We gratefully acknowledge Dr. Hans Clevers (Hubrecht Institute for Developmental Biology and Stem Cell Research, Netherlands) for the kind gift of TOPflash cells.
This project was supported in part by NIH-R01DK083325 (MAH); NIH P30 DK078392 (Digestive Health Center); NIH UL1RR026314 (CTSA).

NOTA: Etica Dichiarazione: Tutti sperimentazione utilizzando tessuti umani descritti nel presente documento è stato approvato da un IRB a CCHMC (IRB # 2012-2858; # 2.014-0.427). Il consenso informato per la raccolta dei tessuti, lo stoccaggio e l&#39;uso dei campioni è stato ottenuto da donatori a CCHMC. 1. Preparazione per la Cultura NOTA: Tutti i reagenti sono elencati nella tabella 1. <ol><li> Preparare soluzione stock EDTA come segue: preparare 0,5 M di acido etilendiamminotetraacetico, pH 8 (EDTA) in ultrapura H 2 O, filtro sterilizzato con 0,22 micron filtro. Facoltativamente, conservare la soluzione EDTA stock in RT a tempo indeterminato. </li><li> Preparare tampone chelante come segue: mescolare 2% sorbitolo, 1% di saccarosio, 1% frazione albumina sierica bovina V (BSA) e 1x Gentamicina / soluzione amfotericina in fosfato di Dulbecco tamponata salina senza Ca 2+ e Mg 2+ (DPBS), filtro sterilizzato con 0,22 micron filtro. Preparare il buf chelantefer fresco. </li><li> Preparare medio Wnt-3A condizionata come segue: media Wnt-3A-condizionata è fatta in casa utilizzando la linea cellulare L Wnt-3A secondo le istruzioni del produttore (ATCC, CRL-2647). Supplemento alla media con glutammina 2 mM, HEPES 10 mM, 100 U / ml di penicillina, 100 g / ml di streptomicina, 1 N2 supplemento, 1 B27 supplemento, 1% BSA e filtro sterilizzato con filtro 0,22 micron. NOTA: test ogni lotto per l&#39;attività Wnt usando un test TOPflash. Utilizzare una stabile linea cellulare HEK293 TOPflash (Hans Clevers laboratorio) con un kit di test luciferasi Renilla secondo le istruzioni del produttore. Normalizzare il saggio TOPflash con 100 ng / ml ricombinante Wnt-3A umana. Conferma almeno un&#39;attività di 10 volte cambiamento dei media condizionati rispetto al controllo. Dividere fresco medio Wnt-3A-condizionata in 10 ml aliquote in 15 ml provette coniche e congelare a -20 ° C per un massimo di 6 mesi. Conservare scongelato aliquote fino a 5 giorni a 4 ° C senza perdita di attività. </li><li> Prepare medio minigut umana come segue: Supplemento avanzata DMEM / F12 con glutammina 2 mM, HEPES 10 mM, 100 U / mL di penicillina, 100 g / mL di streptomicina, 1 N2 integratore, 1 B27 supplemento, 1% BSA e filtro sterilizzato con 0,22 Filtro micron. NOTA: Dividere mezzo fresco minigut umano in 10 ml aliquote in 15 ml provette coniche e congelare a -20 ° C per un massimo di 3 mesi. Conservare scongelato aliquote fino a 5 giorni a 4 ° C senza perdita di attività. </li><li> Preparare mezzo completo minigut umana come segue: Preparare fresco prima cultura cripta o medio cambiamento medio minigut umana (cfr 1,4) integrato con il 50% Wnt-3A-condizionata medie (vedi 1.3), 1 mg / ml di R-spondina 1 (1: 1.000 diluizione di 1 mg / ml di brodo), 100 ng Noggin / ml (1: 1.000 diluizione di 100 g / mL archivio), 50 ng / mL EGF (1: 10.000 diluizione di 500 mg / mL archivio), 500 nM A-83 -01 (1: 1.000 diluizione 500 m stock), 10 mM SB202190 (1: 3.000 diluizione 30 magazzino mM), 10 nM [Leu] 15-Gastrina 1 (1: 10.000 diluizione 100 micronazione), Nicotinamide 10 mm (1: 100 diluizione di 1 m stock) e 1 mm N-Acetilcisteina (1: 1.000 diluizione di 1 m stock). NOTA: Conservare i media minigut umani completi fino a 2 giorni a 4 ° C senza perdita di attività. </li></ol> 2. Cripta isolamento da tutto il tessuto NOTA: Dalla collezione tessuti, è essenziale mantenere il campione in soluzione salina. Si raccomanda di mantenere il tessuto in ghiaccio durante il trasporto. Preparazione del campione per l&#39;isolamento della cripta deve essere eseguita appena possibile. NOTA: Tutti i reagenti sono elencate nella Tabella 1, strumenti, attrezzature, e materiali di consumo sono elencate nella tabella 2. <ol><li> Preparare tutti i reagenti prima di iniziare l&#39;esperimento. Scongelare la matrice membrana basale su ghiaccio e pre-incubare una piastra da 24 pozzetti in un CO 2 incubatore a 37 ° C. NOTA: In alternativa fare un sottile strato di matrice membrana basale utilizzando 15 microlitri / pozzetto nel centro di un 24Piastra -well e collocarlo in un incubatore CO 2 a 37 ° C. Questo passaggio facoltativo mantiene seminterrato matrice di membrana come una goccia durante la polimerizzazione. </li><li> Lavare il tessuto con ghiacciata fosfato di Dulbecco tamponata salina senza Ca 2+ e Mg 2+ (DPBS). Proseguire fino al contenuto di DPBS è chiara. </li><li> Usando 0,2 millimetri di diametro minutien perni, fissare il tessuto su un vetro Petri dish siliconata riempito con DPBS gelide. Allungare e pin il tessuto piana con il lato rivolto verso l&#39;alto della mucosa. </li><li> Sotto un microscopio da dissezione, rimuovere la mucosa sovrastante dalla sottomucosa e tessuto connettivo con le forbici micro-dissezione e punta fine pinze curve (Figura 2A, B). </li><li> Allungare e pin la sezionato mucosa piatta sul piatto di vetro siliconato Petri con il lato rivolto verso l&#39;alto della mucosa. La sottomucosa rimanente e del tessuto connettivo possono essere scartati o utilizzati per ulteriori esperimenti (Figura 2C). </li><li> Delicatamenteraschiare la superficie della mucosa con pinze curve. Questo passo è necessario per migliorare la qualità della preparazione. <ol><li> Per tenue, raschiare delicatamente la mucosa per rimuovere i villi. </li><li> Per colon, raschiare delicatamente la mucosa per rimuovere muco e detriti. </li></ol></li><li> Lavare la mucosa 3-4 volte con tampone chelazione ghiacciato per rimuovere villi e detriti. </li><li> Coprire la mucosa con appena preparato tampone chelazione 2mM EDTA (200 ml 0.5 M EDTA in 49,6 ml tampone di chelazione). </li><li> Porre la capsula Petri sul ghiaccio e agitare delicatamente per 30 minuti su un agitatore orbitale orizzontale. </li><li> Lavare il tessuto 3-4 volte con tampone chelazione gelida, senza EDTA. Dopo il lavaggio, lasciare la mucosa in tampone chelazione gelida. </li><li> Elaborare la mucosa sotto un microscopio da dissezione con pinze curve e sottili. Raschiare delicatamente la mucosa per liberare cripte intestinali utilizzando le pinze curve. </li><li> Rimuovere delicatamente la sospensione cripta dalla capsula di Petri con un piPette e le trasferisce in una provetta conica da 50 ml. NOTA: controllare il tessuto per assicurarsi che quasi tutti cripte sono stati rimossi dalla mucosa. </li><li> Filtrare la sospensione cripte attraverso un 150 micron in rete 2 volte. NOTA: controllare il flusso attraverso cripta