Questo lavoro è stato sostenuto dai contributi filantropici della John G. e Marie Stella Kenedy Memorial Foundation (Grant # 0.727.033) e il Melanoma Research Alliance. Gli autori desiderano ringraziare l&#39;Università del Tissue Texas MD Anderson Cancer Center Institutional Bank (ITB) di coordinare la distribuzione di tessuti e di raccolta e facilitare la ricerca traslazionale, così come il dottor Ignacio Wistuba, il dottor Victor Prieto, il Dipartimento MD Anderson Cancer Center di Patologia e il Programma di Tiro Melanoma Luna. Infine, gli autori desiderano ringraziare tutti i pazienti e le famiglie colpite da melanoma.

Dichiarazione Etica: Questo protocollo è approvato dalla University of Texas MD Anderson Cancer Center. 1. Procurement campioni <ol><li> Raccogliere campioni di tessuto tumorale ricerca da surplus e relativo tessuto normale 10-12. Conservare i campioni sul ghiaccio bagnato per evitare autolisi. </li><li> Invia tutti i tessuti, dispositivi medici e corpi estranei rimossi durante una procedura chirurgica per il Dipartimento di Patologia all&#39;esame necessario per facilitare una diagnosi patologica. </li><li> Maniglia tessuto assegnato per la ricerca in conformità con la ricerca applicabili e le politiche bancarie dei tessuti e delle procedure. NOTA: collezione Biospecimen richiede un coordinamento delle patologi, patologi &#39;assistenti, histotechnologists e specialisti di approvvigionamento dei tessuti. </li></ol> 2. Patologia Quality Assurance (QA) <ol><li> Completare e verificare i dati dei pazienti come misura QA precoce e consultare un patologo a rivedere pa diagnosticorecord di degenza per (rapporti di patologia, scivoli di tessuto, ecc) e campioni di tessuto. Campioni di tessuto giudice caratteristiche morfologiche di interesse come la percentuale di tumori, necrosi, l&#39;interfaccia del tessuto tumorale, ecc Questo è in linea con le best practice biorepository 10-12. </li><li> A seguito di revisione iniziale, condurre revisioni periodiche dei dati biorepository e campioni di ricerca durante l&#39;intera durata del soggiorno dei biospecimen. </li><li> Risultati di link e annotazioni di istopatologici e altre indagini ai campioni e fornire questi dati ai ricercatori attraverso un sistema di software biorepository proprietario. NOTA: i processi QA assicurare l&#39;integrità di entrambi gli aspetti clinici e tecnici delle operazioni biorepository. </li><li> Eseguire i test genetici e molecolari per verificare e caratterizzare i campioni per uso clinico. </li><li> Raccogliere e analizzare i dati in base al feedback da parte dei ricercatori che hanno utilizzato i campioni per esperimenti di laboratorio. Tracciacampioni che utilizzano la tecnologia del codice a barre. Questo sistema di monitoraggio elettronico è anche sostenuto in best practice biorespository 10-12. </li></ol> 3. campioni / Tissue Processing <ol><li> Conservare sempre campioni di tessuto fresco in ghiaccio, e procedimenti più rapidamente possibile, al fine di limitare i cambiamenti indotti da estrazione del campione di tessuto dal suo ambiente naturale. Processo normale tumore abbinato e campioni di tessuto tumorale separatamente per evitare la contaminazione incrociata. NOTA: In base a protocolli di ricerca, elaborazione biospecimen può comportare la raccolta di esemplari in uno o più tipi di media. </li><li> Prima di iniziare il processo, preparare una piastra di Petri sterile cultura, un bisturi, così come un ago o pinze per la lavorazione del tessuto. Accertarsi che i tubi sono stati preparati, etichettati, e disposti al fine di limitare il tempo di trattamento del campione (Figura 2). </li><li> Tutte le informazioni pertinenti dei tessuti, come ad esempio il nome del paziente, il numero, il trattamento, la data dichirurgia, e altre informazioni pertinenti come può essere adatto per lo studio, dovrebbero essere resi facilmente accessibili in un database del tessuto istituzionale. Informazioni per il paziente limitata dovrebbe essere tenuto in laboratorio in formato cartaceo o foglio di calcolo. NOTA:. Raccogliere solo le informazioni biospecimen pertinenti alla natura del cioè ricerca, la ricerca di base biomedica, la ricerca clinica, la ricerca traslazionale, ecc Per informazioni malattia-specifica, il personale biorepository dovrebbe raccogliere dati ritenuti necessari per la letteratura e le organizzazioni che governano a assicurare una corretta diagnosi e la ricerca di significato. Questo include ma non si limita ai gradi tumorali e cancro informazioni stadiazione. </li><li> Piano tutti gli esperimenti successivi desiderati in anticipo, per decidere la dimensione delle sezioni di tessuto necessari per ogni tipo di analisi, così come la posizione di escissioni. Idealmente, anche se impossibile, tutte le analisi devono essere rappresentativi di tutta la sezione di tessuto al fine di tenere conto di heterogenei tessutoty e il limite di polarizzazione delle analisi a valle. Disporre tutti gli elementi richiesti in anticipo come illustrato nella Figura 2. </li><li> Posizionare il campione di tessuto del piatto di coltura di Petri aperta, piatto contro la superficie. NOTA: Consenti solo personale autorizzato biorepository per gestire i campioni individuati e per consultare i dati sanitari identificati. Gli investigatori dovrebbero accedere solo quelle identificazione del paziente, come consentito dalle consensi informati firmati e come regolato dalla IRB. Tutti i campioni devono essere adeguatamente etichettati e dovrebbero comprendere come minimo, un numero di identificazione dei tessuti e tessuti tipo unico. Non includere qualsiasi PHI nelle etichette, in conformità alla normativa HIPAA. </li><li> Controllare il campione da tutti gli angoli, per ottenere una migliore comprensione della struttura e dimensioni. Pin il campione al fondo del piatto con l&#39;ago, e procedere alla bisettrice del tessuto lungo il