Ringraziamo il Dott. Yih-Fan Chen per un aiuto con le pinzette ottiche assiali e per contributo di alcuni dei suoi dati che si estende a questo manoscritto. Questo lavoro è stato sponsorizzato da NSF concedere PHY-0957293 e FOCUS concessione PHY-0114336.

1. Pinzette di installazione <ol><li> Il fascio di un laser 1064 nm è divisa in due fasci polarizzati ortogonalmente. Uno è usato per manipolare la biomolecola mentre l&#39;altro viene usato per scopi di taratura (vedi fig. 2). </li><li> L&#39;intensità del fascio di manipolazione è controllato da un acustoottico deflettore (AOD), mentre la posizione e la messa a fuoco di ogni fascio viene controllata indipendentemente da specchi di orientamento del fascio e telescopi ottici, rispettivamente. </li><li> Le travi vengono poi ricombinati con un altro divisore di fascio polarizzante e condizionato ulteriormente una serie finale di ottiche telescopiche per riempire troppo leggermente l&#39;apertura posteriore dell&#39;obiettivo microscopio. Aletta 50% per il fascio di taratura porta ad una trappola stretta ottico, mentre un fattore leggermente minore per il fascio manipolazione, circa il 20%, dà un focus meno profondo che si traduce in una regione più grande praticità lo potenziale lineare. Le travi sono ben focalizzato da un obj 60x/1.4 microscopio Planapo immersione in oliocace sulla cella campione. </li><li> Questa configurazione pinzette è combinato con un microscopio casa costruita brightfield che fornisce l&#39;illuminazione di una lampada alogena focalizzata sulla camera campione da un condensatore. L&#39;immagine brightfield è separata dalla luce laser da uno specchio dicroico e poi ripreso da due telecamere CCD. Si agisce CCD come i mezzi primari di acquisizione dati e software è attivato per ottenere frequenze di campionamento precisi, mentre l&#39;altra CCD viene usato per una microsfera singola immagine di riferimento la cui posizione bloccata serve come retroazione sistema di controllo per compensare la deriva nel microscopio. </li><li> Il campione viene grossolanamente posizionato rispetto all&#39;obiettivo da uno stadio XY, e possono quindi essere posizionati con precisione da una montatura tridimensionale piezo-stadio. </li><li> La luce laser diffusa in avanti e trasmessa viene raccolta dal condensatore chiaro e focalizzato su un fotorivelatore. Il segnale risultante viene filtrata attraverso un filtro anti-aliasing a 100 kHz, amplificata ecquired a 200 kHz con una scheda DAQ. </li></ol> 2. Calibrazione dimensione apparente del tallone alla posizione assiale <ol><li> Caricare una camera del campione 9 con una soluzione di disperdere 800 nm microsfere di polistirene diametro diluito in tampone fosfato salino. Lasciare riposare per 10-15 minuti e poi leggermente a filo con il tampone per rimuovere l&#39;eccesso microsfere. </li><li> Individuare una microsfera casualmente attaccato al coprioggetti e regolare l&#39;altezza della camera del campione fino a quando la microsfera è circa 1 micron sotto il fuoco per generare una immagine sfocata. </li><li> Per misurare la dimensione apparente dell&#39;immagine, prima trovare il centro della microsfera utilizzando il modello geometrico corrispondente funzione in LabView. </li><li> Successivamente, generare un profilo radiale dell&#39;intensità della microsfera facendo la media di 360 ° intorno al centro di ciascuna sezione trasversale. Il profilo radiale, che corrisponde ad un anello bianco in ciascuna delle immagini chiaro, può essere dotato di una funzione quadratica di trovareun picco di luminosità. La distanza tra il picco e il centro può essere usato come misura della dimensione apparente del tallone. </li><li> Utilizzando il piezostage calibrato, aumentare gradualmente la posizione assiale della microsfera e acquisire un&#39;immagine in ciascuna posizione assiale con la camera CCD. </li><li> Ripetere l&#39;analisi dell&#39;immagine per ogni immagine successiva correlare la dimensione apparente della microsfera con la sua posizione assiale (vedi fig. 3). La risoluzione assiale ottenuta con metodo è circa 1,4 nm 7. </li></ol> 3. Mappatura del potenziale ottico del fascio Manipolazione <ol><li> Iniziare collinearly allineando il fascio manipolazione e il fascio di taratura. Il fascio di calibrazione dovrebbe essere di circa 50 mW in corrispondenza dell&#39;apertura posteriore dell&#39;obiettivo mentre il fascio manipolazione dovrebbe essere molto più debole, diciamo 10 mW. </li><li> Con il fascio manipolazione spento, confinare una microsfera libero all&#39;interno della trappola molto più rigido del fascio di