The authors thank Perkin Elmer Company for supporting this publication. We also thank Alana Ross, B.S. for proofreading this manuscript.

Nota: Tutti gli studi su animali devono essere effettuate secondo protocolli istituzionali approvate e linee guida per la cura degli animali. 1 In Vivo CLI BAT immagini con 18 F-FDG 1.1 Contesto Imaging: <ol><li> Prima di 18 F-FDG iniezione, posizionare quattro topi nudi in una camera di induzione che è stato collegato con isoflurano bilanciato con l&#39;ossigeno per 5 minuti per indurre l&#39;anestesia. Poi posto le quattro topi anestetizzati nell&#39;apparecchio di imaging. </li><li> Acquisire l&#39;immagine di sfondo con i seguenti parametri: Aperto filtro, f = 1, bin = 8, FOV = D, e il tempo di esposizione = 120 sec, temperatura fase = 37 ° C. </li></ol> 1.2 BAT Imaging con 18 F-FGD: <ol><li> Iniettare i topi anestetizzati con 280 μCi di 18 F-FDG in PBS per via endovenosa nella vena della coda. Dopo l&#39;iniezione, restituire i topi per gabbia dotata di cibo e acqua. Nota: è necessario per iniettare per via endovenosa 18 F-FDG per ottenere un contrasto decente intorno all&#39;area BAT. Solo un contrasto molto debole può essere visto con la stessa quantità di 18 F-FDG se si usa un&#39;iniezione intraperitoneale. </li><li> Acquisire immagini CLI a 30, 60 e 120 minuti dopo l&#39;iniezione 18 F-FDG con gli stessi parametri come sfondo delle immagini (punto 1.1.2). Per ogni sessione di imaging, permettono 5 min per il reinduzione anestesia. </li><li> Per quantificare il rapporto segnale-rumore (S / N), utilizzare l&#39;interfaccia software di imaging per disegnare due ROI uguali dimensioni ellisse sul BAT interscapolare e una zona adiacente alla BAT (area di riferimento) (Figura 1b). </li></ol> 1.3 Convalida della Fonte CLI: <ol><li> Anestetizzare quattro topi e iniettare i topi con 280 μCi di 18 F-FDG per via endovenosa. </li><li> Sacrifica i topi 60 min dopo l&#39;iniezione di 18 F-FDG mediante iniezione di pentobarbital sodio (200 mg / kg, IP). Rimuovere con attenzione lo scin dalla zona interscapolare. Immagine tutti i topi con gli stessi parametri come sopra (1.1.2), allo stesso tempo (Figura 2a). </li><li> Rimuovere con attenzione il interscapolare del tessuto adiposo bianco (WAT) e BAT, e quindi l&#39;immagine dei topi sezionati con gli stessi parametri (Figura 2b). </li><li> Dalle immagini CLI, calcolare il contributo da BAT utilizzando due ROI con la seguente equazione: R (BAT) = (CLI un -CLI b) (BAT) / (CLI un -CLI b) (BAT-rimosso), in cui il ROI una è per la zona interscapolare e ROI b è per la zona di riferimento (Figura 2b). </li></ol> 2 BAT Imaging Application 2.1 Attivazione Monitoraggio con NE <ol><li> Dividere topi nudi in due gruppi (n = 4 ciascuno). </li><li> Iniettare un gruppo con noradrenalina (NE) (50 ml, 10mM) intraperitoneale. Utilizzare il secondo gruppo come Contro non attivatol. Dopo 30 minuti, anestetizzare entrambi i gruppi con isoflurano per 5 minuti, e poi iniettare per via endovenosa ogni mouse con 18 F-FDG (220 μCi). Nota: L&#39;iniezione intraperitoneale di NE dovrebbe essere 30 minuti prima di 18 F-FDG iniezione per evitare di agitare drasticamente i topi. </li><li> Immagine topi 60 min dopo 18 F-FDG iniezione utilizzando gli stessi parametri dei protocolli di cui sopra. </li></ol> Activation 2.2 Monitoraggio Sotto esposizione al freddo <ol><li> Misurare la temperatura corporea dei topi in camera fredda con un termometro rettale. Le temperature dovrebbero essere di circa 30 ° C. </li><li> Immagine topi 60 min dopo 18 F-FDG iniezione utilizzando gli stessi parametri di imaging, come i protocolli di cui sopra. Utilizzare topi che sono conservati a temperatura ambiente (25 ° C) come i controlli, e l&#39;immagine con la stessa. </li><li> Per uno studio l&#39;esposizione al freddo, mettere i topi in una stanza fredda (4 ° C) per 4 ore prima di 18 F-FDG iniezione e restituire il mghiaccio per la stanza fredda dopo ogni sessione di imaging e dopo aver recuperato da anestesia. </li><li> parametri come sopra. </li></ol> Disattivazione 2.3 Monitoraggio delle BAT Under lunga anestesia <ol><li> Per molto tempo l&#39;anestesia (60 - 70 min), iniettare topi per via intraperitoneale con ketamina / xilazina e tenerli sotto anestesia per 60 - 70 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Una volta che i topi sono anestetizzati, iniettare 18 F-FDG (220 μCi) per via endovenosa attraverso la vena della coda. </li><li> Immagine topi 60 min dopo 18 F-FDG iniezione utilizzando gli stessi parametri dei protocolli di cui sopra. </li></ol> 3 Spectral unmixing e multispettrali Cerenkov luminescenza Tomografia Studi <ol><li> Anestetizzare il mouse per 5 minuti, e poi iniettare 300 μCi 18 F-FDG per via endovenosa. Acquisire immagini multispettrali 60 min dopo 18 F-FDG iniezione dal lato dorsale dell&#39;animale con i seguenti parametri: f = 1, bin = 16, l&#39;acquisizioneTempo = 300 sec per filtro, filtri di emissione = 580, 600, 620, 640, 660 e 680 nm. </li><li> Condurre unmixing spettrale con Vivere software Imaging 4.3.1 e selezionare due componenti (BAT e segnali non specifici) e unmixing automatico (Figura 4). </li><li> Effettuare la ricostruzione 3D secondo il metodo riportato da Kuo et al. 28,43. Incorporare lo spettro di emissione Cerenkov nella luce modello di propagazione diffusa, applicare Tikhonov regolarizzazione nel NNLS (non negativi minimi quadrati) ottimizzazione dei residui, e generare la tomografia superficie (utilizzato per immagini 3D coregistrazione) dalla luce di imaging struttura (figura 5 ). Nota: Per multispettrale unmixing CLI spettrale e tomografia, sono necessari almeno 5 le immagini con filtri diversi. </li></ol>