arricchimento al microscopio (Figura 2D). </li><li> Centrifugare la cripta di sospensione 5 min a 50 xg, 4 ° C. Scartare il surnatante. </li><li> Risospendere il pellet in 5 ml di tampone chelazione ghiacciata. </li><li> Contare il numero di cripte per caduta di 10 microlitri della sospensione dal punto 2.15. Trasferire il numero di cripte necessari per la placcatura a 5 ml tubo a fondo rotondo. Usa 200 a 500 cripte per pozzetto di un piatto 24 pozzetti per stabilire enteroids o colonoids. </li><li> Centrifugare la frazione cripta per 10 minuti a 150 g, 4 ° C. Rimuovere il surnatante. </li><li> Utilizzare cripte per la cultura successiva. </li></ol> 3. Cripta Isolamento da biopsia <ol><li> Preparare tutti i reagenti primainizio dell&#39;esperimento. Scongelare la matrice membrana basale su ghiaccio e pre-incubare una piastra da 24 pozzetti in un CO 2 incubatore a 37 ° C. </li><li> Lavare la biopsia con ghiacciata fosfato di Dulbecco tamponata salina senza Ca 2+ e Mg 2+ (DPBS). </li><li> Usando 0,1 millimetri di diametro minutien perni, fissare la biopsia su un vetro Petri dish siliconata riempito con DPBS gelide. Allungare e pin mucosa piatta con il lato rivolto verso l&#39;alto della mucosa (Figura 2E). </li><li> Raschiare delicatamente la superficie della mucosa con pinze curve per rimuovere villi e detriti. Questo passo è necessario per migliorare la qualità della preparazione. </li><li> Lavare la biopsia 3-4 volte con tampone chelazione ghiacciato per rimuovere villi e detriti. </li><li> Coprire la biopsia con appena preparato tampone chelazione 2mM EDTA (200 ml 0.5 M EDTA in 49,8 ml tampone di chelazione). </li><li> Porre la capsula Petri sul ghiaccio e agitare delicatamente per 30 minuti su un agitatore orbitale orizzontale. </li> &lt;li&gt; Lavare la biopsia 3-4 volte con tampone chelazione gelida, senza EDTA. Dopo il lavaggio, lasciare la biopsia nel buffer di chelazione gelida. </li><li> Elaborare la biopsia sotto un microscopio da dissezione con pinze curve e sottili. Raschiare delicatamente la mucosa per liberare le cripte intestinali con pinze curve. </li><li> Rimuovere delicatamente la sospensione cripta dalla capsula di Petri con una pipetta e trasferirlo in una provetta da 50 ml. NOTA: controllare il tessuto per assicurarsi che quasi tutti cripte sono stati rimossi dalla mucosa. </li><li> Filtrare la sospensione cripta attraverso un nylon 150 micron maglia 2 volte. NOTA: controllare il flusso attraverso cripta arricchimento al microscopio. </li><li> Centrifugare la cripta di sospensione 5 min a 50 xg, 4 ° C. Scartare il surnatante. </li><li> Risospendere il pellet in 1 ml ghiacciata buffer di chelazione. Trasferire la sospensione cripta in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga. </li><li> Centrifuga la frazione cripta per 10 minuti a 150 xg, 4 ° C. Rimuovere il surnatante. &lt;/ Li&gt; <li> Utilizzare cripte per la cultura successiva. </li></ol> 4. Cripta Cultura a matrice di membrana basale <ol><li> Utilizzando puntali pre-refrigerati, risospendere il pellet crypt (dal punto 2.18 o 3.15) in membrana basale matrice (200 a 500 cripte / 50 ml seminterrato matrice di membrana). </li><li> Applicare 50 ml di sospensione cripta a membrana matrice seminterrato per bene sul piatto pre-riscaldato. Lentamente estrarre la matrice di membrana basale nel centro del pozzo. </li><li> Posizionare la piastra a 24 pozzetti a 37 ° C, 5% CO 2 incubatore per 30 min per permettere una completa polimerizzazione della matrice membrana basale. </li><li> Sovrapporre la matrice membrana basale con 500 ml di mezzo completo minigut umano integrato con 2,5 micron CHIR99021 (1: 4.000 diluizione 10 stock mM) e 2,5 micron Thiazovivin (1: 4.000 diluizione 10 stock mM). </li><li> Incubare la piastra a 37 ° C, 5% CO 2 incubatore. </li><li> Sostituire il mezzo con Huma fresca completan minigut media ogni 2 giorni. </li></ol> 5. Passaging di Colta Enteroids e Colonoids. NOTA: Passage Enteroids e Colonoids ogni 7 a 10 giorni dopo la placcatura iniziale. In generale, dividere un bene nel 3 a 4 pozzi. <ol><li> Preparare tutti i reagenti prima dell&#39;inizio dell&#39;esperimento. Scongelare la matrice membrana basale su ghiaccio e pre-incubare una piastra da 24 pozzetti in un CO 2 incubatore a 37 ° C. </li><li> Rimuovere il supporto con punte sterili e overlay con 1 ml di DPBS ghiacciate. </li><li> Pipetta avanti e indietro con una punta di 1.000 ml. Trasferire la soluzione in un nuovo tubo da 15 ml. </li><li> Aggiungere 2 ml di terreno minigut umana integrata con 5% FBS per 1 ml di terreno. </li><li> Centrifugare la soluzione per 5 min a 50 xg, a 4 ° C. Scartare il surnatante. </li><li> Risospendere il pellet con 2 ml di dissociazione cellulare dell&#39;enzima supplementato con 10 mM Y-27632 (1: 1.000 diluizione 10 stock mM). Incubare per 5 min a 37 ° C in un bagno d&#39;acqua. </li><li> Dissociare il grumi di cellule utilizzando una siringa da 3 ml Luer-Lock dotato di un 18-G di riempimento / ago smussato. Pipetta delicatamente la soluzione avanti e indietro con la siringa per 10 volte. </li><li> Centrifugare la sospensione per 5 minuti a 500 xg, a 4 ° C. Scartare il surnatante. </li><li> Utilizzando puntali pre-refrigerati, risospendere il pellet cellulare in matrice di membrana basale. </li><li> Applicare 50 ml di sospensione cripta a membrana matrice seminterrato per bene sul piatto pre-riscaldato. Lentamente estrarre la matrice di membrana basale nel centro del pozzo. </li><li> Posizionare la piastra a 24 pozzetti a 37 ° C, 5% CO 2 incubatore per 20 min per permettere una completa polimerizzazione della matrice membrana basale. </li><li> Sovrapporre la matrice membrana basale con 500 ml di mezzo completo minigut umano integrato con 10 pM Y-27632 (1: 1.000 diluizione 10 stock mM). </li><li> Incubare la piastra a 37 ° C, 5% CO 2 incubatore. </li><li> Dopo 2 giorni, Sostituire il mezzo con fresco mezzo completo minigut umano supplementato con 10 micron Y-27632 (1: 1.000 diluizione 10 stock mM). Successivamente, sostituire il mezzo fresco con mezzo completo, minigut umana ogni altro giorno. </li></ol> 6. Il congelamento di Colta Enteroids e Colonoids NOTA: Di solito congelare un pozzetto in 2-3 cryovials. <ol><li> Ripetere i punti da 5.1 a 5.8. </li><li> Risospendere il pellet con il mezzo di congelamento freddo. Trasferire 1 ml di congelamento soluzione in una provetta Microbank ™ etichetta. Posizionare il esageratamente in un recipiente congelamento contenente 500 ml di alcool isopropilico. </li><li> Trasferire il contenitore di congelamento di un C congelatore 80 ° per 24 ore, poi il trasferimento esageratamente allo stoccaggio di azoto liquido. NOTA: Conservare Enteroids e Colonoids fino a 1 anno. </li></ol>

