Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni da ANR (Programma Blanc Neuroscienze), FRC (Fédération pour la Recherche sur le Cerveau), Città di Parigi (Programma Emersione), INSERM e La Pitié Salpêtrière Hospital (contratto di ricerca traslazionale) per NR, da Neuropôle de Recherche Francilien (nerf) a ED, presso l&#39;Université Pierre et Marie Curie UPMC (programma di convergenza) e presso l&#39;Institut du Cerveau et à la Moelle epiniere (Parigi) di GH

NOTA: Il protocollo qui descritto segue le linee guida del francese &quot;Comité Consultatif National d&#39;Ethique&quot; e viene dichiarata come attività di raccolta da INSERM. 1. La resezione di tessuto epilettico umano <ol><li> Pazienti <ol><li> Ottenere tessuto cerebrale di pazienti affetti da epilessia intrattabile. Ottenere un consenso informato scritto prima dell&#39;intervento chirurgico. </li><li> Per tutti operati pazienti epilettici eseguire una vasta work-up preoperatorio compreso l&#39;esame neurologico, valutazione neuropsicologica, EEG di superficie, e di neuroimaging (risonanza magnetica e, a volte 18 FDG-PET scansione; Figura 1A), seguita da post-chirurgica esame istologico del tessuto asportato (Figura 1B) . NOTA: L&#39;intervento chirurgico è indicato quando le diverse esplorazioni localizzare allo stesso modo la zona delle crisi e quando i benefici della sua rimozione supera i rischi chirurgici. </li></ol></li><li> Chirurgia <ol><li> Maifarmaci antiepilettici ntain pre-operatorio. Eseguire chirurgia in anestesia generale: induzione con sevoflurano inalato (6% Rapporto consegnato e 100% Frazione inalazione di O 2), intra sufentanyl venosa (0,3 mg / kg) e antracurium (0,5 mg / kg), seguita da mantenimento con intra sufentanyl venosa (0,5 mg / kg / ora) e sevoflurano per via inalatoria (1 MAC). </li><li> Utilizzare un sistema neuronavigazione per consentire una localizzazione precisa della corteccia lesionata (Figura 1C). Dopo l&#39;incisione cutanea, eseguire un foro cranico nell&#39;osso seguita da una craniotomia con un alto trapano fuoriuscita. Elevare delicatamente il lembo osseo, e aprire la dura madre con le forbici (Figura 1D). </li><li> Utilizzare ultrasuoni intra-operatoria per facilitare l&#39;identificazione della corteccia anormale e strumentario microchirurgico e un aspiratore ad ultrasuoni sotto il microscopio operatorio. </li><li> Coagulazione e tagliare il piano di pio-aracnoidea secondo i limiti sulcal. Utilizzare dissezione subpiale per rElease corteccia dalla pia intorno alla zona lesionata. </li><li> Tagliare la materia bianca sotto la corteccia anormale effettuare un pezzo &quot;in massa&quot; resezione, risparmiando il più possibile la vascolarizzazione. Evitare la manipolazione traumatica della corteccia. </li><li> Tagliare una fetta dello spessore di 1 cm dal tessuto resecato lungo una direzione ortogonale alla superficie piale, compreso il fondo del solco e la corteccia transitorio. </li></ol></li></ol> 2. artificiale liquido cerebrospinale (ACSF) per Slice preparazione, incubazione e Registrazione <ol><li> ACSF per la preparazione fetta <ol><li> Preparare 1 L di base di saccarosio-ACSF 7,8, contenente (in mM): 250 saccarosio, 3 KCl, 25 NaHCO3, 10 D-glucosio, 1 CaCl 2, 10 MgCl 2; sciogliere questi sali in acqua deionizzata e ossigenare la soluzione con carbogeno per almeno 10 min. </li><li> Mettere ~ 700 ml di saccarosio ACSF a -80 ° C per 50-60 minuti (o -150 ° C per 15-20 min). Tenere il resto delsoluzione sotto ossigenazione nel ghiaccio. NOTA: Il ACSF per la preparazione fetta può essere conservato a 4 ° C; in questo caso, aggiungere CaCl2 e MgCl2 il giorno dell&#39;esperimento, prima di raffreddarlo. </li></ol></li><li> ACSF per la fetta di incubazione e la registrazione <ol><li> Preparare almeno 3 L di registrazione ACSF 7,8, contenente (in mM): 124 NaCl, KCl 3, 26 NaHCO3, 10 D-glucosio, 1.6 CaCl 2, 1.3 MgCl 2; sciogliere questi sali in acqua deionizzata e ossigenare la soluzione con CarboGen. Prima di aggiungere MgCl 2, mantenere un po &#39;ACSF di effettuare registrazioni in 0 Mg 2+ ACSF. NOTA: Il ACSF incubazione / registrazione può essere conservato a 4 ° C; in questo caso, aggiungere CaCl2 e MgCl2 il giorno dell&#39;esperimento. </li></ol></li></ol> 3. apparecchiature per la fetta di incubazione e Registrazione <ol><li> Camera di Interfaccia per fetta di incubazione <ol><li> Utilizzare una camera fetta cervello per mantenere fette ex vivo vivente &lt;/ Em&gt; in modalità interfaccia. NOTA: La camera è composta da una sezione inferiore, che contiene il riscaldamento e gli elementi sensori e un gorgogliatore ceramica e viene riempita con acqua distillata, ed una parte superiore, dove le fette poggiano su un foglio di tessuto lente nella zona pianeggiante il centro della camera (Figura 2A - B). </li><li> Utilizzare due tubi separati fini di PTFE, attraverso il quale il preoxygenated ACSF entra nella camera. NOTA: I tubi spirale in acqua riscaldata e raggiungono la parte superiore della camera; allora la soluzione esce tramite azione capillare salviette, che trasmette la soluzione nei pozzetti di uscita. </li><li> Collegare i tubi PTFE della camera di interfaccia per una pompa peristaltica, per consentire perfusione continua delle fette con il mezzo preoxygenated. </li><li> Mantenere alta la tensione di ossigeno da ossigenante con carbogeno (95% O 2 e 5% CO 2) attraverso il gorgogliatore di ceramica. NOTA: Questa miscela di gas riscaldato e inumidito raggiunge lasezioni nella parte superiore della camera attraverso appositi fori. </li><li> Mantenere la temperatura nella parte superiore della camera collegando la camera ad un regolatore di temperatura, attraverso un cavo doppio attacco speciale, avente un connettore per l&#39;elemento riscaldante camera ed un sensore di temperatura esterno ad una estremità. Posizionare il sensore vicino le fette di controllare la temperatura durante tutto l&#39;incubazione (Figura 2C). </li></ol></li><li> Registrazioni di array multi-elettrodo <ol><li> Utilizzare planari array multi-elettrodo con 120 elettrodi di nitruro di titanio (30 micron di diametro) isolati con nitruro di silicio ed elettrodo di riferimento interno, disposti in una matrice di 12 x 12 con 200 micron da centro a centro di spaziatura. NOTA: Altre configurazioni con differente diametro dell&#39;elettrodo e la spaziatura sono possibili. In particolare, il chip MEA può essere allargata per campionare grandi fette di tessuti umani. </li><li> Acquisire segnali elettrici a 10 kHz con un sistema MEA2100-120 (pre e fiamplificatore ltro con l&#39;acquisizione integrata dei dati e convertitore analogico-digitale, la risoluzione dei dati a 16 bit, range di tensione di ingresso e la larghezza di banda regolabile via software) attraverso un software dedicato (MC_Rack). NOTA: Il headstage MEA2100 è dotato di una piastra metallica per il fissaggio dell&#39;elemento perfusione riscaldabile mediante supporti magnetici, per perfusione continuamente le fette durante la sessione di registrazione. </li><li> Tenere il tessuto verso il basso sul MEA da un piccolo ancoraggio di platino casalingo, che assicura un buon accoppiamento elettrico tra la fetta e gli elettrodi. </li></ol></li></ol> 4. Preparazione della Camera di interfaccia e strumenti per la dissezione