Ringraziamo il compianto Dr. Norm Taylor, Dipartimento Impianti e Scienza del Suolo presso l&#39;Università del Kentucky, per averci permesso di utilizzare campioni dalle sue trame trifoglio rosso per questo studio. Questo progetto è stato finanziato dal Dipartimento dell&#39;Agricoltura degli Stati Uniti.

1. Preparazione di Estratto di piante <ol><li> Per l&#39;estrazione di composti fenolici da Trifolium pratense cv vedere Kagan e Flythe 10. Kenland. </li><li> Per estrarre altri composti in altre piante, cercare la letteratura analisi fitochimici per metodi di estrazione-vegetali o specifico metabolita (molti sono descritti), o per cercare protocolli come quelli di Khurram et al. 7,8 che isolano molti composti ad un&#39;ampia gamma di polarità. </li></ol> 2. Preparazione delle piastre di strato sottile <ol><li> Piastre TLC Clean di sviluppo in uno o più solventi polari, neutri, in modo da spostare i contaminanti adsorbiti dalla zona di sviluppo. <ol><li> In una cappa aspirante, preparare abbastanza solvente (es 15-100 ml di acetato di etile-metanolo 2:1, v / v) per coprire il fondo della camera di sviluppo TLC, così come il bordo inferiore di una piastra TLC quando insieme all&#39;interno della camera. </li><li> Utilizzare commervetro cialmente disponibili TLC sviluppare camere (diverse dimensioni disponibili, con coperchi) o foglio coperto di Pyrex bicchieri o vasi da conserva. </li><li> Usare le forbici per tagliare (flessibili) lastre di gel di silice di plastica-backed, che sono disponibili in varie dimensioni (20 cm x 20 cm e più piccoli), per adattarsi alla camera di sviluppo disponibili in alluminio o. (Attenzione: silice può causare danni ai polmoni se inalato funziona in una cappa aspirante, e di gestire le piastre TLC con i guanti per evitare di ottenere oli per la pelle sulla silice.). </li><li> Inserire le piastre nella camera, con le cime appoggiati contro le pareti della camera. Piatti non devono toccarsi. Coprire la camera e lasciare che il solvente spostare la piastra per azione capillare. </li><li> Quando il solvente ha raggiunto la cima delle piastre, rimuovere le piastre dalla camera e disporre in una posizione eretta all&#39;interno della cappa fino solvente è evaporato. </li><li> Verificare se le impurità sono migrati vicino alla parte superiore della piastra TLC cercando una banda gialla sotto visibileluce, o una banda fluorescenti ai raggi ultravioletti (UV) (vedere &quot;fronte impurità&quot; o IF in Figura 2B). Se la maggioranza della piastra presenta ancora una sfumatura giallastra, ripetere il processo di pulizia. </li><li> Dopo aver rimosso le piastre TLC dalla camera, scartare il solvente. Lasciare solvente residuo evaporare completamente prima di utilizzare la camera di protocollo 2. </li><li> Per rimuovere l&#39;umidità residua che può influenzare la migrazione dei composti su silice 16, prop le piastre in posizione verticale in forno a 100 ° C (10-15 min per 20 cm x 20 cm Piatto, e 5 min per 7 cm x 10 cm piastre ). </li><li> Se un 100 ° C forno di essiccazione non è disponibile, piastre di calore per un periodo di tempo più lungo a temperature più basse (cioè 40 min a 60 ° C). </li><li> Dopo le piastre sono asciutti, lasciarli raffreddare a temperatura ambiente prima del caricamento. </li></ol></li></ol> 3. Preparazione di Sviluppo Chambers per estratto Separation <ol&gt; <li> Utilizzare le forbici per tagliare un pezzo di carta da filtro leggermente inferiore Altezza della camera, e circa la metà del perimetro camera in larghezza. Questo documento funge da stoppino di elaborare solvente fino parete della camera e saturare la camera con i vapori di solvente, migliorando così la riproducibilità delle separazioni 1. </li><li> In una cappa aspirante, miscelare solventi (acetato di etile-metanolo 4:1, v / v, per questo studio). Versare il composto di solvente nella camera e coprire. Attendere che l&#39;intero stoppino è bagnato con del solvente, indica la saturazione della camera, per mettere le piastre nella camera. </li></ol> 4. Caricamento e Sviluppo di piastre TLC <ol><li> Leggermente segnare l&#39;origine con la matita. Se la piastra assorbente TLC è morbido e facilmente danneggiati, fare segni ai bordi. Composti dovrebbero essere sopra la superficie del solvente di sviluppo quando piastre vengono inseriti nella camera di TLC. </li><li> Sciogliere estratti in solvente organico sufficiente (in questo caso, metanolo) per avere una soluzione concentrata invece di una torbidasospensione. </li><li> Caricare i campioni e gli standard come bande strette con una siringa microlitro o micropipette capillari, lasciando un bordo di 1 cm sui lati della piastra. Lasciare le bande asciugare (sfogliare la targa o caricarlo in una cappa aspirante aiuta). </li><li> Se è necessaria una maggiore concentrazione di campione su un piatto, &quot;overspot&quot; di caricare i campioni di nuovo sulle bande secchi. </li><li> Con pinze o tenaglie, impostare piatto (s) all&#39;interno della camera di TLC saturo. Piastre non dovrebbero toccare lo stoppino perché può fornire solvente alle piastre nei punti di contatto, modificando così il percorso di migrazione composto. Coprire camera e lasciare le piastre si sviluppano. </li></ol> 5. Preparazione di piatti per Bioassay <ol><li> Rimuovere piastra (s) dal serbatoio TLC prima il fronte del solvente raggiunge la parte superiore della piastra, e segnare l&#39;altezza del fronte del solvente con una matita. Lasciate monodisco a secco in cappa. <ol><li> Sviluppare i rimanenti piastre TLC nella stessa camera TLC, che è generally utilizzabile per un giorno intero se tenuto chiuso. Rifare miscela solvente per camera TLC se la quantità di solvente nella camera diminuisce notevolmente. </li></ol></li><li> Dopo le piastre sono a secco, visualizzare le bande sotto la luce visibile o UV, e delineare le bande con una matita. Una camera di osservazione con una lampada UV portatile è conveniente, soprattutto se la lampada può rilevare composti sia a 254 nm (UV ad onde corte) e 365 nm (onda lunga UV). Nota: A questo punto o dopo la fase successiva, le piastre possono essere avvolte in pellicola trasparente, coperto con un foglio, e conservati a -20 ° C. Periodo massimo di conservazione dipende dalla stabilità composto. Poiché la silice non è neutrale, alcuni composti possono degradare mentre sulla piastra TLC. </li><li> Fotografare o disegnare piatti. <ol><li> Utilizzare un sistema gel foto documentazione, se uno dotato di UV spese generali e / o le luci visibili è disponibile. </li><li> Se nessun sistema di foto documentazione commerciale è disponibile, piatti fotografia all&#39;interno di una scatola foderata con carta o panno scuro, wi° Un set fotocamera su un treppiede e una luce UV portatile bloccato per un anello di supporto 17. Quando si fotografa piatti che non hanno indicatore fluorescente, utilizzare un filtro luce blu sopra l&#39;obiettivo della fotocamera per migliorare banda aspetto 17. </li></ol></li><li> Per facilitare bande caratterizzazione, calcolare valori del fattore di ritenzione (R f) per distanze percorse dai composti e fronte del solvente misurazione, e dividendo il primo dal (Figura 2A) quest&#39;ultimo. </li></ol> 6. Batterica cultura e Assay <ol><li> Preparare e inoculare i terreni in condizioni anaerobiche. La lingua utilizzata in questo caso è stato Clostridium SR ceppo sticklandii, che è stato ottenuto dalla raccolta cultura di James B. Russell, Cornell University, Ithaca, NY. <ol><li> Vedere Flythe e Kagan 13 e l&#39;elenco dei materiali per una descrizione di HAB media. </li></ol></li><li> Far crescere la cultura fase esponenziale o stazionaria. Utilizzare sterile anaerobica techniques quando si lavora con microrganismi anaerobici. </li><li> Inoculare la cultura (1% v / v) in agar fuso dopo che la temperatura della agar (0,75% w / v) è diminuita a meno di 60 ° C. Mescolare delicatamente e portare subito in una camera anaerobica (95% di CO 2 -5% H 2 atmosfera per HAB media) a versare. </li><li> Versare in 15 millimetri x 100 millimetri di plastica Petri e lasciare solidificare. </li><li> Con le forbici, tagliare la piastra TLC in zone contenenti band (s) di interesse. Lay bande a faccia in giù su piastre di agar, bande sul supporto targhetta di marcatura per tenere traccia di orientamento originale su piastra TLC. Lay una striscia TLC inutilizzato su una piastra di agar come controllo. </li><li> Incubare le piastre di agar agar, lato verso il basso, nella camera anaerobica (24 hr, 39 ° C). </li></ol> 7. Visualizzazione dei piatti Bioassayed Agar <ol><li> Con pinze, eliminare le bande da piastre di agar mentre sono nella camera anaerobica. </li><li> Aggiungere 1% (w / v) terosso trazolium, preparato in acqua, a gocce sulle superfici delle piastre di agar. Lasciare che il sviluppare il colore per almeno 20 minuti, o fino a quando la piastra di controllo diventa completamente rossa, prima di rimuovere dalla camera anaerobica. I batteri anaerobici inizieranno a perdere vitalità subito dopo la rimozione dalla camera anaerobica, ma il colore è stabile per più di 24 ore. </li><li> Fotografare in luce visibile. </li></ol>