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F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+CFTR+assay+using+primary+cystic+fibrosis+intestinal+organoids.">A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids.</a> Nat Med. 19 (7), 939-945 (2013).</li><li>Kovbasnjuk, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+enteroids:+preclinical+models+of+non-inflammatory+diarrhea.">Human enteroids: preclinical models of non-inflammatory diarrhea.</a> Stem Cell Res Ther. 4, S3 (2013).</li><li>Fujii, M., Sato, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+intestinal+stem+cells:+applications+for+colorectal+cancer+research.">Culturing intestinal stem cells: applications for colorectal cancer research.</a> Front Genet. 5, 169 (2014).</li><li>Koo, B. K., Sasselli, V., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+gene+expression+control+in+primary+organoid+cultures.">Retroviral gene expression control in primary organoid cultures.</a> Curr Protoc Stem Cell Biol. 27 (Unit 5A), 6 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Questo metodo fornisce un sistema completo riprodurre linee dell&#39;epitelio intestinale e dinamiche epiteliali che costituiscono un utile strumento per studiare la biologia epiteliale intestinale. Il metodo presentato qui è stato adattato dallo studio murino originale di Sato e Clevers 22 che si traduce in modo efficiente in enteroids umani e colonoids. Qui, abbiamo scelto manualmente le cripte per microdissezione per evitare contaminanti cellulari. Questo metodo permette una visualizzazione diretta delle cripte e porta a consistenza straordinari rispetto alla raccolta cripta originale &quot;agitando&quot;. Altri gruppi hanno sviluppato tecniche simili utilizzando approcci leggermente diversi soprattutto sostituiscono la chelazione da EDTA con collagenasi 25. Oltre alle differenze di raccolta cripta, tali tecniche utilizzano un supporto definito che è necessaria per far crescere i enteroids umani in coltura 22. Per aumentare l&#39;efficienza crescita a crypt semina, aggiungiamo un inibitore GSK3 (CHIR99021)per i primi due giorni a 12. La movimentazione del tessuto o biopsie è importante e l&#39;isolamento cripta deve essere eseguita non appena il tessuto arriva in laboratorio. Tuttavia, ritardata isolamento e la coltura cripta potrebbero essere eseguite fino a 24 ore dopo la raccolta del tessuto (dati non mostrati) come precedentemente descritto per il tessuto murino 26. Il tessuto intestinale deve essere posto in una provetta conica completamente riempito con DPBS per evitare perturbazioni del tessuto devono essere mantenuti a 4 ° C. La preparazione ritardata permette per trasporto tessuto ma la variazione di temperatura deve essere evitato durante il trasporto. Il tempo complessivo necessario per il fasciame cripta iniziale è di circa 2 ore con 15 a 30 minuti per elaborare il tessuto e da 1 a 2 ore per isolare e piastra cripta. La microdissezione del tessuto è un fattore determinante e predicato di una preparazione crypt pulito. Tuttavia, il rilascio cripta mano tremare, come descritto in diversi protocolli è possibile 22,23. Nonostante le analogie con il sistema enteroid murino (enteroids), le enteroids umani richiedono specifiche molecole per migliorare e sostenere la loro crescita nel tempo. I fattori di crescita, EGF, Noggin, R-spondina vengono utilizzati in modo simile ai organoidi epiteliali murine. Tuttavia, l&#39;uso di Wnt-3A è critica. Abbiamo notato che la formazione e l&#39;efficienza di crescita è maggiore utilizzando un mezzo condizionato Wnt-3A rispetto alla proteina umana ricombinante. Contemporaneamente, abbiamo dimostrato condizioni di coltura migliorate utilizzando un inibitore della chinasi glicogeno sintasi 3 (CHIR99021) 12. Fattori di crescita ricombinanti potrebbero essere sostituiti da Wnt-3A, R-spondina, e Noggin condizionato-media. Una linea L-cell-Wnt-3A espressione è disponibile in commercio (ATCC). Altri gruppi hanno sviluppato R-spondina 1- 23,27, Noggin- 19, e Wnt-3A / R-spondin3 / Noggin- 28 esprimere linee cellulari. Due inibitori piccole molecole vengono utilizzati nella cultura media e sono necessari per il mantenimento della cultura 29. A-83-01 è un inibitore selettivo della trasformazione β fattore di crescita e Activin / recettori nodali (activina-like chinasi 4, 5, 7) e SB202190 è un inibitore della proteina chinasi p38 mitogeno-attivata (MAPK). Entrambi gli inibitori sono stati utilizzati rispettivamente per sostenere umana indotte pluripotenti cellule staminali di auto-rinnovamento e di stabilire naïve cellule staminali pluripotenti umane 30-32. Inoltre, nicotinamide, un precursore di nicotinamide adenina dinucleotide, è necessario per mantenere enteroids ed espansione colonoids in modo lungo termine 22,29. La chelazione EDTA è un passo importante in quanto determina il rendimento dalla preparazione cripta. Abbiamo avuto successo con 2 trattamento mM EDTA. Tuttavia, la concentrazione EDTA può essere modificato da 2 mM a 15 mM relative al tipo di tessuto. In tal caso, il tempo di incubazione deve essere determinato empiricamente. Dopo la placcatura iniziale, la cripta arrotonderà-up e alla fine formano enteroids. Tuttavia, i enteroids o colonoids spesso mostrano un fenotipo &quot;radice&quot; formando sfere con poco o nessun cellule differenziate. In tal caso, la differenziazione può essere avviata prelevando Wnt-3A, nicotinamide e l&#39;inibitore p38 MAPK. L&#39;uso di inibitori Notch come DAPT o DBZ aiuta migliorare la differenziazione all&#39;interno dei enteroids 22. Questo modello ricapitola la fisiologia intestinale con eventi-cripta erba continui derivanti da un compartimento di cellule staminali e domini epiteliali dei villi-like contenenti sia di assorbimento e di secrezione differenziata lignaggi. È interessante notare che questo sistema non contiene cellule mesenchimali e utilizza specifiche condizioni dei media per soddisfare i requisiti del segnale di nicchia. Come il modello murino, enteroids umani possono essere generati da isolate cellule epiteliali intestinali per testare la capacità di queste cellule di funzionare come una cellula staminale. Sevestudi ral hanno utilizzato gruppo di marcatori di differenziazione (CD44, CD24 e CD166) e le cellule positive EphB2 per arricchire per le cellule con proprietà staminali 12,23,33. Insieme, questi studi dimostrano l&#39;utilità di enteroids umane culture per testare la staminalità. Altri ricercatori stanno utilizzando questo modello per studiare malattie intestinali quali le malattie infettive diarroiche, la fibrosi cistica, o tumori colorettali 22,34-37. Questi studi dimostrano che enteroids umani costituiscono un modello affidabile malattia umana con la possibilità di muoversi in direzione di uno screening personalizzato. Enteroids umani possono essere geneticamente modificati utilizzando trasfezione DNA o infezione con particelle virali 38. Ciò fornisce un potente strumento per studiare le funzioni specifiche del gene nei organoidi epiteliali umane o correggere le mutazioni genetiche. Recentemente, Schwank e colleghi hanno dimostrato la possibilità di modificare il genoma con il sistema CRISPR / Cas9 e correggere la mutazione sul gene CFTR causando acfibrosi ystic 24. Enteroids umane costituiscono un sistema prezioso per lo studio delle cellule staminali intestinali e epiteliali della mucosa biologia e servire come un sistema sperimentale romanzo di studiare sia normale e anormale fisiologia gastrointestinale.