e affettare <ol><li> Camera di Interfaccia <ol><li> Riempire la parte inferiore della camera di interfaccia con acqua distillata. Assicurarsi che il livello dell&#39;acqua immerge completamente l&#39;elemento riscaldante ed è da 2 a 4 mm sotto la giunzione tra la parte inferiore e superiore della camera. Controllare il livello di tutti i giorni prima di accendere il riscaldamento,al fine di evitare danni dell&#39;elemento riscaldante. </li><li> Collegare la camera ad una fonte carbogeno, dotato di un regolatore di flusso secondario per regolazioni fini di pressione del gas. </li><li> Tagliare un foglio di tessuto per obiettivi al fine di adattare la zona pianeggiante della camera fetta, e posizionarlo vicino ai tubi di soluzione di ingresso, per permettere la fuoriuscita di bolle dalla linea di ingresso prima di raggiungere le fette. </li><li> Tagliare due pezzi di filo di cotone filamento finché il pezzo di tessuto dell&#39;obiettivo, e posizionarle lungo i principali lati della zona piana della camera. NOTA: Questo aiuta a sollevare leggermente il livello della soluzione nella camera di perfusione. </li><li> Impostare la portata della pompa peristaltica a 1 ml / min e attivare la pompa. </li><li> Avviare ossigenazione dell&#39;acqua nella parte inferiore della camera. </li><li> Impostare la temperatura del regolatore di temperatura a 37 ° C e accenderlo. Coprire la parte superiore della camera di interfaccia con un pezzo di parafilm e attendere almeno 30 minuti per la temperatURE per aumentare e stabilizzare. </li></ol></li><li> Strumenti per la dissezione e affettare <ol><li> Preparare un kit di dissezione costituito da due pinza sottile, una spatola, un piccolo cucchiaio e una lama; due capsule di Petri in vetro, due pennelli e colla cianoacrilato. </li><li> Impostare i parametri del vibratome: spessore 400 micron; frequenza, 70-90 Hz; ampiezza, 0,9-1 mm, velocità di 0,1 mm / sec. </li></ol></li></ol> 5. corticale Fetta Preparazione umano <ol><li> Rimuovere il ACSF base di saccarosio-da -80 ° C congelatore e mescolare in modo da ottenere una sorta di granita. Ossigenare con CarboGen, mettere ~ 250 ml in una bottiglia di vetro e conservarlo in una bottiglia di Dewar pieno di ghiaccio, mentre andando in sala operatoria dell&#39;ospedale per ottenere il tessuto. Nel frattempo, tenere il resto a -20 ° C. NOTA: Durante l&#39;intervento, il neurochirurgo analizza un piccolo blocco di tessuto corticale. Subito posizionare il campione in ghiacciata saccarosio ACSF per il trasferimento al laboratorio. </li><li> Mantenere il tempo necessario per il trasferimento dall&#39;ospedale al laboratorio ad un massimo di 30 min. In laboratorio, prendere la ACSF ossigenato a base di saccarosio-out di -20 ° C freezer, mescolare di avere una granita, riempire una capsula di Petri e la vasca del buffer vibratome e iniziare ossigenante entrambi con CarboGen. Estrarre con attenzione il pezzo di tessuto umano dalla bottiglia con un cucchiaio e metterlo nella capsula di Petri (Figura 2D). </li><li> Utilizzando le pinze, rimuovere con attenzione i coaguli di sangue, i vasi e le meningi per evitare resistenza durante affettare. Rimuovere le meningi, consistente nella pia-materia, a partire dai lati del blocco di tessuto, facendo attenzione a non danneggiare la superficie corticale. Con una lama, tagliare un lato del tessuto per ottenere una superficie piana, che sarà incollato sulla piastra campione vibratome. NOTA: Le meningi, consistenti nella pia-materia, vengono rimossi a partire dai lati del blocco di tessuto, facendo attenzione a non danneggiare la superficie corticale. </li><li> Se il blocco di TiSSUE è più grande della camera di MEA, tagliare un pezzo di dimensioni appropriate prima di incollare sul piatto campioni (Figura 2E). </li><li> Incollare il tessuto in modo da ottenere fette corticali trasversali, metterlo nella vasca del buffer e tagliare 400 micron fette spesse a bassa velocità (0,1 mm / sec) (Figura 2F). </li><li> Tagliare pezzi di tessuto lenti con dimensioni di sezione; con una spatola e una spazzola, trasferire le fette su questi tessuti lenti e incubare nella camera di interfaccia a 37 ° C per almeno 1 ora prima della registrazione (Figura 2G - I) a partire. Continuamente memorizzare le fette nelle stesse condizioni fino al momento dell&#39;uso. NOTA: Mettere le fette su carta obiettivo è un passo importante per facilitare sia la perfusione del lato inferiore delle fette e la rimozione delle fette dalla camera di interfaccia prima di registrare. <ol><li> Durante il trasferimento le fette sul tessuto dell&#39;obiettivo, gestirle con molta attenzione, evitando di toccare l&#39;area strato corticale conla spazzola. </li><li> Preparare le fette uno alla volta e trasferire immediatamente ciascuno di essi alla camera di interfaccia, al fine di garantire il corretto apporto di ossigeno e temperatura; tagliare il blocco di tessuto asportato il più rapidamente possibile. </li></ol></li></ol> 6. Preparazione del programma di installazione MEA per Recordings <ol><li> Inserire il sistema di perfusione ad una pompa peristaltica ed il sistema MEA a un computer. Ossigenare il ACSF registrazione. Inserire un chip MEA vuoto all&#39;interno dell&#39;amplificatore. </li><li> Impostare il regolatore di temperatura per il riscaldamento dell&#39;elemento cannula raggiungere 37 ° C nella camera di MEA e iniziare la perfusione a 5-6 ml / min. NOTA: Di solito è necessario impostare la temperatura di 3-4 ° C superiore a quella desiderata, a seconda della temperatura ambiente e della portata. <ol><li> Controllare la temperatura nella camera MEA con una multa termometro, ponendo così il più vicino possibile al centro, senza toccare la superficie degli elettrodi. </li></ol></li><li> Avviare la registrazione software e verificare che tutti gli elettrodi MEA siano ben collegati e che non c&#39;è alcun rumore a causa di perfusione. </li><li> Inizia MEA_Monitor per verificare il funzionamento della tabella fotocamera. </li></ol> 7. Trasferimento di una fetta dalla camera Interfaccia MEA Chip per la registrazione <ol><li> Versare un po &#39;riscaldato registrazione ACSF in una capsula di Petri di vetro; con una pinza, prendere una fetta dalla camera di interfaccia, afferrando attraverso il panno per lenti, e metterlo nella capsula di Petri. Staccare con cautela la fetta dal tessuto. Se il livello della soluzione nella camera di interfaccia è accuratamente regolata durante il tempo di incubazione, la fetta si stacca dal tessuto lenti solo immergendo nella soluzione; altrimenti, usare uno spazzolino per facilitare il distacco. </li><li> Riempire un chip MEA con qualche ACSF e con una spatola, trasferire la fetta in esso. Con una pipetta Pasteur di plastica, rimuovere delicatamente la soluzione per rendere la fetta aderire sulla superficie degli elettrodi e tenerlo in posizione con un anch di platinoo. Aggiungere 1 ml di ACSF registrazione, posizionare il chip MEA all&#39;interno dell&#39;amplificatore e inizia a perfusione in 5-6 ml / min (Figura 2J - L). </li><li> Controllare la posizione fetta su l&#39;area di registrazione MEA utilizzando MEA_Monitor, regolare, se necessario, al fine di registrare dagli strati corticali e scattare una foto. Avviare la registrazione. </li></ol>

