This work was supported by an NSF grant (MCB-1054449) and a collaborative interdisciplinary Pilot Research Program award from The RNA Institute at University at Albany to PTXL.

1 Preparazione di RNA Molecole per singola molecola Togliersi <ol><li> Clonazione la sequenza di interesse. Clonare la sequenza di DNA corrispondente alla struttura di RNA in un vettore. </li><li> Sintesi e purificazione del template trascrizione. Sintetizzare un modello di trascrizione mediante PCR. [Tabella 1 posto qui] Avanti, purificare i prodotti di PCR utilizzando un kit di purificazione PCR, e concentrare il campione&gt; 200 ng / ml. Poiché il DNA purificato viene utilizzato per la trascrizione, RNasi acqua libera deve essere utilizzato nelle fasi di eluizione e concentrazione. </li><li> Nella trascrizione in vitro. Sintetizzare RNA da trascrizione in vitro a 37 ° C per una notte per massimizzare la resa di RNA. [Tabella 2 posto qui] Dopo la trascrizione, aggiungere 1 ml DNasi I per digerire il DNA stampo per 15 minuti a 37 ° C. Purificare l&#39;RNA utilizzando una colonna di spin di silice. </li><li> Sintesi del biotinilato maniglia A. In primo luogo, produce la maniglia non modificato A mediante PCR utilizzando primers Af e Ar e concEntrate il DNA amplificato a&gt; 200 ng / ml. Successivamente, incorporare modifiche biotina nel prodotto di PCR utilizzando una reazione di primer extension. [Luogo tabella 3 qui] NOTA: La maniglia biotinilato A (biotina-HA) può essere utilizzato direttamente nel ricottura, senza purificazione. Come la biotina-HA deve essere ricotto con l&#39;RNA, è fondamentale utilizzare RNasi acqua libera in entrambe le fasi. </li><li> Sintesi della maniglia digossigenina modificato B. Synthesize digossigenina modificato maniglia B (dig-HB) mediante PCR utilizzando fondo Bf e oligo-digossigenina modificato Dig-Br (Figura 3). Avanti, purificare il prodotto di PCR e concentrare il campione&gt; 200 ng / ml. </li><li> Ricottura RNA alle maniglie. Anneal l&#39;RNA con maniglie. [luogo tabelle 4 e 5 qui] </li><li> Purificare campione ricotto. Aggiungere 3 volumi di etanolo del campione ricotta e mescolare bene. Conservare la miscela a -70 ° C per almeno 1 ora. Spin down a 15.800 xg e scartare il surnatante. Asciugare il pellet con un liofilizzatore. Sciogliere il pellet in100 microlitri RNasi acqua libera. NOTA: Il campione è pronto per essere utilizzato e può essere conservato a -20 ° C. </li></ol> 2 Taratura e funzionamento delle pinzette ottiche <ol><li> Calibrare Pixel Dimensioni di Video Monitor <ol><li> Utilizzare la trappola ottica per intrappolare un cordone con diametro noto (dimensioni standard). </li><li> Cattura immagini di un cordone intrappolato utilizzando software di imaging (Figura 4). </li><li> Determinare il diametro della perlina utilizzando il software di imaging basata sul metodo centroide. </li><li> Ripetere questa procedura per determinare diametri di perle di varie dimensioni. </li><li> Montare i diametri misurati e conosciute di perle da una regressione lineare per ottenere la dimensione fisica di un pixel. </li></ol></li><li> Verifica Distanza di calibrazione <ol><li> Utilizzare la trappola ottica per intrappolare una perlina. </li><li> Determinare la posizione dei pixel del suo baricentro dal software di acquisizione delle immagini e registrare la propria posizione utilizzando i Minitweezers. </li><li> Steer il tallone di diffe<html> affittare posizioni e ripetere la determinazione della posizione. </li><li> Convertire le posizioni X e Y del tallone da pixel a m unità utilizzando la dimensione dei pixel calibrata. </li><li> Confrontare il X e Y tra le posizioni misurate dal video e dai Minitweezers. I due insiemi di valori dovrebbero concordare. Poiché la risoluzione dell&#39;immagine è&gt; 0,1 micron, spostare il tallone sopra 1 micron tra le misure per garantire l&#39;accuratezza. Se la calibrazione distanza non è paragonabile a quella memorizzata nei Minitweezers, ricalibrare lo strumento. </li></ol></li><li> Trappola Rigidità Calibrazione <ol><li> Catturare una perlina utilizzando la trappola ottica e tenerlo ancora. </li><li> Registrare la forza della trappola con un bypass di acquisizione veloce di dati a una velocità&gt; 5 kHz per 3 sec. </li><li> Genera uno spettro di potenza dalla registrazione del movimento tallone utilizzando il software. Montare lo spettro di potenza di un Lorentziana (Figura 5) 38: 542 / 51542eq1.jpg &quot;width =&quot; 200 &quot;/&gt; (Eq. 1) in cui S (f) è la potenza alla frequenza di f, f c è la frequenza di taglio, e S 0 è la potenza asintotica. La frequenza di taglio f c è la frequenza in cui la potenza del moto termico è sceso a metà del valore asintotico. Come f c varia con la potenza del laser e le dimensioni tallone, calibrare ogni perla intrappolati individualmente. </li><li> Calcola la costante elastica della trappola, κ, da f c: <img alt="Equazione 2" fo:content-width="1in" src="/files/ftp_upload/51542/51542eq2.jpg" width="100" /> (Eq. 2) in cui γ è il coefficiente di resistenza del tallone (Eq. 3). Utilizzare la costante della molla per determinare le variazioni di estensione di un RNA dal cambiamento vigore. </li></ol></li><li> Stokes &#39;Legge di prova <ol><li> Catturare una perlina utilizzando la trappola ottica. Spostare