L&#39;epitelio rivestimento del tratto gastrointestinale è in costante rinnovamento. Questo processo è innescato da proliferazione delle cellule staminali intestinali (ISC) che producono continuamente progenie di sostituire rapidamente l&#39;epitelio intestinale come si gira. Il vano proliferativa comprendente le ISC si limita al fondo delle cripte. Le ISC danno origine a una progenie che alla fine differenziarsi in assorbimento o lignaggi secretoria. Spostamento dalla cripta e sulla villi o la superficie epitelio, cellule si differenziano progressivamente quando migrano verso l&#39;alto prima di esfoliazione nel lume 1. ISC danno origine a tutti i tipi di cellule epiteliali intestinali tra cui enterociti, cellule, cellule microfold enteroendocrine, cellule del calice, cellule ciuffo e cellule Paneth. Il colon è caratterizzato da cripte allungati composte principalmente di colonociti e cellule calice, con enteroendocrine sparse e cellule ciuffo 2. Ex vivo culsistemi ture costituiscono strumento promettente per lo studio ISC manutenzione e omeostasi tessuto intestinale. Tuttavia, è difficile fare affidamento su tecnologie di coltura di tessuti come condizioni fisiologiche non sono completamente riprodotti e il microambiente epiteliale spesso alterati 3,4. Un grande passo avanti nel campo ISC è stata la creazione di tecniche di coltura di tessuti per mantenere ed espandere i singoli CSI murini utilizzando fattori di crescita definiti per sostituire i normali segnali di nicchia intestinale. Condizioni di coltura a lungo termine sono stati descritti da Sato et al., In cui singoli cripte o cellule staminali isolate dalla epitelio intestinale crescono a formare strutture epiteliali 3-dimensionale compresa più domini cripta simili 5-7. Queste strutture tridimensionali subiscono eventi di fissione per espandere continuamente. È interessante notare, tutti i tipi di cellule intestinali specifici del tessuto di origine vengono prodotti e così vengono estrusi in un lume 8. Usando modifiche di questo sistema, epitelialeorganoidi possono essere generati dallo stomaco, intestino tenue e colon. Più specificamente, organoidi epiteliali dell&#39;intestino tenue sono enteroids 9, e quelli del colon sono colonoids 9,10. Questi epiteliali sistemi di coltura organoide sono stati utilizzati per testare la capacità di isolate cellule singole a funzionare come cellule staminali in vitro, testando così la &quot;staminalità&quot; di cellule isolate 5,6,10-15. Altri ricercatori hanno usato sia enteroids e colonoids per studiare la funzione di singole cellule epiteliali 16-21. Così, le culture e enteroid colonoid possono essere utilizzati per valutare sia le funzioni di staminali e di cellule non-staminali e dare una nuova visione delle interazioni cellulari fondamentali all&#39;interno dell&#39;intestino. Nel 2011, Sato e colleghi generato cultura a lungo termine di organoidi epiteliali derivati ​​dal piccolo intestino umano e colon 22,23. Oltre alle differenze nella composizione media, le enteroids epiteliali umanee colonoids presentano le stesse caratteristiche come la loro controparte murina. Inoltre, possono essere generati da tessuti malati come l&#39;esofago di Barrett, adenoma o adenocarcinoma, e fibrosi cistica 22,24. Enteroids umane costituiscono un sistema prezioso per lo studio delle cellule staminali intestinali e epiteliali della mucosa biologia e servire come un sistema sperimentale romanzo studiare la fisiologia gastrointestinale sia normale e anormale 3. Qui si descrivono i metodi per stabilire enteroids e colonoids dal piccolo intestino umano e cripte del colon (Figura 1). In questa recensione metodologica, sottolineiamo la raccolta cripta dal tessuto insieme e biopsie. Abbiamo Ricapitoliamo le modalità di coltura che sono essenziali per la crescita e il mantenimento di enteroids e colonoids umani e le possibili strategie sperimentali svolte da questo modello di successo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="803">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:480px;">Name of Reagent</td>
			<td style="width:195px;">Company</td>
			<td style="width:129px;">Catalog Number</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Dulbecco&#8217;s Phosphate buffered saline Ca2+, Mg2+ free (DPBS)</td>
			<td>Life technologies; Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>431788</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sorbitol</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BP439-500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sucrose</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BP220-1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bovine serum albumin (BSA) Fraction V</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BP1600-100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gzntamycin/Amphotericin B solution</td>
			<td>Life technologies; Gibco</td>
			<td>R-015-10</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Wnt-3A conditionned medium</td>
			<td>in house</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Life technologies; Gibco</td>
			<td>12634-028</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES 1M</td>
			<td>Life technologies; Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GlutaMAX (glutamine)</td>
			<td>Life technologies; Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Life technologies; Gibco</td>
			<td>15140-148</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N2 Supplement</td>
			<td>Life technologies; Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">B27 Supplement</td>
			<td>Life technologies; Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N-Acetylcysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165-5G</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nicotidamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0636</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Matrigel, GFR, Phenol free (basement membrane matrix)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">human recombinant Noggin</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>6057-NG/CF</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">human recombinant R-Spondin</td>
			<td>Preprotech</td>
			<td>120-38</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">human recombinant EGF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9644-.2MG</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Y-27632</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y0503-1MG</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">A-83-01</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2939</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SB202190</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7067-5MG</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">human [Leu]15-Gastrin 1</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9145-.1MG</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CHIR99021</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>04-0004</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thiazovivin</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>04-0017</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red (cell dissociation enzyme)</td>
			<td>Life technologies; Gibco</td>
			<td>12605-010</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Life technologies; Gibco</td>
			<td>10082-147</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CTS Synth-a-Freeze Medium (freezing medium)</td>
			<td>Life technologies; Gibco</td>
			<td>A13713-01</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L Wnt-3A cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2647</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Renilla luciferase assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2710</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">human recombinant Wnt-3A</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>5036-WN/CF</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">HEK293 TOPflash cell line</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment of human epithelial enteroids and colonoids from whole tissue and biopsy

The epithelium of the gastrointestinal tract is constantly renewed as it turns over. This process is triggered by the proliferation of intestinal stem cells (ISCs) and progeny that progressively migrate and differentiate toward the tip of the villi. These processes, essential for gastrointestinal homeostasis, have been extensively studied using multiple approaches. Ex vivo technologies, especially primary cell cultures have proven to be promising for understanding intestinal epithelial functions. A long-term primary culture system for mouse intestinal crypts has been established to generate 3-dimensional epithelial organoids. These epithelial structures contain crypt- and villus-like domains reminiscent of normal gut epithelium. Commonly, termed &#8220;enteroids&#8221; when derived from small intestine and &#8220;colonoids&#8221; when derived from colon, they are different from organoids that also contain mesenchyme tissue. Additionally, these enteroids/colonoids continuously produce all cell types found normally within the intestinal epithelium. This in vitro organ-like culture system is rapidly becoming the new gold standard for investigation of intestinal stem cell biology and epithelial cell physiology. This technology has been recently transferred to the study of human gut. The establishment of human derived epithelial enteroids and colonoids from small intestine and colon has been possible through the utilization of specific culture media that allow their growth and maintenance over time. Here, we describe a method to establish a small intestinal and colon crypt-derived system from human whole tissue or biopsies. We emphasize the culture modalities that are essential for the successful growth and maintenance of human enteroids and colonoids.

