Ringraziamo FortéBio per fornire grafica utilizzata in Figura 1. Questo lavoro è stato sostenuto da NIH concedere GM083088 a TMD

<html> 1. Programmare lo strumento per la BLI Assay Accendere lo strumento almeno un&#39;ora di anticipo per permettere alla lampada di riscaldarsi, questo è necessario per minimizzare il rumore e la deriva in segnale ottico durante l&#39;esperimento. Impostare la temperatura desiderata tramite la scheda strumento per preriscaldare il supporto piastra del campione. Quindi impostare il disegno sperimentale nel software di acquisizione dati. Selezionare &quot;Nuovo Kinetics Experiment&quot; nella scheda Wizard Experiment. Questo presenta un menu a schede con tutti i passi che devono essere definiti. 1.1. Definizione Piatto Definire le colonne da utilizzare sul piatto del campione a 96 pozzetti. Assegnare colonne per contenere tampone, proteina immobilizzata o partner di legame. Per ogni associazione bene, immettere la concentrazione di partner di legame da utilizzare. Nota: la definizione piastra mostrata nella figura 2 ha opzioni per saggi distinti. 1.2. Assay Definizione ONTENUTO &quot;&gt; Definisci tutti i passi necessari per il saggio., tra cui (i) Baseline (vari), (ii) Caricare, (iii) di associazione e (iv) dissociazione dei partner di legame. Poi, come descritto di seguito, collegare i singoli passaggi del test con colonne di pozzetti sulla piastra del campione selezionando la fase di test e quindi fare doppio clic sulla rispettiva colonna. Questo programma i sensori devono essere spostati da una colonna di pozzi a quella successiva durante il dosaggio. <ol><li> Baseline Iniziare con una breve fase basale (≥ 60 sec), con sensori in tampone di saggio (Figura 2, colonna 1), stabilire segnali BLI iniziali nella piastra a 96 pozzetti. </li><li> Loading (immobilizzare la proteina biotinilato sui sensori) Assegnare sensori per pozzetti che conterranno la proteina biotinilato (Figura 2, colonna 2). Utilizzare la funzione di soglia per raggiungere un livello predeterminato di legame (vedi introduzione). Impostare l&#39;opzione di soglia in modo che tutti i sensori saranno mossad alla colonna successiva di pozzi quando uno qualsiasi dei sensori raggiunge la soglia. </li><li> Baseline Includere un altro passo basale in tampone (figura 2, colonna 3, in genere&gt; 5 min) per lavare via le proteine ​​biotinilate nonimmobilized dai sensori e stabilire nuovi segnali di base stabili,. Per base saggi di legame / dissociazione solo (come in figura 3), comprende un passaggio aggiuntivo basale (60 sec) con sensori a nuovi pozzi di tampone (Figura 2, colonna 4) prima della fase di associazione. </li><li> Association (del partner di legame alla proteina immobilizzata) Per una dissociazione saggio base legante / (come in figura 3), selezionare un intervallo di concentrazioni di partner di legame da utilizzare per diversi sensori / pozzetti (Figura 2, colonna 5). Regolare il tempo di passaggio in modo che almeno una concentrazione di saturazione del partner di legame deve avvicinarsi segnale vincolante equilibrio. Per unsaggio per testare effetti allosterici di piccoli ligandi sulla dissociazione del complesso proteina-proteina (come in Figura 5), per selezionare una singola concentrazione di partner di legame (~ 10 volte superiori alle stime K D) per l&#39;utilizzo in tutti i pozzetti di associazione. </li><li> Dissociazione (del partner di legame) Per una dissociazione saggio di base legante / solo (come nella figura 3), designa i sensori per tornare alla colonna 4 (Figura 2), gli stessi pozzetti tampone quale usato per la linea di base supplementare prima Association. Per un saggio per testare effetti allosterici di piccoli ligandi, invece designare sensori per spostarsi colonna 6 (figura 2), in cui ciascun pozzetto può contenere tampone più diversi ligandi allosterici. </li></ol> 1.3. Assegnazione del sensore Indicare le posizioni nel cassetto sensore che conterrà i sensori prewetted per il saggio. Identificare eventuali posizioni vuote in quanto l&#39;esperimento FAIl se non sensori sono raccolti. 1.4. Recensione Experiment Visualizza tutti i passi previsti per verificare gli errori e tornare a correggerli. 1.5. Eseguire Experiment Inserire i dettagli necessari, compresa l&#39;ubicazione dei file di dati. Immettere la temperatura desiderata per l&#39;esperimento. Se sensori richiedono ancora prewetting, selezionare l&#39;opzione di ritardare di iniziare l&#39;esperimento. Infine, una volta tutta la preparazione del campione è completa (fase 2) e sia il piatto del campione e il vassoio del sensore vengono caricati nello strumento, fare clic sul pulsante Vai per eseguire il test. 2. Preparazione del campione <ol><li> Preparare un tampone appropriato. Buffer utilizzato per esperimenti mostrati nelle figure 3 e 5: MOPS 20 mm (3 - (N-morfolino) acido propanosulfonico), Tris (Tris (idrossimetil) ammino-metano) (aggiunti per aggiustare il pH a 8,0), 50 mM KCl. Includi BSA (albumina sierica bovina, acidi grassi liberi, 0.5mg / ml finale) nel tampone per tutte le fasi del test e per tutte le diluizioni della proteina biotinilato o partner di legame per minimizzare il legame non specifico di proteine ​​ai sensori. </li><li> Diluire la proteina biotinilato (ε) in tampone a una concentrazione adeguata (vedi introduzione). </li><li> Preparare diluizioni del partner di legame (F 1 (-ε)) in tampone di saggio (vedi