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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+reconstitution+of+cytochrome+P450ox+and+in+vitro+reconstitution+of+the+entire+biosynthetic+pathway+of+the+cyanogenic+glucoside+dhurrin+from+sorghum.">Isolation and reconstitution of cytochrome P450ox and in vitro reconstitution of the entire biosynthetic pathway of the cyanogenic glucoside dhurrin from sorghum.</a> Plant Physiol. 115 (4), (1997).</li><li>Peterson, C. A., Edgington, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+estimation+of+the+fungicide+benomyl+using+a+bioautograph+technique.">Quantitative estimation of the fungicide benomyl using a bioautograph technique.</a> J. Agr. Food Chem. 17 (4), 898-899 (1969).</li></ol>

La citazione di marchi o prodotti commerciali in questo articolo è al solo scopo di fornire informazioni specifiche e non implica alcuna raccomandazione o approvazione da parte del USDA. Gli autori dichiarano assenza concorrente interesse finanziario.

Questo protocollo descrive un metodo semplice per separare un estratto in sottoinsiemi di composti e saggiando i sottoinsiemi per contatto bioautografia. Il metodo è molto simile a quello utilizzato da Chomnawang et al. 15 per lo screening per i metaboliti vegetali inibitori di batteri che causano la gonorrea. Il tipo di bioautografia impiegato per lo screening composti vegetali antimicrobici dipende da molti fattori, tra cui il microrganismo prova, il setup di laboratorio, e le preferenze della per...