taratura. </li><li> Ora, accendere la manilazione del fascio. Poiché il fascio manipolazione è molto più debole del fascio di taratura, la posizione assiale della microsfera sarà leggermente perturbata. Conseguente cambiamento di posizione assiale può essere misurata dalle immagini defocused campo chiaro come già descritto. </li><li> Spegnere il fascio con la manipolazione e microsfere ancora intrappolato nel fascio di taratura, spostare il centro assiale del fascio di taratura regolando la lente telescopica. Accendere la luce manipolazione, misurare lo spostamento successivo della microsfera e ripetere. </li><li> L&#39;AX spostamenti può essere rilevata in posizione assiale del fuoco del fascio di taratura. La posizione assiale corrispondente alla cilindrata massima della microsfera determina il centro della regione lineare della trappola ottica (vedi fig. 4). </li><li> Il passo finale per ottenere la forza ottica del fascio manipolazione in funzione della posizione assiale richiede una misurazione accurata della rigidità deltaratura del fascio. Per ottenere questo, spostare la microsfera, intrappolati dal fascio di taratura, a circa un micrometro sopra la superficie regolando la lente telescopica mentre il fascio di manipolazione è spento. </li><li> Registrare il movimento termico assiale della microsfera misurando l&#39;intensità della luce trasmessa con un fotorivelatore. </li><li> L&#39;autocorrelazione del segnale può essere montato su una singola funzione di decadimento esponenziale per dare la costante di tempo delle fluttuazioni,. Τ z </li><li> Il coefficiente di attrito idrodinamico ζ, della microsfera può essere corretta per la vicinanza microsfere ad una superficie di 5,10. La rigidità della trappola di calibrazione è dato poi da κ z = ζ / τ z (vedi Materiali complementari A e B). </li><li> Conoscendo la rigidità della trappola di calibrazione consente di convertire gli spostamenti assiali misurate in precedenza in vigore ƒ z = κ z Integrazione AX di this produce una curva di mappatura spaziale del potenziale assiale ottico del fascio manipolazione (vedi fig. 4). </li></ol> 4. Stretching un campione di DNA <ol><li> Montare la camera 9 contenenti molecole di DNA superficie frenati (&lt;1 kbp) e, osservando l&#39;immagine chiaro, posizionare il fuoco del fascio manipolazione leggermente sopra la stirata microsfere regolando il telescopio. Quindi regolare la posizione della fase finché una delle microsfere è intrappolato. </li><li> Approssimativamente posizionare il microsfere al centro del piano XY della trappola ottica. Generare una serie di onde quadre in LabView e inviarli al AOD girare ripetutamente il raggio laser e spegnimento. Controllare attentamente l&#39;intensità del laser e la durata dello stato acceso per evitare riscaldamento della camera campione. In genere, utilizzare circa 2 mW di laser di potenza (misurata l &#39;apertura posteriore dell&#39;obiettivo) e inviare impulsi di 200 ms (on) e 500 ms (spento). L&#39;ampiezza del quadrato wave inviato al AOD dovrebbe essere di circa 0,5 V. </li><li> Guarda il microsfere come la trappola viene ripetutamente acceso e spento e annotare se il laser non provoca alcuna direzione preferenziale al moto della microsfere di. Mentre iterativamente la posizione microsfere sia nella direzione X e Y, controllando la piezostage, il movimento casuale della microsfera dovrebbe diventare isotropo nel piano XY, sebbene notevolmente limitato quando il laser è acceso. </li><li> Quindi, allineare il tallone nella direzione Z. Nuovo impulso il raggio laser e spegnimento mentre, questa volta, misurare simultaneamente lo spostamento assiale microsfere in tempo reale. Centro di fase all&#39;interno della regione lineare, che è il punto in cui lo spostamento Z è maggiore. </li><li> Dopo un attento allineamento nella direzione Z, è imperativo controllare che la trappola è ancora centrato nel piano XY. Se l&#39;allineamento XY è cambiato, sia l&#39;allineamento XY e Z deve essere ripetuta finché la microsfera sia centrata lungo i treassi. </li><li> Per l&#39;allungamento del DNA, l&#39;intensità del laser rampa inviando un segnale di tensione al AOD, da 0 V a 0,5 V a passi di 0,025 V. In ogni passo, registrare 400 fotogrammi a 100 fps medi e loro di ottenere lo spostamento assiale. </li><li> Le curve forza di estensione possono essere tracciati e in forma a un modello modificato WLC 11 (vedi Materiali complementari B). </li></ol> 5. Rappresentante dei risultati: Presentiamo curve forza di estensione per due sequenze di DNA: un 1298 bp e 247 bp di sequenza, quest&#39;ultimo essendo più breve sequenza