Consigli per il range di concentrazioni da utilizzare). </li><li> Prewet sensori rivestite di streptavidina per almeno 10 minuti per rimuovere il loro rivestimento protettivo saccarosio. Rimuovere il rack sensore contenente dal vassoio sensore e inserire una piastra a 96 pozzetti a fondo del cassetto, scorrevole un angolo del piatto nella tacca di orientamento sul vassoio. Da utilizzare per la colonna di sensori, aggiungere 200 ml di tampone di saggio per pozzetto in quella colonna della piastra a 96 pozzetti. Ritorno il rack di sensori per il vassoio con l&#39;orientamento corretto (con le schede negli slot). </li><li> Come assegnato durante la programmazione nella Fase 1, riempire pozzi of piatto del campione con tampone di saggio o le diluizioni appropriate proteine, come in Figura 2. Evitare l&#39;introduzione di bolle, in quanto possono causare rumore nel segnale ottico. Includere uno o più pozzi di riferimento che omettono (i) di proteine ​​biotinilato o (ii) partner di legame. </li><li> Aprire lo sportello dello strumento e inserire il vassoio sensore sul palco (a sinistra), con le schede del vassoio inseriti nelle fessure del palcoscenico. Inserire la piastra del campione nel supporto piastra (a destra), fare in modo che la piastra è seduto piatta e con l&#39;orientamento corretto, come indicato sul porta targa. Chiudere la porta e avviare il test dal programma di acquisizione dati (fase 1.5). </li></ol> 3. Elaborazione dati <ol><li> Dopo che il test è stato eseguito, aprire il software di analisi dei dati e caricare la cartella contenente i dati. Fare clic sulla scheda &quot;Processing&quot; per visualizzare un menu graduale Processing (a sinistra) e dati cinetici prime, con ogni sensore (AH) assegnato un colore diverso (vediFigura 3). </li><li> In &quot;Selezione dati&quot;, fare clic sul pulsante &quot;Selezione sensore&quot;. Sul &quot;Map Sample Piatto&quot;, designa i pozzetti per 1 o 2 sensori di controllo (G, H in analisi della figura 3) come pozzi di riferimento. Dal menu Processing, selezionare la casella &quot;sottrazione&quot; e selezionare &quot;Reference Wells&quot; per sottrarre segnale di riferimento (singolo o media) dal segnale di ogni altro sensore. </li><li> Allineare tutte le tracce di Y = 0 tramite il passo &quot;Allinea asse Y&quot;. Selezionare &quot;Baseline&quot;, come il passo di allineamento (questa è l&#39;ultima linea di base prima della fase Association). Per &quot;Intervallo di tempo&quot;, inserire gli ultimi 10 secondi di quella basale (cioè 50-60 sec per 60 sec di base, come nella figura 3). </li><li> Seleziona la casella &quot;Inter-step di correzione&quot; per ridurre al minimo i turni di segnale tra le fasi associazione e dissociazione. Selezionare adeguamento alla Baseline o dissociazione. </li><li> Selezionare la funzione di filtraggio Savitzky-Golay nella maggior parte dei casi e fare clic su &quot;dati di processo!&quot; per procedere. Ispezionarei dati definitivi elaborati (in basso pannello di destra). Con saggi destinati ad analisi di dati globale (come in figura 4), ​​se le tracce di segnale mostrano un significativo spostamento tra associazione e di dissociazione passi, modificare la selezione di dissociazione o Baseline per la &quot;correzione Inter-passo&quot; e rielaborare i dati prima di procedere al Data Analisi. </li></ol> 4. Analisi dei dati Fare clic sulla scheda &quot;Analisi&quot; in Analisi dei dati per iniziare. Nota: l&#39;esempio di seguito sono i passaggi per l&#39;analisi globale di molteplici curve di legame / dissociazione (come nella figura 3). <ol><li> Per &quot;Passo a Analizza&quot;, scegli associazione e dissociazione. Per il &quot;Modello&quot;, selezionare 1:1. Nota: sono disponibili altre opzioni limitate. </li><li> Per il &quot;Lato&quot;, scegli Globale (Full). Per il &quot;Raggruppamento&quot;, selezionare colore (come sul grafico). Selezionare &quot;R max disgiunta da sensore&quot; per consentire il montaggio indipendente di R max (risposta del segnale massimo su saturando vincolante della partner alla proteina immobilizzata). Nota: lo facciamo per la maggior parte dei saggi, come sensori variano leggermente la quantità di proteina immobilizzata (vedi figura 3, Loading). </li><li> Sul tavolo dimostrato, assicurarsi che tutte le tracce di sensori da analizzare hanno lo stesso colore, in modo che saranno analizzati come un insieme globale. Se necessario, selezionare uno o più sensori tracce di omettere dal raccordo globale: sotto la colonna &quot;Include&quot;, fare clic destro sulla posizione del sensore desiderata e selezionare &quot;Escludi Wells&quot;. </li><li> Fare clic su &quot;Curve Fit!&quot; per avviare l&#39;analisi di regressione non lineare. Esaminare i risultati di montaggio, tra cui (i) sovrapposizione delle curve di regressione con dati tracce dei sensori (come in figura 4), ​​(ii) appezzamenti di residui di montaggio, e (iii) una tabella con i valori dei parametri determinati (costanti di velocità, R max, K D) e le statistiche (errori standard per i parametri, Chi-quadrato, R 2). </li><li> In &quot;Esporta dati&quot;, salvare i risultati montaggio facendo clic su &quot;Esporta tabella di. Csv File&quot;. Per grapHing o ulteriori analisi dei dati / curve a muro con altri software, fare clic su &quot;Esporta Montaggio risultati&quot; per salvare i dati di ogni sensore e la curva montato in un file di testo. </li></ol>