il tallone posteriore-e-forza a velocità diversa. </li><li> Registrare il movimento del tallone e la forza con i Minitweezers. </li><li> Calcola il raggio del tallone. NOTA: La forza di attrito, F d, generato dal moto di una particella sferica in un fluido può essere descritto dalla legge di Stokes &#39;: <img alt="Equazione 3" fo:content-width="1.5in" src="/files/ftp_upload/51542/51542eq3.jpg" width="150" /> (Eq. 3) in cui r è il raggio della sfera, v è la velocità, e h è la viscosità dinamica del fluido, che si trova in tabelle di riferimento. Utilizzando la forza misurata come F d, il raggio del cordone può essere calcolato utilizzando l&#39;Eq. 3 (Figura 6) e deve concordare con quello determinato dal software di acquisizione immagini. Il test di legge di Stokes &#39;test efficace le tarature e le prestazioni dello strumento. </li></ol></li></ol> 3. nanomanipolazione di Single RNA Molecole <ol><li> Fare fluidica. <ol><li> Praticare sei fori (mm diametro 2 ciascuno) su un vetro di copertura n ° 2 (Figura 7a) e tagliare tre fessure (larghezza 2 mm) nel lato doppio nastro poliimmide (Figura 7b) utilizzando un incisore laser. </li><li> Fare una camera di flusso da sandwich di due vetro di copertura con due strati di nastro biadesivo Kapton. Inserire una micropipetta e due tubi bypass tra il nastro (Figura 7c). </li><li> Montare la camera di flusso su un telaio metallico, facendo corrispondere i fori fluidici (Figura 7d). </li><li> Collegare i canali fluidici della camera a 10 ml siringhe riempite con tampone di scelta tramite tubi di polietilene (Figura 7e). </li><li> Montare l&#39;intera camera sulle pinzette ottiche tra i due obiettivi. Assicurarsi che il lato anteriore della camera con i canali fluidici rivolto verso destra. Ritrarre l&#39;obiettivo a destra e inserire i perni di ottone del telaio (Figura 7e) per fori di montaggio sulla tegli pinzette. Serrare le viti per fissare la posizione della camera. </li></ol></li><li> Mescolando il campione e perline ricotto. Mescolare il campione ricotto con perle anti-digossigenina-rivestite (DIG-sfere), e lasciare che la miscela di rimanere a temperatura ambiente per 5-10 minuti. Tipicamente, 1 ml di campione ricotto è mescolato con 5 microlitri dig-perle in 1 ml di tampone. NOTA: La quantità di perline da caricare nella camera di flusso deve essere scelto al fine di garantire una ragionevole quantità di perline da consegnare dal tubo bypass. Il rapporto del campione ricotto per le perline non è facilmente quantificabile. In un caso ideale, la maggior parte dei branelli hanno RNA tale che solo una piccola frazione di perline può avere solo una molecola di RNA a tallone. Mentre i campioni ricotti e la sospensione di sferette sono difficili da quantificare, il migliore e unico modo attualmente è di variare il rapporto di miscelazione e testare il composto sulle pinzette. </li><li> Invia perline al sito di reazione nella camera di flusso (cioè, alcuni micrometri in cima al mipunta cropipette, Figura 7c). <ol><li> Caricare una sospensione di perline rivestite di streptavidina (strep-sfere) in una siringa da 1 ml. </li><li> Collegare la siringa al tubo fluidico che conduce al canale inferiore della camera di flusso (figura 7a). </li><li> Spingere la siringa a scorrere le strep-perle nella camera. </li><li> Spostare l&#39;intera camera utilizzando il software di controllo del motore per posizionare la trappola ottica vicino all&#39;apertura del tubo bypass inferiore (figura 7b). Quindi azionare la trappola ottica da una trackball per catturare una strep-tallone. </li><li> Spostare il tallone vicino alla punta della micropipetta utilizzando il software di controllo del motore. </li><li> Estrarre la siringa collegata alla micropipetta a succhiare il tallone sul micropipetta. </li><li> Applicare flusso premendo delicatamente la siringa per il canale centrale per scovare strep-perline extra. </li><li> Allo stesso modo, consegnare la miscela del campione e dello scavo-perline (vedi punto 3.2) al canale superiore della camera. </li><li> Cattura uno scavo-tallone e portarlo vicino alla strep-tallone utilizzando la trappola ottica. </li><li> Pulire il canale centrale mediante l&#39;applicazione di flusso. NOTA: Il strep- e Dig-perle sono scelti per essere diverse dimensioni in modo che possano essere distinti visivamente sotto la vista microscopico (Figura 4). </li></ol></li><li> Pesca &quot;una singola molecola di legare tra una coppia di perline. <ol><li> Posizionare il dig-tallone in verticale sulla parte superiore del strep-tallone (Figura 4). </li><li> Spostare il dig-tallone verso il strep-tallone dal governare la trappola. Aprire una finestra del grafico forza-distanza sul computer per visualizzare i cambiamenti di forza. </li><li> In caso di contatto delle due perle, spostare il dig-tallone verticalmente dalla strep-tallone. </li><li> Se non viene fatto alcun contatto specifico, la forza rimane quasi zero. Se i due talloni sono collegati da molecole, la forza aumenta notevolmente quando i due talloni separati. Questa procedura, comunemente indicato come &quot;pesca&quot;, è spesso perfORMED più volte su ogni coppia di perline per trovare un efficace cavezza singola molecola. </li></ol></li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