Saggio di composti antimicrobici nelle piante richiede separare i componenti di un estratto vegetale, esponendo un microrganismo di prova per tali componenti, e determinare se la crescita del microrganismo è inibita da qualsiasi dei composti. Separazioni di carta o cromatografia su strato sottile (TLC o PC) sono convenienti perché molti composti possono essere separati su una superficie planare. La separazione è basata sulla polarità, con alcuni composti vincolante strettamente al adsorbente (cellulosa nel caso di PC, e una varietà di adsorbenti nel caso di TLC) e la migrazione meno di altri 1. Figura 1 fornisce un esempio delle posizioni relative composti fenolici polari e apolari dopo separazione su una piastra TLC silice. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51411/51411fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51411/51411fig1.jpg" /> Figura 1. Diagramma che illustra le distribuzioni di composti di diverse polarità dopo la separazione su una silice per cromatografia su strato sottile (TLC) piastra. Composti fenolici di trifoglio rosso (Trifolium pratense L.) vengono utilizzati come esempio. Composti polari, come clovamide, hanno una forte affinità per un adsorbente polare come silice e rimangono vicino all&#39;origine (OR), mentre i composti polari meno, come le tre isoflavoni vicino al fronte del solvente (SF), partizione più facilmente in solventi (che sono meno polare silice meno acqua, acidi o basi sono incluse) e migrare lontano sulla piastra. Dopo separazione di un estratto su una piastra TLC, microrganismi di prova possono essere esposti a tutti i composti sulla piastra, accelerando così l&#39;identificazione dei componenti attivi di un estratto 2. Se una coltura fungina o batterica è esposto al cromatogramma, crescita microbica avverrà ovunque tranne su aree con incremento-inibitoreComposti y. Zone di inibizione quindi possono essere visualizzate osservando il contrasto tra la crescita del micelio e le zone di libero crescita se i funghi sono stati applicati 3 o spruzzo con composti che cambiano colore quando ridotto o idrolizzato dalle cellule viventi 4. Sebbene l&#39;uso di carta o sottile strato cromatogrammi per saggi antimicrobici è stata applicata in primo luogo agli antibiotici 5 e fungicidi 3,6, estratti di piante sono ora spesso sottoposti a screening per composti antimicrobici con questo metodo, spesso definito come bioautografia. I protocolli descritti nel presente documento si applicano a bioautografia di cromatogrammi a film sottile. TLC è ampiamente utilizzato perché è relativamente rapida e può essere eseguita su diversi adsorbenti (ad esempio silice, amido, allumina), oltre a fornire una buona risoluzione e sensibilità 1. Estratti vegetali possono essere preparati per TLC in molti modi. I metodi più comuni includono materiale vegetale di estrazione in alcmiscele ohol in acqua come etanolo 80% 7,8, eventualmente con l&#39;aggiunta di acido o di base 9. A seguito un&#39;estrazione in tali solventi, che contengono acqua e sono eventualmente acida o basica, estratti devono essere concentrate in modo che possano essere applicati alle piastre TLC in un volume minimo. La concentrazione di estratti alcol-acqua può essere ottenuto partizionando con solventi organici immiscibili in acqua 8 o con una miscela di tali solventi, quali acetato di etile-etere etilico (1:1 v / v) 10,11. Diversi metaboliti vegetali vengono estratti in solventi organici diversi, a seconda della loro polarità. Per assicurarsi che l&#39;impianto acidi organici o basi vengono estratti in solventi organici, in questa fase, il pH di un estratto alcolico-acqua può essere sollevato o abbassato con un acido solubile in acqua o base per convertire analiti dissociate nelle loro forme nondissociated, che sono poi solubile in solventi organici neutri 9. La fase organica può quindi essere postavaporated sotto pressione ridotta o sotto azoto e regolato il volume desiderato per TLC. Il pH dell&#39;estratto è improbabile che sia letale per i microrganismi di prova biologica dovuti all&#39;isolamento di analiti in solventi neutri, piccolo volume finale, e l&#39;evaporazione dell&#39;estratto sulla piastra TLC prima della separazione. Entrambi i funghi e batteri sono impiegati come microrganismi prova in bioautografia di estratti vegetali 2. Spore di alcuni funghi, come Cladosporium cucumerinum, germinano su piastre di TLC (a parte le zone con composti inibitori) se spruzzato su piastre in una soluzione nutritiva e incubate in un ambiente umido per diversi giorni 3. Il micelio scuro di C. cucumerinum sulle zone noninhibitory fornisce un netto contrasto con le zone franche di crescita del micelio. Anche se i batteri sono stati applicati per cromatografia su strato sottile (TLC) piastre nello stesso modo 4,12, i batteri si riversano anche su TLCsuperfici delle piastre di agar si sovrappone 13,14. Lieviti, come Candida albicans, può essere applicato in sovrapposizioni agar e 14. In alternativa, le piastre TLC possono essere posizionati a faccia in giù su agar inoculato con batteri o lieviti 10,15 8, un metodo noto come contatto bioautografia 2. Descriviamo un metodo per contatto bioautografia per schermare per i composti fenolici antimicrobici di trifoglio rosso (Trifolium pratense cv. Kenland). Il microrganismo test è Clostridium sticklandii, a-ammoniaca produce iper batterio ruminale (HAB) e obbligano anaerobi. Sebbene le separazioni utilizzati non risolvono tutti i componenti dell&#39;estratto, facilitano l&#39;individuazione delle zone di attività antimicrobica, riducendo così il numero di possibili composti antimicrobici. Il protocollo utilizza procedure standard per TLC 1. Il protocollo descrive anche alcune delle tecniche necessarie per la coltura obblighianaerobi cancello per tale saggio, un ciclo di contatto bioautografia 15 e un metodo di visualizzazione con un sale di tetrazolio, che colora le cellule viventi 2,4.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="739">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Silica F254 TLC plates, aluminum-backed, 0.2 mm thickness, 20 &#215; 20 cm</td>
			<td>EMD Chemicals&#160;</td>
			<td>5554/7</td>
			<td>These plates are coated with silica that contains an indicator fluorescing at 254 nm.&#160; Compounds absorbing at that wavelength appear dark on a fluorescent green background.&#160; Alternative sources include Analtech, Selecto Scientific, Fluka.&#160; Adsorbents other than silica may be needed.&#160; Plastic-backed plates may be suitable, depending on the solvents to be used.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sharp, heavy-duty scissors&#160;</td>
			<td>any sewing supply company</td>
			<td>similar to Fiskars&#160; 175800-1002</td>