<ol>
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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+plasmid+expression+vector+for+the+production+of+biotinylated+proteins+by+site-specific,+enzymatic+modification+in+Escherichia+coli.">A versatile plasmid expression vector for the production of biotinylated proteins by site-specific, enzymatic modification in Escherichia coli.</a> Gene. 169, 59-64 (1996).</li><li>Dayne, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BioLayer+Interferometry+(BLI)+-+How+Does+it+Work?.">BioLayer Interferometry (BLI) - How Does it Work?.</a> Fort&#233;Bio newsletter In Interactions. 5, 8-9 (2012).</li><li>Wartchow, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosensor-based+small+molecule+fragment+screening+with+biolayer+interferometry.">Biosensor-based small molecule fragment screening with biolayer interferometry.</a> J. Comput. Aided Mol. Des. 25, 669-676 (2011).</li><li>Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+kinetics+and+affinities+of+protein+interactions+using+a+parallel+real-time+label-free+biosensor,+the+Octet.">Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet.</a> Anal. Biochem. 377, 209-217 (2008).</li></ol>

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Strumenti attualmente disponibili per BLI permettono di throughput e di flessibilità nella saggi per interazioni biomolecolari. Vari campioni di soluzione vengono dispensati in pozzetti della micropiastra nero, e una serie di sensori BLI parallele sono programmati per muoversi avanti e indietro tra colonne di pozzetti sulla piastra. I campioni vengono mescolati agitando orbitale durante tutta la seduta. Il sistema utilizzato qui ha 8 sensori e utilizza una piastra campione di 96-bene, ma un altro sistema utilizza 16 se...