La figura 2D mostra un tipico esempio di cripte appena isolate da tutto il tessuto (Figura 2D). Il numero di cripte isolate da una biopsia è inferiore nel tessuto intero. Utilizzando pinze capacità standard di biopsia con ago, di solito effettuiamo due morsi biopsia su un unico passaggio. Ogni risultati morso biopsia in una superficie 10 mm 2 con una media di 50 a 100 cripte per biopsia (Figura 2F). Dopo la cultura in matrice membrana basale, le cripte completano a formare enterospheres per tenue e colonospheres per colon. La cripta erba di solito si verifica entro 5 o 6 giorni, dopo la semina. Tuttavia non è raro vedere sia enteroids (enteroids) o colonoids (colonoids) formano sfere della matrice membrana basale (Figura 3A-C, Movie 1). Il passaging può essere effettuata dopo 7 giorni, a seconda delle dimensioni delle enteroids. Il enteroids o colonoids establmentata da biopsie subiscono lo stesso sviluppo della cultura. Tuttavia, poiché la densità cripta di semina è inferiore, il passaging viene di solito effettuata dopo 10 a 12 giorni di coltura (figura 4a, b). Enteroids e colonoids culture espandono in modo riproducibile. Entrambi enteroids e colonoids presentano un lato luminale e sono rivestiti con un epitelio (Figura 5A, B). Le cellule proliferative si possono osservare nei enteroids e si trovano all&#39;interno delle punte del germoglio (figura 5C, D). Confocale di enteroids colorati con E-caderina (Ecad) mostra le cellule epiteliali (Figura 5E). Sia enteroids e colonoids possono essere stabiliti dal tessuto ottenuti da pazienti affetti da malattie genetiche / congenite. La figura 6 mostra enteroids rappresentativi che crescono da un paziente con fibrosi cistica (Figura 6A) e una enteropatia trapunto a causa di una mutazione congenita nell&#39;annuncio cellule epitelialigene coesio molecola (EpCAM) (Figura 6B). Oltre al difetto genetico, i enteroids non presentano differenze di condizioni basali. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52483/52483fig1highres.jpg" /> Figura 1. Flusso di lavoro di cripte dissociazione e la generazione di enteroids umani e colonoids in coltura. Cripte (dal piccolo intestino o colon umano) sono isolati dal EDTA chelazione. Cripte coltivate formano enteroids per l&#39;intestino tenue e colonoids per il colon. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52483/52483fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52483/52483fig2highres.jpg" /> Figura 2. processo di dissezione per l&#39;isolamento cripta. (A) L&#39;intestino tenue specimen è allungata e appuntato piatta in una capsula di Petri siliconata. (B) La mucosa è separata dalla sottomucosa sottostante. (C) La mucosa sezionato è allungata e appuntato piatta in una capsula di Petri siliconata. (D) Dopo EDTA chelazione, cripte sono isolate dal tessuto. (E) Una biopsia è allungata e appuntato piatta in una capsula di Petri siliconata. (F) Dopo EDTA chelazione, cripte sono isolati dalla biopsia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52483/52483fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52483/52483fig3highres.jpg" /> Figura 3. cultura Cripta e enteroid umana e la generazione colonoid dal tessuto intero. (A) cripte digiunale placcato in matrice membrana basale dopo l&#39;isolamento. Le cripte stanno chiudendo dopo 3 a 4 ore e iniziano a palloncino fino a formare enterospheres oltre tale termine. In 7 giorni, le enteroids digiunali si formano. (B) Dopo l&#39;isolamento e la cultura, cripte ileali si comportano come le cripte digiunali e forma enteroids ileale. (C) cripte del colon sono placcati in matrice membrana basale dopo l&#39;isolamento. Le cripte stretti e formano colonoids dopo 7 giorni (bar Scala: 100 micron). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52483/52483fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52483/52483fig4highres.jpg" /> Figura 4. cultura Cripta e enteroid umana e la generazione colonoid dalla biopsia. (A) cripte duodenali placcato in matrice membrana basale dopo l&#39;isolamento. Le cripte stanno chiudendo dopo 3 a 4 ore e iniziano a palloncino fino Beyond questa volta a formare enterospheres. In 7 giorni, le enteroids si formano. (B) Dopo l&#39;isolamento e la cultura, cripte del colon sono placcati in matrice di membrana basale. Le cripte vicino a formare colonospheres poi colonoids dopo 7 giorni (bar Scala: 100 micron). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52483/52483fig4large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52483/52483fig5highres.jpg" /> Figura 5. intestinali lignaggi dei enteroids umane. (A) enteroid umana dopo 6 giorni di coltura. (B) sezioni ematossilina-eosina dei enteroids in (A) dimostrare l&#39;epiteliali che rivestono (bar Scala: 100 micron). (CD) confocale di enteroids dopo EdU colorazione (magenta) indica la presenza di cellule proliferative. (E </strong&gt;) confocale del enteroids dimostra la presenza di: E-caderina per le cellule epiteliali (ECAD, verde) (bar Scala:. 50 micron) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52483/52483fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/52483/52483fig6highres.jpg" /> Figura 6. cultura Cripta e la generazione enteroid umana dal tessuto malato. (A) Enteroids stabilito da un campione di fibrosi cistica. (B) Enteroids stabilito da un congenito esemplare tufting enteropatia (barre di scala: 100 micron). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52483/52483fig6large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> Movie 1. Enterosphere formando enteroid umano nella cultura. 32 hr temporali girie filmato mostra un enterosphere stabilita dal piccolo intestino umano scomparsa per formare un enteroid in cultura. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/52483/Movie1_v2.mp4" target="_blank">Clicca qui per vedere il video.