Presentiamo un protocollo per produrre un gran numero di esosomi di grado GMP da cellule staminali mesenchimali del liquido sinoviale utilizzando il nostro bioreattore 3D. Questi esosomi potrebbero essere utilizzati nella ricerca sulla biologia degli esosomi e nel trattamento clinico dell'artrite. A dimostrare la procedura sarà il Dr.Yujie Liang.
Iniziare a raccogliere le cellule mesenchimali umane, o MSC, centrifugando il liquido sinoviale a 1.500 volte G per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Dopo la centrifugazione, scartare il surnatante e risospendere il pellet cellulare con 10 millilitri di PBS. Centrifugare le cellule risospese a 1.500 volte G per 10 minuti a quattro gradi Celsius e scartare il PBS prima di risospendere il pellet con 10 millilitri di terreno di coltura MSC umano a una densità cellulare di cinque volte 10 alla quarta cella per millilitro e quindi placcare la sospensione in un piatto da 100 millimetri.
Incubare il piatto a 37 gradi Celsius in un'atmosfera contenente il 5% di anidride carbonica. Dopo due settimane, raccogliere il surnatante di coltura cellulare per identificare le cellule staminali mesenchimali del liquido sinoviale, o SF-MSC, utilizzando la citometria a flusso. Per fare ciò, digerire il passaggio di terza generazione tre di SF-MSC mediante centrifugazione a 1.000 volte G per cinque minuti a quattro gradi Celsius.
Quindi, scartare il surnatante prima di raccogliere il pellet cellulare. Quindi, aggiungere 400 microlitri del tampone bloccante al pellet cellulare alla concentrazione di cinque volte 10 al quarto e lasciare riposare il pellet per 15 minuti a temperatura ambiente. Dopo 15 minuti, centrifugare la sospensione cellulare come descritto in precedenza, quindi risospendere il pellet separato in 100 microlitri di 1X PBS.
Aggiungere un microlitro di anticorpo monoclonale fluorescente con un rapporto di diluizione di 1:100 per provetta, come descritto nel manoscritto, e porre la provetta per l'incubazione a temperatura ambiente per 30 minuti. Dopo l'incubazione, lavare le cellule due volte con 1X PBS e risospendere le cellule in 100 microlitri di 1X PBS. Quindi, rilevare i fluorofori in un massimo di 10.000 cellule su un citometro a flusso utilizzando canali rossi e FITC.
Per preparare i microcarrier, gonfiare e idratare 0,75 grammi di microcarrier in 1X DPBS alla concentrazione di 50 milligrammi per grammo per almeno tre ore a temperatura ambiente. Quindi, decantare il surnatante per lavare i microcarrier in DPBS fresco per cinque minuti. Dopo aver sostituito il mezzo con DPBS 1X fresco a 50 milligrammi di microcarrier per grammo, sterilizzare i microcarrier in autoclave a 121 gradi Celsius per 15 minuti a 15 libbre per pollice quadrato.
Quindi, lasciare che i microvettori sterilizzati si depositino prima di decantare il surnatante. Risciacquare i microcarrier nel terreno di coltura alla concentrazione di 50 milligrammi di microcarrier per grammo a temperatura ambiente. Quando i microcarrier sono sistemati, scartare il surnatante.
Per preparare il bioreattore di perfusione, sterilizzare il bioreattore in autoclave come descritto in precedenza. Al termine, contare il numero di SF-MSC da allocare 2,5 volte 10 al settimo SF-MSC e microcarrier al bioreattore perfuso con 250 millilitri del terreno di coltura MSC di grado GMP. Posizionare il bioreattore in un incubatore con il 5% di anidride carbonica a 37 gradi Celsius ad una velocità di 15 rotazioni al minuto.
Cambiare il terreno di coltura ogni sei giorni. Dopo 14 giorni, raccogliere i supernatanti e i microcarrier della coltura cellulare per ulteriori analisi. Centrifugare il surnatante di coltura cellulare a 300 volte G per 10 minuti a quattro gradi Celsius e raccogliere il surnatante mentre si scartano i detriti cellulari.