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Sponsorizzazione da sistemi multicanale è stato fornito per la produzione della pubblicazione video e accesso aperto.

Epilessia farmacoresistente è una condizione rara, che può essere esplorato in tessuti umani in vitro. Ciò consente lo studio corteccia umana epilettica, che visualizza difetti specifici che sono solo parzialmente riprodotte in modelli animali. Il metodo qui descritto consente la preparazione e la registrazione dei tessuti post-operatori umani ex vivo con la vitalità cellulare conservato e reti in modo che essi spontaneamente producono attività epilettiche. Mantenendo attività simili rispetto a quelli registrati in vivo è fondamentale per studiare i meccanismi di genesi di attività patologiche. Inoltre, tali metodi permettono di esplorare i tessuti umani e di evitare modelli non perfetti animali della malattia. Tuttavia, lo studio dei tessuti umani richiede la sincronizzazione tra neurochirurghi e il laboratorio sperimentale. Il trasporto dei tessuti richiede una cura specifica di non essere traumatico. Inoltre, sia la quantità di campione e tessuti è limitata. Infine, l&#39;accesso ai tessuti di controllo adeguati è il main preoccupazione. Con questa preparazione, i tessuti post-operatorie producono spontaneamente gli scarichi interictali-come nel normale ACSF 7,8. Eventi ictale-simili possono anche essere raggiunta in modificato, ACSF proconvulsivanti in modo che i meccanismi di sequestro iniziazione e di passaggio dallo stato interictale a crisi epilettiche possono essere studiate. Tessuto umano può essere mantenuta valida per un massimo di 10 ore in condizioni di interfaccia. Fette sono stati considerati vitali quando più elementi o campo di attività potenziali sono state osservate spontaneamente e quando tali attività sono state evocate, aumentando l&#39;eccitabilità attraverso l&#39;aumento di potassio extracellulari e / o diminuzione di magnesio. Anche se la variabilità dell&#39;attività si verifica, probabilmente riflettendo le differenze di patologie e aree corticali, abbiamo esplorato le caratteristiche epilettogene di un tessuto solo in fette sani mostrano interictale spontanea ed evocata scarichi ictali. Per salvaguardare la vitalità e l&#39;attività del tessuto, una camera interfaccia è utilizzata per memorizzare tegli fette a 36-37 ° C per il recupero prima della registrazione con il sistema MEA. Infatti, molti gruppi hanno dimostrato chiaramente i vantaggi del sistema di memorizzazione basato interfaccia rispetto allo stoccaggio becher standard e l&#39;importanza della temperatura per il mantenimento dell&#39;attività di rete come onda increspature taglienti spontanee o colinergici indotta oscillazioni 9,10. Stoccaggio Interfaccia di fette è stato precedentemente utilizzato per registrare l&#39;attività epilettica da dell&#39;ippocampo umano e fette subicular 1,11. Con la tecnica MEA corrente, dopo il periodo di recupero affettatura in condizioni di interfaccia dai, l&#39;attività di rete viene registrato in condizioni sommerse, in presenza di elevata portata (5-6 ml / min) a 37 ° C, con il sistema MEA. Il diametro ridotto (1,8 cm) di circuito integrato MEA, che delimita una piccola camera a volume (&lt;1,5 ml), insieme con la portata aumentata, aumenta il rifornimento di ossigeno della fetta, che è stato dimostrato essere un fattore critico per spontanea e PHArmacologically indotta da attività di rete 9,10. Inoltre, la ridotta quantità di circolante ACSF facilita test farmacologici. La procedura di taglio è comunque un trauma per i tessuti 12. Sia l&#39;architettura neuronale e cloruro omeostasi sembrano essere perturbato alla superficie del tessuto (50 micron). L&#39;origine delle attività registrate a scarti di MEA, che campione di tessuto per lo più superficialmente, senza penetrazione in profondità, può derivare da aree traumatizzate. Tuttavia, i nostri dati mostrano che i potenziali di campo extracellulari identificati localmente sono registrati nella maggior parte degli elettrodi MEA e precedente lavoro mostrano che esse sono integrate in un 100 a 200 micron di distanza dal sito di registrazione 13, suggerendo che i sequestri registrati nella nostra preparazione è improbabile che siano prodotto da aree traumatizzate. Inoltre, in studi effettuati con elettrodi di tungsteno che consentono la penetrazione in profondità, le attività epilettici registrati nei tessuti umani sono similia quelli osservati nei pazienti epilettici 1,7,8. Un altro limite del franco registrazione tessuto vivo è la rottura delle connessioni tra le diverse aree del cervello, limitando così neuromodulations dinamici. Questo potrebbe spiegare il motivo per cui in tale tessuto nessun evento ictale, come è registrato spontaneamente, ma richiede di essere attivato dalla manipolazione ionica o farmacologica stimolazione migliorare eccitabilità. Pertanto, in questo protocollo, attacchi simili sono indotti combinando una variazione K + extracellulare da 3 a 6 mm e una diminuzione di Mg 2+ esterno da 1,3 mM Mg 2 + -free ACSF, al fine di aumentare l&#39;eccitabilità del tessuto e rimuovere il blocco del recettore NMDA-dipendente Mg 2+. Infatti, è già stato dimostrato che l&#39;attività epilettiforme indotta in fettine di ippocampo e neocorteccia umana con Mg 2 + -free ACSF ricorda i sequestri elettrografiche registrati in vivo 14. Inoltre,è stato dimostrato che gli scarichi epilettiformi ottenuti in fette lobo temporale diventano resistenti anticonvulsivanti utilizzati clinicamente dopo esposizione prolungata a Mg2 + -free ACSF 15,16, fornendo così un modello per studiare attacchi simili farmacoresistenti in vitro. MEA consentono la registrazione di entrambi i potenziali di campo, e le attività a più elementi costituiti in potenziali d&#39;azione neuronali ex vivo. Così, MEA sono un potente strumento elettrofisiologico rispetto al EEG, che esplorano potenziali di campo generati dalle attività sincrone di gruppi neuronali in vivo, ma non dà accesso al singolo neurone comportamenti 17. Anche se microelettrodi più recenti in grado di registrare le attività a più elementi in vivo che consistono in potenziali d&#39;azione neuronali, che sono invasivi, quindi il loro uso è per lo più limitato a scopi di ricerca durante le registrazioni intracraniche. In particolare, le registrazioni MEA rappresentano una tecnica di sceltadi studiare i modelli spazio-temporali di eventi epilettici, i meccanismi che controllano il sequestro insorgenza e la propagazione e l&#39;azione di farmaci antiepilettici classici e nuovi. Sorprendentemente, per svelare i tipi di cellule e la base di segnalazione di scarichi epilettici, picco tecniche di ordinamento e la sperimentazione farmacologica deve essere combinata con tecniche di MEA. Anche se MEA possono dare accesso alle singole punte, non forniscono informazioni sulle proprietà sinaptiche e biofisici. In futuro, altre tecniche devono essere accoppiati alle registrazioni MEA, al fine di migliorare il comportamento cellulare di esempio, le attività di rete e segnalazione sinaptica. Per esempio, fluorescenza a dipanare neuroni o cellule gliali comportamento, e anche la dinamica di ioni, può essere combinato con MEA registrazioni. Ulteriori analisi istologica post hoc può anche rivelare alterazioni specifiche di tipi di cellule, proteine ​​o recettori in modo che la posizione delle attività epilettici può essere correlata con riarrangiamenti specifici delstruttura nervosa. Il sistema MEA può anche essere incorporato in un patch-clamp set-up per correlare singole cellule o conduttanze con le attività della popolazione. In futuro, strumenti optogenetic potrebbero anche essere utilizzati, purché fette umani possono essere coltivati ​​a lungo termine, interpretato per fette organotipiche, in modo che la trasfezione o infezione di specifici tipi cellulari possono essere eseguite.