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La pubblicazione di questo video-articolo è supportata da Perkin Elmer Società.

Ricerca nel settore BAT è stata condotta da diversi decenni. In precedenza, era stato considerato di avere alcuna significativa rilevanza fisiologica durante l&#39;età adulta umana 1. BAT Tuttavia, di recente su larga scala di imaging PET clinico con 18 F-FDG e altre indagini hanno confermato è ancora presente nella parte superiore del torace, collo e altre località in adulti 2,3. Studi recenti hanno suggerito che fortemente BAT svolge un ruolo importante nella obesità e diabete 2,6. Altre ricerche indicano anche che la BAT svolge ruoli importanti durante il processo di invecchiamento 12, e che la sua attività potrebbe essere rafforzato attraverso l&#39;esercizio 10,44. Sia negli studi clinici umani e di ricerca preclinica, l&#39;imaging PET con 18 F-FDG è il metodo più utilizzato per lo studio BAT. Tuttavia, per gli studi preclinici su animali, il PET è generalmente molto più costoso di imaging ottico. In questo protocollo, dimostriamo che CLI con 18 F-FDG può essere applicato per l&#39;imaging ottico BAT nei piccoli animali. Come altre tecniche di imaging ottico, limitazione tessuto penetrante e bassa sensibilità per gli obiettivi profondi sono i limiti intrinseci della CLI 25,32. Tuttavia, recentemente Spinelli et al. Hanno dimostrato che il segnale CLI decente potrebbe essere osservato con 10 mm di profondità di tessuto con 32 P 28,43, e Thorek et al. ha mostrato che 16 millimetri di penetrazione potrebbe essere raggiunto nei linfonodi di pazienti dopo 18 F-FDG iniezione 39, 40. Rispetto al PET, CLI può essere eseguita con un sistema di imaging costo relativamente basso. Recentemente, Thorek et al. Dimostrato che significativamente elevata sensibilità potrebbe essere realizzato con CLI basse quantità di 18 F-FDG accumulati (circa 2Ci) nei nodi di pazienti, 39. In vitro test 40 indica che il segnale CLI da 0,01 Ci 90Y era rilevabile in soluzione 25,32,33 </sup&gt;. Inoltre, CLI ha anche il potenziale per alta risoluzione spaziale e la capacità di screening ad alto rendimento. Inoltre, CLI è facile da imparare e da usare. Nel corso di esperimenti, abbiamo scoperto che CLI contrasto di BAT con 18 F-FDG è fortemente legato ai metodi di iniezione. L&#39;iniezione endovenosa di 18 F-FDG in grado di fornire un eccellente contrasto per BAT interscapolare, mentre l&#39;iniezione intraperitoneale con la stessa quantità di 18 F-FDG ha mostrato soltanto un contrasto debole nella zona BAT. Unmixing spettrale, una tecnica molto pratico per separare due serie di segnali, è stato ampiamente utilizzato in imaging di fluorescenza. E &#39;ben noto che l&#39;assorbimento di 18 F-FDG non è altamente specifico target, e diversi target / tessuti avere differenti proprietà di attenuazione della luce. Abbiamo trovato il picco dello spettro CLI di BAT è di circa 640 nm, e questo dato riflette i contesti reali di BAT. La ricostruzione 3D di questo protocol è molto operabile, perché può essere eseguita con un sistema di imaging ottico disponibile in commercio basata sulle proprietà diffusive di luce di diverse lunghezze d&#39;onda. Con questo approccio, siamo in grado di evitare l&#39;uso di un sistema di imaging specializzato che richiede multiple angolo di visione immagini per la ricostruzione in 3D. Per entrambi unmixing spettrale e ricostruzione 3D, è necessario un maggiore minimo di 600 conteggi di fotoni da ogni immagine nella BAT. A tal fine, grande binning (bin = 16), piccola sosta f (f = 1) e un tempo di acquisizione lungo (5 min) sono necessari per ogni immagine. In sintesi, sfruttando la posizione unica e la forma della BAT e significativamente elevato assorbimento di 18 F-FDG nel BAT, dimostriamo come BAT nei piccoli animali può essere otticamente ripreso con 18 F-FDG tramite la tecnica CLI. Questo metodo può essere utilizzato in modo affidabile per l&#39;imaging BAT e per il controllo di attivazione BAT. Inoltre, abbiamo anche dimostrato che unmixing spettrale e Reco 3Dnstruction sono praticabili e volume 3D quantificazione è possibile per gli studi futuri.