			<td>For cutting TLC plates.&#160; A paper cutter with a sharp blade can be used as well.&#160; Do not inhale silica dust.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drying oven at 100 &#176;C (mechanical convection)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PR305225M</td>
			<td>Quincy Lab, Inc, Chicago, IL (www.quincylab.com); Cascade Technical Sciences, Hillsboro, OR (www.cascadetek.com)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLC chamber</td>
			<td>Kimble Chase&#160;</td>
			<td>416180-0000</td>
			<td>Alternative sources:&#160; Aldrich. Pyrex beakers or preserving jars can be used for small plates (i.e. 5 &#215; 10 cm).&#160; Cover with aluminum foil (jar lids may contain material extractable by solvent vapors).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50-&#181;L syringe with flat needle tip</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>80965</td>
			<td>For loading amounts of standard or sample exceeding 5-10 &#181;L.&#160; Alternative sources are equivalent.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micropipets</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>2-000-001</td>
			<td>For loading small amounts of standards or samples.&#160; Alternative sources:&#160; VWR.&#160; Also, Pasteur pipets can be stretched to a thinner diameter with a butane torch.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper (#1 grade)</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1001 917</td>
			<td>Serves as a chamber wick.&#160; Other grades of filter paper are OK.&#160; This size can be trimmed for the chambers holding 20 &#215; 20 cm plates.&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker tongs</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-186</td>
			<td>For putting plates in and out of a large TLC chamber.&#160; Alternate sources: VWR&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat-edge forceps&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10-275</td>
			<td>For putting plates in and out of a small chamber.&#160;&#160; Alternate sources: VWR&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small portable UV lamp with 4-Watt or 6-Watt bulbs for short- and long-wave UV light illumination (254 and 365 nm, respectively)</td>
			<td>Ultraviolet Products&#160;</td>
			<td>95-0271-01</td>
			<td>Alternate sources: Spectronics Corporation (www.spectroline.net)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viewing cabinet for use with hand-held UV lamp</td>
			<td>Ultraviolet Products&#160;</td>
			<td>Chromato-Vue C-10E</td>
			<td>UV-active bands are more easily circled if plates can be set in here.&#160; Alternate sources: Spectronics Corporation.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photodocumentation system with overhead UV lamp and visible lamp</td>
			<td>Kodak&#160;</td>
			<td>Gel Logic 200</td>
			<td>&#160;Alternate sources: Ultraviolet Products (www.uvp.com).&#160; See protocol for homemade alternative.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anaerobic Chamber, Type A, Vinyl</td>
			<td>Coy&#160;</td>
			<td>7150000</td>
			<td>This chamber is appropriate for anaerobic bacteria, like Clostridium sticklandii, as described. &#160;However, growth conditions must be tailored to organism used in the assay.&#160; A biosafety cabinet and other precautions should be taken if pathogenic organisms are used. Alternate sources: Anaerobe Systems, BioRad, Plas Labs, others&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrazolium red</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8877</td>
			<td>Alternate sources: MP Biomedicals, Santa Cruz Biotechnology, Alfa Aesar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ingredients for HAB media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyridoxamine &#183; 2 HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9380</td>
			<td>For this and for all the other reagents in this table, alternative sources are equivalent.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Riboflavin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R4500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiamine HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N3376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium D-Pantothenate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipoic Acid&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-Aminobenzoic acid&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8798</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B4639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cobalamine&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3607</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyridoxal HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyridoxine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;E6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron sulfate &#183; 7 H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;F8263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc sulfate &#183; 7 H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z0251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manganese chloride &#183; 4 H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B6768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cobalt chloride &#183; 6 H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;C8661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper chloride &#183; 2 H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>459097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nickel chloride &#183; 6 H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>203866</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium molybdate &#183; 2 H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>331058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Trypticase (Pancreatic digest of casein)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>B11921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic anhydrous</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>P284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium carbonate &#183; H2O&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>S636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>50841063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate &#183; 6 H2O</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>7791-18-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride &#183; 2 H2O</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>BP510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cysteine HCl</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>19464780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic anhydrous</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>P290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>BP358</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