A quattro gradi Celsius, centrifugare sequenzialmente il surnatante a 2.000 volte G per 10 minuti e poi a 10.000 volte G per 30 minuti per scartare le vescicole più grandi e raccogliere il pellet. Dopo aver risospeso il pellet in 40 millilitri di PBS, centrifugare la sospensione cellulare a 120.000 volte G per 70 minuti a quattro gradi Celsius. Quindi, risospendere il pellet raccolto contenente esosomi in 500 microlitri di PBS.
Diluire i campioni di esosomi appena isolati con PBS sterile alla concentrazione da 10 alla settima a 10 alla nona particella per millilitro e iniettare 500 microlitri del campione per ogni corsa nell'analisi di tracciamento delle nanoparticelle, o sistema NTA, a 30 microlitri al minuto e da 24,4 a 24,5 gradi Celsius. Impostare manualmente il sistema di acquisizione e analisi in base al protocollo del produttore. Visualizza le particelle mediante diffusione della luce laser e cattura il loro movimento browniano su video digitali.
Successivamente, analizza le videocassette registrate utilizzando il software, tracciando almeno 200 singole particelle per esecuzione. Per il Western blotting, aggiungere 300 microlitri del tampone di lisi e del cocktail di inibitori della proteasi agli esosomi con miscelazione mediante pipettaggio su e giù. Quindi, lasciare riposare sul ghiaccio per 20 minuti.
Dopo la centrifugazione della miscela a 9.391 volte G per 10 minuti a quattro gradi Celsius, misurare la concentrazione proteica nel surnatante utilizzando un kit di analisi delle proteine. Dopo il test, riscaldare il campione con 100 microlitri di tampone di carico proteico 4X a 100 gradi Celsius per 10 minuti. Quindi, caricare 15 microlitri di proteine a una concentrazione di 10 milligrammi per millilitro per eseguire l'elettroforesi su gel a 120 volt per 70 minuti e l'elettroblotting a 100 volt per 60 minuti a quattro gradi Celsius.
Rilevare i marcatori specifici non esosomi, come la calnexina e i biomarcatori esosomici come CD9, CD63 e CD81 mediante Western blotting fluorescente. Nello studio, la citometria a flusso è stata utilizzata per identificare i marcatori di superficie delle SF-MSC. L'analisi della citometria a flusso ha rivelato che le SF-MSC coltivate erano negative per CD34, CD45 e HLA-DR e positive per CD73, CD90 e CD105, soddisfacendo i criteri di identificazione delle MSC.
Sotto microscopia invertita, è stato notato che le SF-MSC proliferano su microcarrier. L'SF-MSC ha proliferato nella cultura 3D più rapidamente da sei giorni in poi rispetto alla cultura 2D. Gli esosomi delle SF-MSC di coltura 2D e 3D sono stati identificati utilizzando Western blotting e gli esosomi sono risultati esprimere CD63, CD9 e CD81 pur essendo negativi per la calnessina.
L'analisi dei nanociti ha dimostrato che il diametro degli esosomi 2D e 3D era di circa 120 nanometri. L'analisi microscopica elettronica a trasmissione ha rivelato la morfologia degli esosomi 2D e 3D, mostrando vescicole approssimativamente sferoidali. Utilizzando l'analisi NTA, è stata analizzata la concentrazione di particelle di dimensioni da 30 a 160 nanometri.
Dopo la coltura 3D, la concentrazione di particelle era 4,0 volte 10 al sei per millilitro. Tuttavia, dopo la coltura 2D, la concentrazione di particelle delle stesse dimensioni era 2,5 volte 10 per sei per millilitro. Inoltre, la coltura 3D ha prodotto più proteine esosomiche rispetto alla coltura 2D.
L'analisi rappresentativa mostra l'internalizzazione degli esosomi marcati con Dil da parte dei condrociti primari. Gli esosomi marcati con Dil entrati nei condrociti primari possono essere visti con un picco a tre ore. Lo studio di somministrazione in vitro ha dimostrato che gli esosomi potrebbero fornire microRNA-140 marcati con sulfo-cianina3 ai condrociti.
Placcare le cellule, avviare la reazione nel bioreattore e il surnatante sono i passi più importanti di questo protocollo. La coltura 3D è comunemente usata per la coltura su larga scala di cellule aderenti. Altri metodi come lo spin flex possono anche essere utilizzati per la produzione su larga scala di esosomi.
Il nostro metodo migliora la resa degli esosomi, consentendo così l'applicazione preclinica basata sugli esosomi MSC.