<html> Modifica e risoluzione dei problemi in preparazione di campioni tweezing Scelta di clonazione vettoriale. Sebbene lo schema generale qui descritto (Figura 3) non richiede una speciale clonazione vettore, il vettore è preferito non avere T7 intrinseca o promotore T3 per la facilità di trascrizione tale che un promotore può essere introdotto tramite PCR in posizioni desiderate. Sequenza e Lunghezze delle manig...

Lo sviluppo della tecnica pinzette ottiche è stata a lungo accompagnato con la sua applicazione nella ricerca biologica. Quando l&#39;effetto intrappolamento ottico è stato scoperto, Arthur Ashkin osservato che i batteri in acqua contaminata potrebbero essere intrappolati nel fuoco del laser 1. Da allora, i batteri trapping è diventato un involontario, divertente esperimento per generazioni di studenti biofisica, nonché come strumento di ricerca seria per studiare la fisiologia microbica 2,3. La tecnica di intrappolamento ottico utilizza focalizzato fascio laser per immobilizzare un oggetto microscopico 1. In pratica, una funzione di limitatore laser come una molla ottico, che misura anche la forza (F) sull&#39;oggetto intrappolato dal suo spostamento dal centro della trappola (AX). Entro un breve intervallo, F = κ x AX, in κ è la costante della molla della trappola. La trappola ottica può essere utilizzato per esercitare una forza in piconewton (PN) di precisione ad un microsoggetto Copic e misurare la sua posizione con nanometri (nm) di precisione. Negli ultimi due decenni, pinzette ottiche sono diventati una delle più utilizzate tecniche di singola molecola in biofisica. La tecnica è stata impiegata per studiare piegatura e la meccanica di 4-6 DNA, RNA 7-9, e le proteine ​​10,11. Pinzette ottiche sono stati utilizzati anche per osservare la replicazione del DNA 12, trascrizione dell&#39;RNA 13, e la sintesi proteica 14,15, così come molti altri eventi biomolecolari 16-18. Approcci singola molecola sono impiegati in RNA ricerca strutturale principalmente per esplorare il paesaggio aspro energia folding di RNA. Una sequenza di RNA di solito può piegare in più stabili, strutture si escludono a vicenda, a causa delle semplici di composizione chimica e di sbucciatura base di regole di RNA. E &#39;noto da tempo che l&#39;RNA polimorfismo strutturale, come ad esempio che si verifica in riboswitches 19,20, gioca un ruolo importante nella regolazione genica. A Recent sondaggio a livello di genoma ha rivelato che le variazioni di temperatura di soli pochi gradi influenzano notevolmente la struttura e la sintesi proteica di una grande porzione del trascrittoma cellulare 21. Questo esempio suggerisce che il ruolo biologico di RNA folding alternativa è forse più importante e pervasivo di quanto precedentemente ipotizzato. Polimorfismo strutturale, tuttavia, rappresenta una sfida per i tradizionali approcci biochimici e biofisici, che esaminano le proprietà medie di molte molecole. Ad esempio, la &quot;a&quot; e conformazioni &quot;off&quot; di un riboswitch si escludono a vicenda. Una struttura media derivato da strutture eterogenee non è in grado di assomigliare uno dei conformeri biologicamente rilevanti. Inoltre, RNA non tradotta e mRNA di solito formano strutture. La loro interazione con proteine ​​e RNA regolatori comunemente richiede svolgersi della struttura esistente come parte dell&#39;interazione. Pertanto, lo studio di RNA dispiegamento / ripiegamento diventa un pertinentequestione di RNA biologia. Per rispondere a tale sfida, l&#39;approccio di singola molecola è stato impiegato per svelare RNA polimorfismo strutturale studiando una molecola alla volta 22-27. Rispetto al popolare metodo di fluorescenza singola molecola, pinzette a base meccanica dispiegarsi offre un vantaggio che conformazioni delle singole molecole possono essere manipolati con la forza applicata e essere misurate con precisione nanometrica. Questa capacità nanomanipolazione può essere utilizzato per monitorare il dispiegamento / ripiegamento dei singoli domini strutturali tali che la piegatura gerarchica di un grande RNA può essere sezionato 28. In alternativa, un singolo filo può essere diretto a piegare in uno dei diversi conformeri; o una struttura esistente può essere indotta meccanicamente per ripiegare in una diversa conformazione 29. In condizioni biologiche, una struttura di RNA può essere modificato in caso di cambio di temperatura o ligando. La capacità di manipolare direttamente s molecolariTRUTTURA apre una nuova sede di RNA studio strutturale. In linea di principio, altre tecniche meccaniche come microscopio a forza atomica e pinzette magnetiche, possono anche essere utilizzati per studiare piegatura di singole molecole di RNA. Tuttavia, tali applicazioni sono limitate soprattutto a causa della risoluzione spaziale relativamente bassa 30. L&#39;impiego di pinzette ottiche permette strutture di RNA di essere spiegati con la forza meccanica. Il vantaggio di meccanica svolgimento è diverse volte. La forza può essere usata per spiegare sia le strutture secondarie e terziarie, mentre gli ioni metallici e ligando indotta piegatura sono limitati principalmente a strutture terziarie. Temperatura e denaturante possono influenzare in modo significativo le attività di acqua e soluti. Al contrario, la forza viene applicata localmente per perturbare strutture molecolari; l&#39;effetto della forza sull&#39;ambiente circostante è trascurabile. Inoltre, la fusione termica è meglio utilizzato per studiare la termodinamica pieghevoli di piccole strutture di RNA,considerando pinzette ottiche sono stati utilizzati per studiare le strutture di RNA con diverse dimensioni, che vanno da un sette-base-pair tetraloop tornante 28 per un ribozyme 400-nucleotide 31. Inoltre, le strutture di RNA possono essere spiegati meccanicamente a temperature mesofili. In contrasto, di dispiegarsi RNA in un esperimento di fusione termica, la temperatura è in genere ben sollevato sopra temperature fisiologiche, che aumenta significativamente