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Solvente </td><td> Archivio Concentrazione </td><td> Concentrazione finale </td><td> Commento </td></tr><tr><td> Fosfato di Dulbecco tamponata salina Ca 2+, Mg 2+ gratuito (DPBS) </td><td> Life Technology; Gibco </td><td> 14190-144 </td><td> - </td><td> - </td><td> 1x </td><td></td></tr><tr><td> Etilendiammina tetraacetico (EDTA) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 431.788 </td><td> Ultrapure dH 2 O </td><td&gt; 0.5 M </td><td> 2 mm </td><td></td></tr><tr><td> Sorbitolo </td><td> Fischer Scientific </td><td> BP439-500 </td><td> DPBS </td><td> Polvere </td><td> 2% </td><td></td></tr><tr><td> Saccarosio </td><td> Fischer Scientific </td><td> BP220-1 </td><td> DPBS </td><td> Polvere </td><td> 1% </td><td></td></tr><tr><td> Albumina di siero bovino (BSA) Frazione V </td><td> Fischer Scientific </td><td> BP1600-100 </td><td> DPBS </td><td> Polvere </td><td> 1% </td><td></td></tr><tr><td> Soluzione Gzntamycin / amfotericina B </td><td> Life Technology; Gibco </td><td> R-015-10 </td><td> - </td><td> 500x </td><td> 1x </td><td></td></tr><tr><td> Wnt-3A conditionned medio </td><td> in casa </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td></td></tr><tr><td> Avanzate DMEM / F12 </td><td> Life Technology; Gibco </td><td> 12634-028 </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td></td></tr><tr><td> HEPES 1M </td><td> Life Technology; Gibco </td><td> 15630-080 </td><td> - </td><td> 1 M </td><td> 10 mM </td><td></td></tr><tr><td> Glutamax (glutamina) </td><td> Life Technology; Gibco </td><td> 35050-061 </td><td> - </td><td> 100X </td><td> 1X </td><td></td></tr><tr><td> Penicillina-streptomicina (10.000 U / mL) </td><td> Life Technology; Gibco </td><td> 15140-148 </td><td> - </td><td> 100X </td><td> 1X </td><td></td></tr><tr><td> N2 Supplemento </td><td> Life Technology; Gibco </td><td> 17502-048 </td><td> - </td><td> 100X </td><td> 1X </td><td></td></tr><tr><td> B27 Supplemento </td><td> Life Technology; Gibco </td><td> 17504-044 </td><td> - </td><td> 50X </td><td> 1X </td><td></td></tr><tr><td> N-Acetilcisteina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A9165-5G </td><td> DPBS </td><td> 1 M </td><td> 1 mM </td><td> &lt;/ Td&gt; </tr><tr><td> Nicotidamide </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> N0636 </td><td> DPBS </td><td> 1 M </td><td> 10 mM </td><td></td></tr><tr><td> Matrigel, GFR, fenolo (matrice membrana basale) gratis </td><td> Corning </td><td> 356.231 </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> RICHIESTO </td></tr><tr><td> Noggin ricombinante umana </td><td> R &amp; S </td><td> 6057-NG / CF </td><td> DPBS </td><td> 100 ug / ml </td><td> 100 ng / ml </td><td rowspan="3"> Altri fornitori: R &amp; S; Anaspec e Preprotech </td></tr><tr><td> umana ricombinante R-spondina </td><td> Preprotech </td><td> 120-38 </td><td> DPBS </td><td> 1 mg / ml </td><td> 1 ug / ml </td></tr><tr><td> EGF ricombinante umana </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E9644-.2MG </td><td> DBPs </td><td> 500 mg / ml </td><td> 50 ng / ml </td></tr><tr><td> Y-27632 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> Y0503-1MG </td><td> DPBS </td><td> 10 mM </td><td> 10 mM </td><td></td></tr><tr><td> A-83-01 </td><td> Tocris </td><td> 2939 </td><td> DMSO </td><td> 500 micron </td><td> 500 nM </td><td></td></tr><tr><td> SB202190 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S7067-5MG </td><td> DMSO </td><td> 30 mM </td><td> 10 mM </td><td></td></tr><tr><td> umana [Leu] 15-Gastrin 1 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G9145-.1MG </td><td> DPBS </td><td> 100 pM </td><td> 10 nM </td><td></td></tr><tr><td> CHIR99021 </td><td> Stemgent </td><td> 04-0004 </td><td> DMSO </td><td> 10 mM </td><td> 2,5 micron </td><td></td></tr><tr><td> Thiazovivin </td><td> Stemgent </td><td> 04-0017 </td><td> DMSO </td><td> 10 mM </td><td> 2,5 micron </td><td></td></tr><tr><td> TrypLE espresso Enzyme (1X), rosso fenolo (cellule dissociazione enzimatica) </td><td> Life Technology; Gibco </td><td> 12605-010 </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> Per passaging </td></tr><tr><td> Siero fetale bovino </td><td> Life Technology; Gibco </td><td> 10082-147 </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> Per passaging </td></tr><tr><td> CTS Synth-a-Freeze (media di congelamento) Medium </td><td> Life Technology; Gibco </td><td> A13713-01 </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> Per il congelamento </td></tr><tr><td> Linea cellulare L Wnt-3A </td><td> ATCC </td><td> CRL-2647 </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> Wnt-3A conditionned produzione di media </td></tr><tr><td> Renilla test luciferasi </td><td> Promega </td><td> E2710 </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> Wnt-3A conditionned attività dei media </td></tr><tr><td> umana ricombinante Wnt-3A </td><td> R &amp; S </td><td> 5036-WN / CF </td><td> DPBS </td><td> 100 ug / ml </td><td> 100 ng / ml </td><td&gt; Wnt-3A conditionned attività dei media </td></tr><tr><td> Linea cellulare HEK293 TOPflash </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> Wnt-3A conditionned attività dei media; Regalo da laboratorio di Hans Clevers </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Elenco dei reagenti dettagliato con il produttore preferito e numero di catalogo. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Attrezzatura </td><td> Consumabili </td><td> Strumenti </td></tr><tr><td> Cappa a flusso laminare </td><td> 15 e 50 ml provette coniche </td><td> Dumont # 5 pinze normali (FST; # 11251-20) </td></tr><tr><td> CO 2 Incubatore </td><td> Tubi microcentrifuga </td><td> Dumont # 7, curve pinza sottile (FST; # 11274-20) </td></tr><tr><td> Stereomicroscopio </td><td> Piastre da 24 pozzetti </td><td> Forbici Belle (FST; # 14060-09) </td></tr><tr&gt; <td> Centrifuga </td><td> 0.22 micron filtri (Sartorius) </td><td> Forbici primavera Vännäs (FST; # 15018-10) </td></tr><tr><td> Shaker orbitale </td><td> Pipette sierologiche </td><td> 0,2 millimetri di diametro minutien perni (FST; # 26002-20) </td></tr><tr><td> Contenitore congelamento (Nalgene) </td><td> Suggerimenti micropipetta </td><td> 0,1 millimetri di diametro minutien perni (FST; # 26002-10) </td></tr><tr><td> Sylgard 184 Silicone (Dow Corning) </td><td> 150 micron aperture di maglia, lo screening di nylon (Dynamic Aqua-fornitura) </td><td></td></tr><tr><td> Piatto di vetro Petri </td><td> 5 ml tubi in polipropilene a fondo tondo (Falcon) </td><td></td></tr><tr><td> Pipetta sierologica </td><td> 18G ago riempimento smussato (BD) </td><td></td></tr><tr><td> Micropipetta </td><td> 3 ml lsyringes con punte Luer-Lock (BD) </td><td></td></tr><tr><td></td><td> Cryovials </td><td></td></tr></tbody></table><strong&gt; Tabella 2. dettagliata di consumo, strumenti, e le attrezzature necessarie per l&#39;isolamento e la coltura cripta.

