i fenotipi di crescita delle singole cellule di lieviti in quanto crescono in colonie su supporti solidi utilizzando la microscopia a tempo scaduto denominata &quot;Valutazione doppia di una sola cellula vivente di lievito&quot; (ODELAY). L&#39;eterogeneità delle popolazioni di cellule geneticamente identiche in colonie può essere direttamente osservata e quantificata.

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Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

Global defects in RNA polymerase II transcription might be overlooked by transcriptomic studies analyzing steady-state RNA. Indeed, the global decrease in mRNA synthesis has been shown to be compensated by a simultaneous decrease in mRNA degradation to restore normal steady-state levels. Hence, the genome-wide quantification of mRNA synthesis, independently from mRNA decay, is the best direct reflection of RNA polymerase II transcriptional activity. Here, we discuss a method using non-perturbing metabolic labeling of nascent RNAs in Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae). Specifically, the cells are cultured for 6 min with a uracil analog, 4-thiouracil, and the labeled newly transcribed RNAs are purified and quantified to determine the synthesis rates of all individual mRNA. Moreover, using labeled Schizosaccharomyces pombe cells as internal standard allows comparing mRNA synthesis in different S. cerevisiae strains. Using this protocol and fitting the data with a dynamic kinetic model, the corresponding mRNA decay rates can be determined.

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The protocol described here is based on the genome-wide quantification of newly synthesized mRNA purified from yeast cells labeled with 4-thiouracil. This method allows to measure mRNA synthesis uncoupled from mRNA decay and, thus, provides an accurate measurement of RNA polymerase II transcription.

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Biologia

Measuring Replicative Life Span in the Budding Yeast

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae has been used extensively to study the biology of aging, and several determinants of yeast longevity have been shown to be conserved in multicellular eukaryotes, including worms, flies, and mice 1. Due to the lack of easily quantified age-associated phenotypes, aging in yeast has been assayed almost exclusively by measuring the life span of cells in different contexts, with two different life span paradigms in common usage 2. Chronological life span refers to the length of time that a mother cell can survive in a non-dividing, quiescence-like state, and is proposed to serve as a model for aging of post-mitotic cells in multicellular eukaryotes. Replicative life span, in contrast, refers the number of daughter cells produced by a mother cell prior to senescence, and is thought to provide a model of aging in mitotically active cells. Here we present a generalized protocol for measuring the replicative life span of budding yeast mother cells. The goal of the replicative life span assay is to determine how many times each mother cell buds. The mother and daughter cells can be easily differentiated by an experienced researcher using a standard light microscope (total magnification 160X), such as the Zeiss Axioscope 40 or another comparable model. Physical separation of daughter cells from mother cells is achieved using a manual micromanipulator equipped with a fiber-optic needle. Typical laboratory yeast strains produce 20-30 daughter cells per mother and one life span experiment requires 2-3 weeks.

In this article we present a general protocol for measuring the replicative life span of yeast mother cells.

Durata pannello misura replicazione in lievito

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding ...

A Quantitative Fitness Analysis Workflow

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is an experimental and computational workflow for comparing fitnesses of microbial cultures grown in parallel1,2,3,4. QFA can be applied to focused observations of single cultures but is most useful for genome-wide genetic interaction or drug screens investigating up to thousands of independent cultures. The central experimental method is the inoculation of independent, dilute liquid microbial cultures onto solid agar plates which are incubated and regularly photographed. Photographs from each time-point are analyzed, producing quantitative cell density estimates, which are used to construct growth curves, allowing quantitative fitness measures to be derived. Culture fitnesses can be compared to quantify and rank genetic interaction strengths or drug sensitivities. The effect on culture fitness of any treatments added into substrate agar (e.g. small molecules, antibiotics or nutrients) or applied to plates externally (e.g. UV irradiation, temperature) can be quantified by QFA.
The QFA workflow produces growth rate estimates analogous to those obtained by spectrophotometric measurement of parallel liquid cultures in 96-well or 200-well plate readers. Importantly, QFA has significantly higher throughput compared with such methods. QFA cultures grow on a solid agar surface and are therefore well aerated during growth without the need for stirring or shaking.
QFA throughput is not as high as that of some Synthetic Genetic Array (SGA) screening methods5,6. However, since QFA cultures are heavily diluted before being inoculated onto agar, QFA can capture more complete growth curves, including exponential and saturation phases3. For example, growth curve observations allow culture doubling times to be estimated directly with high precision, as discussed previously1.
Here we present a specific QFA protocol applied to thousands of S. cerevisiae cultures which are automatically handled by robots during inoculation, incubation and imaging. Any of these automated steps can be replaced by an equivalent, manual procedure, with an associated reduction in throughput, and we also present a lower throughput manual protocol. The same QFA software tools can be applied to images captured in either workflow.
We have extensive experience applying QFA to cultures of the budding yeast S. cerevisiae but we expect that QFA will prove equally useful for examining cultures of the fission yeast S. pombe and bacterial cultures.