siamo stati in grado di allungare riproducibile. Per brevi tratti di DNA, convenzionale Worm-Like a catena (WLC) modello non spiega completamente il rapporto forza di estensione perché a queste scale di lunghezza si deve tenere conto per finita dimensioni effetti e l&#39;estensione forza uguale a zero derivanti dai vincoli al contorno. Le misure di forza di estensione, quindi, devono essere in forma con un modello modificato WLC che ha un efficave lunghezza di persistenza e di una forza di estensione pari a zero come parametri di fit, descritti ulteriormente nei materiali supplementari. Per lunghezze contorno grandi dsDNA, la lunghezza effettiva persistenza è semplicemente la lunghezza di persistenza nominale (~ 50 nm) e la forza di estensione zero può essere trascurato. Tuttavia, poiché la lunghezza del profilo si accorcia la lunghezza di persistenza reale diminuisce ben inferiore a 50 nm e il DNA, anche in forza zero, mostra una significativa estensione. I dati e le crisi corrispondenti curve di estensione delle forze sono mostrati in figura. 5 per le due sequenze. Dal WLC modificato adatta, abbiamo determinato le lunghezze di persistenza efficaci da 35 nm per il 1298 bp del DNA e 25 nm per 247 bp. A scopo illustrativo, stiamo presentando singole misure delle curve di estensione la forza per ogni sequenza. In pratica, si potrebbe ripetere le misure più volte e ottenere i risultati medi insieme con gli errori standard. Si deve anche notare that previo ogni curva è fondamentale garantire che la microsfera rimane intrappolato e posizionati correttamente all&#39;interno della regione lineare, altrimenti la microsfera deve essere riallineata come precedentemente descritto nel protocollo. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3405/3405fig1.jpg" /> Figura 1 Principio della assiali pinzette ottiche. (Sinistra) convenzionale trappola ottica pinzette presso il fuoco. Il tallone viene poi spostato lateralmente alla coprioggetto per esercitare tensione. (Destro) In assiali pinzette ottiche, una microsfera viene intrappolato dal fuoco, nella regione lineare del potenziale ottico. In questa configurazione, il polimero viene tenuto sotto tensione costante per un intervallo di estensioni. Inoltre, aumentando l&#39;intensità del laser sposta il microsfere nella direzione assiale. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3405/3405fig2.jpg" /> Figura 2 Schema delAssiali pinzette ottiche luce laser (1064nm Nd: YVO 4). È divisa in due fasci passando attraverso un divisore di fascio polarizzante (PBS). Il fascio manipolazione, passa attraverso un deflettore acusto-ottico (AOD) e il fascio di taratura può essere regolata in modo indipendente utilizzando lenti telescopiche. I due fasci vengono poi ricombinati utilizzando un altro PBS e focalizzato sul campione da un obiettivo elevata NA. Contemporaneamente, brightfield illuminazione utilizzato per tenere traccia della microsfera, passa attraverso il campione, è infrarossi (IR) viene poi filtrato e ripreso da due telecamere CCD, uno dei quali prende misurazioni mentre gli altri atti come parte di un sistema di controllo in retroazione. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3405/3405fig3.jpg" /> Figura 3 Calibrazione posizione assiale. Per calibrare la posizione assiale, abbiamo acquisire immagini sfocate di un tallone attaccato alla coprioggetto camera a diverse posizioni assiali di fase. La dimensione del microsmosfera è data dalla distanza tra il centro e la posizione del picco di intensità luminosa per l&#39;anello formato attorno all&#39;immagine della microsfera. L&#39;inserto presenta la distribuzione radiale dell&#39;intensità che dà la dimensione del tallone. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3405/3405fig4.jpg" /> Figura 4 principio dietro Mappatura del potenziale ottico. Per mappare la forza ottica del fascio manipolazione, lo spostamento assiale che induce in una microsfera intrappolati all&#39;interno di un fascio di taratura molto più forte è misurata. Il centro della regione lineare dove questo spostamento è massimo si trova. La Forza ottica curva della posizione assiale può essere integrato per trovare il potenziale ottico. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3405/3405fig5.jpg" /> Figura 5 Curva forza di estensione. Dato viene mostrato per una casuale 1.298 bp e 247 bp (nel riquadro) Segment di dsDNA allungato da assiali pinzette ottiche. I punti di dati erano idonei al WLC modificato modello di Eq. 3 (linee continue) e prodotto persistenza lunghezze effettive di 34 nm e 25 nm per la rispettivamente 1298bp e ​​247bp.