Tessuto adiposo bruno (BAT) è un tessuto speciale per la termogenesi nei mammiferi, e una delle sue principali funzioni è quella di mantenere l&#39;equilibrio energetico di tutto il corpo attraverso dissipare grandi quantità di sostanza chimica / energia degli alimenti sotto forma di calore 1. Caratteristiche più uniche BAT comprendono proteina-1 (UCP-1) espressione abbondante sganciamento, abbondanti piccole goccioline di olio, un gran numero di mitocondri in una singola cella, e significativa vascolarizzazione del tessuto 2-5. Queste caratteristiche uniche associano fortemente con il ruolo importante del tessuto nel metabolismo e l&#39;energia spesa. BAT, considerata in precedenza non essere più presenti e in possesso di significative funzioni fisiologiche negli esseri umani adulti 1, tuttavia recenti studi di imaging PET / CT hanno chiaramente dimostrato che la BAT presenta ancora negli adulti umani 2,3,6-9. Una correlazione inversa tra massa BAT e indice di massa corporea (BMI) è stato istituito da diversi studi, e ristudi cent indicato che esercizi fisici potrebbero aumentare la massa di BAT. Questi risultati suggeriscono che la disfunzione di BAT è strettamente associato con le patologie di obesità e diabete 2,6,10,11. Inoltre, le prove di montaggio indica che la funzione di BAT è fortemente legata a varie altre patologie come le malattie neurodegenerative e il cancro 3,7,12,13. Attivazione BAT, un processo per aumentare la termogenesi, può essere realizzato in varie condizioni, quali l&#39;esposizione al freddo, esercizio fisico, e il trattamento farmacologico e la manipolazione genetica 1,14,15. Esposizione al freddo e il trattamento noradrenalina sono i metodi più utilizzati per attivare BAT. Freddo, che può essere rilevata da vari meccanismi, come termorecettori nella pelle, stimola nervi simpatici e porta al rilascio di noradrenalina (NE) a BAT. La NE rilasciato innesca UCP-1 per inizializzare la termogenesi per mantenere la temperatura corporea normale. Sotto questo conditi, l&#39;assorbimento di glucosio aumenta anche per fornire ulteriori fonti di carbonio per l&#39;aumento del metabolismo nella BAT 1,16,17. L&#39;imaging PET con 18F-FDG ha confermato che l&#39;assorbimento di glucosio marcato aumentato in condizioni di freddo in studi sull&#39;uomo 6. In termini di imaging ottico, BAT è un bersaglio ideale. Il interscapolare BAT ha una posizione unica nei topi, situato lontano dagli organi più grandi come il fegato, il cuore e lo stomaco. Pertanto, interferenze di segnale da questi grandi organi è insignificante (Figura 1a). Nel frattempo, la posizione bassa della BAT interscapolare permette più segnali di essere catturato dalla macchina fotografica di rilevazione. Inoltre, BAT è un organo di massa concentrata, che limita il segnale luminoso in alcune zone. Inoltre, l&#39;unica forma fisica triangolare di BAT rende facile da distinguere da altri tessuti (Figura 1a). Imaging Cerenkov luminescenza (CLI), un mol di recente è emersotecnologia di imaging ecular 18-26, sfrutta la luminescenza generata dal + e - decadimento dei radionuclidi quali 18 F e 131 io nel mezzo. La particella carica (come + e -) polarizza le molecole, mentre viaggia nel medio 18-20, e la luminescenza / luce viene emessa quando le molecole polarizzate rilassarsi di nuovo in equilibrio. La luminescenza emessa si chiama Cerenkov luminescenza (CL). Le proprietà uniche spettrali di CL comprendono il suo ampio spettro tutta la luce ultravioletta (UV) e spettro visibile 18-20, e la sua correlazione inversa tra l&#39;intensità e il quadrato della lunghezza d&#39;onda (λ 2). Entrambe le gamme UV e visibili della luce emessa può essere utilizzato per diverse applicazioni. La porzione UV di Cerenkov luminescenza è stata applicata per in vivo fotoattivazione di luciferina in gabbia 21, mentre la luce emessa nella lunghezza d&#39;onda può essereutilizzato per in vivo imaging ottico 18,27-31. Per i piccoli studi su animali, CLI di imaging con un sistema di imaging ottico è più veloce e più conveniente rispetto PET. Inoltre, CLI può essere applicato per alta throughput screening con un sistema di imaging dotata di elevata capacità di flusso. I vantaggi e gli svantaggi di questa tecnologia sono stati discussi in diverse recensioni 25,32,33. 3D tomografia di CLI è stato intensamente studiato in diversi gruppi 28,34-37, e le applicazioni di CLI per l&#39;imaging endoscopico e l&#39;imaging intraoperatorio è stato dimostrato con successo nei topi pure 30,38. Inoltre, Spinelli e Thorek et al. Hanno dimostrato che l&#39;imaging CLI potrebbe essere applicato a soggetti umani, così la tecnologia ha anche il potenziale per le applicazioni cliniche 39, 40. Nel corso della riscoperta di BAT nell&#39;uomo, immagini PET chiaramente indicato che unnotevole quantità di 18 F-FDG accumulata nella BAT, a determinate condizioni 2,3,6. Inoltre, l&#39;imaging PET con i topi anche senza dubbio dimostrato che la BAT può essere evidenziato con 18 F-FDG 41 42. In questo rapporto, si dimostra come Cerenkov luminescenza emessa da 18 F-FDG può essere utilizzato per l&#39;imaging BAT nei piccoli animali con un sistema di imaging ottico. Il nostro approccio fornisce un metodo veloce, comodo ed economico delle BAT di imaging per piccoli animali. Questa tecnica può essere utilizzata come un metodo alternativo per l&#39;imaging PET con 18F-FDG, specialmente per laboratori senza servizi PET.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="885">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:71px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:479px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="231">
			<td height="231" style="height:231px;width:216px;">Optical Imaging system</td>
			<td style="width:71px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:479px;">IVIS Spectrum is an optical imaging system that is equiped with very sensitive camera for Cerenkov Luminescence. Some instrumental information is listed below: CCD Sensor: Back thinned, back illuminated 
			CCD Size: 2.7cm x 2.7cm 
			Pixels: 2048 x 2048 
			Quantum Efficiency: 85% 
			Min detectable photons: 70 photons/s/sr/cm &#60; sup &#62; 2 &#60; /sup &#62; 
			Dark Current: &#60; 100 electrons/s/cm &#60; sup &#62; 2 &#60; /sup &#62; 
			Lens: f 0.95 50mm 
			CCD Cooling: Cooled to-90 degree.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">18F-FDG</td>
			<td style="width:71px;">IBA Molecular</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">norepinephrine</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>N5785-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ketamine/Xylazine</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>K113-10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cerenkov luminescence imaging of interscapular brown adipose tissue