suo asse maggiore e migliore rappresentante. </li><li> Tagliare un piccolo pezzo di tessuto e metterlo in una sterile 1,5 ml micrtubo ocentrifuge contenente 1 ml di soluzione-RNA stabilizzante. Questo esempio può essere collocato sul ghiaccio per il resto del processo e conservata a 4 ° C fino al momento dell&#39;uso. NOTA: Quando si lavora con l&#39;RNA, guanti deve sempre essere indossato, e puntali con filtro RNasi-free dovrebbe essere usato per limitare le possibilità di degradazione e la contaminazione di RNA. </li><li> Disporre una cassetta biopsia aperta e pre-marcato nel coperchio del piatto cultura Petri. Tagliare una fettina di tessuto di spessore non superiore a 5 mm 3 e trasferirlo alla cassetta. Mettere la cassetta nel 10% neutra tamponata formalina (NBF) per un minimo di 72 ore. Trasferire la cassetta in etanolo al 70% per l&#39;archiviazione a lungo termine prima di paraffina-embedding. NOTA: Labeling di cassette deve essere effettuata a matita o con marcatori raccomandati come uso di xilene durante la lavorazione si altrimenti cancellerà etichette. </li><li> Tagliare un pezzo di tessuto e metterlo in uno stampo di tessuto. Coprire la sezione di tessuto in temperatura ottimale di taglio (OCT) composto, e congelare immediatamentea -20 ° C per criosezionamento. Questa sezione di tessuto può essere conservato a -20 ° C fino al momento criosezionamento. </li><li> Tagliare uno o più pezzi di tessuto e di trasferirli in un tubo da 50 ml contenente tampone MACS (1x tampone fosfato salino (PBS), siero fetale bovino 0,5% (FBS), 2 l&#39;acido etilendiamminotetracetico mm (EDTA)) per la successiva citometria a flusso di analisi . Per la citometria a flusso, i campioni più grandi possono essere preferibile in quanto le cellule potrebbero essere persi durante dissociazione tumore, la fissazione delle cellule e permeabilizzazione quando richiesto. Generalmente, questa sezione può essere presa alla fine, una volta che tutte le altre parti sono state elaborate. Leftover campione del tumore rappresentante può essere utilizzato per la citometria a flusso. Opzionalmente, questo tubo può essere conservato a 4 ° CO / N o utilizzati per la colorazione di citometria di flusso immediatamente dopo la digestione in una sospensione cellulare (vedere il punto 4 - citometria a flusso colorazione). </li><li> Tagliare resto del tessuto in pezzi non più grandi di una dimensione massima di 0,5 mm x 0,5 mm e trasferirli criogenicofiale per immediatamente congelati in azoto liquido. Questi campioni a scatto congelati possono essere utilizzati per analisi future e le finalità di collaborazione. NOTA: La cura supplementare dovrebbe essere presa quando si lavora con l&#39;azoto liquido come il contatto diretto può provocare gravi lesioni. Gli occhi devono essere protetti con occhiali di sicurezza con protezioni laterali o con una visiera. Guanti criogenici dovrebbero anche essere indossati per proteggere dalle scottature azoto liquido causati da spruzzi e il contatto diretto. I guanti devono misura giusta ma essere abbastanza largo da rimuovere rapidamente dovrebbe azoto liquido spruzzata in loro. </li></ol> 4. citometria a flusso Colorazione <ol><li> Tissue omogeneizzazione <ol><li> Preparare medio digestione con DMEM (40 ml), DNasi I (50 U / ml) e collagenasi I (2 mg / ml). Luogo fresco o tumore O / N-memorizzato in tampone MACS nel coperchio di una piastra di Petri e sommergere con mezzo di digestione. NOTA:. Esistono diversi metodi di digestione, ciascuno con vantaggi (per esempio, superficie cellulare proteina expressione, vitalità). Assicurarsi di avere il metodo corretto per l&#39;applicazione a valle desiderata. </li><li> Tumore bottone al fondo del piatto con un ago, e taglio dall&#39;esterno per centrare con un bisturi, fino a quando il tumore ha una consistenza pastosa. Trasferimento mix tumore ad un tubo da 50 ml, sigillo e mettere in un sacchetto di plastica per evitare perdite. Trasferire tubo un&#39;incubatrice, e ruotare a 225 RPM, 37 ° C, 1 ora. </li><li> Filtro sospensione delle cellule tumorali attraverso un colino cellula 70μm. Sospensione cellulare a 250 xg Centrifugare, 4 ° C, 5 min. Risospendere pellet di cellule in 1 ml di tampone di FACS (500 ml di PBS, 1 ml di 0,5 m stock EDTA, 10 ml FCS o FBS). </li><li> Contare le cellule utilizzando un emocitometro e risospendere alla concentrazione di 1x10 7 cellule / ml. Trasferire 100 microlitri per pozzetto (10 6 celle) in una piastra di fondo pozzo rotondo 96 per la colorazione. </li></ol></li><li> Viabilità e anticorpi colorazione <ol><li> Aggiungere 200 ml di soluzione colorante vitalità in ogni pozzetto e mescolare. Incubate per 30 minuti, a 4 ° C, al buio. Spin le cellule a 250 xg, 4 ° C, 5 min, e aspirare il surnatante. </li><li> Aggiungi miscela di anticorpi a raccomandato / concentrazione titolato (secondo produttore) per antigeni di superficie in 200 ml di tampone FACS. Incubare le cellule a 4 ° C, 30 min, al buio. Spin le cellule a 250 xg, 4 ° C, 5 min, e aspirare il surnatante. </li><li> Lavare con 200 ml di tampone FACS, centrifugare le cellule a 250 xg, 4 ° C, 5 min, e aspirare il surnatante. Risospendere le cellule in 200 ml di buffer di FACS e procedere al citofluorimetro per l&#39;acquisizione e l&#39;analisi. NOTA: Se si effettuano intracellulare citometria a flusso colorazione, eseguire fissazione e passi permeabilizzazione e colorazione intracellulare tra i passaggi 4.2.2 e 4.2.3. Se si esegue citochine colorazione, le cellule devono essere pre-attivato colorazione precedente come raccomandato, e un inibitore del trasporto della proteina intracellulare e la secrezione quali monensin dovrebbero essere utilizzati durante l&#39;attivazione perassicurare il mantenimento di fattori solubili. Cellule fisse possono essere conservate a breve termine (una settimana) a 4 ° C al buio prima di acquisizione su un citometro a flusso. </li></ol></li></ol>