thin-layer chromatographic (tlc) separations and bioassays of plant extracts to identify antimicrobial compounds

Uno schermo comune per i composti antimicrobici vegetali consiste nel separare estratti vegetali da carta o cromatografia su strato sottile (TLC o PC), esponendo i cromatogrammi di sospensioni microbiche (ad esempio funghi o batteri in brodo o agar), dando il tempo per i microbi di crescere in un ambiente umido, e la visualizzazione zone senza crescita microbica. L&#39;efficacia di questo metodo di screening, noto come bioautografia, dipende sia dalla qualità della separazione cromatografica e la cura con condizioni di coltura microbica. Questo articolo descrive i protocolli standard per TLC e contattare bioautografia con una nuova applicazione di aminoacidi batteri dell&#39;acido fermentazione. L&#39;estratto viene separata su flessibili (alluminio-di appoggio) lastre TLC silice, e le bande sono visualizzati sotto luce ultravioletta (UV). Le zone sono tagliati fuori e incubate a faccia in giù su agar inoculato con il microrganismo test. Bande inibitorie sono visibili con la colorazione della piastra di agars con tetrazolio rosso. Il metodo è applicato alla separazione di trifoglio rosso (Trifolium pratense cv. Kenland), composti fenolici e la loro selezione per attività contro il Clostridium sticklandii, un batterio che produce ammoniaca iper (HAB), che è nativo del rumine dei bovini. I metodi TLC applicano a molti tipi di estratti vegetali e altre specie batteriche (aerobici o anaerobici), così come funghi, può essere utilizzato come organismi di prova se le condizioni della coltura vengono modificate per adattarsi alle esigenze di crescita della specie.

Rappresentante separazioni TLC silice di trifoglio rosso (Trifolium pratense cv. Kenland) estratti, contenenti composti fenolici, sono illustrati nella Figura 2. Separazione di estratto di trifoglio rosso in acetato di etile-esano (9:1, v / v), oltre 8,5 cm provocato cinque bande, una incompleto risolto dall&#39;origine (Figura 2A). Tuttavia, la Figura 2B mostra che circa il doppio delle bande sono stati rivelati quando un altro campione di estratto di trifogli...

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Thin-layer Chromatographic TLC Separations and Bioassays of Plant Extracts to Identify Antimicrobial Compounds

I metodi sono descritti per cromatografia su strato sottile (TLC) separazione di estratti vegetali e contattare bioautografia per identificare i metaboliti antibatterici. I metodi sono applicati alla proiezione del trifoglio composti fenolici che inibiscono iper-ammoniaca batteri che producono (HAB) native del rumine dei bovini.

Strato sottile cromatografica (TLC) Separazioni e Bioassays di estratti vegetali per identificare composti antimicrobici

A common screen for plant antimicrobial compounds consists of separating plant extracts by paper or thin-layer chromatography (PC or TLC), exposing the ...

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Thin-layer Chromatographic (TLC) Separations and Bioassays of Plant Extracts to Identify Antimicrobial Compounds

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67.3K Views.  United States Department of Agriculture.  I metodi sono descritti per cromatografia su strato sottile (TLC) separazione di estratti vegetali e contattare bioautografia per identificare i metaboliti antibatterici. I metodi sono applicati alla proiezione del trifoglio composti fenolici che inibiscono iper-ammoniaca batteri che producono (HAB) native del rumine dei bovini. 

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Profiling the Triacylglyceride Contents in Bat Integumentary Lipids by Preparative Thin Layer Chromatography and MALDI-TOF Mass Spectrometry

The mammalian integument includes sebaceous glands that secrete an oily material onto the skin surface. Sebum production is part of the innate immune system that is protective against pathogenic microbes. Abnormal sebum production and chemical composition are also a clinical symptom of specific skin diseases. Sebum contains a complex mixture of lipids, including triacylglycerides, which is species-specific. The broad chemical properties exhibited by diverse lipid classes hinder the specific determination of sebum composition. Analytical techniques for lipids typically require chemical derivatizations that are labor-intensive and increase sample preparation costs. This paper describes how to extract lipids from mammalian integument, separate broad lipid classes by thin-layer chromatography, and profile the triacylglyceride contents using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. This robust method enables a direct determination of the triacylglyceride profiles among species and individuals, and it can be readily applied to any taxonomic group of mammals.