L&#39;epilessia è una malattia cronica in cui crisi epilettiche, che sono scarichi fantasia intermittenti della durata di diversi secondi a decine di secondi su elettroencefalografici (EEG) registrazioni associate a manifestazioni cliniche, interrompono uno stato interictale, caratterizzato dalla presenza di scariche neuronali sincrone decine di millisecondi durata e ha invitato gli eventi interictali 1. Essa colpisce popolazione di circa l&#39;1% mondo e sebbene convulsioni sono controllate nella maggior parte dei pazienti, circa un terzo delle persone con epilessia non mostrano risposta adeguata ai farmaci antiepilettici 2. In questa condizione, chiamato epilessie farmacoresistenti ei cui meccanismi devono ancora essere chiaramente identificata, la resezione chirurgica della parte specifica del cervello identificata come la zona di sequestro insorgenza rimane l&#39;unico trattamento alternativo dà un risultato positivo per i pazienti. Così, i campioni asportati da un intervento chirurgico producono la opporoppor- per studiare i meccanismi di scarichi interictali e la generazione e la propagazione delle crisi, così come farmacoresistenza sul tessuto nervoso centrale umano vitale ex vivo. Multi-elettrodo array (MEA), presenta una disposizione di microelettrodi spazialmente distribuiti, consentono la stimolazione simultanea e registrazione dell&#39;attività elettrofisiologica da diversi siti del tessuto, fornendo così un metodo eccellente per studiare gli schemi spazio-temporali di attività spontanea ed evocata . Questa tecnica, prima applicazione di monitorare i cambiamenti dello sviluppo di attività colture cellulari neuronali 3 e poi adattato per il cervello acuto e organotipica e fette del midollo spinale 4-6, è oggi considerato uno strumento prezioso elettrofisiologico. Il protocollo attuale descrive come preparare le fette corticali umani dal tessuto asportato chirurgicamente e per registrare con MEA affidabile ex VIvo interictale ed eventi convulsivi, come da queste fette. Questa tecnica fornisce quindi un modo per affrontare i meccanismi fondamentali alla base delle attività epilettiche iniziazione, propagazione e gli effetti dei farmaci antiepilettici sia a livello cellulare e di rete. Tutte le procedure utilizzate per ottenere, preparare, mantenere e registrare fette umani vengono qui descritti in dettaglio.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="826">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:201px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:279px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Brain Slice Chamber-2: Interface</td>
			<td style="width:201px;">AutoMate Scientific, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">S-BSC2</td>
			<td style="width:279px;">It requires separate temperature controller</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">2-channel Temperature Controller</td>
			<td style="width:201px;">Multichannel Systems, Germany</td>
			<td style="width:119px;">TC02</td>
			<td style="width:279px;">It allows to plug in and use 2 interface chambers.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:227px;">Special cable for connection of TC01 to S-BSC2 with external reference PT100</td>
			<td style="width:201px;">Multichannel Systems, Germany</td>
			<td style="width:119px;">CA3</td>
			<td style="width:279px;">The reference PT100 is placed near the slices&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">6pin plug-connector with PT100</td>
			<td style="width:201px;">Multichannel Systems, Germany</td>
			<td style="width:119px;">TS-PT100</td>
			<td style="width:279px;">External reference for CA3 cable</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:227px;">MEA workstation for recording data from 120-electrode MEAs</td>
			<td style="width:201px;">Multichannel Systems, Germany</td>
			<td style="width:119px;">MEA2100-120</td>
			<td style="width:279px;">It includes MEA2100-120 headstage and MEA2100 interface board. www.multichannelsystems.com</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:227px;">Microelectrode array for MEA2100-120</td>
			<td style="width:201px;">Multichannel Systems, Germany</td>
			<td style="width:119px;">120MEA200/30</td>
			<td style="width:279px;">Electrode spacing: 200 &#181;m; electrode diameter: 30 &#181;m; glass ring: 6 mm high. Different configurations (spacing, diameter, ring) possible.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:227px;">Video Microscope Table</td>
			<td style="width:201px;">Multichannel Systems, Germany</td>
			<td style="width:119px;">MEA-VMT-1</td>
			<td style="width:279px;">Table with a video microscope underneath to image the electrode field of the MEAs in an amplifier placed on top of the table and transfer the image to a computer.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:227px;">Perfusion cannula</td>
			<td style="width:201px;">Multichannel Systems, Germany</td>
			<td style="width:119px;">PH01</td>
			<td style="width:279px;">Heatable perfusion cannula with temperature sensor; temperature can be programmed with TC02 controller</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">MC_Rack</td>
			<td style="width:201px;">Multichannel Systems, Germany</td>
			<td></td>
			<td style="width:279px;">Software for data acquisition and recordings</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:227px;">Magnetic Perfusion Holder</td>
			<td style="width:201px;">Multichannel Systems, Germany</td>
			<td style="width:119px;">MPH</td>
			<td style="width:279px;">Magnetic perfusion holder for PH01 element to fix the perfusion cannula and connect the perfusion system to the amplifier&#39;s ground</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Neuroexplorer</td>
			<td style="width:201px;">Nex Technologies</td>
			<td></td>
			<td style="width:279px;">Software for data analysis; info@neuroexplorer.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">Peristaltic pump (drive unit)</td>
			<td style="width:201px;">Gilson</td>
			<td style="width:119px;">F155001</td>
			<td style="width:279px;">0,01 to 48 rp</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">Peristaltic pump (pump head)</td>
			<td style="width:201px;">Gilson</td>
			<td style="width:119px;">F117800</td>
			<td style="width:279px;">R2 two channel</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Ultrasonic aspirator</td>
			<td style="width:201px;">Integra Life sciences, USA</td>
			<td style="width:119px;">Cusa Excel +</td>
			<td style="width:279px;">It allows blunt subpial dissection of the cortex</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Neuronavigation</td>
			<td style="width:201px;">Isis Solutions, France</td>
			<td style="width:119px;">Surgiscope</td>
			<td style="width:279px;">It allows real time identification of the brain structure on the preoperative MRI</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">Vibratome HM 650 V</td>
			<td style="width:201px;">Microm</td>
			<td></td>
			<td style="width:279px;">Block slicing into 400 &#956;m thick slices</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multi-electrode array recordings of human epileptic postoperative cortical tissue