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N., Meiners, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Femtonewton+entropic+forces+can+control+the+formation+of+protein-mediated+DNA+loops.">Femtonewton entropic forces can control the formation of protein-mediated DNA loops.</a> Phys. Rev. Lett. 104, 048301-048301 (2010).</li><li>Raghunathan, K., Milstein, J. N., Juliar, B., Blaty, J., Meiners, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+Dependent+Effects+on+the+Elasticity+of+Short+DNA+Molecules.">Sequence Dependent Effects on the Elasticity of Short DNA Molecules.</a> , (2011).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Pinzette ottiche convenzionali invocare o retroazione analogica o controllato dal computer per applicare una forza costante su un oggetto rifrangenti. Questi sistemi di feedback attivi hanno difficoltà a svolgere in condizioni in cui sbalzi l&#39;estensione del campione si verificano, per esempio, dal legame di una proteina di DNA o il passo rapido di un motore molecolare lungo un filamento. Vari metodi passivi per applicare forze costanti sono recentemente sviluppate. Un tale metodo, utilizzato per risolvere l&#39;int...

<table border="1"><tbody><tr><th> Reagente / attrezzature </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Commenti </th></tr><tr><td> Laser Nd: YVO4 </td><td> Spectra Physics </td><td> T40-Z-106C </td><td></td></tr><tr><td> Acustoottico deflettore </td><td> IntraAction </td><td> DTD-274HA6 </td><td></td></tr><tr><td> Obiettivo Microscopio </td><td> Olimpo </td><td> Planapo </td><td> 60X, NA 1,4 </td></tr><tr><td> Piezo fase </td><td> Mad City Labs </td><td> Nano-LP100 </td><td> XYZ fase </td></tr><tr><td> Telecamera CCD </td><td> PIXELINK </td><td> PL-A741 </td><td></td></tr><tr><td> Rilevatori </td><td> Electro-Optics Tech </td><td> ET-3020 </td><td></td></tr><tr><td> Polistirolo Perline </td><td> Spherotech </td><td> SVP-08-10 </td><td> 800nm, streptavidina rivestito </td></tr><tr><td> Anti-digossigenina </td><td> Roche </td&gt; <td> 11333089001 </td><td> Dalla pecora </td></tr><tr><td> Primers </td><td> MWG operone </td><td> Oligo personalizzati </td><td> Una mano di fondo: biotina Altro: digossigenina </td></tr><tr><td> Reagenti PCR </td><td> Nuova Inghilterra Biolabs </td><td> TAQ polimerasi, dNTP </td><td></td></tr><tr><td> Vetrino </td><td> Fisher Scientific </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Altri prodotti chimici per bufferizzare </td><td> Fisher Scientific </td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Materiali complementari A. Coefficiente di attrito idrodinamico Per la determinazione del coefficiente di attrito idrodinamico della microsfera prossimità di una superficie si possono usare le seguenti 5,10 espansione: <img src="/files/ftp_upload/3405/3405eq1.jpg" alt="Equazione 1" /> dove la h stenografia seguentecome state introdotte: <img src="/files/ftp_upload/3405/3405eq2.jpg" alt="Equazione 2" /> Il coefficiente di attrito è definito in termini di viscosità η del fluido e il raggio della microsfera, con il centro di microsfere di una distanza η situato sopra la superficie. La sommatoria converge abbastanza bene quando ampliato per una decina di termini. Influenza B. della posizione assiale sulla stazzatura Rigidità La taratura della rigidità trappola comporta un compromesso tra la precisione della calibrazione, che aumenta con l&#39;aumentare della distanza dalla superficie, e la posizione assiale effettivo in cui viene utilizzata la trappola sperimentalmente. In generale, la trappola viene tarato a circa 800-1000 nm dalla superficie, che è superiore alla effettiva condizione sperimentale. C. modificato Worm-Like a catena (WLC) Modello Le curve forza di estensione può essere adatto ad un WLC modificato modello che tiene conto degli effetti di volume di esclusione a zero forza ottica nel modo seguente: <img src="/files/ftp_upload/3405/3405eq3.jpg" alt="Equazione 3" /> dove F è la forza opt ottico, X o è un parametro di misura per la forza di estensione zero, x opt è l&#39;estensione in vigore, L è la lunghezza del profilo del DNA, e L * p è un parametro di misura secondo un &quot;efficace &quot;lunghezza di persistenza. F wlc è dato dal consueto modello WLC 11 <img src="/files/ftp_upload/3405/3405eq4.jpg" alt="Equazione 4" /> dove ε è l&#39;estensione di DNA relativo.

stretching short sequences of dna with constant force axial optical tweezers

Singola molecola tecniche di allungamento del DNA di lunghezze di profilo meno di un kilobasi sono irto di difficoltà sperimentali. Tuttavia, molti interessanti eventi biologici come legame istoni e proteine ​​mediata da loop di DNA 1,2, si verificano su questa scala di lunghezza. In anni recenti, le proprietà meccaniche del DNA hanno dimostrato di giocare un ruolo significativo nel fondamentali processi cellulari come il confezionamento di DNA in nucleosomi compatti e fibre cromatina 3,4. Chiaramente, è quindi importante capire le proprietà meccaniche dei brevi tratti di DNA. In questo lavoro forniamo una guida pratica di una tecnica singola molecola tweezing ottica che abbiamo sviluppato per studiare il comportamento meccanico del DNA con lunghezza di contorno più corti a poche centinaia di paia di basi. L&#39;ostacolo principale che si estende in brevi segmenti di DNA è che convenzionali pinzette ottiche sono generalmente progettati per applicare la forza in un direction laterale alla fase 5,6, (vedi fig. 1). In questa geometria, l&#39;angolo tra il tallone ed il coprioggetto, a cui il DNA è legato, diventa molto ripida per DNA lunghezza submicron. La posizione assiale deve ora essere rappresentato, che può essere una sfida, e, in quanto l&#39;estensione trascina microsfera più vicino al vetrino, effetti sterici sono migliorate. Inoltre, a causa della asimmetria delle microsfere, prolungamenti laterali genererà diversi livelli di coppia dovuta alla rotazione della microsfera all&#39;interno della trappola ottica poiché la direzione dei cambiamenti forza di reazione durante l&#39;estensione. Metodi alternativi per il DNA submicron estende correre contro i propri ostacoli unici. Per esempio, una trappola doppio raggio ottico è limitata allo stiramento DNA di circa una lunghezza d&#39;onda, in cui gli effetti di interferenza di punti tra le due trappole e dalla dispersione della luce tra le microsfere iniziano a rappresentare un problema significativo. Sostituzione di una delle trappolecon una micropipetta molto probabilmente soffre di problemi analoghi. Sebbene si possa utilizzare direttamente il potenziale assiale per allungare il DNA, un regime di retroazione attiva sarebbe necessaria per applicare una forza costante e la larghezza di banda di questo è piuttosto limitata, soprattutto a basse forze. Abbiamo aggirare questi problemi di fondo direttamente tirando il DNA dal vetrino utilizzando una forza assiale costante pinzette ottiche 7,8. Ciò è ottenuto intrappolando il tallone in una regione lineare del potenziale ottico, in cui la forza ottica è costante la forza che può essere regolato regolando la potenza del laser. Intrappolando all&#39;interno della regione lineare serve anche come un tutto ottico forza-clamp sul DNA che si estende per circa 350 nm in direzione assiale. Abbiamo contemporaneamente compensare la deriva termica e meccanica finemente regolando la posizione della fase in modo che una microsfera riferimento attaccata al vetrino rimane nella stessa posizione e fuoco, unllowing per un periodo di osservazione praticamente illimitata.