l&#39;RNA all&#39;idrolisi, soprattutto in presenza di ioni Mg 2 +. È importante notare che l&#39;effetto meccanico della forza dipende da come viene applicato ad una struttura. La forza applicata inclina il pieghevole panorama energetico. Ad esempio, quando la forza è applicata ad una forcina, le coppie di basi sono rotti in sequenza, uno alla volta (Figura 1a). La forcella strappo avanza lungo l&#39;asse elicoidale, che è perpendicolare alla forza applicata. Al contrario, quando un complesso baciare minima è sotto tensione, i due baciandocoppie di basi, che sono parallele alla forza applicata, condividono il carico di forza (Figura 1b). Le diverse geometrie del tornante e baciare relativo complesso al risultato forza applicata nella loro risposta meccanica differente, che può essere utilizzata per distinguere secondaria e terziaria piegatura 28,32. L&#39;aspetto teorico della meccanica svolgimento è stato già recensito 8,9,30. Questo lavoro descrive gli approcci di base per impostare ed eseguire una singola molecola meccanico test dispiegarsi. Setup sperimentale. Nel nostro esperimento trazione meccanica, il campione di RNA per tweezing è costituito da RNA di interesse affiancato da due manici a doppio filamento di DNA / RNA (Figura 2) 7. L&#39;intera molecola può essere legato a due perle di micron-size superficie rivestita (Spherotech) tramite streptavidina-biotina e interazioni anticorpi anti-digossigenina-digoxigenin rispettivamente. Una perla è detenuto da un tr ottica forza di misuraap, mentre l&#39;altra si tiene sulla punta di una micropipetta. La distanza relativa tra le perline può essere cambiato da uno sterzo trappola o spostando la micropipetta. Usando questo approccio, una singola molecola di RNA legare le perline può essere allungato e rilassato. Preparazione dei campioni. La sintesi di campioni di RNA per tweezing comprende a pochi passi (Figura 3). Innanzitutto, la sequenza di DNA corrispondente alla RNA di interesse viene dapprima clonato in un vettore plasmidico. Avanti, tre reazioni di PCR vengono eseguite per generare le due maniglie e un modello per la trascrizione. Il modello trascrizione comprende le regioni della leva e le sequenze inserite. La lunghezza totale RNA è sintetizzato in vitro trascrizione. Infine, l&#39;RNA e le maniglie modificati chimicamente sono sottoposti a ricottura insieme per generare le molecole per tweezing. Taratura e funzionamento delle pinzette. Il disegno di base dell&#39;uso Minitweezersd in questo lavoro segue quello dei dual-beam pinzette ottiche 33. Con molti miglioramenti, i Minitweezers visualizzare straordinaria stabilità rispetto alle pinzette ottiche di prima generazione. Un certo numero di gruppi di ricerca in diversi paesi utilizzano le Minitweezers nella loro ricerca singola molecola 14,15,34-37. I dettagli di costruzione, taratura e il funzionamento del dispositivo, inclusi video di istruzioni, sono disponibili sul sito &quot;Pinzetta Lab&quot; (http://tweezerslab.unipr.it). Qui, miglioramenti e procedure di calibrazione che devono essere eseguite su basi giornaliere sono descritte in dettaglio.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="745">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;width:249px;">Minitweezers</td>
			<td style="width:211px;">Steven B. Smith Engineering</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"><a href="http://tweezerslab.unipr.it/">http://tweezerslab.unipr.it</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Data acquisition card</td>
			<td style="width:211px;">National Instruments</td>
			<td style="width:119px;">USB-6351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Video card</td>
			<td style="width:211px;">National Instruments</td>
			<td style="width:119px;">PCI-1407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Labview programming software</td>
			<td style="width:211px;">National Instruments</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">NI Vision Builder</td>
			<td style="width:211px;">National Instruments</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Laser engraver</td>
			<td style="width:211px;">Epilogue laser systems</td>
			<td style="width:119px;">Zing-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;"></td>
			<td style="width:211px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">PCR purification kit</td>
			<td style="width:211px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">28104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;width:249px;">MEGAscript T7 kit</td>
			<td style="width:211px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">AM1334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">MEGAclear kit</td>
			<td style="width:211px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">AM1908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Biotin-11-UTP</td>
			<td style="width:211px;">Thermo Fisher</td>
			<td>FERR0081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">T4 DNA polymerase</td>
			<td style="width:211px;">New England Labs</td>
			<td style="width:119px;">M0203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;width:249px;">Streptavidin coated microsphere</td>
			<td style="width:211px;">Spherotech</td>
			<td style="width:119px;">SVP-20-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Antidigoxigenin coated microsphere</td>
			<td style="width:211px;">Spherotech</td>
			<td style="width:119px;">DIGP-20-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Size standard microspheres</td>
			<td style="width:211px;">Spherotech</td>
			<td style="width:119px;">PPS-6K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Kapton tape</td>
			<td style="width:211px;">Kaptontape.com</td>
			<td>KPPTDE-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">No. 2 cover glass</td>
			<td style="width:211px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">12-543D</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nanomanipulation of single rna molecules by optical tweezers