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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+of+mRNA+amplification+for+microarray+analysis.">Advantages of mRNA amplification for microarray analysis.</a> Biotechniques. 33, 906-914 (2002).</li><li>Francino, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+of+real-time+PCR+assay+for+diagnosis+and+monitoring+of+canine+leishmaniosis.">Advantages of real-time PCR assay for diagnosis and monitoring of canine leishmaniosis.</a> Vet Parasitol. 137, 214-221 (2006).</li><li>Grunberg-Manago, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Messenger+RNA+stability+and+its+role+in+control+of+gene+expression+in+bacteria+and+phages.">Messenger RNA stability and its role in control of gene expression in bacteria and phages.</a> Annu. Rev. Genet. 33, 193-227 (1999).</li><li>Lesnik, E. A., Freier, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relative+thermodynamic+stability+of+DNA,+RNA,+and+DNA:RNA+hybrid+duplexes:+relationship+with+base+composition+and+structure.">Relative thermodynamic stability of DNA, RNA, and DNA:RNA hybrid duplexes: relationship with base composition and structure.</a> Biochemistry. 34, 10807-10815 (1995).</li><li>MacBeath, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+microarrays+and+proteomics.">Protein microarrays and proteomics.</a> Nat Genet. 32, 526-532 (2002).</li></ol>

The authors have no conflicts of interest to disclose.

Infine, i metodi di lavorazione devono essere dettate dalla ipotesi desiderata e previsti saggi tecnici da eseguire (Figura 1). La sezione seguente serve come una panoramica di descrivere eventuali saggi che possono essere eseguite su tali sezioni di tessuto. E non è affatto un quadro esaustivo, ma ha lo scopo di aiutare i metodi di lavorazione campione di guida e scelta di saggi a valle con tecniche descrivere ed elencare i loro punti di forza e di debolezza. Citometria a ...