Brown adipose tissue (BAT), widely known as a &#8220;good fat&#8221; plays pivotal roles for thermogenesis in mammals. This special tissue is closely related to metabolism and energy expenditure, and its dysfunction is one important contributor for obesity and diabetes. Contrary to previous belief, recent PET/CT imaging studies indicated the BAT depots are still present in human adults. PET imaging clearly shows that BAT has considerably high uptake of 18F-FDG under certain conditions. In this video report, we demonstrate that Cerenkov luminescence imaging (CLI) with 18F-FDG can be used to optically image BAT in small animals. BAT activation is observed after intraperitoneal injection of norepinephrine (NE) and cold treatment, and depression of BAT is induced by long anesthesia. Using multiple-filter Cerenkov luminescence imaging, spectral unmixing and 3D imaging reconstruction are demonstrated. Our results suggest that CLI with 18F-FDG is a practical technique for imaging BAT in small animals, and this technique can be used as a cheap, fast, and alternative imaging tool for BAT research.

Nella figura 1, BAT interscapolare (Figura 1a) è stato messo in evidenza in tutti i punti di tempo (30, 60, 120 min), e il contrasto tra BAT e l&#39;area di riferimento può essere facilmente osservato (Figura 1b). In particolare, il contorno dell&#39;immagine riflessa BAT attentamente l&#39;aspetto fisico, che ha un profilo triangolare. I rapporti di segnale tra BAT e l&#39;area di riferimento erano 2.37, 2.49, 2.53 e piega a 30, 60 e 120 minuti dopo l&#39;iniezione (Figura 1a). Dal esperimento dissezione step-wise, 85% del segnale nel sito interscapolare aveva origine dalla BAT (Figura 2). Tuttavia, c&#39;era ancora qualche segnale residuo si trova vicino al bordo superiore della BAT, che probabilmente origine dal tessuto residuo BAT e altri tessuti adiacenti che includono i vasi sanguigni e muscoli. E &#39;stato riportato che l&#39;attivazione BAT può essere realizzato attraversoNoradrenalina (NE) il trattamento e l&#39;esposizione a freddo 3,6. In primo luogo, abbiamo osservato l&#39;attivazione BAT con NE nello stesso gruppo di topi con e senza trattamento di NE in breve (5 min) anestesia isoflurano. I dati hanno mostrato segnale CLI significativamente maggiore sotto la condizione NE-trattati (1,23 volte) rispetto senza trattamento NE (Figura 3a). Negli studi sull&#39;uomo, l&#39;imaging PET ha mostrato che i soggetti sotto esposizione al freddo avevano molto più alto 18 F-FDG nel BAT di quelli a temperatura ambiente 6. In questo studio i topi, un aumento del 39% nel 18 F-FDG è stata osservata nella BAT degli animali trattati con l&#39;esposizione a freddo (Figura 3b). Nei topi, l&#39;attività BAT può essere influenzato da anestesia diversi regimi 3,41. Ad esempio, 18 F-FDG nella BAT può essere notevolmente diminuita dopo un&#39;ora di anestesia con ketamina 41. Confrontando il uptak 18 F-FDGe nello stesso gruppo di topi in breve (5 min con isoflurano) e lunga anestesia (70 min con ketamina / xilazina) regimi, una diminuzione del 54% in 18 F-FDG BAT captazione è stata osservata nel gruppo anestetizzato con ketamina / xilazina ( Figura 3c). E &#39;ben noto che eme contenenti proteine ​​(come l&#39;emoglobina nel sangue e citocromo c nei mitocondri) può portare ad un significativo assorbimento della luce, e si prevede che le abbondanti vasi sanguigni BAT 1 cambieranno lo spettro di CLI, e la spettrale forma dalla zona BAT sarà diverso da altre aree. In teoria, le tecniche unmixing spettrali ci permettono di separare i due spettri CLI. Dalla Figura 4a, nessun settore particolare è stato evidenziato dall&#39;immagine non miscelato di componente # 1 (Unmix # 1), e lo spettro corrispondente (linea blu nella figura 4d) assomigliava lo spettro di emissione di 18 F nei media puri, in cui il CLI IntensiTy è inversamente correlata con il quadrato della lunghezza d&#39;onda di 18,20. Questi dati suggeriscono che Unmix # 1 ha rappresentato un segnale CLI non specifico, che è probabilmente da profondità molto superficiale, come ad esempio 18 F-FDG accumulo nella pelle. Il picco della mescolate # 2 spettro (linea rossa) è stato di circa 640 nm, suggerendo il segnale era dalla BAT. È interessante notare che, contrariamente alla significativa attenuazione dell&#39;intensità di CLI inferiore a 640 nm, non drammatica riduzione dell&#39;intensità è stata osservata una volta raggiunto il suo picco (linea rossa in figura 4), ​​indicando una migliore penetrazione nel tessuto della luce emessa a lunghezze d&#39;onda maggiori. Multispettrale Cerenkov luminescenza tomografia (msCLT) è stato utilizzato per la ricostruzione in 3D. msCLT è stata precedentemente riportata da Kuo et al. 28,43, ed è costruito in un set di immagini planari 2D acquisite con una serie di filtri passa-banda stretta (&gt; 5 filtri). Le immagini 3D ricostruiti sono coregistderati con tomografia superficie che è generato dalla luce struttura, e le immagini rivelano che una parte sostanziale del segnale CLI origine da BAT interscapolare (Figura 5). Sorprendentemente, l&#39;immagine coronale (figura 5a) delinea chiaramente i due lobi della BAT, che si avvicinano il contorno triangolo della BAT mostrato in Figura 5e. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51790/51790fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1: (a) profilo triangolare della BAT interscapolare (freccia blu) in un mouse; (A sinistra) BAT è coperta di tessuto adiposo bianco, e (a destra) BAT è esposto. immagini (b) CLI di un mouse a 30 e 60 min dopo 18 F-FDG (280 μCi) iniezione endovenosa. Le immagini illustrano chiaramente il contorno delle BAT. (C) Analisi quantitativa del segnale CLI di intezona BAT rscapular e una zona di riferimento. Ristampa di riferimento 42. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51790/51790fig1highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51790/51790fig2highres.jpg" width="500" /> Figura 2: (a) Immagini rappresentative dei topi prima (a sinistra) e dopo (a destra) la rimozione BAT. (B) La quantificazione indica che il&gt; 85% CLI origine da BAT. Ristampa di riferimento 42. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51790/51790fig2highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51790/51790fig3highres.jpg" width="500" /> Figura 3:(A) immagini Rappresentante CLI di BAT di topi con (a sinistra) e senza (a destra) la stimolazione NE sotto breve anestesia isoflurano. (B) Analisi quantitativa dei segnali CLI dai due gruppi in (a) (n = 4 per ogni gruppo). (C) immagini Rappresentante CLI di BAT di topi con (a sinistra) e senza (a destra) la stimolazione fredda sotto breve anestesia isoflurano. (D) Analisi quantitativa dei segnali CLI dei due gruppi mostrati in (e) (n = 3 - 4 per ciascun gruppo). (e) immagini Rappresentante CLI di BAT a 60 min dopo 18 F-FDG iniezione sotto breve anestesia isoflurano (5 min) (a sinistra) e ketamina / xilazina anestesia (70 min) (a destra). (F) Analisi quantitativa dei segnali CLI dei due gruppi mostrati in (g) (n = 4 per ciascun gruppo). Ristampa di riferimento 42. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51790/51790fig3highres.jpg" target="_blank">Plea</a>SE clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51790/51790fig4highres.jpg" width="500" /> Figura 4:. Unmixing spettrale per CLI aspecifici e BAT CLI (a) Unmix # 1 mostra che il segnale non specifico CLI da 18 F-FDG è distribuito su tutto il corpo (lo spettro non miscelato per questa immagine è mostrata in (d) (linea blu )). (B) Unmix # 2 indica che la maggioranza dei CLI presso il sito interscapolare è da BAT (lo spettro non miscelato è mostrata in (d) (linea rossa)). Il picco CLI è di circa 640 nm. (C) l&#39;immagine a video di Unmix # 1 e # 2. (D) Gli spettri CLI di Unmix # 1 e # 2. Ristampa di riferimento 42. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51790/51790fig4highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> &lt;/ P&gt; <img alt="Figura 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51790/51790fig5highres.jpg" width="500" /> Figura 5: multispettrale Cerenkov luminescenza tomografia (a - d) ricostruzione 3D delle immagini.. Interscapolare BAT può essere visto in coronale (a), sagittale (b) e trasversale (c) visite, così come nell&#39;immagine 3D (d); (E) la forma fisica BAT è indicata (freccia blu), che correla con immagini ricostruite. Ristampa e adattare di riferimento 42. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51790/51790fig5highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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Cerenkov Luminescence Imaging of Interscapular Brown Adipose Tissue