Interazioni proteina-proteina sono importanti per molti processi biologici e metodi ottici label-free come Surface Plasmon Resonance (SPR) sono stati utilizzati in vitro per studiare la cinetica di legame e di dissociazione 1. La maggior parte dei metodi di label-free immobilizzare uno biomolecole su una superficie del sensore e utilizzare un segnale ottico per rilevare un partner di legame dalla soluzione in quanto si associa con la biomolecola immobilizzata 1. Mentre SPR è un metodo altamente sensibile, è soggetta a interferenze dovute a variazioni dell&#39;indice di rifrazione della soluzione scorre sopra il sensore 2. Anche se non è così sensibile come SPR, Bio-strato Interferometria (BLI) è meno influenzata dai cambiamenti nella composizione del campione 1,3. BLI utilizza biosensori in fibra ottica che hanno un rivestimento biocompatibile proprietaria alla punta. Il sistema utilizzato here (Octet-RED96) contiene otto spettrofotometri. La luce bianca viene convogliata ad una fila di sonde che si muovono su un braccio robotico. Sensori in fibra ottica are raccolto dalle sonde e spostata in una piastra a 96 pozzetti contenenti campioni. Una delle molecole bersaglio è immobilizzato sulla superficie del biosensore. Poi sensori vengono spostati pozzetti contenenti il ​​partner di legame in soluzione. BLI monitora associazione del partner di legame con la molecola immobilizzata, quindi controlla dissociazione dopo aver spostato i sensori di soluzione senza il partner di legame. Il legame di molecole di superficie biosensore comportano modifiche interferenza ottica tra le onde luminose che riflettono indietro ai spettrofotometri da una superficie interna e dall&#39;interfaccia esterna tra il sensore e la soluzione. Questi cambiamenti di interferenza possono essere quantificate e utilizzati per determinare i tassi cinetiche di legame e di dissociazione, come riassunto nell&#39;animazione della figura 1. Abbiamo applicato BLI per misurare le interazioni tra il complesso catalitico di ATP sintasi batterica e la sua subunità ε, che può auto-inibire l&#39;enzima. ATP synthase è un nanomotor rotativo membrana integrato che catalizza la sintesi e idrolisi di ATP 4. Il complesso catalitico (F 1) può essere isolato in forma solubile che funziona come un ATPasi. Subunità ε ha due domini: il dominio N-terminale (NTD) è necessaria per il corretto montaggio e l&#39;accoppiamento funzionale dell&#39;enzima, ma non interagire direttamente con le subunità catalitiche, il dominio C-terminale (CTD) in grado di inibire l&#39;enzima interagendo con più subunità catalitiche 5,6. Questo regolamento ε-mediata è specifico per ATP sintasi batteriche e non è osservata nel omologo mitocondriale. ATP sintasi è emerso come un bersaglio per farmaci antibatterici, come dimostrato dalla recente approvazione della FDA di bedaquiline per il trattamento della tubercolosi farmaco-resistente 7. Così, il targeting ruolo inibitorio di ε per la scoperta della droga potrebbe produrre antibatterici che non inibiscono la mitocondriale ATP sintasi. Con l&#39;isolato complesso catalitico (F 1), εdiventa una subunità dissociabile. Tuttavia, con ε vincolato a F 1, il εCTD può subire un drastico cambiamento conformazionale, parzialmente inserito nella cavità centrale dell&#39;enzima e formando uno stato inibitorio che difficilmente dissociare direttamente 6,8. Usiamo BLI per misurare cinetica di F 1 / ε associazione e la dissociazione e, indirettamente, per esaminare gli effetti allosterici di catalizzatore sito ligandi sulla conformazione di ε. Nel nostro sistema, ε è stato scelto per l&#39;immobilizzazione sulla superficie del sensore dal segnale BLI (come SPR) è sensibile alla massa dei leganti in superficie molecole. La subunità ε è piccolo (~ 15 kDa) rispetto alla principale F 1 complesso (~ 347 kDa). Così, un segnale BLI più grande sarà il risultato di legame di F 1 a ε immobilizzato. Per monitorare F 1 dissociazione, che può essere molto lento, ε deve essere fortemente immobilizzato. Così abbiamo scelto di biotinylateE immobilizzarlo sul biosensori rivestite di streptavidina. Le proteine ​​possono essere biotinilati (i) modifica casuale di lisine superficie 9, (ii) reazione di un unico cisteina nativa o attrezzata con biotina-maleimmide reagente 10 o (iii) geneticamente aggiungendo uno specifico peptide biotina-accettore che viene enzimaticamente biotinilato durante espressione in vivo della proteina marcata 11. Nel nostro sistema, ε è biotinilato utilizzando il metodo (iii) 8. Una volta ε biotina-tag è immobilizzato su sensori streptavidina, BLI può misurare l&#39;associazione e dissociazione di F 1, che è stato impoverito di subunità ε (F 1 (-ε)). Per gli esperimenti qui descritti, saggi preliminari sono stati condotti per determinare ragionevole quantità di proteina biotinilato per immobilizzare sui sensori. Questo può variare, a seconda del peso molecolare della proteina e il suo partner di legame, ma l&#39;obiettivo è quello di determinare una quantità minima di proteina immobilizzata tcappello prevede (i) accettabile segnale-rumore per il legame cinetica con una bassa concentrazione del partner di legame (di seguito K D) e (ii) una distorsione minima di cinetica di legame con concentrazione quasi saturazione del partner di legame. Inoltre, stechiometria biotinilazione può variare (ma evitare&gt; 1 mol biotina / proteine ​​mol), per cui alcuni dosaggio iniziale può essere necessario per ogni nuovo lotto di proteine ​​biotinilato per confermare che un segnale coerente BLI può essere raggiunto durante l&#39;immobilizzazione sulla streptavidina-rivestito sensori.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="610">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Octet-RED96</td>
			<td style="width:108px;">Pall/Fort&#233;Bio</td>
			<td style="width:119px;">30-5048</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A6003-10G</td>
			<td>Fatty Acid free</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Biosensor/Streptavidin</td>
			<td style="width:108px;">Pall/Fort&#233;Bio</td>
			<td style="width:119px;">18-5019</td>
			<td>Tray of 96 sensors</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:216px;">Microtiter plate</td>
			<td style="width:108px;">Greiner Bio-one</td>
			<td style="width:119px;">655209</td>
			<td>Black, Polypropylene</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Data Acquisition software</td>
			<td style="width:108px;">Pall/Fort&#233;Bio</td>
			<td style="width:119px;">Version 6.4</td>
			<td>Newer versions available</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Data Analysis software</td>
			<td style="width:108px;">Pall/Fort&#233;Bio</td>
			<td style="width:119px;">Version 6.4</td>
			<td>Newer versions available</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bio-layer interferometry for measuring kinetics of protein-protein interactions and allosteric ligand effects