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Establishment of Human Epithelial Enteroids and Colonoids from Whole Tissue and Biopsy

We describe a method to establish human enteroids from small intestinal crypts and colonoids from colon crypts collected from both surgical tissue and biopsies. In this methodological article, we present the culture modalities that are essential for the successful growth and maintenance of human enteroids and colonoids.

Istituzione di umano epiteliali Enteroids e Colonoids dal tessuto intero e biopsia

The epithelium of the gastrointestinal tract is constantly renewed as it turns over. This process is triggered by the proliferation of intestinal stem ...

establishment-human-epithelial-enteroids-colonoids-from-whole-tissue

Research

JoVE Journal

Medicine

34.4K Views.  Cincinnati Children's Hospital Medical Center. We describe a method to establish human enteroids from small intestinal crypts and colonoids from colon crypts collected from both surgical tissue and biopsies. In this methodological article, we present the culture modalities that are essential for the successful growth and maintenance of human enteroids and colonoids.

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Establishment and Propagation of Human Retinoblastoma Tumors in Immune Deficient Mice

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited time. These cultured tumorspheres may exhibit markedly different cellular phenotypes when compared to the original tumors. Demonstration that cultured cells have the capability of forming new tumors is important to ensure that cultured cells model the biology of the original tumor. 
Here we present a protocol for propagating human retinoblastoma tumors in vivo using Rag2-/- immune deficient mice. Cultured human retinoblastoma tumorspheres of low passage or cells obtained from freshly harvested human retinoblastoma tumors injected directly into the vitreous cavity of murine eyes form tumors within 2-4 weeks. These tumors can be harvested and either further passaged into murine eyes in vivo or grown as tumorspheres in vitro. Propagation has been successfully carried out for at least three passages thus establishing a continuing source of human retinoblastoma tissue for further experimentation. 
Wesley S. Bond and Lalita Wadhwa are co-first authors.

A method is described to propagate human retinoblastoma tumors in mice. Tumor cells are directly injected into the eyes of immune deficient mice. Secondary tumors have been successfully established using both cells directly harvested from human tumors and cultured tumorspheres.

Istituzione e Propagazione dei Tumori retinoblastoma umani in topi privi di sistema immunitario

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited ...

Ricerca

Medicina

Real-time Cytotoxicity Assays in Human Whole Blood

A live cell-based whole blood cytotoxicity assay (WCA) that allows access to temporal information of the overall cell cytotoxicity is developed with high-throughput cell positioning technology. The targeted tumor cell populations are first preprogrammed to immobilization into an array format, and labeled with green fluorescent cytosolic dyes. Following the cell array formation, antibody drugs are added in combination with human whole blood. Propidium iodide (PI) is then added to assess cell death. The cell array is analyzed with an automatic imaging system. While cytosolic dye labels the targeted tumor cell populations, PI labels the dead tumor cell populations. Thus, the percentage of target cancer cell killing can be quantified by calculating the number of surviving targeted cells to the number of dead targeted cells. With this method, researchers are able to access time-dependent and dose-dependent cell cytotoxicity information. Remarkably, no hazardous radiochemicals are used. The WCA presented here has been tested with lymphoma, leukemia, and solid tumor cell lines. Therefore, WCA allows researchers to assess drug efficacy in a highly relevant ex&#160;vivo condition.

The whole blood cytotoxicity assay (WCA) is a cytotoxicity assay developed by incorporating high-throughput cell positioning technology with fluorescence microscopy and automated image processing. Here, we describe how lymphoma cells treated with an anti-CD20 antibody can be analyzed real-time in human whole blood to provide quantitative cellular cytotoxicity analysis.

In tempo reale citotossicità saggi in Human Sangue intero

A live cell-based whole blood cytotoxicity assay (WCA) that allows access to temporal information of the overall cell cytotoxicity is developed with ...

Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling

The generation of patient-specific cell lines represents an invaluable tool for diagnostic or translational research, and these cells can be collected from skin or muscle biopsy tissue available during the patient&#8217;s diagnostic workup. In this protocol, we describe a technique for live cell isolation from small amounts of muscle or skin tissue for primary cell culture. Additionally, we provide a technique for the immortalization of myogenic cell lines and fibroblast cell lines from primary cells. Once cell lines are immortalized, substantial expansion of patient-derived cells can be achieved. Immortalized cells are amenable to many downstream applications, including drug screening and in vitro correction of the genetic mutation. Altogether, these protocols provide a reliable tool to generate and preserve patient-derived cells for downstream applications.

This protocol describes techniques for live cell isolation and primary culture of myogenic and fibroblast cell lines from muscle or skin tissue. A technique for the immortalization of these cell lines is also described. Altogether, these protocols provide a reliable tool to generate and preserve patient-derived cells for downstream applications.

Isolamento e Immortalizzazione di paziente derivati ​​da linee cellulari provenienti da Muscle Biopsia per la malattia Modeling

The generation of patient-specific cell lines represents an invaluable tool for diagnostic or translational research, and these cells can be collected ...

Preparation and Respirometric Assessment of Mitochondria Isolated from Skeletal Muscle Tissue Obtained by Percutaneous Needle Biopsy

Respirometric profiling of isolated mitochondria is commonly used to investigate electron transport chain function. We describe a method for obtaining samples of human Vastus lateralis, isolating mitochondria from minimal amounts of skeletal muscle tissue, and plate based respirometric profiling using an extracellular flux (XF) analyzer. Comparison of respirometric profiles obtained using 1.0, 2.5 and 5.0 &#956;g of mitochondria indicate that 1.0 &#956;g is sufficient to measure respiration and that 5.0 &#956;g provides most consistent results based on comparison of standard errors. Western blot analysis of isolated mitochondria for mitochondrial marker COX IV and non-mitochondrial tissue marker GAPDH indicate that there is limited non-mitochondrial contamination using this protocol. The ability to study mitochondrial respirometry in as little as 20 mg of muscle tissue allows users to utilize individual biopsies for multiple study endpoints in clinical research projects.

Methods for biopsy of Vastus lateralis, preparation of purified mitochondria, and respirometric profiling are described. The use of small muscle volume makes this technique suitable for clinical research applications.

Preparazione e respirometrici valutazione dei mitocondri isolati dal tessuto muscolare scheletrico Ottenuto dalla biopsia percutanea

Respirometric profiling of isolated mitochondria is commonly used to investigate electron transport chain function. We describe a method for obtaining ...

Human Vastus Lateralis Skeletal Muscle Biopsy Using the Weil-Blakesley Conchotome

Percutaneous muscle biopsy using the Weil-Blakesley conchotome is well established in both clinical and research practice. It is a safe, effective and well tolerated technique. The Weil-Blakesley conchotome has a sharp biting tip with a 4 - 6 mm wide hollow. It is inserted through a 5 - 10 mm skin incision and can be maneuvered for controlled tissue penetration. The tip is opened and closed within the tissue and then rotated through 90 -180&#176; to cut the muscle. The amount of muscle obtained following repeated sampling can vary from 20 mg to 290 mg which can be processed for both histology and molecular studies. The wound needs to be kept dry and vigorous physical activity kept to a minimum for approximately 72 hr although normal levels of activity can restart immediately following the procedure. This procedure is safe and effective when close attention is paid to the selection of subjects, full asepsis and post procedure care. &#160;Both right and left vastus lateralis are suitable for biopsy dependent on participant preference.

Human Vastus Lateralis Skeletal Muscle Biopsy Using the Weil-Blakesley Conchotome

This video demonstrates the technique of percutaneous muscle biopsy of the human vastus lateralis using the Weil-Blakesley conchotome.

Umano<em&gt; vasto laterale</em&gt; Biopsia muscolare scheletrico Utilizzando la Weil-Blakesley Conchotome

Percutaneous muscle biopsy using the Weil-Blakesley conchotome is well established in both clinical and research practice. It is a safe, effective and ...

3D Whole-heart Myocardial Tissue Analysis

Cardiac regenerative therapies aim to protect and repair the injured heart in patients with ischemic heart disease. By injecting stem cells or other biologicals that enhance angio- or vasculogenesis into the infarct border zone (IBZ), tissue perfusion is improved, and the myocardium can be protected from further damage. For maximum therapeutic effect, it is hypothesized that the regenerative substance is best delivered to the IBZ. This requires accurate injections and has led to the development of new injection techniques. To validate these new techniques, we have designed a validation protocol based on myocardial tissue analysis. This protocol includes whole-heart myocardial tissue processing that enables detailed two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) analysis of the cardiac anatomy and intramyocardial injections. In a pig, myocardial infarction was created by a 90-min occlusion of the left anterior descending coronary artery. Four weeks later, a mixture of a hydrogel with superparamagnetic iron oxide particles (SPIOs) and fluorescent beads was injected in the IBZ using a minimally-invasive endocardial approach. 1 h after the injection procedure, the pig was euthanized, and the heart was excised and embedded in agarose (agar). After the solidification of the agar, magnetic resonance imaging (MRI), slicing of the heart, and fluorescence imaging were performed. After image post-processing, 3D analysis was performed to assess the IBZ targeting accuracy. This protocol provides a structured and reproducible method for the assessment of the targeting accuracy of intramyocardial injections into the IBZ. The protocol can be easily used when the processing of scar tissue and/or validation of the injection accuracy of the whole heart is desired.