In this video report, we show the application of Cerenkov Luminescence Imaging (CLI) for interscapular brown adipose tissue in mice under activated and depressed conditions.

Cerenkov Luminescenza Imaging di interscapolare Brown Tessuto adiposo

Brown adipose tissue (BAT), widely known as a &#8220;good fat&#8221; plays pivotal roles for thermogenesis in mammals. This special tissue is closely ...

cerenkov-luminescence-imaging-of-interscapular-brown-adipose-tissue

Research

JoVE Journal

Medicine

12.3K Views.  Massachusetts General Hospital/Harvard Medical School. In this video report, we show the application of Cerenkov Luminescence Imaging (CLI) for interscapular brown adipose tissue in mice under activated and depressed conditions.

Video: Cerenkov Luminescence Imaging of Interscapular Brown Adipose Tissue

Cerenkov Luminescence Imaging (CLI) for Cancer Therapy Monitoring

In molecular imaging, positron emission tomography (PET) and optical imaging (OI) are two of the most important and thus most widely used modalities1-3. PET is characterized by its excellent sensitivity and quantification ability while OI is notable for non-radiation, relative low cost, short scanning time, high throughput, and wide availability to basic researchers. However, both modalities have their shortcomings as well. PET suffers from poor spatial resolution and high cost, while OI is mostly limited to preclinical applications because of its limited tissue penetration along with prominent scattering optical signals through the thickness of living tissues.
 Recently a bridge between PET and OI has emerged with the discovery of Cerenkov Luminescence Imaging (CLI)4-6. CLI is a new imaging modality that harnesses Cerenkov Radiation (CR) to image radionuclides with OI instruments. Russian Nobel laureate Alekseyevich Cerenkov and his colleagues originally discovered CR in 1934. It is a form of electromagnetic radiation emitted when a charged particle travels at a superluminal speed in a dielectric medium7,8. The charged particle, whether positron or electron, perturbs the electromagnetic field of the medium by displacing the electrons in its atoms. After passing of the disruption photons are emitted as the displaced electrons return to the ground state. For instance, one 18F decay was estimated to produce an average of 3 photons in water5. 
 Since its emergence, CLI has been investigated for its use in a variety of preclinical applications including in vivo tumor imaging, reporter gene imaging, radiotracer development, multimodality imaging, among others4,5,9,10,11. The most important reason why CLI has enjoyed much success so far is that this new technology takes advantage of the low cost and wide availability of OI to image radionuclides, which used to be imaged only by more expensive and less available nuclear imaging modalities such as PET.
 Here, we present the method of using CLI to monitor cancer drug therapy. Our group has recently investigated this new application and validated its feasibility by a proof-of-concept study12. We demonstrated that CLI and PET exhibited excellent correlations across different tumor xenografts and imaging probes. This is consistent with the overarching principle of CR that CLI essentially visualizes the same radionuclides as PET. We selected Bevacizumab (Avastin; Genentech/Roche) as our therapeutic agent because it is a well-known angiogenesis inhibitor13,14. Maturation of this technology in the near future can be envisioned to have a significant impact on preclinical drug development, screening, as well as therapy monitoring of patients receiving treatments.