Mammalian integument contains solvent-extractable lipids that can provide chemical compositions characteristic of individual species. This paper presents a routine method for separating broad lipid classes isolated from integumentary tissues using thin layer chromatography and determining the triacylglyceride profile by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry.

Profiling Contenuti Triacylglyceride nella BAT tegumentario lipidi da preparativa cromatografia su strato sottile e MALDI-TOF

The mammalian integument includes sebaceous glands that secrete an oily material onto the skin surface. Sebum production is part of the innate immune ...

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Chimica

Methods to Identify the NMR Resonances of the 13C-Dimethyl N-terminal Amine on Reductively Methylated Proteins

Nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy is a proven technique for protein structure and dynamic studies. To study proteins with NMR, stable magnetic isotopes are typically incorporated metabolically to improve the sensitivity and allow for sequential resonance assignment. Reductive 13C-methylation is an alternative labeling method for proteins that are not amenable to bacterial host over-expression, the most common method of isotope incorporation. Reductive 13C-methylation is a chemical reaction performed under mild conditions that modifies a protein&#39;s primary amino groups (lysine &#949;-amino groups and the N-terminal &#945;-amino group) to 13C-dimethylamino groups. The structure and function of most proteins are not altered by the modification, making it a viable alternative to metabolic labeling. Because reductive 13C-methylation adds sparse, isotopic labels, traditional methods of assigning the NMR signals are not applicable. An alternative assignment method using mass spectrometry (MS) to aid in the assignment of protein 13C-dimethylamine NMR signals has been developed. The method relies on partial and different amounts of 13C-labeling at each primary amino group. One limitation of the method arises when the protein&#39;s N-terminal residue is a lysine because the &#945;- and &#949;-dimethylamino groups of Lys1 cannot be individually measured with MS. To circumvent this limitation, two methods are described to identify the NMR resonance of the 13C-dimethylamines associated with both the N-terminal &#945;-amine and the side chain &#949;-amine. The NMR signals of the N-terminal &#945;-dimethylamine and the side chain &#949;-dimethylamine of hen egg white lysozyme, Lys1, are identified in 1H-13C heteronuclear single-quantum coherence spectra.

Methods to Identify the NMR Resonances of the 13C-Dimethyl N-terminal Amine on Reductively Methylated Proteins

Two methods for assigning the &#945;- and &#949;-dimethylamine nuclear magnetic resonance signals of a reductively 13C-methylated N-terminal lysine are described. One method utilizes the pH-induced selectivity of the reductive methylation reaction, and the other uses aminopeptidase to selectively remove the N-terminal lysine.

Nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy is a proven technique for protein structure and dynamic studies. To study proteins with NMR, stable magnetic ...

Analysis of Volatile and Oxidation Sensitive Compounds Using a Cold Inlet System and Electron Impact Mass Spectrometry

This video presents a protocol for the mass spectrometrical analysis of volatile and oxidation sensitive compounds using electron impact ionization. The analysis of volatile and oxidation sensitive compounds by mass spectrometry is not easily achieved, as all state-of-the-art mass spectrometric methods require at least one sample preparation step, e.g., dissolution and dilution of the analyte (electrospray ionization), co-crystallization of the analyte with a matrix compound (matrix-assisted laser desorption/ionization), or transfer of the prepared samples into the ionization source of the mass spectrometer, to be conducted under atmospheric conditions. Here, the use of a sample inlet system is described which enables the analysis of volatile metal organyls, silanes, and phosphanes using a sector field mass spectrometer equipped with an electron impact ionization source. All sample preparation steps and the sample introduction into the ion source of the mass spectrometer take place either under air-free conditions or under vacuum, enabling the analysis of compounds highly susceptible to oxidation. The presented technique is especially of interest for inorganic chemists, working with metal organyls, silanes, or phosphanes, which have to be handled using inert conditions, such as the Schlenk technique. The principle of operation is presented in this video.

This video presents a protocol for the mass spectrometrical analysis of volatile and oxidation sensitive compounds using electron impact ionization. The presented technique is especially of interest for inorganic chemists, working with metal organyls, silanes, or phosphanes which have to be handled using inert conditions, such as the Schlenk technique.

Analisi di composti volatili sensibili e ossidazione utilizzando un sistema di aspirazione a freddo e impatto elettronico Spettrometria di Massa

This video presents a protocol for the mass spectrometrical analysis of volatile and oxidation sensitive compounds using electron impact ionization. The ...

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical (Methylation) and Physical (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Techniques

This protocol describes the specific techniques used for the characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of heteroxylans. De-starched wheat endosperm cell walls were isolated as an alcohol-insoluble residue (AIR)1 and sequentially extracted with water (W-sol Fr) and 1 M KOH containing 1% NaBH4 (KOH-sol Fr) as described by Ratnayake et al. (2014)2. Two different approaches (see summary in Figure 1) are adopted. In the first, intact W-sol AXs are treated with 2AB to tag the original RE backbone chain sugar residue and then treated with an endoxylanase to generate a mixture of 2AB-labelled RE and internal region reducing oligosaccharides, respectively. In a second approach, the KOH-sol Fr is hydrolyzed with endoxylanase to first generate a mixture of oligosaccharides which are subsequently labelled with 2AB. The enzymically released ((un)tagged) oligosaccharides from both W- and KOH-sol Frs are then methylated and the detailed structural analysis of both the native and methylated oligosaccharides is performed using a combination of MALDI-TOF-MS, RP-HPLC-ESI-QTOF-MS and ESI-MSn. Endoxylanase digested KOH-sol AXs are also characterized by nuclear magnetic resonance (NMR) that also provides information on the anomeric configuration. These techniques can be applied to other classes of polysaccharides using the appropriate endo-hydrolases.