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is a complementary series of experimental and computational methods for estimating microbial culture fitnesses. QFA estimates the effect of genetic mutations, drugs or other applied treatments on microbe growth. Experiments scaling from focussed analysis of single cultures to thousands of parallel cultures can be designed.

A Quantitative Analysis Fitness Workflow

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is an experimental and computational workflow for comparing fitnesses of microbial cultures grown in parallel1,2,3,4. ...

Analysis of Lipid Droplet Content in Fission and Budding Yeasts using Automated Image Processing

Lipid metabolism and its regulation are of interest to both basic and applied life sciences and biotechnology. In this regard, various yeast species are used as models in lipid metabolic research or for industrial lipid production. Lipid droplets are highly dynamic storage bodies and their cellular content represents a convenient readout of the lipid metabolic state. Fluorescence microscopy is a method of choice for quantitative analysis of cellular lipid droplets, as it relies on widely available equipment and allows analysis of individual lipid droplets. Furthermore, microscopic image analysis can be automated, greatly increasing overall analysis throughput. Here, we describe an experimental and analytical workflow for automated detection and quantitative description of individual lipid droplets in three different model yeast species: the fission yeasts Schizosaccharomyces pombe and Schizosaccharomyces japonicus, and the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Lipid droplets are visualized with BODIPY 493/503, and cell-impermeable fluorescent dextran is added to the culture media to help identify cell boundaries. Cells are subjected to 3D epifluorescence microscopy in green and blue channels and the resulting z-stack images are processed automatically by a MATLAB pipeline. The procedure outputs rich quantitative data on cellular lipid droplet content and individual lipid droplet characteristics in a tabular format suitable for downstream analyses in major spreadsheet or statistical packages. We provide example analyses of lipid droplet content under various conditions that affect cellular lipid metabolism.

Here, we present a MATLAB implementation of automated detection and quantitative description of lipid droplets in fluorescence microscopy images of fission and budding yeast cells.

Analisi del contenuto delle goccioline lipidi in Fissione e lieviti in forati utilizzando l'elaborazione automatizzata delle immagini

Lipid metabolism and its regulation are of interest to both basic and applied life sciences and biotechnology. In this regard, various yeast species are ...

Immunologia e infezioni

Temporal Quantification of MAPK Induced Expression in Single Yeast Cells

The quantification of gene expression at the single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements performed at the population level. Two methods based on microscopy and flow cytometry are presented to demonstrate how such data can be acquired. The expression of a fluorescent reporter induced upon activation of the high osmolarity glycerol MAPK pathway in yeast is used as an example. The specific advantages of each method are highlighted. Flow cytometry measures a large number of cells (10,000) and provides a direct measure of the dynamics of protein expression independent of the slow maturation kinetics of the fluorescent protein. Imaging of living cells by microscopy is by contrast limited to the measurement of the matured form of the reporter in fewer cells. However, the data sets generated by this technique can be extremely rich thanks to the combinations of multiple reporters and to the spatial and temporal information obtained from individual cells. The combination of these two measurement methods can deliver new insights on the regulation of protein expression by signaling pathways.

Two complementary methods based on flow cytometry and microscopy are presented which enable the quantification, at the single cell level, of the dynamics of gene expression induced by the activation of a MAPK pathway in yeast.

La quantificazione temporale di espressione MAPK indotta in cellule di lievito singole

The quantification of gene expression at the  single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements  performed at the population ...