Una gran parte del genoma umano viene trascritto ma non tradotto. In questo post genomica, funzioni di regolamentazione di RNA hanno dimostrato di essere sempre più importante. Dato che la funzione RNA spesso dipende dalla sua capacità di adottare strutture alternative, è difficile prevedere RNA strutture tridimensionali direttamente dalla sequenza. Singola molecola approcci mostrano potenzialità per risolvere il problema di RNA polimorfismo strutturale monitorando strutture molecolari una molecola alla volta. Questo lavoro presenta un metodo per manipolare con precisione la piegatura e la struttura delle molecole di RNA singoli utilizzando pinzette ottiche. In primo luogo, i metodi per sintetizzare molecole adatte a singola molecola lavoro meccanico sono descritti. Avanti, diverse procedure di calibrazione per garantire le operazioni corrette delle pinzette ottiche sono discussi. Successivamente, vari esperimenti sono spiegati. Per dimostrare l&#39;utilità della tecnica, i risultati di dispiegamento meccanicamente forcine RNA e un singolo RNA kissing complesso sono utilizzati come prova. In questi esempi, la tecnica nanomanipolazione stato utilizzato per studiare piegatura di ciascun dominio strutturale, comprese secondaria e terziaria, in modo indipendente. Infine, le limitazioni e le future applicazioni del metodo sono discussi.

Limitato dallo spazio, nanomanipolazione di singole molecole di RNA è dimostrato mostrando solo esempi meccanici dispiegarsi di forcine RNA e di un RNA con struttura terziaria. Manipolare singolo Hairpin Molecole Una volta che una pastoia è stabilito tra le perle, l&#39;estensione di e vigore alla cavezza possono essere manipolati tramite un protocollo definito dall&#39;utente. Quattro protocolli comuni di manipolazione sono comunemente usati. ...

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Nanomanipulation of Single RNA Molecules by Optical Tweezers

Optical tweezers have been used to study RNA folding by stretching individual molecules from their 5&#8217; and 3&#8217; ends. Here common procedures are described to synthesize RNA molecules for tweezing, calibration of the instrument, and methods to manipulate single molecules.

Nanomanipolazione di Single RNA Molecole da pinzette ottiche

A large portion of the human genome is transcribed but not translated. In this post genomic era, regulatory functions of RNA have been shown to be ...

nanomanipulation-of-single-rna-molecules-by-optical-tweezers

Research

JoVE Journal

Bioengineering

14.7K Views.  University at Albany, State University of New York. Optical tweezers have been used to study RNA folding by stretching individual molecules from their 5’ and 3’ ends. Here common procedures are described to synthesize RNA molecules for tweezing, calibration of the instrument, and methods to manipulate single molecules. 

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Stretching Short Sequences of DNA with Constant Force Axial Optical Tweezers