Descriviamo l&#39;uso di Bio-strato interferometria per studiare le interazioni inibitorie della subunità ε con il complesso catalitico di Escherichia coli ATP sintasi. Batterica di tipo F ATP sintasi è l&#39;obiettivo di un nuovo antibiotico approvato dalla FDA per combattere la tubercolosi resistente ai farmaci. Capire specifici batteri-auto-inibizione della ATP sintasi dal dominio C-terminale della subunità ε potrebbe fornire un nuovo mezzo per indirizzare l&#39;enzima per la scoperta di farmaci antibatterici. Il dominio C-terminale di ε subisce un drastico cambiamento conformazionale quando le transizioni tra gli stati di enzimi attivi e inattivi, e ligandi catalitica-portale possono influenzare quale delle conformazioni di ε è predominante. Le cinetiche di saggio misura di ε legante / dissociazione con il complesso catalitico, e indirettamente meaSures lo spostamento di ε enzima legato alla e dalla conformazione inibitorio apparentemente nondissociable. Il segnale interferometria Bio-strato non è eccessivamente sensibili composizione della soluzione, in modo che possa essere utilizzato anche per monitorare gli effetti dei ligandi allosterici catalitica-portale sulle variazioni conformazionali di ε.

Vincolante in tempo reale e la cinetica di dissociazione BLI sono mostrato in Figura 3. Questo esperimento è stato fatto con tampone di saggio in associazione e di dissociazione. Questo esperimento è stato avviato con una fase basale 10 min poiché i sensori sono stati prewet solo brevemente. Successivamente, ε biotinilato è stato caricato sui sensori. Nessuna dissociazione rilevabile di ε si è verificato in tutti i passaggi rimanenti come si è visto dalla curva di riferimento (G) che non aveva p...

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Bio-layer Interferometry for Measuring Kinetics of Protein-protein Interactions and Allosteric Ligand Effects

I protocolli che seguono descrivono saggi cinetici di interazioni proteina-proteina con Bio-strato Interferometria. F-tipo ATP sintasi, che è coinvolto nel metabolismo energetico cellulare, può essere inibita dalla sua subunità ε nei batteri. Abbiamo adattato Bio-strato interferometria per studiare le interazioni del complesso catalitico con il dominio C-terminale inibitorio di ε.

Bio-strato Interferometria per Cinetica di interazioni proteina-proteina e allosterici effetti Ligand di misura

We describe the use of Bio-layer Interferometry to study inhibitory interactions of subunit &#949;&#160;with the catalytic complex of Escherichia ...

bio-layer-interferometry-for-measuring-kinetics-protein-protein

Research

JoVE Journal

Chemistry

28.7K Views.  SUNY Upstate Medical University.  I protocolli che seguono descrivono saggi cinetici di interazioni proteina-proteina con Bio-strato Interferometria. F-tipo ATP sintasi, che è coinvolto nel metabolismo energetico cellulare, può essere inibita dalla sua subunità ε nei batteri. Abbiamo adattato Bio-strato interferometria per studiare le interazioni del complesso catalitico con il dominio C-terminale inibitorio di ε. 

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A Simple and Rapid Protocol for Measuring Neutral Lipids in Algal Cells Using Fluorescence

Algae are considered excellent candidates for renewable fuel sources due to their natural lipid storage capabilities. Robust monitoring of algal fermentation processes and screening for new oil-rich strains requires a fast and reliable protocol for determination of intracellular lipid content. Current practices rely largely on gravimetric methods to determine oil content, techniques developed decades ago that are time consuming and require large sample volumes. In this paper, Nile Red, a fluorescent dye that has been used to identify the presence of lipid bodies in numerous types of organisms, is incorporated into a simple, fast, and reliable protocol for measuring the neutral lipid content of Auxenochlorella protothecoides, a green alga. The method uses ethanol, a relatively mild solvent, to permeabilize the cell membrane before staining and a 96 well micro-plate to increase sample capacity during fluorescence intensity measurements. It has been designed with the specific application of monitoring bioprocess performance. Previously dried samples or live samples from a growing culture can be used in the assay.

A simple protocol to determine the neutral lipid content of algal cells using a Nile Red staining procedure is described. This time-saving technique offers an alternative to traditional gravimetric-based lipid quantification protocols. It has been designed for the specific application of monitoring bioprocess performance.