Reporter-based Growth Assay for Systematic Analysis of Protein Degradation

Protein degradation by the ubiquitin-proteasome system (UPS) is a major regulatory mechanism for protein homeostasis in all eukaryotes. The standard approach to determining intracellular protein degradation relies on biochemical assays for following the kinetics of protein decline. Such methods are often laborious and time consuming and therefore not amenable to experiments aimed at assessing multiple substrates and degradation conditions. As an alternative, cell growth-based assays have been developed, that are, in their conventional format, end-point assays that cannot quantitatively determine relative changes in protein levels.
Here we describe a method that faithfully determines changes in protein degradation rates by coupling them to yeast cell-growth kinetics. The method is based on an established selection system where uracil auxotrophy of URA3-deleted yeast cells is rescued by an exogenously expressed reporter protein, comprised of a fusion between the essential URA3 gene and a degradation determinant (degron). The reporter protein is designed so that its synthesis rate is constant whilst its degradation rate is determined by the degron. As cell growth in uracil-deficient medium is proportional to the relative levels of Ura3, growth kinetics are entirely dependent on the reporter protein degradation.
This method accurately measures changes in intracellular protein degradation kinetics. It was applied to: (a) Assessing the relative contribution of known ubiquitin-conjugating factors to proteolysis (b) E2 conjugating enzyme structure-function analyses (c) Identification and characterization of novel degrons. Application of the degron-URA3-based system transcends the protein degradation field, as it can also be adapted to monitoring changes of protein levels associated with functions of other cellular pathways.

Here we describe a robust biological assay for quantifying the relative rate of proteolysis by the ubiquitin-proteasome system. The assay readout is yeast growth rate in liquid culture, which is dependent on the cellular levels of a reporter protein comprising a degradation signal fused to an essential metabolic marker.

Saggio di crescita a base Reporter, per l&#39;analisi sistematica di proteine ​​degradazione

Protein degradation by the ubiquitin-proteasome system (UPS) is a major regulatory mechanism for protein homeostasis in all eukaryotes. The standard ...

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic requirements for eukaryotic protein degradation was initially established in Saccharomyces cerevisiae. Classical analyses of protein degradation have relied on biochemical pulse-chase and cycloheximide-chase methodologies. While these techniques provide sensitive means for observing protein degradation, they are laborious, time-consuming, and low-throughput. These approaches are not amenable to rapid or large-scale screening for mutations that prevent protein degradation. Here, a yeast growth-based assay for the facile identification of genetic requirements for protein degradation is described. In this assay, a reporter enzyme required for growth under specific selective conditions is fused to an unstable protein. Cells lacking the endogenous reporter enzyme but expressing the fusion protein can grow under selective conditions only when the fusion protein is stabilized (i.e. when protein degradation is compromised). In the growth assay described here, serial dilutions of wild-type and mutant yeast cells harboring a plasmid encoding a fusion protein are spotted onto selective and non-selective medium. Growth under selective conditions is consistent with degradation impairment by a given mutation. Increased protein abundance should be biochemically confirmed. A method for the rapid extraction of yeast proteins in a form suitable for electrophoresis and western blotting is also demonstrated. A growth-based readout for protein stability, combined with a simple protocol for protein extraction for biochemical analysis, facilitates rapid identification of genetic requirements for protein degradation. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of short-lived proteins. In the example presented, the His3 enzyme, which is required for histidine biosynthesis, was fused to Deg1-Sec62. Deg1-Sec62 is targeted for degradation after it aberrantly engages the endoplasmic reticulum translocon. Cells harboring Deg1-Sec62-His3 were able to grow under selective conditions when the protein was stabilized.

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

This article describes a yeast growth-based assay for the determination of genetic requirements for protein degradation. It also demonstrates a method for rapid extraction of yeast proteins, suitable for western blotting to biochemically confirm degradation requirements. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of proteins.

Determinazione base alla crescita e conferma biochimica dei requisiti genetici per Protein Degradazione in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic ...

Precise, High-throughput Analysis of Bacterial Growth

Bacterial growth is a central concept in the development of modern microbial physiology, as well as in the investigation of cellular dynamics at the systems level. Recent studies have reported correlations between bacterial growth and genome-wide events, such as genome reduction and transcriptome reorganization. Correctly analyzing bacterial growth is crucial for understanding the growth-dependent coordination of gene functions and cellular components. Accordingly, the precise quantitative evaluation of bacterial growth in a high-throughput manner is required. Emerging technological developments offer new experimental tools that allow updates of the methods used for studying bacterial growth. The protocol introduced here employs a microplate reader with a highly optimized experimental procedure for the reproducible and precise evaluation of bacterial growth. This protocol was used to evaluate the growth of several previously described Escherichia coli strains. The main steps of the protocol are as follows: the preparation of a large number of cell stocks in small vials for repeated tests with reproducible results, the use of 96-well plates for high-throughput growth evaluation, and the manual calculation of two major parameters (i.e., maximal growth rate and population density) representing the growth dynamics. In comparison to the traditional colony-forming unit (CFU) assay, which counts the cells that are cultured in glass tubes over time on agar plates, the present method is more efficient and provides more detailed temporal records of growth changes, but has a stricter detection limit at low population densities. In summary, the described method is advantageous for the precise and reproducible high-throughput analysis of bacterial growth, which can be used to draw conceptual conclusions or to make theoretical observations.