La ricerca medica ha beneficiato immensamente dallo studio di entrambe le linee cellulari umane e modelli animali. Linee cellulari consentono un migliore controllo dei componenti in un sistema, così come l&#39;uso di cellule dalla corretta organismo. Lavorare con le cellule umane, mentre più rappresentativo, presenta un&#39;istantanea drasticamente semplificata di meccanismi che potrebbero essere responsabili per la salute e la malattia, perché le linee di cellule non potrebbero riassumere l&#39;impatto di altre cellule, componenti stromali e gli organi che possono influenzare le risposte 1. D&#39;altra parte, i modelli animali, anche se non del tutto accurata nel riprodurre malattie umane e eterogeneità genetica, offrono ulteriore comprensione, consentendo per l&#39;introduzione di sistemi animali interi nella maggior parte dei modelli 2,3. Carenze a parte, entrambi i metodi hanno i loro vantaggi e sono complementari. Tuttavia, l&#39;obiettivo principale rimane per studiare le cellule e organi umani, in un corpo pieno, sistema multi-organo. Di conseguenza, la ricerca traslazionale ha takit grandi passi avanti nel facilitare lo studio di organi e tessuti umani estratti da pazienti, al fine di cogliere meglio i meccanismi della malattia di base. Ricerca traslazionale offre il vantaggio di studiare il risultato di trattamenti e malattie in tutto il corpo e in cellule opportune, fornendo in tal modo il meglio dei due mondi tra cellula animale e di lavoro 4. Ricerca traslazionale inoltre, non è esente da difetti. Campioni raccolti da pazienti umani, dopo la rimozione dal padrone di casa, sono immediatamente sottoposti a ischemia e altri fattori esterni, da cui sarebbero stati altrimenti protetti. Ciò può causare cambiamenti molecolari e genetiche indotte dallo stress, e causare pregiudizi in studi successivi. Pertanto, molto sforzo è stato messo in estrarre e trattare i tessuti con metodi rigorosi per conservare meglio organo e l&#39;integrità delle cellule per gli studi a valle 5. È importante sottolineare che le future applicazioni devono essere considerate attentamente quando si seleziona i metodi of elaborazione campioni umani, come certi metodi possono essere dannosa per i componenti cellulari e vie di segnalazione, risparmiando altri. Per ogni ricerca che coinvolge i tessuti umani, questioni normative devono essere affrontate. Dopo le relazioni di Tuskegee e Belmont, c&#39;è stata una crescente accettazione del fatto che la ricerca biomedica è risultato associato a rischi spesso con conseguente dilemmi etici inevitabili 6. La necessità di norme nazionali è stata riconosciuta e il governo federale ha creato Institutional Review Boards (IRB) come un mezzo per sostenere i principi del Rapporto Belmont (rispetto delle persone, la beneficenza, la giustizia). IRB di ogni istituzione è un comitato di medici, ricercatori e membri della comunità che sono responsabili per la protezione dei partecipanti alla ricerca. Si richiede che il consenso volontario presso tutti i partecipanti di studi di ricerca biomedica, e che tale consenso documentato in un consenso informato fo<html> rm. Il processo di consenso informato si propone di fornire informazioni adeguate a un partecipante, in modo che una decisione informata può essere fatta o meno di iscriversi in uno studio, o di continuare la partecipazione. A questo proposito, il documento di consenso informato deve avere una buona leggibilità e dovrebbe essere scritto in un linguaggio che può essere facilmente compreso (6 all&#39;8 livello di lettura grado) da parte della popolazione bersaglio. La possibilità di coercizione o indebito condizionamento deve essere ridotto al minimo, e il soggetto deve essere dato tempo sufficiente per prendere in considerazione la partecipazione. Il partecipante deve essere consentito di esercitare il diritto di revocare il consenso in qualsiasi momento durante il corso dello studio senza penalità. Consenso informato volontario è un pre-requisito obbligatorio per la partecipazione di un soggetto nel campo della ricerca ed è anche giuridicamente efficace 7. Come da regolamento per la protezione dei diritti umani assoggetta 21 CFR 50.25 (/45cfr46.html&quot;&gt;http://www.hhs.gov/ohrp/humansubjects/guidance/45cfr46.html 8), partecipanti allo studio devono essere informati dello scopo della ricerca, le procedure coinvolti nella ricerca, alternative alla partecipazione, tutti i rischi prevedibili e disagi (tra cui non solo danni fisici, ma anche possibile danni psicologici, sociali o economiche, disagio o disagio), i benefici della ricerca per la società e, eventualmente, per l&#39;individuo, tempo in cui il soggetto si aspetta di partecipare, persona da contattare per le risposte alle domande o in caso di un infortunio connesse alla ricerca o di emergenza, dichiarazione che indichi che la partecipazione è volontaria e che il rifiuto di partecipare non comporterà alcuna conseguenza o qualsiasi perdita di benefici, come un compromesso in una regolare cura clinica che il partecipante ha comunque diritto a ricevere come risultato dei suoi / sue diagnosi, e, infine, una dichiarazione per quanto riguarda il diritto del soggetto alla riservatezza e diritto di recedere dalstudio in qualsiasi momento senza conseguenze. I campioni di tessuto da partecipanti che si ritirano consenso nel corso dello studio non devono essere inclinate e devono essere immediatamente esauriti. Rinuncia di uno o più elementi di consenso informato possono essere ottenute presso la IRB per alcuni progetti di ricerca che non possono praticamente essere fatto senza una modifica gli elementi necessari o per studi in cui gli elementi richiesti non sono applicabili. Grande cura deve essere presa per garantire la riservatezza dei dati. La Health Insurance Portability e Accountability Act (HIPAA) è una legge federale che impedisce di utilizzo o la divulgazione &quot;Protected Health Information&quot; (PHI) senza il consenso scritto da parte dei partecipanti. PHI include ma non si limita alle informazioni sulla salute trasmesse o mantenuti in qualsiasi forma o mezzo e comprende campi che potrebbero essere utilizzate per identificare un individuo 9. Attraverso questo lavoro, ci proponiamo di delineare il protocollo da seguire durante tissue trattamento - compresi gli appalti, e lo stoccaggio e sottolineano l&#39;importanza di queste linee guida rigorose seguente, in modo da ridurre al minimo le distorsioni che possono derivare a causa delle sollecitazioni un tessuto è sottoposto al momento dell&#39;estrazione. Abbiamo anche sforziamo di fornire una breve panoramica dei saggi a valle o analisi (Figura 1) che possono essere eseguite su tali esemplari modo che i lettori possano esprimere un giudizio qualificato su quale dosaggio (s) più adatta alle loro esigenze.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>305167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel disposable scalpels</td>
			<td>Miltex</td>
			<td>4-410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy Cassettes</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>58931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA-stabilizing solution</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5ml Eppendorf tubes</td>
			<td>Phenix</td>
			<td>MAX-815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50ml tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Neutral Buffered Formalin</td>
			<td>StatLab Medical Products</td>
			<td>28600-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin Containers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-032-059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimal cutting temperature solution (OCT)</td>
			<td>Sakura Finetek</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Cryomold</td>
			<td>Sakura Finetek</td>
			<td>4557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase I</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10104159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase I</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11088793001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70&#956;m cell strainers</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well round bottom plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live/Dead stain solution</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L34957</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