Cerenkov Luminescence Imaging CLI for Cancer Therapy Monitoring

Use of Cerenkov Luminescence Imaging (CLI) for monitoring preclinical cancer treatment is described here. This method takes advantage of Cerenkov Radiation (CR) and optical imaging (OI) to visualize radiolabeled probes and thus provides an alternative to PET in preclinical therapeutic monitoring and drug screening.

Luminescenza Imaging Cerenkov (CLI) per il monitoraggio Cancer Therapy

In  molecular imaging, positron emission tomography (PET) and optical imaging (OI)  are two of the most important and thus most widely used modalities1-3. ...

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Medicina

Human Brown Adipose Tissue Depots Automatically Segmented by Positron Emission Tomography/Computed Tomography and Registered Magnetic Resonance Images

Reliably differentiating brown adipose tissue (BAT) from other tissues using a non-invasive imaging method is an important step toward studying BAT in humans. Detecting BAT is typically confirmed by the uptake of the injected radioactive tracer 18F-Fluorodeoxyglucose (18F-FDG) into adipose tissue depots, as measured by positron emission tomography/computed tomography (PET-CT) scans after exposing the subject to cold stimulus. Fat-water separated magnetic resonance imaging (MRI) has the ability to distinguish BAT without the use of a radioactive tracer. To date, MRI of BAT in adult humans has not been co-registered with cold-activated PET-CT. Therefore, this protocol uses 18F-FDG PET-CT scans to automatically generate a BAT mask, which is then applied to co-registered MRI scans of the same subject. This approach enables measurement of quantitative MRI properties of BAT without manual segmentation. BAT masks are created from two PET-CT scans: after exposure for 2 hr to either thermoneutral (TN) (24 &#176;C) or cold-activated (CA) (17 &#176;C) conditions. The TN and CA PET-CT scans are registered, and the PET standardized uptake and CT Hounsfield values are used to create a mask containing only BAT. CA and TN MRI scans are also acquired on the same subject and registered to the PET-CT scans in order to establish quantitative MRI properties within the automatically defined BAT mask. An advantage of this approach is that the segmentation is completely automated and is based on widely accepted methods for identification of activated BAT (PET-CT). The quantitative MRI properties of BAT established using this protocol can serve as the basis for an MRI-only BAT examination that avoids the radiation associated with PET-CT.

The method presented here uses 18F-Fluorodeoxyglucose (18F-FDG) positron emission tomography/computed tomography (PET-CT) and fat-water separated magnetic resonance imaging (MRI), each scanned following 2 hr exposure to thermoneutral (24 &#176;C) and cold conditions (17 &#176;C) in order to map brown adipose tissue (BAT) in adult human subjects.

Umano Brown adipose Depositi tessuti segmentato automaticamente da Positron Emission Tomography / tomografia computerizzata e registrati Risonanza Magnetica Images

Reliably differentiating brown adipose tissue (BAT) from other tissues using a non-invasive imaging method is an important step toward studying BAT in ...

Murine Isolated Heart Model of Myocardial Stunning Associated with Cardioplegic Arrest

The following protocol is of use to evaluate impaired cardiac function or myocardial stunning following moderate ischemic insults. The technique is useful for modeling ischemic injury associated with numerous clinically relevant phenomenon including cardiac surgery with cardioplegic arrest and cardiopulmonary bypass, off-pump CABG, transplant, angina, brief ischemia, etc. The protocol presents a general method to model hypothermic hyperkalemic cardioplegic arrest and reperfusion in rodent hearts focusing on measurement of myocardial contractile function. In brief, a mouse heart is perfused in langendorff mode, instrumented with an intraventricular balloon, and baseline cardiac functional parameters are recorded. Following stabilization, the heart is then subject to brief infusion of a cardioprotective hypothermic cardioplegia solution to initiate diastolic arrest. Cardioplegia is delivered intermittently over 2 hr. The heart is then reperfused and warmed to normothermic temperatures and recovery of myocardial function is monitored. Use of this protocol results in reliable depressed cardiac contractile function free from gross myocardial tissue damage in rodents.

The goal of this protocol to assess myocardial stunning following ischemic cardioplegic arrest in rodents.

Murino Isolato Cuore modello di infarto stordimento associati con arresto cardioplegica

The following protocol is of use to evaluate impaired cardiac function or myocardial stunning following moderate ischemic insults. The technique is useful ...

Encapsulation Thermogenic Preadipocytes for Transplantation into Adipose Tissue Depots

Cell encapsulation was developed to entrap viable cells within semi-permeable membranes. The engrafted encapsulated cells can exchange low molecular weight metabolites in tissues of the treated host to achieve long-term survival. The semipermeable membrane allows engrafted encapsulated cells to avoid rejection by the immune system. The encapsulation procedure was designed to enable a controlled release of bioactive compounds, such as insulin, other hormones, and cytokines. Here we describe a method for encapsulation of catabolic cells, which consume lipids for heat production and energy dissipation (thermogenesis) in the intra-abdominal adipose tissue of obese mice. Encapsulation of thermogenic catabolic cells may be potentially applicable to the prevention and treatment of obesity and type 2 diabetes. Another potential application of catabolic cells may include detoxification from alcohols or other toxic metabolites and environmental pollutants.