Una semplice e rapida il protocollo per la misurazione lipidi neutri in cellule algali Uso fluorescenza

Algae are considered excellent candidates for renewable fuel sources due to their natural lipid storage capabilities. Robust monitoring of algal ...

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Quantitative and Qualitative Examination of Particle-particle Interactions Using Colloidal Probe Nanoscopy

Colloidal Probe Nanoscopy (CPN), the study of the nano-scale interactive forces between a specifically prepared colloidal probe and any chosen substrate using the Atomic Force Microscope (AFM), can provide key insights into physical interactions present within colloidal systems. Colloidal systems are widely existent in several applications including, pharmaceuticals, foods, paints, paper, soil and minerals, detergents, printing and much more.1-3 Furthermore, colloids can exist in many states such as emulsions, foams and suspensions. Using colloidal probe nanoscopy one can obtain key information on the adhesive properties, binding energies and even gain insight into the physical stability and coagulation kinetics of the colloids present within. Additionally, colloidal probe nanoscopy can be used with biological cells to aid in drug discovery and formulation development. In this paper we describe a method for conducting colloidal probe nanoscopy, discuss key factors that are important to consider during the measurement, and show that both quantitative and qualitative data that can be obtained from such measurements.

Colloidal probe nanoscopy can be used within a variety of fields to gain insight into the physical stability and coagulation kinetics of colloidal systems and aid in drug discovery and formulation sciences using biological systems. The method described within provides a quantitative and qualitative means to study such systems.

Esame quantitativa e qualitativa delle interazioni particella-particella colloidale Uso Probe Nanoscopia

Colloidal Probe Nanoscopy (CPN), the study of the nano-scale interactive forces between a specifically prepared colloidal probe and any chosen substrate ...

An ELISA Based Binding and Competition Method to Rapidly Determine Ligand-receptor Interactions

A comprehensive understanding of signaling pathways requires detailed knowledge regarding ligand-receptor interaction. This article describes two fast and reliable point-by-point protocols of enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) for the investigation of ligand-receptor interactions: the direct ligand-receptor interaction assay (LRA) and the competition LRA. As a case study, the ELISA based analysis of the interaction between different lambda interferons (IFNLs) and the alpha subunit of their receptor (IL28RA) is presented: the direct LRA is used for the determination of dissociation constants (KD values) between receptor and IFN ligands, and the competition LRA for the determination of the inhibitory capacity of an oligopeptide, which was designed to compete with the IFNLs at their receptor binding site. Analytical steps to estimate KD and half maximal inhibitory concentration (IC50) values are described. Finally, the discussion highlights advantages and disadvantages of the presented method and how the results enable a better molecular understanding of ligand-receptor interactions.

The presented protocols describe two enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) based techniques for the rapid investigation of ligand-receptor interactions: The first assay allows the determination of dissociation constant between ligand and receptor. The second assay enables a rapid screening of blocking peptides for ligand-receptor interactions.

Un ELISA Based rilegatura e metodo concorrenza di determinare con rapidità interazioni ligando-recettore

A comprehensive understanding of signaling pathways requires detailed knowledge regarding ligand-receptor interaction. This article describes two fast and ...

Synthesis of Ligand-free CdS Nanoparticles within a Sulfur Copolymer Matrix

Aliphatic ligands are typically used during the synthesis of nanoparticles to help mediate their growth in addition to operating as high-temperature solvents. These coordinating ligands help solubilize and stabilize the nanoparticles while in solution, and can influence the resulting size and reactivity of the nanoparticles during their formation. Despite the ubiquity of using ligands during synthesis, the presence of aliphatic ligands on the nanoparticle surface can result in a number of problems during the end use of the nanoparticles, necessitating further ligand stripping or ligand exchange procedures. We have developed a way to synthesize cadmium sulfide (CdS) nanoparticles using a unique sulfur copolymer. This sulfur copolymer is primarily composed of elemental sulfur, which is a cheap and abundant material. The sulfur copolymer has the advantages of operating both as a high temperature solvent and as a sulfur source, which can react with a cadmium precursor during nanoparticle synthesis, resulting in the generation of ligand free CdS. During the reaction, only some of the copolymer is consumed to produce CdS, while the rest remains in the polymeric state, thereby producing a nanocomposite material. Once the reaction is finished, the copolymer stabilizes the nanoparticles within a solid polymeric matrix. The copolymer can then be removed before the nanoparticles are used, which produces nanoparticles that do not have organic coordinating ligands. This nascent synthesis technique presents a method to produce metal-sulfide nanoparticles for a wide variety of applications where the presence of organic ligands is not desired.

Herein we present a method to synthesize ligand-free cadmium sulfide (CdS) nanoparticles based on a unique sulfur copolymer. The sulfur copolymer operates as a high temperature solvent and a sulfur source during the nanoparticle synthesis and stabilizes the nanoparticles after the reaction.