working with human tissues for translational cancer research

Medical research for human benefit is greatly impeded by the necessity for human tissues and subjects. However, upon obtaining consent for human specimens, precious samples must be handled with the greatest care in order to ensure integrity of organs, tissues, and cells to the highest degree. Unfortunately, tissue processing by definition requires extraction of tissues from the host, a change which can cause great cellular stress and have major repercussions on subsequent analyses. These stresses could result in the specimen being no longer representative of the site from which it was retrieved. Therefore, a strict protocol must be adhered to while processing these specimens to ensure representativeness. The desired assay(s) must also be taken into consideration in order to ensure that an optimal technique is used for sample processing. Outlined here is a protocol for tissue retrieval, processing and various analyses which may be performed on processed tissue in order to maximize downstream production from limited tissue samples.

<html> I risultati visualizzati rappresentano il flusso di strategia citometria gating per un&#39;ampia fenotipizzazione immunitario un tumore melanoma trattati. Il giorno di colorazione, campione di tessuto è stato digerito con collagenasi e omogeneizzato I e DNasi I incubazione per 60 min a 37 ° C sotto 225 rotazione RPM. A seguito di digestione, sospensione cellulare è stata filtrata attraverso un colino cella 70 micron per eliminare i detriti e le cellule sono state colorate con il flusso di fluorescenza marcata c...

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Working with Human Tissues for Translational Cancer Research

Translational cancer research is dependent on extraction of human tissues. Much work has gone into optimizing extraction methods for ex vivo analysis. Here, we describe tissue processing methods allowing for maximal data output from limited samples.

Lavorare con tessuti umani per Translational Cancer Research

Medical research for human benefit is greatly impeded by the necessity for human tissues and subjects. However, upon obtaining consent for human ...

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Research

JoVE Journal

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Video: Working with Human Tissues for Translational Cancer Research

Generation of Comprehensive Thoracic Oncology Database - Tool for Translational Research

The Thoracic Oncology Program Database Project was created to serve as a comprehensive, verified, and accessible repository for well-annotated cancer specimens and clinical data to be available to researchers within the Thoracic Oncology Research Program. This database also captures a large volume of genomic and proteomic data obtained from various tumor tissue studies. A team of clinical and basic science researchers, a biostatistician, and a bioinformatics expert was convened to design the database. Variables of interest were clearly defined and their descriptions were written within a standard operating manual to ensure consistency of data annotation. Using a protocol for prospective tissue banking and another protocol for retrospective banking, tumor and normal tissue samples from patients consented to these protocols were collected. Clinical information such as demographics, cancer characterization, and treatment plans for these patients were abstracted and entered into an Access database. Proteomic and genomic data have been included in the database and have been linked to clinical information for patients described within the database. The data from each table were linked using the relationships function in Microsoft Access to allow the database manager to connect clinical and laboratory information during a query. The queried data can then be exported for statistical analysis and hypothesis generation.

A thoracic oncology database was developed to serve as a comprehensive repository for clinical and laboratory data for the purposes of translational research. The database will serve translational cancer researchers within the Thoracic Oncology Research Program. This database is adaptable to other cancer models, as well as other human diseases.

Generazione di Comprehensive Database Oncologia Toracica - Strumento per la ricerca traslazionale

The Thoracic Oncology Program Database Project was created to serve as a comprehensive, verified, and accessible repository for well-annotated cancer ...

Ricerca

Medicina

Establishment and Propagation of Human Retinoblastoma Tumors in Immune Deficient Mice

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited time. These cultured tumorspheres may exhibit markedly different cellular phenotypes when compared to the original tumors. Demonstration that cultured cells have the capability of forming new tumors is important to ensure that cultured cells model the biology of the original tumor. 
Here we present a protocol for propagating human retinoblastoma tumors in vivo using Rag2-/- immune deficient mice. Cultured human retinoblastoma tumorspheres of low passage or cells obtained from freshly harvested human retinoblastoma tumors injected directly into the vitreous cavity of murine eyes form tumors within 2-4 weeks. These tumors can be harvested and either further passaged into murine eyes in vivo or grown as tumorspheres in vitro. Propagation has been successfully carried out for at least three passages thus establishing a continuing source of human retinoblastoma tissue for further experimentation. 
Wesley S. Bond and Lalita Wadhwa are co-first authors.