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Stretching Short Sequences of DNA with Constant Force Axial Optical Tweezers

Illustriamo l&#39;uso di una forza costante pinzette ottiche assiali per esplorare le proprietà meccaniche delle molecole di DNA brevi. Con stiramento DNA assialmente, riduciamo al minimo gli ostacoli sterici e manufatti derivanti convenzionale manipolazione laterale, che ci permette di studiare molecole di DNA più corto ~ 100 nm.

Stretching brevi sequenze di DNA con pinzette costante forza assiale ottici

Single-molecule techniques for stretching DNA of contour lengths  less than a kilobase are fraught with experimental difficulties. However, many ...

stretching-short-sequences-dna-with-constant-force-axial-optical

Research

JoVE Journal

Bioengineering

13.0K Views.  University of Michigan. Illustriamo l'uso di una forza costante pinzette ottiche assiali per esplorare le proprietà meccaniche delle molecole di DNA brevi. Con stiramento DNA assialmente, riduciamo al minimo gli ostacoli sterici e manufatti derivanti convenzionale manipolazione laterale, che ci permette di studiare molecole di DNA più corto ~ 100 nm.

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Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On the end of the microscope's cantilever is a nano-scale probe, which traverses image areas ranging from nanometers to micrometers, measuring the elevation of macromolecules resting on the substrate surface at any given point. Electrostatic forces cause proteins, lipids, and nucleic acids to loosely attach to the substrate in random orientations and permit imaging. The generated data resemble a topographical map, where the macromolecules resolve as three-dimensional particles of discrete sizes (Figure 1) 1,2. Tapping mode AFM involves the repeated oscillation of the cantilever, which permits imaging of relatively soft biomaterials such as DNA and proteins. One of the notable benefits of AFM over other nanoscale microscopy techniques is its relative adaptability to visualize individual proteins and macromolecular complexes in aqueous buffers, including near-physiologic buffered conditions, in real-time, and without staining or coating the sample to be imaged. 
The method presented here describes the imaging of DNA and an immunoadsorbed transcription factor (i.e. the glucocorticoid receptor, GR) in buffered solution (Figure 2). Immunoadsorbed proteins and protein complexes can be separated from the immunoadsorbing antibody-bead pellet by competition with the antibody epitope and then imaged (Figure 2A). This allows for biochemical manipulation of the biomolecules of interest prior to imaging. Once purified, DNA and proteins can be mixed and the resultant interacting complex can be imaged as well. Binding of DNA to mica requires a divalent cation 3,such as Ni2+ or Mg2+, which can be added to sample buffers yet maintain protein activity. Using a similar approach, AFM has been utilized to visualize individual enzymes, including RNA polymerase 4 and a repair enzyme 5, bound to individual DNA strands. These experiments provide significant insight into the protein-protein and DNA-protein biophysical interactions taking place at the molecular level. Imaging individual macromolecular particles with AFM can be useful for determining particle homogeneity and for identifying the physical arrangement of constituent components of the imaged particles. While the present method was developed for visualization of GR-chaperone protein complexes 1,2 and DNA strands to which the GR can bind, it can be applied broadly to imaging DNA and protein samples from a variety of sources.

A tapping mode atomic force microscope (AFM) method for the visualization of plasmid DNA, cytoplasmic proteins, and DNA-protein complexes is described. The method includes alternate approaches for preparing samples for AFM imaging following biochemical manipulation. DNA containing specific protein interacting regions are observed in near-physiologic buffer conditions.

Visualizzazione del DNA ricombinante e Complessi proteina usando la microscopia a forza atomica

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On ...