L&#39;epilessia, che colpisce circa l&#39;1% della popolazione, comprende un gruppo di disturbi neurologici caratterizzati dalla presenza periodica di crisi epilettiche, che perturbano la normale funzione cerebrale. Nonostante il trattamento con farmaci antiepilettici attualmente disponibili il targeting funzioni neuronali, un terzo dei pazienti affetti da epilessia farmacoresistente sono. In questa condizione, la resezione chirurgica della zona del cervello generando convulsioni rimane l&#39;unico trattamento alternativo. Studiare tessuti epilettici umani ha contribuito a capire i nuovi meccanismi epilettogene nel corso degli ultimi 10 anni. In effetti, questi tessuti generano scariche epilettiche spontanee interictali così come gli eventi ictali farmacologicamente indotto, che possono essere registrati con le tecniche di elettrofisiologia classiche. Sorprendentemente, gli array multi-elettrodo (MEA), che sono i dispositivi che incorporano microfabbricate un array di microelettrodi spazialmente disposte, offrono l&#39;opportunità unica di stimolare contemporaneamente e campo del record potentials, nonché potenziali di azione di molteplici neuroni di diverse zone del tessuto. Così MEA registrazioni offrono un ottimo approccio per studiare i modelli spazio-temporali di interictale spontanea ed eventi convulsivi, come evocati e dei meccanismi alla base delle crisi insorgenza e la propagazione. Qui si descrive come preparare fettine corticali umani dal tessuto asportato chirurgicamente e per registrare con MEA interictali e ictali simili eventi ex vivo.

La registrazione dell&#39;attività fetta corticale umano inizia mentre perfusione del tessuto normale con ACSF registrazione (come descritto in precedenza) 7,8. In questa condizione, quando il tessuto è ben conservata durante l&#39;intervento e successivamente durante il trasferimento del tessuto dalla preparazione ospedaliero e fetta, si può osservare attività spontanea, in forma di piccoli eventi interictali simili, identificati da piccoli gruppi di elettrodi MEA. Scarichi interictale simile consistevano in un campo potenziale, di solito bifasico, comprendente una brusca deviazione negativa iniziale, raggiungendo decine di microvolt, seguita da un&#39;onda più opposto durata diverse decine di millisecondi. Attività veloci più elementi sono di solito incorporati nel potenziale di campo soprattutto nella parte iniziale. Un esempio rappresentativo di attività interictale come è illustrato nella Figura 3Aii, dove viene mostrata la traccia registrata da un elettrodo MEA. Per registrare crisi epilettiche da invitro fettine corticali umane, è necessario perfusione loro con un ACSF &quot;epilettogena&quot;, in cui Mg 2+ è assente e K + viene portata a 6 mM, per aumentare l&#39;eccitabilità del tessuto 1 (l&#39;aumento di K + da 3 a 6 mM da sola non è sufficiente per indurre convulsioni, dati non mostrati). Una volta che la perfusione con 0 Mg 2+ 6 mM K + ACSF è iniziata, l&#39;attività di fette corticali aumenta gradualmente e la prima crisi compare entro 15 a 20 min (15,4 ± 1,7 min, n = 10, da 5 pazienti; la figura 3 Ai ). Abbiamo ricordato attività accessuale simile, come mostrato in figura 3, nel 75% dei pazienti testati e 66,7% di tutte le sezioni registrate. Attività epilettiche sono registrati da elettrodi adiacenti del chip MEA, e il confronto delle dinamiche di insorgenza di potenziali eventi di campo permette di studiare il loro sito di genesi e propagazione. Un sequestro rappresentante registrata da una fetta di ronziouna corteccia cerebrale con il sistema MEA è mostrato nella Figura 3B (una traccia rappresentativa di un sequestro registrato da un singolo elettrodo MEA è mostrato in maggiore risoluzione temporale in figura 3 AIII). Si noti che il sequestro è registrata da quasi tutti gli elettrodi del chip MEA, indicando così che è in grado di propagare a una grande area corticale. Inoltre, guardando le singole tracce registrate da ciascun elettrodo, è possibile osservare la propagazione progressiva del sequestro di tutti i tessuti: infatti, inizia prima nella zona corticale che copre la metà destra della matrice di elettrodi, e si estende gradualmente l&#39;area che copre la metà sinistra (.. i e, confrontare tracce di elettrodo L6 e B6; Figura 3B). <img alt="Figura 1" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/51870/51870fig1highres.jpg" width="300" /> Figura 1: Una displasia corticale un. d la sua rimozione chirurgica di tipo A Taylor focale displasia corticale (freccia bianca) incorporato in un lobo solco frontale sinistro è visualizzato sul preoperatoria RM (A), e successivamente confermato da chinasi etichettatura esame istologico (B) MAP; barra della scala: 200 micron) che mostra un dyslamination corticale, i neuroni anormali e una traccia sui neuroni con una migrazione incompleta nella sostanza bianca in basso. Durante l&#39;intervento chirurgico, la displasia è localizzata in base ai dati MRI con sistema neuronavigazione (C). Visualizzazione del giro contenenti la displasia durante l&#39;intervento chirurgico (D). <img alt="Figura 2" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51870/51870fig2highres.jpg" width="400" /> Figura 2:. Attrezzature e procedure per la preparazione fetta corticale umano Una camera interfaccia viene utilizzata per mantenere le fette corticali umani ex vivo (A); Le fette di riposo su un foglio di tessuto lente nella zona pianeggiante nella parte superiore della camera (B), in cui un sensore di temperatura (C, sinistra), collegato ad un regolatore di temperatura (C, destra, sopra) attraverso un doppio Cavo ended (C, a destra, in basso), è posto a mantenere 37 ° C nel corso del tempo fetta di incubazione. Una volta ottenuto, posizionare il blocco resecato di tessuto in una capsula di Petri riempita con ACSF base di saccarosio-ghiacciata (D) e rimuovere coaguli sanguigni, vasi e meningi, per facilitare il taglio. Se il blocco di tessuto è più grande di camere MEA, isolare un pezzo di dimensioni adeguate con una lama (E) e la colla sul piatto portacampione vibratome (F). Tagliare 400 micron fette spesse e con l&#39;aiuto di una spatola (G) trasferirle su pezzi di tessuto lente (H) e incubare nella camera di interfaccia (I). Prima di registrare, remove la lente tessuto immergendo la fetta in una capsula di Petri riempita con ACSF e trasferirlo ad un ACSF riempito di chip MEA con una spatola (J). Rimuovere la soluzione di lasciare la fetta aderire sulla MEA (K) e mantenerlo in posizione utilizzando un ancoraggio platino. Posizionare il MEA dell&#39;amplificatore (L), avviare perfusione e la registrazione. <img alt="Figura 3" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/51870/51870fig3highres.jpg" width="300" /> Figura 3: registrazioni MEA di crisi epilettiche in fettine corticali umani (A) Una traccia rappresentante dell&#39;attività fetta corticale umana registrata da un elettrodo di MEA è come da tabella i.. In presenza di normale ACSF, è possibile osservare l&#39;attività interictale simile spontanea (piccolo rettangolo grigio, ingrandita Panel II); poi, quando la perfusione con 0 Mg 2+ 6 mM K + ACSF è iniziata, la prima seizure appare dopo un minuto di ritardo ~ 15 ed è seguito da altri eventi a 2-3 minuti di intervallo. Panel III mostra il sequestro nel grande rettangolo grigio nel pannello di I con una scala ingrandita. La traccia blu illustra uno zoom dell&#39;attività, come indicato dalla linea blu e freccia. Pannello iv) mostra i dati illustrati nel pannello iii) con filtro passa alto a 250 Hz, che rivelano l&#39;attività più unità in caso di zoom (traccia blu). (B) Registrazione Rappresentante di un sequestro in presenza di 0 Mg 2+ 6 K mm + ACSF da tutti gli elettrodi MEA. Ogni quadrato rappresenta un elettrodo di 12 x 12 serie MEA e mostra una finestra di tempo di 80 sec; la linea tratteggiata indica la posizione della superficie corticale relativamente alla matrice MEA.