A method is described to propagate human retinoblastoma tumors in mice. Tumor cells are directly injected into the eyes of immune deficient mice. Secondary tumors have been successfully established using both cells directly harvested from human tumors and cultured tumorspheres.

Istituzione e Propagazione dei Tumori retinoblastoma umani in topi privi di sistema immunitario

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited ...

Ex Vivo Infection of Live Tissue with Oncolytic Viruses

Oncolytic Viruses (OVs) are novel therapeutics that selectively replicate in and kill tumor cells1. Several clinical trials evaluating the effectiveness of a variety of oncolytic platforms including HSV, Reovirus, and Vaccinia OVs as treatment for cancer are currently underway2-5. One key characteristic of oncolytic viruses is that they can be genetically modified to express reporter transgenes which makes it possible to visualize the infection of tissues by microscopy or bio-luminescence imaging6,7. This offers a unique advantage since it is possible to infect tissues from patients ex vivo prior to therapy in order to ascertain the likelihood of successful oncolytic virotherapy8. To this end, it is critical to appropriately sample tissue to compensate for tissue heterogeneity and assess tissue viability, particularly prior to infection9. It is also important to follow viral replication using reporter transgenes if expressed by the oncolytic platform as well as by direct titration of tissues following homogenization in order to discriminate between abortive and productive infection. The object of this protocol is to address these issues and herein describes 1. The sampling and preparation of tumor tissue for cell culture 2. The assessment of tissue viability using the metabolic dye alamar blue 3. Ex vivo infection of cultured tissues with vaccinia virus expressing either GFP or firefly luciferase 4. Detection of transgene expression by fluorescence microscopy or using an In Vivo Imaging System (IVIS) 5. Quantification of virus by plaque assay. This comprehensive method presents several advantages including ease of tissue processing, compensation for tissue heterogeneity, control of tissue viability, and discrimination between abortive infection and bone fide viral replication.

Ex Vivo Infection of Live Tissue with Oncolytic Viruses

Oncolytic viruses are promising for cancer therapeutics. The ability to ascertain the infectability of live tissue specimens obtained from patients prior to treatment is a unique advantage of this therapeutic approach. This protocol describes how to process tissues for ex vivo infection with oncolytic virus and subsequent viral quantification.

Ex infezione Vivo del tessuto Live con virus oncolitici

Oncolytic Viruses (OVs) are novel therapeutics that selectively replicate in and kill tumor cells1. Several clinical trials evaluating the effectiveness ...

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts (CAFs) from Human Mammary Fibroblasts

Carcinomas are complex tissues comprised of neoplastic cells and a non-cancerous compartment referred to as the 'stroma'. The stroma consists of extracellular matrix (ECM) and a variety of mesenchymal cells, including fibroblasts, myofibroblasts, endothelial cells, pericytes and leukocytes 1-3.
The tumour-associated stroma is responsive to substantial paracrine signals released by neighbouring carcinoma cells. During the disease process, the stroma often becomes populated by carcinoma-associated fibroblasts (CAFs) including large numbers of myofibroblasts. These cells have previously been extracted from many different types of human carcinomas for their in vitro culture. A subpopulation of CAFs is distinguishable through their up-regulation of &alpha;-smooth muscle actin (&alpha;-SMA) expression4,5. These cells are a hallmark of 'activated fibroblasts' that share similar properties with myofibroblasts commonly observed in injured and fibrotic tissues 6. The presence of this myofibroblastic CAF subset is highly related to high-grade malignancies and associated with poor prognoses in patients.
Many laboratories, including our own, have shown that CAFs, when injected with carcinoma cells into immunodeficient mice, are capable of substantially promoting tumourigenesis 7-10. CAFs prepared from carcinoma patients, however, frequently undergo senescence during propagation in culture limiting the extensiveness of their use throughout ongoing experimentation. To overcome this difficulty, we developed a novel technique to experimentally generate immortalised human mammary CAF cell lines (exp-CAFs) from human mammary fibroblasts, using a coimplantation breast tumour xenograft model.
In order to generate exp-CAFs, parental human mammary fibroblasts, obtained from the reduction mammoplasty tissue, were first immortalised with hTERT, the catalytic subunit of the telomerase holoenzyme, and engineered to express GFP and a puromycin resistance gene. These cells were coimplanted with MCF-7 human breast carcinoma cells expressing an activated ras oncogene (MCF-7-ras cells) into a mouse xenograft. After a period of incubation in vivo, the initially injected human mammary fibroblasts were extracted from the tumour xenografts on the basis of their puromycin resistance 11.
We observed that the resident human mammary fibroblasts have differentiated, adopting a myofibroblastic phenotype and acquired tumour-promoting properties during the course of tumour progression. Importantly, these cells, defined as exp-CAFs, closely mimic the tumour-promoting myofibroblastic phenotype of CAFs isolated from breast carcinomas dissected from patients. Our tumour xenograft-derived exp-CAFs therefore provide an effective model to study the biology of CAFs in human breast carcinomas. The described protocol may also be extended for generating and characterising various CAF populations derived from other types of human carcinomas.