Sintesi di CdS nanoparticelle libera-ligando all&#39;interno di una matrice zolfo Copolimero

Aliphatic ligands are typically used during the synthesis of nanoparticles to help mediate their growth in addition to operating as high-temperature ...

Site Directed Spin Labeling and EPR Spectroscopic Studies of Pentameric Ligand-Gated Ion Channels

Ion channel gating is a stimulus-driven orchestration of protein motions that leads to transitions between closed, open, and desensitized states. Fundamental to these transitions is the intrinsic flexibility of the protein, which is critically modulated by membrane lipid-composition. To better understand the structural basis of channel function, it is necessary to study protein dynamics in a physiological membrane environment. Electron Paramagnetic Resonance (EPR) spectroscopy is an important tool to characterize conformational transitions between functional states. In comparison to NMR and X-ray crystallography, the information obtained from EPR is intrinsically of lower resolution. However, unlike in other techniques, in EPR there is no upper-limit to the molecular weight of the protein, the sample requirements are significantly lower, and more importantly the protein is not constrained by the crystal lattice forces. Therefore, EPR is uniquely suited for studying large protein complexes and proteins in reconstituted systems. In this article, we will discuss general protocols for site-directed spin labeling and membrane reconstitution using a prokaryotic proton-gated pentameric Ligand-Gated Ion Channel (pLGIC) from Gloeobacter violaceus (GLIC) as an example. A combination of steady-state Continuous Wave (CW) and Pulsed (Double Electron Electron Resonance-DEER) EPR approaches will be described that will enable a complete quantitative characterization of channel dynamics.

This article describes methods for site-directed spin labeling and reconstitution of pentameric ligand-gated channels for Electron Paramagnetic Resonance studies. This protocol can be adapted for any membrane protein. The reconstitution method described here can also be used for patch-clamp measurements of macroscopic and single-channel currents in a defined lipid system.

Sito-Labeling Spin e EPR spettroscopiche Studi di canali pentamerica ligando-dipendenti Ion

Ion channel gating is a stimulus-driven orchestration of protein motions that leads to transitions between closed, open, and desensitized states. ...

Sulfate Separation by Selective Crystallization with a Bis-iminoguanidinium Ligand

A simple and effective method for selective sulfate separation from aqueous solutions by crystallization with a bis-guanidinium ligand, 1,4-benzene-bis(iminoguanidinium) (BBIG), is demonstrated. The ligand is synthesized as the chloride salt (BBIG-Cl) by in situ imine condensation of terephthalaldehyde with aminoguanidinium chloride in water, followed by crystallization as the sulfate salt (BBIG-SO4). Alternatively, BBIG-Cl is synthesized ex situ in larger scale from ethanol. The sulfate separation ability of the BBIG ligand is demonstrated by selective and quantitative crystallization of sulfate from seawater. The ligand can be recycled by neutralization of BBIG-SO4 with aqueous NaOH and crystallization of the neutral bis-iminoguanidine, which can be converted back into BBIG-Cl with aqueous HCl and reused in another separation cycle. Finally, 35S-labeled sulfate and &#946; liquid scintillation counting are employed for monitoring the sulfate concentration in solution. Overall, this protocol will instruct the user in the necessary skills to synthesize a ligand, employ it in the selective crystallization of sulfate from aqueous solutions, and quantify the separation efficiency.

A protocol for in situ aqueous synthesis of a bis(iminoguanidinium) ligand and its utilization in selective separation of sulfate is presented.

Separazione solfato da selettiva cristallizzazione con un legante bis-iminoguanidinium

A simple and effective method for selective sulfate separation from aqueous solutions by crystallization with a bis-guanidinium ligand, ...

Insights into the Interactions of Amino Acids and Peptides with Inorganic Materials Using Single-Molecule Force Spectroscopy

The interactions between proteins or peptides and inorganic materials lead to several interesting processes. For example, combining proteins with minerals leads to the formation of composite materials with unique properties. In addition, the undesirable process of biofouling is initiated by the adsorption of biomolecules, mainly proteins, on surfaces. This organic layer is an adhesion layer for bacteria and allows them to interact with the surface. Understanding the fundamental forces that govern the interactions at the organic-inorganic interface is therefore important for many areas of research and could lead to the design of new materials for optical, mechanical and biomedical applications. This paper demonstrates a single-molecule force spectroscopy technique that utilizes an AFM to measure the adhesion force between either peptides or amino acids and well-defined inorganic surfaces. This technique involves a protocol for attaching the biomolecule to the AFM tip through a covalent flexible linker and single-molecule force spectroscopy measurements by atomic force microscope. In addition, an analysis of these measurements is included.

Here we present a protocol to measure the force of interactions between a well-defined inorganic surface and either peptides or amino acids by single-molecule force spectroscopy measurements using an atomic force microscope (AFM). The information obtained from the measurement is important to better understand the peptide-inorganic material interphase.