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Multi-electrode Array Recordings of Human Epileptic Postoperative Cortical Tissue

Siamo qui descritto come eseguire multi-elettrodo registrazioni matrice di tessuto corticale epilettica umana. Resezione del tessuto epilettico, preparazione e fetta di array multi-elettrodo di registrazioni di eventi interictali e ictali sono dimostrati in dettaglio.

Multi-elettrodi array registrazioni di umano Epileptic postoperatoria corticale del tessuto

Epilepsy, affecting about 1% of the population, comprises a group of neurological disorders characterized by the periodic occurrence of seizures, which ...

multi-electrode-array-recordings-human-epileptic-postoperative

Research

JoVE Journal

Medicine

20.4K Views.  CNRS UMR 7241, INSERM U1050, Collège de France.  Siamo qui descritto come eseguire multi-elettrodo registrazioni matrice di tessuto corticale epilettica umana. Resezione del tessuto epilettico, preparazione e fetta di array multi-elettrodo di registrazioni di eventi interictali e ictali sono dimostrati in dettaglio. 

Video: Multi-electrode Array Recordings of Human Epileptic Postoperative Cortical Tissue

Formation of Human Prostate Epithelium Using Tissue Recombination of Rodent Urogenital Sinus Mesenchyme and Human Stem Cells

Progress in prostate cancer research is severely limited by the availability of human-derived and hormone-na&iuml;ve model systems, which limit our ability to understand genetic and molecular events underlying prostate disease initiation. Toward developing better model systems for studying human prostate carcinogenesis, we and others have taken advantage of the unique pro-prostatic inductive potential of embryonic rodent prostate stroma, termed urogenital sinus mesenchyme (UGSM). When recombined with certain pluripotent cell populations such as embryonic stem cells, UGSM induces the formation of normal human prostate epithelia in a testosterone-dependent manner. Such a human model system can be used to investigate and experimentally test the ability of candidate prostate cancer susceptibility genes at an accelerated pace compared to typical rodent transgenic studies. Since Human embryonic stem cells (hESCs) can be genetically modified in culture using inducible gene expression or siRNA knock-down vectors prior to tissue recombination, such a model facilitates testing the functional consequences of genes, or combinations of genes, which are thought to promote or prevent carcinogenesis.
The technique of isolating pure populations of UGSM cells, however, is challenging and learning often requires someone with previous expertise to personally teach. Moreover, inoculation of cell mixtures under the renal capsule of an immunocompromised host can be technically challenging. Here we outline and illustrate proper isolation of UGSM from rodent embryos and renal capsule implantation of tissue mixtures to form human prostate epithelium. Such an approach, at its current stage, requires in vivo xenografting of embryonic stem cells; future applications could potentially include in vitro gland formation or the use of induced pluripotent stem cell populations (iPSCs).

To unravel the earliest molecular mechanisms underlying prostate cancer initiation, novel and innovative human model systems and approaches are desperately needed. The potential of pre-prostatic urogenital sinus mesenchyme (UGSM) to induce pluripotent stem cell populations to form human prostate epithelium is a powerful experimental tool in prostate research.

Formazione di epitelio prostatico umano utilizzando tessuti ricombinazione dei roditori urogenitale Mesenchima Sinus e cellule staminali umane

Progress in prostate cancer research is severely  limited by the availability of human-derived and hormone-na&iuml;ve model systems,  which limit our ...

Ricerca

Medicina

Encapsulation Thermogenic Preadipocytes for Transplantation into Adipose Tissue Depots

Cell encapsulation was developed to entrap viable cells within semi-permeable membranes. The engrafted encapsulated cells can exchange low molecular weight metabolites in tissues of the treated host to achieve long-term survival. The semipermeable membrane allows engrafted encapsulated cells to avoid rejection by the immune system. The encapsulation procedure was designed to enable a controlled release of bioactive compounds, such as insulin, other hormones, and cytokines. Here we describe a method for encapsulation of catabolic cells, which consume lipids for heat production and energy dissipation (thermogenesis) in the intra-abdominal adipose tissue of obese mice. Encapsulation of thermogenic catabolic cells may be potentially applicable to the prevention and treatment of obesity and type 2 diabetes. Another potential application of catabolic cells may include detoxification from alcohols or other toxic metabolites and environmental pollutants.