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical Methylation and Physical Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance Techniques

This protocol describes the specific techniques used for the structural characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of heteroxylans by tagging the RE with 2 aminobenzamide prior to enzymatic (endoxylanase) hydrolysis and then analysis of the resultant oligosaccharides using mass spectrometry (MS) and nuclear magnetic resonance (NMR).

Il sequenziamento di Plant parete Heteroxylans Utilizzando enzimatica, chimica (metilazione) e (Spettrometria di Massa, Risonanza Magnetica Nucleare) tecniche fisiche

This protocol describes the specific techniques used for the characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of ...

On-line Analysis of Nitrogen Containing Compounds in Complex Hydrocarbon Matrixes

The shift to heavy crude oils and the use of alternative fossil resources such as shale oil are a challenge for the petrochemical industry. The composition of heavy crude oils and shale oils varies substantially depending on the origin of the mixture. In particular they contain an increased amount of nitrogen containing compounds compared to the conventionally used sweet crude oils. As nitrogen compounds have an influence on the operation of thermal processes occurring in coker units and steam crackers, and as some species are considered as environmentally hazardous, a detailed analysis of the reactions involving nitrogen containing compounds under pyrolysis conditions provides valuable information. Therefore a novel method has been developed and validated with a feedstock containing a high nitrogen content, i.e., a shale oil. First, the feed was characterized offline by comprehensive two-dimensional gas chromatography (GC &#215; GC) coupled with a nitrogen chemiluminescence detector (NCD). In a second step the on-line analysis method was developed and tested on a steam cracking pilot plant by feeding pyridine dissolved in heptane. The former being a representative compound for one of the most abundant classes of compounds present in shale oil. The composition of the reactor effluent was determined via an in-house developed automated sampling system followed by immediate injection of the sample on a GC &#215; GC coupled with a time-of-flight mass spectrometer (TOF-MS), flame ionization detector (FID) and NCD. A novel method for quantitative analysis of nitrogen containing compounds using NCD and 2-chloropyridine as an internal standard has been developed and demonstrated.

A method combining comprehensive two-dimensional gas chromatography with nitrogen chemiluminescence detection has been developed and applied to on-line analysis of nitrogen containing compounds in a complex hydrocarbon matrix.

Analisi on-line dei composti contenenti azoto in matrici idrocarburi complessi

The shift to heavy crude oils and the use of alternative fossil resources such as shale oil are a challenge for the petrochemical industry. The ...

Using Capillary Electrophoresis to Quantify Organic Acids from Plant Tissue: A Test Case Examining Coffea arabica Seeds

Carboxylic acids are organic acids containing one or more terminal carboxyl (COOH) functional groups. Short chain carboxylic acids (SCCAs; carboxylic acids containing three to six carbons), such as malate and citrate, are critical to the proper functioning of many biological systems, where they function in cellular respiration and can serve as indicators of cell health. In foods, organic acid content can have significant impact on taste, with increased SCCA levels resulting in a sour or &#34;acid&#34; taste. Because of this, methods for the rapid analysis of organic acid levels are of particular interest to the food and beverage industries. Unfortunately, however, most methods used for SCCA quantification are dependent on time-consuming protocols requiring the derivatization of samples with hazardous reagents, followed by costly chromatographic and/or mass spectrometric analyses. This method details an alternate method for the detection and quantification of organic acids from plant material and food samples using free zonal capillary electrophoresis (CZE), sometimes simply referred to as capillary electrophoresis (CE). CZE provides a cost-effective method for measuring SCCAs with a low limit of detection (0.005 mg/ml). This article details the extraction and quantification of SCCAs from plant samples. While the method provided focuses on measurement of SCCAs from coffee beans, the method provided can be applied to multiple plant-based food materials.

Using Capillary Electrophoresis to Quantify Organic Acids from Plant Tissue: A Test Case Examining Coffea arabica Seeds

This article presents a method for the detection and quantification of organic acids from plant material using free zonal capillary electrophoresis. An example of the potential application of this method, determining the effects of a secondary fermentation on organic acid levels in coffee seeds, is provided.

Usando elettroforesi capillare per quantificare Acidi organici da tessuti vegetali: un banco di prova d&#39;esame<em&gt; Coffea arabica</em&gt; Semi

Carboxylic acids are organic acids containing one or more terminal carboxyl (COOH) functional groups. Short chain carboxylic acids (SCCAs; carboxylic ...