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts CAFs from Human Mammary Fibroblasts

Carcinoma-associated fibroblasts (CAFs) rich in myofibroblasts present within the tumour stroma, play a major role in driving tumour progression. We developed a coimplantation tumour xengraft model for experimentally generating CAFs from human mammary fibroblasts. The protocol describes how to establish CAF myofibroblasts that acquire an ability to promote tumourigenesis.

Generazione sperimentale di carcinoma-Associated fibroblasti (CAF) da fibroblasti umani mammari

Carcinomas are complex tissues comprised of neoplastic cells and a non-cancerous compartment referred to as the 'stroma'. The stroma consists of ...

Processing of Human Reduction Mammoplasty and Mastectomy Tissues for Cell Culture

Experimental examination of normal human mammary epithelial cell (HMEC) behavior, and how normal cells acquire abnormal properties, can be facilitated by in vitro culture systems that more accurately model in vivo biology. The use of human derived material for studying cellular differentiation, aging, senescence, and immortalization is particularly advantageous given the many significant molecular differences in these properties between human and commonly utilized rodent cells1-2. Mammary cells present a convenient model system because large quantities of normal and abnormal tissues are available due to the frequency of reduction mammoplasty and mastectomy surgeries.
The mammary gland consists of a complex admixture of many distinct cell types, e.g., epithelial, adipose, mesenchymal, endothelial. The epithelial cells are responsible for the differentiated mammary function of lactation, and are also the origin of the vast majority of human breast cancers. We have developed methods to process mammary gland surgical discard tissues into pure epithelial components as well as mesenchymal cells3. The processed material can be stored frozen indefinitely, or initiated into primary culture. Surgical discard material is transported to the laboratory and manually dissected to enrich for epithelial containing tissue. Subsequent digestion of the dissected tissue using collagenase and hyaluronidase strips stromal material from the epithelia at the basement membrane. The resulting small pieces of the epithelial tree (organoids) can be separated from the digested stroma by sequential filtration on membranes of fixed pore size. Depending upon pore size, fractions can be obtained consisting of larger ductal/alveolar pieces, smaller alveolar clusters, or stromal cells. We have observed superior growth when cultures are initiated as organoids rather than as dissociated single cells. Placement of organoids in culture using low-stress inducing media supports long-term growth of normal HMEC with markers of multiple lineage types (myoepithelial, luminal, progenitor)4-5. Sufficient numbers of cells can be obtained from one individual's tissue to allow extensive experimental examination using standardized cell batches, as well as interrogation using high throughput modalities.
Cultured HMEC have been employed in a wide variety of studies examining the normal processes governing growth, differentiation, aging, and senescence, and how these normal processes are altered during immortal and malignant transformation4-15,16. The effects of growth in the presence of extracellular matrix material, other cell types, and/or 3D culture can be compared with growth on plastic5,15. Cultured HMEC, starting with normal cells, provide an experimentally tractable system to examine factors that may propel or prevent human aging and carcinogenesis.

A method to process human mammary surgical discard material is described. Processed tissue, in the form of organoids, can be stored frozen indefinitely or placed in culture for long-term growth. This method enables experimental examination of normal human epithelial cell biology, and the effects of exogenous perturbations.

Elaborazione di mastoplastica riduttiva e tessuti umani mastectomia per coltura cellulare

Experimental  examination of normal human mammary epithelial cell (HMEC) behavior, and how  normal cells acquire abnormal properties, can be facilitated ...

A Modified Heterotopic Swine Hind Limb Transplant Model for Translational Vascularized Composite Allotransplantation (VCA) Research

Vascularized Composite Allotransplantation (VCA) such as hand and face transplants represent a viable treatment option for complex musculoskeletal trauma and devastating tissue loss. Despite favorable and highly encouraging early and intermediate functional outcomes, rejection of the highly immunogenic skin component of a VCA and potential adverse effects of chronic multi-drug immunosuppression continue to hamper widespread clinical application of VCA. Therefore, research in this novel field needs to focus on translational studies related to unique immunologic features of VCA and to develop novel immunomodulatory strategies for immunomodulation and tolerance induction following VCA without the need for long term immunosuppression.
This article describes a reliable and reproducible translational large animal model of VCA that is comprised of an osteomyocutaneous flap in a MHC-defined swine heterotopic hind limb allotransplantation. Briefly, a well-vascularized skin paddle is identified in the anteromedial thigh region using near infrared laser angiography. The underlying muscles, knee joint, distal femur, and proximal tibia are harvested on a femoral vascular pedicle. This allograft can be considered both a VCA and a vascularized bone marrow transplant with its unique immune privileged features. The graft is transplanted to a subcutaneous abdominal pocket in the recipient animal with a skin component exteriorized to the dorsolateral region for immune monitoring.
Three surgical teams work simultaneously in a well-coordinated manner to reduce anesthesia and ischemia times, thereby improving efficiency of this model and reducing potential confounders in experimental protocols. This model serves as the groundwork for future therapeutic strategies aimed at reducing and potentially eliminating the need for chronic multi-drug immunosuppression in VCA.