Here, we present a protocol for encapsulation of catabolic cells, which consume lipids for heat production in intra-abdominal adipose tissue and increase energy dissipation in obese mice.

Incapsulamento termogenico preadipocytes al trapianto nel tessuto adiposo Depositi tessuti

Cell encapsulation was developed to entrap viable cells within semi-permeable membranes. The engrafted encapsulated cells can exchange low molecular ...

Working with Human Tissues for Translational Cancer Research

Medical research for human benefit is greatly impeded by the necessity for human tissues and subjects. However, upon obtaining consent for human specimens, precious samples must be handled with the greatest care in order to ensure integrity of organs, tissues, and cells to the highest degree. Unfortunately, tissue processing by definition requires extraction of tissues from the host, a change which can cause great cellular stress and have major repercussions on subsequent analyses. These stresses could result in the specimen being no longer representative of the site from which it was retrieved. Therefore, a strict protocol must be adhered to while processing these specimens to ensure representativeness. The desired assay(s) must also be taken into consideration in order to ensure that an optimal technique is used for sample processing. Outlined here is a protocol for tissue retrieval, processing and various analyses which may be performed on processed tissue in order to maximize downstream production from limited tissue samples.

Translational cancer research is dependent on extraction of human tissues. Much work has gone into optimizing extraction methods for ex vivo analysis. Here, we describe tissue processing methods allowing for maximal data output from limited samples.

Lavorare con tessuti umani per Translational Cancer Research

Medical research for human benefit is greatly impeded by the necessity for human tissues and subjects. However, upon obtaining consent for human ...

3D Ultrasound Imaging: Fast and Cost-effective Morphometry of Musculoskeletal Tissue

The developmental goal of 3D ultrasound imaging (3DUS) is to engineer a modality to perform 3D morphological ultrasound analysis of human muscles. 3DUS images are constructed from calibrated freehand 2D B-mode ultrasound images, which are positioned into a voxel array. Ultrasound (US) imaging allows quantification of muscle size, fascicle length, and angle of pennation. These morphological variables are important determinants of muscle force and length range of force exertion. The presented protocol describes an approach to determine volume and fascicle length of m.&#160;vastus lateralis and m.&#160;gastrocnemius medialis. 3DUS facilitates standardization using 3D anatomical references. This approach provides a fast and cost-effective approach for quantifying 3D morphology in skeletal muscles. In healthcare and sports, information on the morphometry of muscles is very valuable in diagnostics and/or follow-up evaluations after treatment or training.

3D ultrasound imaging (3DUS) allows fast and cost-effective morphometry of musculoskeletal tissues. We present a protocol to measure muscle volume and fascicle length using 3DUS.

Ecografia 3D: veloce e conveniente morfometria del tessuto muscolo-scheletrico

The developmental goal of 3D ultrasound imaging (3DUS) is to engineer a modality to perform 3D morphological ultrasound analysis of human muscles. 3DUS ...

Assessment of Human Adipose Tissue Microvascular Function Using Videomicroscopy

While obesity is closely linked to the development of metabolic and cardiovascular disease, little is known about mechanisms that govern these processes. It is hypothesized that pro-atherogenic mediators released from fat tissues particularly in association with central/visceral adiposity may promote pathogenic vascular changes locally and systemically, and the notion that cardiovascular disease may be the consequence of adipose tissue dysfunction continues to evolve. Here, we describe a unique method of videomicroscopy that involves analysis of vasodilator and vasoconstrictor responses of intact small human arterioles removed from the adipose depot of living human subjects. Videomicroscopy is used to examine functional properties of isolated microvessels in response to pharmacological or physiological stimuli using a pressured system that mimics in vivo conditions. The technique is a useful approach to gain understanding of the pathophysiology and molecular mechanisms that contribute to vascular dysfunction locally within the adipose tissue milieu. Moreover, abnormalities in the adipose tissue microvasculature have also been linked with systemic diseases. We applied this technique to examine depot-specific vascular responses in obese subjects. We assessed endothelium-dependent vasodilation to both increased flow and acetylcholine in adipose arterioles (50 - 350 &#181;m internal diameter, 2 - 3 mm in length) isolated from two different adipose depots during bariatric surgery from the same individual. We demonstrated that arterioles from visceral fat exhibit impaired endothelium-dependent vasodilation compared to vessels isolated from the subcutaneous depot. The findings suggest that the visceral microenvironment is associated with vascular endothelial dysfunction which may be relevant to clinical observation linking increased visceral adiposity to systemic disease mechanisms. The videomicroscopy technique can be used to examine vascular phenotypes from different fat depots as well as compare findings across individuals with different degrees of obesity and metabolic dysfunction. The method can also be used to examine vascular responses longitudinally in response to clinical interventions.

Videomicroscopy systems are used to examine functional properties of isolated adipose tissue arterioles in response to physiological and pharmacological stimuli. This technique can be used to examine microvascular phenotypes in different adipose tissue domains in obese humans.

Valutazione della funzione microvascolare di tessuto adiposo umano mediante videomicroscopia

While obesity is closely linked to the development of metabolic and cardiovascular disease, little is known about mechanisms that govern these processes. ...

A Mouse Model of Orthopedic Surgery to Study Postoperative Cognitive Dysfunction and Tissue Regeneration

Surgery is commonly used to improve and maintain quality of life. Unfortunately, in vulnerable patients such as the elderly, complications may occur and significantly diminish the outcome. Indeed, after routine orthopedic surgery to repair a fracture, as many as 50% of elderly patients suffer from neurologic complications like delirium. Also, the capacity to heal and regenerate tissue after surgery decreases with age, and can impact the quality of fracture repair and even osseous integration of implants. Thus, a better understanding of mechanisms that drive these age-dependent changes could provide strategic targets to minimize risk for such complications and optimize outcomes. Here, we introduce a clinically relevant mouse model of tibial fracture. The postoperative changes in these mice mimic some of the cognitive impairments commonly observed after routine orthopedic surgery in humans. Briefly, an incision is performed in the right hind limb under strictly aseptic conditions. Muscles are disassociated, and a 0.38-mm stainless steel pin is inserted into the upper crest of the tibia, inside the intramedullary canal. Osteotomy is then performed, and the wound is stapled. We have used this model to investigate the effects of surgical trauma on postoperative neuroinflammation and behavioral changes. By applying this fracture model in combination with parabiosis, a surgical model in which 2 mice are anastomosed, we have studied cells and secreted factors that systemically rejuvenate organ function and tissue regeneration after injury. By following our step-by-step protocol, these models can be reproduced with high fidelity, and can be adapted to interrogate many biologic pathways that are altered by surgical trauma.