Single-molecule techniques for stretching DNA of contour lengths less than a kilobase are fraught with experimental difficulties. However, many interesting biological events such as histone binding and protein-mediated looping of DNA1,2, occur on this length scale. In recent years, the mechanical properties of DNA have been shown to play a significant role in fundamental cellular processes like the packaging of DNA into compact nucleosomes and chromatin fibers3,4. Clearly, it is then important to understand the mechanical properties of short stretches of DNA. In this paper, we provide a practical guide to a single-molecule optical tweezing technique that we have developed to study the mechanical behavior of DNA with contour lengths as short as a few hundred basepairs.
The major hurdle in stretching short segments of DNA is that conventional optical tweezers are generally designed to apply force in a direction lateral to the stage5,6, (see Fig. 1). In this geometry, the angle between the bead and the coverslip, to which the DNA is tethered, becomes very steep for submicron length DNA. The axial position must now be accounted for, which can be a challenge, and, since the extension drags the microsphere closer to the coverslip, steric effects are enhanced. Furthermore, as a result of the asymmetry of the microspheres, lateral extensions will generate varying levels of torque due to rotation of the microsphere within the optical trap since the direction of the reactive force changes during the extension.
Alternate methods for stretching submicron DNA run up against their own unique hurdles. For instance, a dual-beam optical trap is limited to stretching DNA of around a wavelength, at which point interference effects between the two traps and from light scattering between the microspheres begin to pose a significant problem. Replacing one of the traps with a micropipette would most likely suffer from similar challenges. While one could directly use the axial potential to stretch the DNA, an active feedback scheme would be needed to apply a constant force and the bandwidth of this will be quite limited, especially at low forces.
We circumvent these fundamental problems by directly pulling the DNA away from the coverslip by using a constant force axial optical tweezers7,8. This is achieved by trapping the bead in a linear region of the optical potential, where the optical force is constant-the strength of which can be tuned by adjusting the laser power. Trapping within the linear region also serves as an all optical force-clamp on the DNA that extends for nearly 350 nm in the axial direction. We simultaneously compensate for thermal and mechanical drift by finely adjusting the position of the stage so that a reference microsphere stuck to the coverslip remains at the same position and focus, allowing for a virtually limitless observation period.

We illustrate the use of a constant force axial optical tweezers to explore the mechanical properties of short DNA molecules. By stretching DNA axially, we minimize steric hindrances and artifacts arising in conventional lateral manipulation, allowing us to study DNA molecules as short as ~100 nm.

Stretching brevi sequenze di DNA con pinzette costante forza assiale ottici

Single-molecule techniques for stretching DNA of contour lengths  less than a kilobase are fraught with experimental difficulties. However, many ...

Ricerca

Bioingegneria

Multiplexed Single-molecule Force Proteolysis Measurements Using Magnetic Tweezers

The generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology, with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 and wound healing3. In each of these examples, cells both exert force on their surroundings and simultaneously enzymatically remodel the extracellular matrix (ECM). The effect of forces on ECM has thus become an area of considerable interest due to its likely biological and medical importance4-7.
	Single molecule techniques such as optical trapping8, atomic force microscopy9, and magnetic tweezers10,11 allow researchers to probe the function of enzymes at a molecular level by exerting forces on individual proteins. Of these techniques, magnetic tweezers (MT) are notable for their low cost and high throughput. MT exert forces in the range of ~1-100 pN and can provide millisecond temporal resolution, qualities that are well matched to the study of enzyme mechanism at the single-molecule level12. Here we report a highly parallelizable MT assay to study the effect of force on the proteolysis of single protein molecules. We present the specific example of the proteolysis of a trimeric collagen peptide by matrix metalloproteinase 1 (MMP-1); however, this assay can be easily adapted to study other substrates and proteases.

In this article we describe the use of magnetic tweezers to study the effect of force on enzymatic proteolysis at the single molecule level in a highly parallelizable manner.

Multiplex singola molecola Forza Misure proteolisi con delle pinzette magnetiche

The  generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology,  with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 ...

In vitro Synthesis of Native, Fibrous Long Spacing and Segmental Long Spacing Collagen

Collagen fibrils are present in the extracellular matrix of animal tissue to provide structural scaffolding and mechanical strength. These native collagen fibrils have a characteristic banding periodicity of ~67 nm and are formed in vivo through the hierarchical assembly of Type I collagen monomers, which are 300 nm in length and 1.4 nm in diameter. In vitro, by varying the conditions to which the monomer building blocks are exposed, unique structures ranging in length scales up to 50 microns can be constructed, including not only native type fibrils, but also fibrous long spacing and segmental long spacing collagen. Herein, we present procedures for forming the three different collagen structures from a common commercially available collagen monomer. Using the protocols that we and others have published in the past to make these three types typically lead to mixtures of structures. In particular, unbanded fibrils were commonly found when making native collagen, and native fibrils were often present when making fibrous long spacing collagen. These new procedures have the advantage of producing the desired collagen fibril type almost exclusively. The formation of the desired structures is verified by imaging using an atomic force microscope.

In vitro Synthesis of Native, Fibrous Long Spacing and Segmental Long Spacing Collagen

Simple and reproducible procedures are described for making three structurally distinct collagen assemblies from a common commercially available Type I collagen monomer. Native type, fibrous long spacing or segmental long spacing collagen can be constructed by varying the conditions to which the 300 nm long and 1.4 nm diameter monomer building block is exposed.

In sintesi in vitro di Native, Spaziatura fibrosa lungo e segmentale collagene spaziatura lungo

Collagen fibrils are present in the  extracellular matrix of animal tissue to provide structural scaffolding and  mechanical strength. These native ...

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a model microorganism. The biosensor relies on direct binding of the target bacteria cells onto its surface, while no pretreatment (e.g.&#160;by cell lysis) of the studied sample is required. A mesoporous Si thin film is used as the optical transducer element of the biosensor. Under white light illumination, the porous layer displays well-resolved Fabry-P&#233;rot fringe patterns in its reflectivity spectrum. Applying a fast Fourier transform (FFT) to reflectivity data results in a single peak. Changes in the intensity of the FFT peak are monitored. Thus, target bacteria capture onto the biosensor surface, through antibody-antigen interactions, induces measurable changes in the intensity of the FFT peaks, allowing for a &#39;real time&#39; observation of bacteria attachment.
The mesoporous Si film, fabricated by an electrochemical anodization process, is conjugated with monoclonal antibodies, specific to the target bacteria. The immobilization, immunoactivity and specificity of the antibodies are confirmed by fluorescent labeling experiments. Once the biosensor is exposed to the target bacteria, the cells are directly captured onto the antibody-modified porous Si surface. These specific capturing events result in intensity changes in the thin-film optical interference spectrum of the biosensor. We demonstrate that these biosensors can detect relatively low bacteria concentrations (detection limit of 104 cells/ml) in less than an hour.