Quantitative evaluation of bacterial growth is essential to understanding microbial physiology as a systems-level phenomenon. A protocol for experimental manipulation and an analytical approach are introduced, allowing for precise, high-throughput analysis of bacterial growth, which is a key subject of interest in systems biology.

Analisi precisa, High-throughput di crescita batterica

Bacterial growth is a central concept in the development of modern microbial physiology, as well as in the investigation of cellular dynamics at the ...

Saccharomyces cerevisiae Exponential Growth Kinetics in Batch Culture to Analyze Respiratory and Fermentative Metabolism

Saccharomyces cerevisiae cells in the exponential phase sustain their growth by producing ATP through fermentation and/or mitochondrial respiration. The fermentable carbon concentration mainly governs how the yeast cells generate ATP; thus, the variation in fermentable carbohydrate levels drives the energetic metabolism of S. cerevisiae. This paper describes a high-throughput method based on exponential yeast growth to estimate the effects of concentration changes and nature of the carbon source on respiratory and fermentative metabolism. The growth of S. cerevisiae is measured in a microplate or shaken conical flask by determining the optical density (OD) at 600 nm. Then, a growth curve is built by plotting OD versus time, which allows identification and selection of the exponential phase, and is fitted with the exponential growth equation to obtain kinetic parameters. Low specific growth rates with higher doubling times generally represent a respiratory growth. Conversely, higher specific growth rates with lower doubling times indicate fermentative growth. Threshold values of doubling time and specific growth rate are estimated using well-known respiratory or fermentative conditions, such as non-fermentable carbon sources or higher concentrations of fermentable sugars. This is obtained for each specific strain. Finally, the calculated kinetic parameters are compared with the threshold values to establish whether the yeast shows fermentative and/or respiratory growth. The advantage of this method is its relative simplicity for understanding the effects of a substance/compound on fermentative or respiratory metabolism. It is important to highlight that growth is an intricate and complex biological process; therefore, preliminary data from this method must be corroborated by the quantification of oxygen consumption and accumulation of fermentation byproducts. Thereby, this technique can be used as a preliminary screening of compounds/substances that may disturb or enhance fermentative or respiratory metabolism.

Saccharomyces cerevisiae Exponential Growth Kinetics in Batch Culture to Analyze Respiratory and Fermentative Metabolism

Here we present a protocol to estimate the respiratory and fermentative metabolism by fitting the exponential growth of Saccharomyces cerevisiae to the exponential growth equation. Calculation of the kinetic parameters allows for the screening of influences of substances/compounds on fermentation or mitochondrial respiration.

Saccharomyces cerevisiae Cinetica di crescita esponenziale nella cultura di Batch per analizzare il metabolismo fermentativo e respiratorio

Saccharomyces cerevisiae cells in the exponential phase sustain their growth by producing ATP through fermentation and/or mitochondrial respiration. The ...

ODELAY: Metodo su vasta scala per la quantificazione multiparametrica della crescita del lievito

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Saccharomyces cerevisiae Metabolica etichettatura con 4-tiouracile e la quantificazione di nuova sintesi mRNA come Proxy per attività di RNA polimerasi II

Quantificare cronologica Span lievito Life di conseguenza di cellule invecchiate

Durata pannello misura replicazione in lievito

A Quantitative Analysis Fitness Workflow

Analisi del contenuto delle goccioline lipidi in Fissione e lieviti in forati utilizzando l'elaborazione automatizzata delle immagini

La quantificazione temporale di espressione MAPK indotta in cellule di lievito singole

Saggio di crescita a base Reporter, per l'analisi sistematica di proteine degradazione

Determinazione base alla crescita e conferma biochimica dei requisiti genetici per Protein Degradazione in

Analisi precisa, High-throughput di crescita batterica

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