This protocol describes a novel method for the 3D comparison of whole-heart myocardial tissue with MRI. This is designed for the accurate assessment of intramyocardial injections in the infarct border zone of a chronic porcine model of myocardial infarction.

3D Whole-cuore Analisi tessuto miocardico

Cardiac regenerative therapies aim to protect and repair the injured heart in patients with ischemic heart disease. By injecting stem cells or other ...

A Technique for Subcutaneous Abdominal Adipose Tissue Biopsy via a Non-diathermy Method

Adipose tissue biopsies offer tissue samples that, upon analysis, may provide insightful overviews of mechanisms relating to metabolism and disease. To obtain subcutaneous adipose tissue biopsies in the abdominal area, researchers and physicians use either a surgical or a needle-based technique. However, surgical subcutaneous fat biopsies can offer tissue samples that may provide a more comprehensive overview of the complexities of biological indices in white adipose tissue. Usually, a surgical adipose tissue biopsy includes a diathermy treatment for cauterizing blood vessels to prevent excessive bleeding. Nevertheless, side effects, such as flash fires and skin lesions in the tissue, have been reported after diathermy. Therefore, we aimed to standardize a surgical abdominal adipose tissue biopsy performed under local anesthesia using a non-diathermy method. We conducted 115 subcutaneous adipose tissue biopsies in healthy men using a non-diathermy abdominal surgical biopsy method. Our results showed three cases of excessive post-operation bleeding out of 115 operations (2.61%).In conclusion, our standardized subcutaneous abdominal adipose tissue surgical biopsy using a non-diathermy method can be safely applied to healthy men at the bedside, with minimal side effects.

We standardized an abdominal adipose tissue biopsy using a non-diathermy method performed under local anesthesia. Three cases of excessive post-operation bleeding out of 115 operations (2.61%) occurred.We conclude that an abdominal adipose tissue surgical biopsy using a non-diathermy method can be safely applied to healthy men.

Una tecnica per la biopsia del tessuto adiposo sottocutaneo addominale tramite un metodo Non-diatermia

Adipose tissue biopsies offer tissue samples that, upon analysis, may provide insightful overviews of mechanisms relating to metabolism and disease. To ...

Whole Body and Regional Quantification of Active Human Brown Adipose Tissue Using 18F-FDG PET/CT

In endothermic animals, brown adipose tissue (BAT) is activated to produce heat for defending body temperature in response to cold. BAT&#39;s ability to expend energy has made it a potential target for novel therapies to ameliorate obesity and associated metabolic disorders in humans. Though this tissue has been well studied in small animals, BAT&#39;s thermogenic capacity in humans remains largely unknown due to the difficulties of measuring its volume, activity, and distribution. Identifying and quantifying active human BAT is commonly performed using 18F-Fluorodeoxyglucose (18F-FDG) positron emission tomography and computed tomography (PET/CT) scans following cold-exposure or pharmacological activation. Here we describe a detailed image-analysis approach to quantify total-body human BAT from 18F-FDG PET/CT scans using an open-source software. We demonstrate the drawing of user-specified regions of interest to identify metabolically active adipose tissue while avoiding common non-BAT tissues, to measure BAT volume and activity, and to further characterize its anatomical distribution. Although this rigorous approach is time-consuming, we believe it will ultimately provide a foundation to develop future automated BAT quantification algorithms.

Whole Body and Regional Quantification of Active Human Brown Adipose Tissue Using 18F-FDG PET/CT

Using free, open-source software, we have developed an analytical approach to quantify total and regional brown adipose tissue (BAT) volume and metabolic activity of BAT using 18F-FDG PET/CT.

Tutto il corpo e quantificazione regionale dell'essere umano attivo marrone tessuto adiposo con 18F-FDG PET/CT

In endothermic animals, brown adipose tissue (BAT) is activated to produce heat for defending body temperature in response to cold. BAT&#39;s ability to ...

Culture and Imaging of Human Nasal Epithelial Organoids

Individualized therapy for cystic fibrosis (CF) patients can be achieved with an in vitro disease model to understand baseline Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator (CFTR) activity and restoration from small molecule compounds. Our group recently focused on establishing a well-differentiated organoid model directly derived from primary human nasal epithelial cells (HNE). Histology of sectioned organoids, whole-mount immunofluorescent staining, and imaging (using confocal microscopy, immunofluorescent microscopy, and bright field) are essential to characterize organoids and confirm epithelial differentiation in preparation for functional assays. Furthermore, HNE organoids produce lumens of varying sizes that correlate with CFTR activity, distinguishing between CF and non-CF organoids. In this manuscript, the methodology for culturing HNE organoids are described in detail, focusing on the assessment of differentiation using the imaging modalities, including the measurement of baseline lumen area (a method of CFTR activity measurement in organoids that any laboratory with a microscope can employ) as well as the developed automated approach to a functional assay (which requires more specialized equipment).

A detailed protocol is presented here to describe an in vitro organoid model from human nasal epithelial cells. The protocol has options for measurements requiring standard laboratory equipment, with additional possibilities for specialized equipment and software.

Coltura e imaging di organoidi epiteliali nasali umani

Individualized therapy for cystic fibrosis (CF) patients can be achieved with an in vitro disease model to understand baseline Cystic Fibrosis ...

Testing Epithelial Permeability in Fetal Tissue-Derived Enteroids

Human fetal tissue-derived enteroids are emerging as a promising in vitro model to study intestinal injuries in preterm infants. Enteroids exhibit polarity, consisting of a lumen with an apical border, tight junctions, and a basolateral outer layer exposed to growth media. The consequences of intestinal injuries include mucosal inflammation and increased permeability. Testing intestinal permeability in vulnerable preterm human subjects is often not feasible. Thus, an in vitro fetal tissue-derived intestinal model is needed to study intestinal injuries in preterm infants. Enteroids can be used to test changes in epithelial permeability regulated by tight junction proteins. In enteroids, intestinal stem cells differentiate into all epithelial cell types and form a three-dimensional structure on a basement membrane matrix secreted by mouse sarcoma cells. In this article, we describe the methods used for establishing enteroids from fetal intestinal tissue, characterizing the enteroid tight junction proteins with immunofluorescent imaging, and testing epithelial permeability. As gram-negative dominant bacterial dysbiosis is a known risk factor for intestinal injury, we used lipopolysaccharide (LPS), an endotoxin produced by gram-negative bacteria, to induce permeability in the enteroids. Fluorescein-labeled dextran was microinjected into the enteroid lumen, and serial dextran concentrations leaked into the culture media were measured to quantify the changes in paracellular permeability. The experiment showed that apical exposure to LPS induces epithelial permeability in a concentration-dependent manner. These findings support the hypothesis that gram-negative dominant dysbiosis contributes to the mechanism of intestinal injury in preterm infants.

This protocol details the establishment of enteroids, a three-dimensional intestinal model, from fetal intestinal tissue. Immunofluorescent imaging of epithelial biomarkers was used for model characterization. Apical exposure of lipopolysaccharides, a bacterial endotoxin, using microinjection technique induced epithelial permeability in a dose-dependent manner measured by the leakage of fluorescent dextran.