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Bioingegneria

Multiplexed Single-molecule Force Proteolysis Measurements Using Magnetic Tweezers

The generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology, with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 and wound healing3. In each of these examples, cells both exert force on their surroundings and simultaneously enzymatically remodel the extracellular matrix (ECM). The effect of forces on ECM has thus become an area of considerable interest due to its likely biological and medical importance4-7.
	Single molecule techniques such as optical trapping8, atomic force microscopy9, and magnetic tweezers10,11 allow researchers to probe the function of enzymes at a molecular level by exerting forces on individual proteins. Of these techniques, magnetic tweezers (MT) are notable for their low cost and high throughput. MT exert forces in the range of ~1-100 pN and can provide millisecond temporal resolution, qualities that are well matched to the study of enzyme mechanism at the single-molecule level12. Here we report a highly parallelizable MT assay to study the effect of force on the proteolysis of single protein molecules. We present the specific example of the proteolysis of a trimeric collagen peptide by matrix metalloproteinase 1 (MMP-1); however, this assay can be easily adapted to study other substrates and proteases.

In this article we describe the use of magnetic tweezers to study the effect of force on enzymatic proteolysis at the single molecule level in a highly parallelizable manner.

Multiplex singola molecola Forza Misure proteolisi con delle pinzette magnetiche

The  generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology,  with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 ...

Quantifying the Mechanical Properties of the Endothelial Glycocalyx with Atomic Force Microscopy

Our understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the mechanical properties of the endothelial surface layer. It is known that adhesion molecules on leukocytes are distributed non-uniformly relative to surface topography 3, that topography limits adhesive bond formation with other surfaces 9, and that physiological contact forces (&asymp; 5.0 &minus; 10.0 pN per microvillus) can compress the microvilli to as little as a third of their resting length, increasing the accessibility of molecules to the opposing surface 3, 7. We consider the endothelium as a two-layered structure, the relatively rigid cell body, plus the glycocalyx, a soft protective sugar coating on the luminal surface 6. It has been shown that the glycocalyx can act as a barrier to reduce adhesion of leukocytes to the endothelial surface 4. In this report we begin to address the deformability of endothelial surfaces to understand how the endothelial mechanical stiffness might affect bond formation. Endothelial cells grown in static culture do not express a robust glycocalyx, but cells grown under physiological flow conditions begin to approximate the glycocalyx observed in vivo 2. The modulus of the endothelial cell body has been measured using atomic force microscopy (AFM) to be approximately 5 to 20 kPa 5. The thickness and structure of the glycocalyx have been studied using electron microscopy 8, and the modulus of the glycocalyx has been approximated using indirect methods, but to our knowledge, there have been no published reports of a direct measurement of the glycocalyx modulus in living cells. In this study, we present indentation experiments made with a novel AFM probe on cells that have been cultured in conditions to maximize their glycocalyx expression to make direct measurements of the modulus and thickness of the endothelial glycocalyx.

The mechanical characteristics of endothelial glycocalyx were measured by indentation using micron sized spheres on AFM cantilevers. Endothelial cells were cultured in a custom chamber under physiological flow conditions to induce glycocalyx expression. Data were analyzed using a thin film model to determine the glycocalyx thickness and modulus.

Quantificare le proprietà meccaniche del glicocalice endoteliale con microscopia a forza atomica

Our  understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during  leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the ...

Biosensor for Detection of Antibiotic Resistant Staphylococcus Bacteria

A structurally transformed lytic bacteriophage having a broad host range of Staphylococcus aureus strains and a penicillin-binding protein (PBP 2a) antibody conjugated latex beads have been utilized to create a biosensor designed for discrimination of methicillin resistant (MRSA) and sensitive (MSSA) S. aureus species 1,2. The lytic phages have been converted into phage spheroids by contact with water-chloroform interface. Phage spheroid monolayers have been moved onto a biosensor surface by Langmuir-Blodgett (LB) technique 3. The created biosensors have been examined by a quartz crystal microbalance with dissipation tracking (QCM-D) to evaluate bacteria-phage interactions. Bacteria-spheroid interactions led to reduced resonance frequency and a rise in dissipation energy for both MRSA and MSSA strains. After the bacterial binding, these sensors have been further exposed to the penicillin-binding protein antibody latex beads. Sensors analyzed with MRSA responded to PBP 2a antibody beads; although sensors inspected with MSSA gave no response. This experimental distinction determines an unambiguous discrimination between methicillin resistant and sensitive S. aureus strains. Equally bound and unbound bacteriophages suppress bacterial growth on surfaces and in water suspensions. Once lytic phages are changed into spheroids, they retain their strong lytic activity and show high bacterial capture capability. The phage and phage spheroids can be utilized for testing and sterilization of antibiotic resistant microorganisms. Other applications may include use in bacteriophage therapy and antimicrobial surfaces.

Lytic phage biosensors and antibody beads are able to discriminate between methicillin resistant (MRSA) and sensitive staphylococcus bacteria. The phages were immobilized by a Langmuir-Blodgett method onto a surface of a quartz crystal microbalance sensor and worked as broad range staphylococcus probes. Antibody beads recognize MRSA.

Biosensori per il rilevamento di antibiotici batteri di stafilococco resistenti

A structurally transformed lytic bacteriophage having a broad host range of Staphylococcus aureus strains and a penicillin-binding protein (PBP 2a) ...

Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the enzymes onto the noncatalytic scaffold protein is directed by interactions among a family of related receptor-ligand pairs comprising interacting cohesin and dockerin modules. The extremely strong binding between cohesin and dockerin modules results in dissociation constants in the low picomolar to nanomolar range, which may hamper accurate off-rate measurements with conventional bulk methods. Single-molecule force spectroscopy (SMFS) with the atomic force microscope measures the response of individual biomolecules to force, and in contrast to other single-molecule manipulation methods (i.e.&#160;optical tweezers), is optimal for studying high-affinity receptor-ligand interactions because of its ability to probe the high-force regime (&#62;120 pN). Here we present our complete protocol for studying cellulosomal protein assemblies at the single-molecule level. Using a protein topology derived from the native cellulosome, we worked with enzyme-dockerin and carbohydrate binding module-cohesin (CBM-cohesin) fusion proteins, each with an accessible free thiol group at an engineered cysteine residue. We present our site-specific surface immobilization protocol, along with our measurement and data analysis procedure for obtaining detailed binding parameters for the high-affinity complex. We demonstrate how to quantify single subdomain unfolding forces, complex rupture forces, kinetic off-rates, and potential widths of the binding well. The successful application of these methods in characterizing the cohesin-dockerin interaction responsible for assembly of multidomain cellulolytic complexes is further described.

Cellulosomes are multienzyme complexes designed for digesting cellulose. AFM-based SMFS was used to study the mechanical properties and folding configuration of cellulosome-associated protein assemblies. We present a complete workflow for protein immobilization, data acquisition, and data analysis to study the interactions of individual receptor-ligand complexes involved in cellulosome assembly.

Indagare Sistemi recettore-ligando del Cellulosome con sede a AFM singola molecola di Forza Spettroscopia

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the ...

Quantitative Optical Microscopy: Measurement of Cellular Biophysical Features with a Standard Optical Microscope

We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of mass, volume, and density on cellular specimens through a combination of bright field and differential interference contrast imagery. Two primary approaches are presented: noninterferometric quantitative phase microscopy (NIQPM), to perform measurements of total cell mass and subcellular density distribution, and Hilbert transform differential interference contrast microscopy (HTDIC)&#160;to determine volume. NIQPM is based on a simplified model of wave propagation, termed the paraxial approximation, with three underlying assumptions: low numerical aperture (NA) illumination, weak scattering, and weak absorption of light by the specimen. Fortunately, unstained cellular specimens satisfy these assumptions and low NA illumination is easily achieved on commercial microscopes. HTDIC is used to obtain volumetric information from through-focus DIC imagery under high NA illumination conditions. High NA illumination enables enhanced sectioning of the specimen along the optical axis. Hilbert transform processing on the DIC image stacks greatly enhances edge detection algorithms for localization of the specimen borders in three dimensions by separating the gray values of the specimen intensity from those of the background. The primary advantages of NIQPM and HTDIC lay in their technological accessibility using &#8220;off-the-shelf&#8221; microscopes. There are two basic limitations of these methods: slow z-stack acquisition time on commercial scopes currently abrogates the investigation of phenomena faster than 1 frame/minute, and secondly, diffraction effects restrict the utility of NIQPM and HTDIC to objects from 0.2 up to 10 (NIQPM) and 20 (HTDIC) &#956;m in diameter, respectively. Hence, the specimen and its associated time dynamics of interest must meet certain size and temporal constraints to enable the use of these methods. Excitingly, most fixed cellular specimens are readily investigated with these methods.

We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of cellular mass, volume, and density through a combination of bright field and differential interference contrast imagery.

Quantitative Microscopia ottica: Misura di Biofisica Cellulare caratteristiche con un microscopio ottico standard

We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of mass, volume, and density on cellular specimens through a ...

Stretching Micropatterned Cells on a PDMS Membrane

Mechanical forces exerted on cells and/or tissues play a major role in numerous processes. We have developed a device to stretch cells plated on a PolyDiMethylSiloxane (PDMS) membrane, compatible with imaging. This technique is reproducible and versatile. The PDMS membrane can be micropatterned in order to confine cells or tissues to a specific geometry. The first step is to print micropatterns onto the PDMS membrane with a deep UV technique. The PDMS membrane is then mounted on a mechanical stretcher. A chamber is bound on top of the membrane with biocompatible grease to allow gliding during the stretch. The cells are seeded and allowed to spread for several hours on the micropatterns. The sample can be stretched and unstretched multiple times with the use of a micrometric screw. It takes less than a minute to apply the stretch to its full extent (around 30%). The technique presented here does not include a motorized device, which is necessary for applying repeated stretch cycles quickly and/or computer controlled stretching, but this can be implemented. Stretching of cells or tissue can be of interest for questions related to cell forces, cell response to mechanical stress or tissue morphogenesis. This video presentation will show how to avoid typical problems that might arise when doing this type of seemingly simple experiment.

This manuscript presents a technique to apply or release forces on adherent cells or tissues using unidirectional stretching.

Stretching celle micropatterned su una membrana PDMS

Mechanical forces exerted on cells and/or tissues  play a major role in numerous processes. We have developed a device to stretch  cells plated on a ...