Here, we present a protocol for encapsulation of catabolic cells, which consume lipids for heat production in intra-abdominal adipose tissue and increase energy dissipation in obese mice.

Incapsulamento termogenico preadipocytes al trapianto nel tessuto adiposo Depositi tessuti

Cell encapsulation was developed to entrap viable cells within semi-permeable membranes. The engrafted encapsulated cells can exchange low molecular ...

Assessment of Human Adipose Tissue Microvascular Function Using Videomicroscopy

While obesity is closely linked to the development of metabolic and cardiovascular disease, little is known about mechanisms that govern these processes. It is hypothesized that pro-atherogenic mediators released from fat tissues particularly in association with central/visceral adiposity may promote pathogenic vascular changes locally and systemically, and the notion that cardiovascular disease may be the consequence of adipose tissue dysfunction continues to evolve. Here, we describe a unique method of videomicroscopy that involves analysis of vasodilator and vasoconstrictor responses of intact small human arterioles removed from the adipose depot of living human subjects. Videomicroscopy is used to examine functional properties of isolated microvessels in response to pharmacological or physiological stimuli using a pressured system that mimics in vivo conditions. The technique is a useful approach to gain understanding of the pathophysiology and molecular mechanisms that contribute to vascular dysfunction locally within the adipose tissue milieu. Moreover, abnormalities in the adipose tissue microvasculature have also been linked with systemic diseases. We applied this technique to examine depot-specific vascular responses in obese subjects. We assessed endothelium-dependent vasodilation to both increased flow and acetylcholine in adipose arterioles (50 - 350 &#181;m internal diameter, 2 - 3 mm in length) isolated from two different adipose depots during bariatric surgery from the same individual. We demonstrated that arterioles from visceral fat exhibit impaired endothelium-dependent vasodilation compared to vessels isolated from the subcutaneous depot. The findings suggest that the visceral microenvironment is associated with vascular endothelial dysfunction which may be relevant to clinical observation linking increased visceral adiposity to systemic disease mechanisms. The videomicroscopy technique can be used to examine vascular phenotypes from different fat depots as well as compare findings across individuals with different degrees of obesity and metabolic dysfunction. The method can also be used to examine vascular responses longitudinally in response to clinical interventions.

Videomicroscopy systems are used to examine functional properties of isolated adipose tissue arterioles in response to physiological and pharmacological stimuli. This technique can be used to examine microvascular phenotypes in different adipose tissue domains in obese humans.

Valutazione della funzione microvascolare di tessuto adiposo umano mediante videomicroscopia

While obesity is closely linked to the development of metabolic and cardiovascular disease, little is known about mechanisms that govern these processes. ...

Characterization of Immune Cells in Human Adipose Tissue by Using Flow Cytometry

Infiltration of immune cells in the subcutaneous and visceral adipose tissue (AT) deposits leads to a low-grade inflammation contributing to the development of obesity-associated complications such as type 2 diabetes. To quantitatively and qualitatively investigate the immune cell subsets in human AT deposits, we have developed a flow cytometry approach. The stromal vascular fraction (SVF), containing the immune cells, is isolated from subcutaneous and visceral AT biopsies by collagenase digestion. Adipocytes are removed after centrifugation. The SVF cells are stained for multiple membrane-bound markers selected to differentiate between immune cell subsets and analyzed using flow cytometry. As a result of this approach, pro- and anti-inflammatory macrophage subsets, dendritic cells (DCs), B-cells, CD4+ and CD8+ T-cells, and NK cells can be detected and quantified. This method gives detailed information about immune cells in AT and the amount of each specific subset. Since there are numerous fluorescent antibodies available, our flow cytometry approach can be adjusted to measure various other cellular and intracellular markers of interest.

This article describes a method to analyze immune cell content of adipose tissue by isolation of immune cells from adipose tissue and subsequent analysis using flow cytometry.

Caratterizzazione di cellule immunitarie nel tessuto adiposo umano mediante citometria a flusso

Infiltration of immune cells in the subcutaneous and visceral adipose tissue (AT) deposits leads to a low-grade inflammation contributing to the ...

Clinical Protocol of Producing Adipose Tissue-Derived Stromal Vascular Fraction for Potential Cartilage Regeneration

Osteoarthritis (OA) is one of the most common debilitating disorders.&#160;Recently, numerous attempts have been made to improve the functions of the knees by using different forms of mesenchymal stem cells (MSCs). In Korea, bone marrow concentrates and cord blood-derived stem cells have been approved by the Korean Food and Drug Administration (KFDA) for cartilage regeneration. In addition, an adipose tissue-derived stromal vascular fraction (SVF) has been allowed by the KFDA for joint injections in human patients. Autologous adipose tissue-derived SVF contains extracellular matrix (ECM) in addition to mesenchymal stem cells. ECM excretes various cytokines that, along with hyaluronic acid (HA) and platelet-rich plasma (PRP) activated by calcium chloride, may help MSCs to regenerate cartilage and improve knee functions. In this article, we presented a protocol to improve knee functions by regenerating cartilage-like tissue in human patients with OA. The result of the protocol was first reported in 2011 followed by a few additional publications. The protocol involves liposuction to obtain autologous lipoaspirates that are mixed with collagenase. This lipoaspirates-collagenase mixture is then cut and homogenized to remove large fibrous tissue that may clog up the needle during the injection. Afterwards, the mixture is incubated to obtain adipose tissue-derived SVF. The resulting adipose tissue-derived SVF, containing both adipose tissue-derived MSCs and remnants of ECM, is injected into knees of patients, combined with HA and calcium chloride activated PRP. Included are three cases of patients who were treated with our protocol resulting in improvement of knee pain, swelling, and range of motion along with MRI evidence of hyaline cartilage-like tissue.