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor for rapid bacteria detection is introduced. The biosensor is based on a nanostructured porous Si, which is designed to directly capture the target bacteria cells onto its surface. We use monoclonal antibodies, immobilized onto the porous transducer, as the capture probes. Our studies demonstrate the applicability of these biosensors for the detection of low bacterial concentrations within minutes with no prior sample processing (such as cell lysis).

Rilevamento ottico di<em&gt; E. coli</em&gt; Batteri di mesoporosi Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a ...

Magnetic Tweezers for the Measurement of Twist and Torque

Single-molecule techniques make it possible to investigate the behavior of individual biological molecules in solution in real time. These techniques include so-called force spectroscopy approaches such as atomic force microscopy, optical tweezers, flow stretching, and magnetic tweezers. Amongst these approaches, magnetic tweezers have distinguished themselves by their ability to apply torque while maintaining a constant stretching force. Here, it is illustrated how such a &#8220;conventional&#8221; magnetic tweezers experimental configuration can, through a straightforward modification of its field configuration to minimize the magnitude of the transverse field, be adapted to measure the degree of twist in a biological molecule. The resulting configuration is termed the freely-orbiting magnetic tweezers. Additionally, it is shown how further modification of the field configuration can yield a transverse field with a magnitude intermediate between that of the &#8220;conventional&#8221; magnetic tweezers and the freely-orbiting magnetic tweezers, which makes it possible to directly measure the torque stored in a biological molecule. This configuration is termed the magnetic torque tweezers. The accompanying video explains in detail how the conversion of conventional magnetic tweezers into freely-orbiting magnetic tweezers and magnetic torque tweezers can be accomplished, and demonstrates the use of these techniques. These adaptations maintain all the strengths of conventional magnetic tweezers while greatly expanding the versatility of this powerful instrument.

Magnetic tweezers, a powerful single-molecule manipulation technique, can be adapted for the direct measurements of the twist (using a configuration called freely-orbiting magnetic tweezers) and torque (using a configuration termed magnetic torque tweezers) in biological macromolecules. Guidelines for performing such measurements are given, including applications to the study of DNA and associated nucleo-protein filaments.

Pinzetta magnetici per la misurazione di Twist and Torque

Single-molecule techniques make it possible to investigate the behavior of individual biological molecules in solution in real time. These techniques ...

Fluorescence Biomembrane Force Probe: Concurrent Quantitation of Receptor-ligand Kinetics and Binding-induced Intracellular Signaling on a Single Cell

Membrane receptor-ligand interactions mediate many cellular functions. Binding kinetics and downstream signaling triggered by these molecular interactions are likely affected by the mechanical environment in which binding and signaling take place. A recent study demonstrated that mechanical force can regulate antigen recognition by and triggering of the T-cell receptor (TCR). This was made possible by a new technology we developed and termed fluorescence biomembrane force probe (fBFP), which combines single-molecule force spectroscopy with fluorescence microscopy. Using an ultra-soft human red blood cell as the sensitive force sensor, a high-speed camera and real-time imaging tracking techniques, the fBFP is of ~1 pN (10-12 N), ~3 nm and ~0.5 msec in force, spatial and temporal resolution. With the fBFP, one can precisely measure single receptor-ligand binding kinetics under force regulation and simultaneously image binding-triggered intracellular calcium signaling on a single live cell. This new technology can be used to study other membrane receptor-ligand interaction and signaling in other cells under mechanical regulation.

We describe a technique for concurrently measuring force-regulated single receptor-ligand binding kinetics and real-time imaging of calcium signaling in a single T lymphocyte.

Fluorescenza Biomembrane Forza Probe: quantificazione simultanea di Cinetica recettore-ligando e Binding-indotta intracellulare segnalazione su una singola cella

Membrane receptor-ligand interactions mediate many cellular functions. Binding kinetics and downstream signaling triggered by these molecular interactions ...

Delivery of Proteins, Peptides or Cell-impermeable Small Molecules into Live Cells by Incubation with the Endosomolytic Reagent dfTAT

Macromolecular delivery strategies typically utilize the endocytic pathway as a route of cellular entry. However, endosomal entrapment severely limits the efficiency with which macromolecules penetrate the cytosolic space of cells. Recently, we have circumvented this problem by identifying the reagent dfTAT, a disulfide bond dimer of the peptide TAT labeled with the fluorophore tetramethylrhodamine. We have generated a fluorescently labeled dimer of the prototypical cell-penetrating peptide (CPP) TAT, dfTAT, which penetrates live cells and reaches the cytosolic space of cells with a particularly high efficiency. Cytosolic delivery of dfTAT is achieved in multiple cell lines, including primary cells. Moreover, delivery does not noticeably impact cell viability, proliferation or gene expression. dfTAT can deliver small molecules, peptides, antibodies, biologically active enzymes and a transcription factor. In this report, we describe the protocols involved in dfTAT synthesis and cellular delivery. The manuscript describes how to control the amount of protein delivered to the cytosolic space of cells by varying the amount of protein administered extracellularly. Finally, the current limitations of this new technology and steps involved in validating delivery are discussed. The described protocols should be extremely useful for cell-based assays as well as for the ex vivo manipulation and reprogramming of cells.