Magnetic Tweezers for the Measurement of Twist and Torque

Single-molecule techniques make it possible to investigate the behavior of individual biological molecules in solution in real time. These techniques include so-called force spectroscopy approaches such as atomic force microscopy, optical tweezers, flow stretching, and magnetic tweezers. Amongst these approaches, magnetic tweezers have distinguished themselves by their ability to apply torque while maintaining a constant stretching force. Here, it is illustrated how such a &#8220;conventional&#8221; magnetic tweezers experimental configuration can, through a straightforward modification of its field configuration to minimize the magnitude of the transverse field, be adapted to measure the degree of twist in a biological molecule. The resulting configuration is termed the freely-orbiting magnetic tweezers. Additionally, it is shown how further modification of the field configuration can yield a transverse field with a magnitude intermediate between that of the &#8220;conventional&#8221; magnetic tweezers and the freely-orbiting magnetic tweezers, which makes it possible to directly measure the torque stored in a biological molecule. This configuration is termed the magnetic torque tweezers. The accompanying video explains in detail how the conversion of conventional magnetic tweezers into freely-orbiting magnetic tweezers and magnetic torque tweezers can be accomplished, and demonstrates the use of these techniques. These adaptations maintain all the strengths of conventional magnetic tweezers while greatly expanding the versatility of this powerful instrument.

Magnetic tweezers, a powerful single-molecule manipulation technique, can be adapted for the direct measurements of the twist (using a configuration called freely-orbiting magnetic tweezers) and torque (using a configuration termed magnetic torque tweezers) in biological macromolecules. Guidelines for performing such measurements are given, including applications to the study of DNA and associated nucleo-protein filaments.

Pinzetta magnetici per la misurazione di Twist and Torque

Single-molecule techniques make it possible to investigate the behavior of individual biological molecules in solution in real time. These techniques ...

Nanomanipulation of Single RNA Molecules by Optical Tweezers

A large portion of the human genome is transcribed but not translated. In this post genomic era, regulatory functions of RNA have been shown to be increasingly important. As RNA function often depends on its ability to adopt alternative structures, it is difficult to predict RNA three-dimensional structures directly from sequence. Single-molecule approaches show potentials to solve the problem of RNA structural polymorphism by monitoring molecular structures one molecule at a time. This work presents a method to precisely manipulate the folding and structure of single RNA molecules using optical tweezers. First, methods to synthesize molecules suitable for single-molecule mechanical work are described. Next, various calibration procedures to ensure the proper operations of the optical tweezers are discussed. Next, various experiments are explained. To demonstrate the utility of the technique, results of mechanically unfolding RNA hairpins and a single RNA kissing complex are used as evidence. In these examples, the nanomanipulation technique was used to study folding of each structural domain, including secondary and tertiary, independently. Lastly, the limitations and future applications of the method are discussed.

Optical tweezers have been used to study RNA folding by stretching individual molecules from their 5&#8217; and 3&#8217; ends. Here common procedures are described to synthesize RNA molecules for tweezing, calibration of the instrument, and methods to manipulate single molecules.

Nanomanipolazione di Single RNA Molecole da pinzette ottiche

A large portion of the human genome is transcribed but not translated. In this post genomic era, regulatory functions of RNA have been shown to be ...

Quantifying Fibrillar Collagen Organization with Curvelet Transform-Based Tools

Fibrillar collagens are prominent extracellular matrix (ECM) components, and their topology changes have been shown to be associated with the progression of a wide range of diseases including breast, ovarian, kidney, and pancreatic cancers. Freely available fiber quantification software tools are mainly focused on the calculation of fiber alignment or orientation, and they are subject to limitations such as the requirement of manual steps, inaccuracy in detection of the fiber edge in noisy background, or lack of localized feature characterization. The collagen fiber quantitation tool described in this protocol is characterized by using an optimal multiscale image representation enabled by curvelet transform (CT). This algorithmic approach allows for the removal of noise from fibrillar collagen images and the enhancement of fiber edges to provide location and orientation information directly from a fiber, rather than using the indirect pixel-wise or window-wise information obtained from other tools. This CT-based framework contains two separate, but linked, packages named &#8220;CT-FIRE&#8221; and &#8220;CurveAlign&#8221; that can quantify fiber organization on a global, region of interest (ROI), or individual fiber basis. This quantification framework has been developed for more than ten years and has now evolved into a comprehensive and user-driven collagen quantification platform. Using this platform, one can measure up to about thirty fiber features including individual fiber properties such as length, angle, width, and straightness, as well as bulk measurements such as density and alignment. Additionally, the user can measure fiber angle relative to manually or automatically segmented boundaries. This platform also provides several additional modules including ones for ROI analysis, automatic boundary creation, and post-processing. Using this platform does not require prior experience of programming or image processing, and it can handle large datasets including hundreds or thousands of images, enabling efficient quantification of collagen fiber organization for biological or biomedical applications.

Here, we present a protocol to use a curvelet transform-based, open-source MATLAB software tool for quantifying fibrillar collagen organization in the extracellular matrix of both normal and diseased tissues. This tool can be applied to images with collagen fibers or other types of line-like structures.

Quantificazione dell'organizzazione del collagene fibrilla con strumenti a base di trasformata curvelet

Fibrillar collagens are prominent extracellular matrix (ECM) components, and their topology changes have been shown to be associated with the progression ...