Here, we present a protocol to produce an adipose tissue-derived stromal vascular fraction and its application to improve knee functions by regenerating cartilage-like tissue in human patients with osteoarthritis.

Protocollo clinico di produrre tessuto adiposo-derivato Stromal frazione vascolare per potenziale rigenerazione della cartilagine

Osteoarthritis (OA) is one of the most common debilitating disorders.&#160;Recently, numerous attempts have been made to improve the functions of the ...

Whole Body and Regional Quantification of Active Human Brown Adipose Tissue Using 18F-FDG PET/CT

In endothermic animals, brown adipose tissue (BAT) is activated to produce heat for defending body temperature in response to cold. BAT&#39;s ability to expend energy has made it a potential target for novel therapies to ameliorate obesity and associated metabolic disorders in humans. Though this tissue has been well studied in small animals, BAT&#39;s thermogenic capacity in humans remains largely unknown due to the difficulties of measuring its volume, activity, and distribution. Identifying and quantifying active human BAT is commonly performed using 18F-Fluorodeoxyglucose (18F-FDG) positron emission tomography and computed tomography (PET/CT) scans following cold-exposure or pharmacological activation. Here we describe a detailed image-analysis approach to quantify total-body human BAT from 18F-FDG PET/CT scans using an open-source software. We demonstrate the drawing of user-specified regions of interest to identify metabolically active adipose tissue while avoiding common non-BAT tissues, to measure BAT volume and activity, and to further characterize its anatomical distribution. Although this rigorous approach is time-consuming, we believe it will ultimately provide a foundation to develop future automated BAT quantification algorithms.

Whole Body and Regional Quantification of Active Human Brown Adipose Tissue Using 18F-FDG PET/CT

Using free, open-source software, we have developed an analytical approach to quantify total and regional brown adipose tissue (BAT) volume and metabolic activity of BAT using 18F-FDG PET/CT.

Tutto il corpo e quantificazione regionale dell'essere umano attivo marrone tessuto adiposo con 18F-FDG PET/CT

In endothermic animals, brown adipose tissue (BAT) is activated to produce heat for defending body temperature in response to cold. BAT&#39;s ability to ...

Inguinal Subcutaneous White Adipose Tissue (ISWAT) Transplantation Model of Murine Islets

Pancreatic islet transplantation is a well-established therapeutic treatment for type 1 diabetes. The kidney capsule is the most commonly used site for islet transplantation in rodent models. However, the tight kidney capsule limits the transplantation of sufficient islets in large animals and humans. The inguinal subcutaneous white adipose tissue (ISWAT), a new subcutaneous space, was found to be a potentially valuable site for islet transplantation. This site has better blood supply than other subcutaneous spaces. Moreover, the ISWAT accommodates a larger islet mass than the kidney capsule, and transplantation into it is simple. This manuscript describes the procedure of mouse islet isolation and transplantation in the ISWAT site of syngeneic diabetic mouse recipients. Using this protocol, murine pancreatic islets were isolated by standard collagenase digestion and a basement membrane matrix hydrogel was used for fixing the purified islets in the ISWAT site. The blood glucose levels of the recipient mice were monitored for more than 100 days. Islet grafts were retrieved at day 100 after transplantation for histological analysis. The protocol for islet transplantation in the ISWAT site described in this manuscript is simple and effective.

Inguinal Subcutaneous White Adipose Tissue ISWAT Transplantation Model of Murine Islets

In this protocol, a method of murine islet isolation and transplantation into the inguinal subcutaneous white adipose tissue is described. Isolated syngeneic murine islets are transplanted into a murine recipient using a basement membrane hydrogel. The blood glucose level of the recipients is monitored, and histology analysis of the islet grafts is performed.

Modello di trapianto di Murine (ISWAT) del tessuto adiposo sottocutaneo inguinale (ISWAT)

Pancreatic islet transplantation is a well-established therapeutic treatment for type 1 diabetes. The kidney capsule is the most commonly used site for ...

Fat-Covered Islet Transplantation Using Epididymal White Adipose Tissue

Islet transplantation is a cellular replacement therapy for severe diabetes mellitus. The intraperitoneal cavity is typically the transplant site for this procedure. However, intraperitoneal islet transplantation has some limitations, including poor transplant efficacy, difficult graft detection ability, and a lack of graftectomy capability for post-transplant analysis. In this paper, "fat-covered islet transplantation", an intraperitoneal islet transplantation method that utilizes epididymal white adipose tissue, is used to assess the therapeutic effects of bioengineered islets. The simplicity of the method lies in the seeding of islets onto epididymal white adipose tissue and using the tissue to cover the islets. While this method can be categorized as an intraperitoneal islet transplantation technique, it shares characteristics with intra-adipose tissue islet transplantation. The fat-covered islet transplantation method demonstrates more robust therapeutic effects than intra-adipose tissue islet transplantation, however, including the improvement of blood glucose and plasma insulin levels and the potential for graft removal. We recommend the adoption of this method for assessing the mechanisms of islet engraftment into white adipose tissue and the therapeutic effects of bioengineered islets.

This fat-covered islet transplantation method is suitable for the detection of engrafted islets in the intraperitoneal cavity. Notably, it does not require the use of biobinding agents or suturing.

Trapianto di isole ricoperte di grasso utilizzando tessuto adiposo bianco epididimo

Islet transplantation is a cellular replacement therapy for severe diabetes mellitus. The intraperitoneal cavity is typically the transplant site for this ...