Raman and IR Spectroelectrochemical Methods as Tools to Analyze Conjugated Organic Compounds

In the presented work, two spectroelectrochemical techniques are discussed as tools for the analysis of the structural changes occurring in the molecule on the vibrational level of energy. Raman and IR spectroelectrochemistry can be used for advanced characterization of the structural changes in the organic electroactive compounds. Here, the step-by-step analysis by means of Raman and IR spectroelectrochemistry is shown. Raman and IR spectroelectrochemical techniques provide complementary information about structural changes occurring during an electrochemical process, i.e. allows for the investigation of redox processes and their products. The examples of IR and Raman spectroelectrochemical analysis are presented, in which the products of the redox reactions, both in solution and solid state, are identified.

A protocol of step-by-step Raman and IR spectroelectrochemical analysis is presented.

Raman e IR Spettroelettrochimica metodi come strumenti per analizzare composti organici coniugati

In the presented work, two spectroelectrochemical techniques are discussed as tools for the analysis of the structural changes occurring in the molecule ...

Using Cyclic Voltammetry, UV-Vis-NIR, and EPR Spectroelectrochemistry to Analyze Organic Compounds

Cyclic voltammetry (CV) is a technique used in the analysis of organic compounds. When this technique is combined with electron paramagnetic resonance (EPR) or ultraviolet-visible and near-infrared (UV-Vis-NIR) spectroscopies, we obtain useful information such as electron affinity, ionization potential, band-gap energies, the type of charge carriers, and degradation information that can be used to synthesize stable organic electronic devices. In this study, we present electrochemical and spectroelectrochemical methods to analyze the processes occurring in active layers of an organic device as well as the generated charge carriers.

In this article, we describe electrochemical, electron paramagnetic resonance, and ultraviolet-visible and near-infrared spectroelectrochemical methods to analyze organic compounds for application in organic electronics.

Mediante voltammetria ciclica, UV-Vis-NIR ed EPR Spectroelectrochemistry per analizzare composti organici

Cyclic voltammetry (CV) is a technique used in the analysis of organic compounds. When this technique is combined with electron paramagnetic resonance ...

Electrophoretic Crystallization of Ultrathin High-performance Metal-organic Framework Membranes

We report the synthesis of thin, highly intergrown, polycrystalline metal-organic framework (MOF) membranes on a wide range of unmodified porous and non-porous supports (polymer, ceramic, metal, carbon, and graphene). We developed a novel crystallization technique, which is termed the ENACT approach: the electrophoretic nuclei assembly for the crystallization of highly intergrown thin films (ENACT). This approach allows for a high density of heterogeneous nucleation of MOFs on a chosen substrate via the electrophoretic deposition (EPD) directly from the precursor sol. The growth of well-packed MOF nuclei leads to a highly intergrown polycrystalline MOF film. We show that this simple approach can be used for the synthesis of thin, intergrown zeolite imidazole framework (ZIF)-7 and ZIF-8 films. The resulting 500 nm-thick ZIF-8 membranes show a considerably high H2 permeance (8.3 x 10-6 mol m-2 s-1 Pa-1) and ideal gas selectivities (7.3 for H2/CO2, 15.5 for H2/N2, 16.2 for H2/CH4, and 2655 for H2/C3H8). An attractive performance for C3H6/C3H8 separation is also achieved (a C3H6 permeance of 9.9 x 10-8 mol m-2 s-1 Pa-1 and a C3H6/C3H8 ideal selectivity of 31.6 at 25 &#176;C). Overall, the ENACT process, owing to its simplicity, can be extended to synthesize intergrown thin films of a wide range of nanoporous crystalline materials.

A simple, reproducible, and versatile approach for the synthesis of intergrown, polycrystalline metal-organic framework membranes on a wide range of unmodified porous and non-porous supports is presented.

Elettroforetica cristallizzazione delle membrane ultrasottile ad alte prestazioni Metal-organic frameworks

We report the synthesis of thin, highly intergrown, polycrystalline metal-organic framework (MOF) membranes on a wide range of unmodified porous and ...

Design, Synthesis, and Photochemical Properties of Clickable Caged Compounds

Caged compounds enable the photo-mediated manipulation of the cell physiology with high spatiotemporal resolution. However, the limited structural diversity of currently available caging groups and the difficulties in synthetic modification without sacrificing their photolysis efficiencies are obstacles to expanding the repertoire of caged compounds for live cell applications. As the chemical modification of coumarin-type photo-caging groups is a promising approach for the preparation of caged compounds with diverse physical and chemical properties, we report a method for the synthesis of clickable caged compounds that can be modified easily with various functional units via the copper(I)-catalyzed Huisgen cyclization. The modular platform molecule contains a (6-bromo-7-hydroxycoumarin-4-yl)methyl (Bhc) group as a photo-caging group, which exhibits a high photolysis efficiency compared to those of the conventional 2-nitrobenzyls. General procedures for the preparation of clickable caged compounds containing amines, alcohols, and carboxylates are presented. Additional properties such as the water solubility and cell targeting ability can be readily incorporated into clickable caged compounds. Furthermore, the physical and photochemical properties, including the photolysis quantum yield, were measured and were found to be superior to those of the corresponding Bhc caged compounds. The described protocol could therefore be considered a potential solution for the lack of structural diversity in the available caged compounds.

A protocol for the synthesis and measurement of the photochemical properties of modular caged compounds with clickable moieties is presented.