Intuizioni le interazioni di aminoacidi e peptidi con materiali inorganici Uso singola molecola Forza Spettroscopia

The interactions between proteins or peptides and inorganic materials lead to several interesting processes. For example, combining proteins with minerals ...

Accessing Valuable Ligand Supports for Transition Metals: A Modified, Intermediate Scale Preparation of 1,2,3,4,5-Pentamethylcyclopentadiene

A reliable, intermediate scale preparation of 1,2,3,4,5-pentamethylcyclopentadiene (Cp*H) is presented, based on modifications of existing protocols that derive from initial 2-bromo-2-butene lithiation followed by acid mediated dienol cyclization. The revised synthesis and purification of the ligand avoids the use of mechanical stirring while still permitting access to significant quantities (39 g) of Cp*H in good yield (58%). The procedure offers other additional benefits, including a more controlled quench of excess lithium during the production of the intermediate heptadienols and a simplified isolation of Cp*H of sufficient purity for metallation with transition metals. The ligand was subsequently used to synthesize [Cp*MCl2]2 complexes of both iridium and ruthenium to demonstrate the utility of the Cp*H prepared and purified by our method. The procedure outlined herein affords substantial quantities of a ubiquitous ancillary ligand support used in organometallic chemistry while minimizing the need for specialized laboratory equipment, thus providing a simpler and more accessible entry point into the chemistry of 1,2,3,4,5-pentamethylcyclopentadiene.

Reliable, intermediate scale preparation of 1,2,3,4,5-pentamethylcyclopentadiene (Cp*H) is presented. The revised protocol for the synthesis and purification of the ligand minimizes the need for specialized laboratory equipment while simplifying reaction workups and product purification. Use of Cp*H in the synthesis of [Cp*MCl2]2 complexes (M = Ru, Ir) is also described.

Accesso prezioso Ligand Supporti per metalli di transizione: una versione modificata, Intermedio Scala Preparazione di 1,2,3,4,5-Pentamethylcyclopentadiene

A reliable, intermediate scale preparation of 1,2,3,4,5-pentamethylcyclopentadiene (Cp*H) is presented, based on modifications of existing protocols that ...

Ligand-Mediated Nucleation and Growth of Palladium Metal Nanoparticles

The size, size distribution and stability of colloidal nanoparticles are greatly affected by the presence of capping ligands. Despite the key contribution of capping ligands during the synthesis reaction, their role in regulating the nucleation and growth rates of colloidal nanoparticles is not well understood. In this work, we demonstrate a mechanistic investigation of the role of trioctylphosphine (TOP) in Pd nanoparticles in different solvents (toluene and pyridine) using in situ SAXS and ligand-based kinetic modeling. Our results under different synthetic conditions reveal the overlap of nucleation and growth of Pd nanoparticles during the reaction, which contradicts the LaMer-type nucleation and growth model. The model accounts for the kinetics of Pd-TOP binding for both, the precursor and the particle surface, which is essential to capture the size evolution as well as the concentration of particles in situ. In addition, we illustrate the predictive power of our ligand-based model through designing the synthetic conditions to obtain nanoparticles with desired sizes. The proposed methodology can be applied to other synthesis systems and therefore serves as an effective strategy for predictive synthesis of colloidal nanoparticles.

The main goal of this work is to elucidate the role of capping agents in regulating the size of palladium nanoparticles by combining in situ small angle x-ray scattering (SAXS) and ligand-based kinetic modeling.

Ligando-mediata di nucleazione e crescita di nanoparticelle metalliche Palladium

The size, size distribution and stability of colloidal nanoparticles are greatly affected by the presence of capping ligands. Despite the key contribution ...

Analyzing Protein Architectures and Protein-Ligand Complexes by Integrative Structural Mass Spectrometry

Proteins are an important class of biological macromolecules that play many key roles in cellular functions including gene expression, catalyzing metabolic reactions, DNA repair and replication. Therefore, a detailed understanding of these processes provides critical information on how cells function. Integrative structural MS methods offer structural and dynamical information on protein complex assembly, complex connectivity, subunit stoichiometry, protein oligomerization and ligand binding. Recent advances in integrative structural MS have allowed for the characterization of challenging biological systems including large DNA binding proteins and membrane proteins. This protocol describes how to integrate diverse MS data such as native MS and ion mobility-mass spectrometry (IM-MS) with molecular dynamics simulations to gain insights into a helicase-nuclease DNA repair protein complex. The resulting approach provides a framework for detailed studies of ligand binding to other protein complexes involved in important biological processes.

Mass spectrometry (MS) has emerged as an important tool for the investigation of structure and dynamics of macromolecular assemblies. Here, we integrate MS-based approaches to interrogate protein complex formation and ligand binding.