This protocol describes a mouse model of orthopedic surgery that has been used to study mechanisms of postoperative neuroinflammation and behavioral changes, and when combined with parabiosis, to study tissue regeneration during aging.

Un modello murino di chirurgia ortopedica per studiare la disfunzione cognitiva postoperatoria e rigenerazione tissutale

Surgery is commonly used to improve and maintain quality of life. Unfortunately, in vulnerable patients such as the elderly, complications may occur and ...

Generation of Human 3D Lung Tissue Cultures (3D-LTCs) for Disease Modeling

Translation of novel discoveries to human disease is limited by the availability of human tissue-based models of disease. Precision-cut lung slices (PCLS) used as 3D lung tissue cultures (3D-LTCs) represent an elegant and biologically highly relevant 3D cell culture model, which highly resemble in situ tissue due to their complexity, biomechanics and molecular composition. Tissue slicing is widely applied in various animal models. 3D-LTCs derived from human PCLS can be used to analyze responses to novel drugs, which might further help to better understand the mechanisms and functional effects of drugs in human tissue. The preparation of PCLS from surgically resected lung tissue samples of patients, who experienced lung lobectomy, increases the accessibility of diseased and peritumoral tissue. Here, we describe a detailed protocol for the generation of human PCLS from surgically resected soft-elastic patient lung tissue. Agarose was introduced into the bronchoalveolar space of the resectates, thus preserving lung structure and increasing the tissue&#39;s stiffness, which is crucial for subsequent slicing. 500 &#181;m thick slices were prepared from the tissue block with a vibratome. Biopsy punches taken from PCLS ensure comparable tissue sample sizes and further increase the amount of tissue samples. The generated lung tissue cultures can be applied in a variety of studies in human lung biology, including the pathophysiology and mechanisms of different diseases, such as fibrotic processes at its best at (sub-)cellular levels. The highest benefit of the 3D-LTC ex vivo model is its close representation of the in situ human lung in respect of 3D tissue architecture, cell type diversity and lung anatomy as well as the potential for assessment of tissue from individual patients, which is relevant to further develop novel strategies for precision medicine.

Generation of Human 3D Lung Tissue Cultures 3D-LTCs for Disease Modeling

Here, we present a protocol for the preparation of agarose-filled human precision-cut lung slices from resected patient tissue that are suitable for generating 3D lung tissue cultures to model human lung diseases in biological and biomedical studies.

Generazione di colture del tessuto polmonare umano 3D (3D-LTC) per la modellazione di malattia

Translation of novel discoveries to human disease is limited by the availability of human tissue-based models of disease. Precision-cut lung slices (PCLS) ...

Nanoscopic Imaging of Human Tissue Sections via Physical and Isotropic Expansion

In modern pathology, optical microscopy plays an important role in disease diagnosis by revealing microscopic structures of clinical specimens. However, the fundamental physical diffraction limit prevents interrogation of nanoscale anatomy and subtle pathological changes when using conventional optical imaging approaches. Here, we describe a simple and inexpensive protocol, called expansion pathology (ExPath), for nanoscale optical imaging of common types of clinical primary tissue specimens, including both fixed-frozen or formalin-fixed paraffin embedded (FFPE) tissue sections. This method circumvents the optical diffraction limit by chemically transforming the tissue samples into tissue-hydrogel hybrid and physically expanding them isotropically across multiple scales in pure water. Due to expansion, previously unresolvable molecules are separated and thus can be observed using a conventional optical microscope.

Nanoscale imaging of clinical tissue samples can improve understanding of disease pathogenesis. Expansion pathology (ExPath) is a version of expansion microscopy (ExM), modified for compatibility with standard clinical tissue samples, to explore the nanoscale configuration of biomolecules using conventional diffraction limited microscopes.

Imaging nanoscopico delle sezioni dei tessuti umani attraverso l'espansione fisica e isotropica

In modern pathology, optical microscopy plays an important role in disease diagnosis by revealing microscopic structures of clinical specimens. However, ...

A Postoperative Evaluation Guideline for Computer-Assisted Reconstruction of the Mandible

Valid comparisons of postoperative accuracy results in computer-assisted reconstruction of the mandible are difficult due to heterogeneity in imaging modalities, mandibular defect classification, and evaluation methodologies between studies. This guideline uses a step-by-step approach guiding the process of imaging, classification of mandibular defects and volume assessment of three-dimensional (3D) models, after which a legitimized quantitative accuracy evaluation method can be performed between the postoperative clinical situation and the preoperative virtual plan. The condyles and the vertical and horizontal corners of the mandible are used as bony landmarks to define virtual lines in the computer-assisted surgery (CAS) software. Between these lines the axial, coronal, and both sagittal mandibular angles are calculated on both pre- and postoperative 3D models of the (neo)mandible and subsequently the deviations are calculated. By superimposing the postoperative 3D model to the preoperative virtually planned 3D model, which is fixed to the XYZ axis, the deviation between pre- and postoperative virtually planned dental implant positions can be calculated. This protocol continues and specifies an earlier publication of this evaluation guideline.

Here, we propose a practical, feasible and reproducible evaluation guideline for computer-assisted reconstruction of the mandible in order to create uniformity between studies regarding postoperative accuracy evaluation. This protocol continues and specifies an earlier publication of this evaluation guideline.

Una linea guida di valutazione postoperatoria per la ricostruzione assistita dal computer della mandibola

Valid comparisons of postoperative accuracy results in computer-assisted reconstruction of the mandible are difficult due to heterogeneity in imaging ...

Preparation of Human Myocardial Tissue for Long-Term Cultivation

Cardiomyocyte cultivation has seen a vast number of developments, ranging from two-dimensional (2D) cell cultivation to iPSC derived organoids. In 2019, an ex vivo way to cultivate myocardial slices obtained from human heart samples was demonstrated, while approaching in vivo condition of myocardial contraction. These samples originate mostly from heart transplantations or left-ventricular assist device placements. Using a vibratome and a specially developed cultivation system, 300 &#181;m thick slices are placed between a fixed and a spring wire, allowing for stable and reproducible cultivation for several weeks. During cultivation, the slices are continuously stimulated according to individual settings. Contractions can be displayed and recorded in real-time, and pharmacological agents can be readily applied. User-defined stimulation protocols can be scheduled and performed to assess vital contraction parameters like post-pause-potentiation, stimulation threshold, force-frequency relation, and refractory period. Furthermore, the system enables a variable pre- and afterload setting for a more physiological cultivation.
Here, we present a step-by-step guide on how to generate a successful long-term cultivation of human left ventricular myocardial slices, using a commercial biomimetic cultivation solution.

We present a protocol for ex vivo cultivation of human ventricular myocardial tissue. It allows for detailed analysis of contraction force and kinetics, as well as the application of pre- and afterload to mimic the in vivo physiological environment more closely.

Preparazione del tessuto miocardico umano per la coltivazione a lungo termine

Cardiomyocyte cultivation has seen a vast number of developments, ranging from two-dimensional (2D) cell cultivation to iPSC derived organoids. In 2019, ...