We describe how to deliver proteins and cell-impermeable small molecules into cultured mammalian cells by a simple co-incubation protocol with a reagent that causes endocytic organelles to become leaky.

Consegna di proteine, peptidi o cella-impermeabile piccole molecole in cellule vive mediante incubazione con il reagente Endosomolytic dfTAT

Macromolecular delivery strategies typically utilize the endocytic pathway as a route of cellular entry. However, endosomal entrapment severely limits the ...

Label-free Single Molecule Detection Using Microtoroid Optical Resonators

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental studies on the behavior of molecules. Single molecule detection techniques commonly utilize labels such as fluorescent tags or quantum dots, however, labels are not always available, increase cost and complexity, and can perturb the events being studied. Optical resonators have emerged as a promising means to detect single molecules without the use of labels. Currently the smallest particle detected by a non-plasmonically-enhanced bare optical resonator system in solution is a 25 nm polystyrene sphere1. We have developed a technique known as Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER) that can surpass this limit and achieve label-free single molecule detection in aqueous solution2. As signal strength scales with particle volume, our work represents a &#62; 100x improvement in the signal to noise ratio (SNR) over the current state of the art. Here the procedures behind FLOWER are presented in an effort to increase its usage in the field.

We have developed a label-free biosensing system based on optical resonator technology known as Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER) that is capable of detecting single molecules in solution. Here the procedures behind this work are described and presented.

Singola molecola di rilevamento senza etichetta di testo usando Microtoroid ottici Risonatori

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental ...

Optical Control of Living Cells Electrical Activity by Conjugated Polymers

Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated polymers display several optimal properties as substrates for biological systems, such as good biocompatibility, excellent mechanical properties, cheap and easy processing technology, and possibility of deposition on light, thin and flexible substrates. These materials have been employed for cellular interfaces like neural probes, transistors for excitation and recording of neural activity, biosensors and actuators for drug release. Recent experiments have also demonstrated the possibility to use conjugated polymers for all-optical modulation of the electrical activity of cells. Several in-vitro study cases have been reported, including primary neuronal networks, astrocytes and secondary line cells. Moreover, signal photo-transduction mediated by organic polymers has been shown to restore light sensitivity in degenerated retinas, suggesting that these devices may be used for artificial retinal prosthesis in the future. All in all, light sensitive conjugated polymers represent a new approach for optical modulation of cellular activity.
In this work, all the steps required to fabricate a bio-polymer interface for optical excitation of living cells are described. The function of the active interface is to transduce the light stimulus into a modulation of the cell membrane potential. As a study case, useful for in-vitro studies, a polythiophene thin film is used as the functional, light absorbing layer, and Human Embryonic Kidney (HEK-293) cells are employed as the biological component of the interface. Practical examples of successful control of the cell membrane potential upon stimulation with light pulses of different duration are provided. In particular, it is shown that both depolarizing and hyperpolarizing effects on the cell membrane can be achieved depending on the duration of the light stimulus. The reported protocol is of general validity and can be straightforwardly extended to other biological preparations.

A method for stimulation of in-vitro cell cultures electrical activity with visible light, based on the use of organic semiconducting polymers is described.

Controllo ottico di cellule viventi attività elettrica da coniugati Polimeri

Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated ...

Development of Microfluidic Devices to Study the Elongation Capability of Tip-growing Plant Cells in Extremely Small Spaces

In vivo, tip-growing plant cells need to overcome a series of physical barriers; however, researchers lack the methodology to visualize cellular behavior in such restrictive conditions. To address this issue, we have developed growth chambers for tip-growing plant cells that contain a series of narrow, micro-fabricated gaps (~1 &#181;m) in a poly-dimethylsiloxane (PDMS) substrate. This transparent material allows the user to monitor tip elongation processes in individual cells during microgap penetration by time-lapse imaging. Using this experimental platform, we observed morphological changes in pollen tubes as they penetrated the microgap. We captured the dynamic changes in the shape of a fluorescently labeled vegetative nucleus and sperm cells in a pollen tube during this process. Furthermore, we demonstrated the capability of root hairs and moss protonemata to penetrate the 1 &#181;m gap. This in vitro platform can be used to study how individual cells respond to physically constrained spaces and may provide insights into tip-growth mechanisms.

We describe a method to investigate the capability of tip-growing plant cells, including pollen tubes, root hairs, and moss protonemata, to elongate through extremely narrow gaps (~1 &#181;m) in a microfluidic device.

Sviluppo di dispositivi microfluidici per studiare la capacità di allungamento di punta-coltivazione di cellule vegetali in spazi estremamente ridotti

In vivo, tip-growing plant cells need to overcome a series of physical barriers; however, researchers lack the methodology to visualize cellular behavior ...