A Modified Heterotopic Swine Hind Limb Transplant Model for Translational Vascularized Composite Allotransplantation VCA Research

Vascularized Composite Allotransplantations (VCA) have become a clinical reality. However, broad clinical application of VCA is limited by chronic multi-drug immunosuppression. The authors present a reliable and reproducible large animal model to translate novel immunomodulatory strategies that can minimize or potentially eliminate the need of immunosuppression in VCA.

Un modificata eterotopica suina Hind Arto Trapianto Modello traslazionale vascolarizzato composito allotrapianto (VCA) La ricerca

Vascularized Composite Allotransplantation (VCA) such as hand and face transplants represent a viable treatment option for complex musculoskeletal trauma ...

MR Molecular Imaging of Prostate Cancer with a Small Molecular CLT1 Peptide Targeted Contrast Agent

Tumor extracellular matrix has abundance of cancer related proteins that can be used as biomarkers for cancer molecular imaging. In this work, we demonstrated effective MR cancer molecular imaging with a small molecular peptide targeted Gd-DOTA monoamide complex as a targeted MRI contrast agent specific to clotted plasma proteins in tumor stroma. We performed the experiment of evaluating the effectiveness of the agent for non-invasive detection of prostate tumor with MRI in a mouse orthotopic PC-3 prostate cancer model. The targeted contrast agent was effective to produce significant tumor contrast enhancement at a low dose of 0.03 mmol Gd/kg. The peptide targeted MRI contrast agent is promising for MR molecular imaging of prostate tumor.

To demonstrate MR cancer molecular imaging with a small peptide targeted MRI contrast agent specific to clotted plasma proteins in tumor stroma in a mouse prostate cancer model.

MR Imaging Molecolare del cancro alla prostata con un piccolo Molecular CLT1 Peptide mirato di contrasto agente

Tumor extracellular  matrix has abundance of cancer related proteins that can be used as biomarkers  for cancer molecular imaging. In this work,  we ...

Cell Death Associated with Abnormal Mitosis Observed by Confocal Imaging in Live Cancer Cells

Phenanthrene derivatives acting as potent PARP1 inhibitors prevented the bi-focal clustering of supernumerary centrosomes in multi-centrosomal human cancer cells in mitosis. The phenanthridine PJ-34 was the most potent molecule. Declustering of extra-centrosomes causes mitotic failure and cell death in multi-centrosomal cells. Most solid human cancers have high occurrence of extra-centrosomes. The activity of PJ-34 was documented in real-time by confocal imaging of live human breast cancer MDA-MB-231 cells transfected with vectors encoding for fluorescent &gamma;-tubulin, which is highly abundant in the centrosomes and for fluorescent histone H2b present in the chromosomes. Aberrant chromosomes arrangements and de-clustered &gamma;-tubulin foci representing declustered centrosomes were detected in the transfected MDA-MB-231 cells after treatment with PJ-34. Un-clustered extra-centrosomes in the two spindle poles preceded their cell death. These results linked for the first time the recently detected exclusive cytotoxic activity of PJ-34 in human cancer cells with extra-centrosomes de-clustering in mitosis, and mitotic failure leading to cell death. According to previous findings observed by confocal imaging of fixed cells, PJ-34 exclusively eradicated cancer cells with multi-centrosomes without impairing normal cells undergoing mitosis with two centrosomes and bi-focal spindles. This cytotoxic activity of PJ-34 was not shared by other potent PARP1 inhibitors, and was observed in PARP1 deficient MEF harboring extracentrosomes, suggesting its independency of PARP1 inhibition. Live confocal imaging offered a useful tool for identifying new molecules eradicating cells during mitosis.

The cytotoxic activity of the phenanthridine PJ-34 in cancer cells undergoing mitosis was documented in real time by live confocal imaging. PJ-34 eradicated human breast cancer MDA-MB-231 cells harboring extra-centrosomes in mitosis. Unlike normal bi-focal mitosis, the extra-centrosomes were not clustered in the two spindle poles in the presence of PJ-34.

Cella della morte associata a mitosi anomalo osservato da Imaging confocale in cellule vive di cancro

Phenanthrene derivatives acting as potent PARP1 inhibitors prevented the bi-focal clustering of supernumerary centrosomes in multi-centrosomal human ...

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial cells tend to lose hormone receptor expression. Widely used hormone receptor positive breast cancer cell lines are of limited relevance to the in vivo situation. Here, we describe an ex vivo model to study hormone action in the human breast. Fresh human breast tissue specimens from surgical discard material such as reduction mammoplasties or mammectomies are mechanically and enzymatically digested to obtain tissue fragments containing ducts and lobules and multiple stromal cell types. These tissue microstructures kept in basal medium without growth factors preserve their intercellular contacts, the tissue architecture, and remain hormone responsive for several days. They are readily processed for RNA and protein extraction, histological analysis or stored in freezing medium. Fluorescence activated cell sorting (FACS) can be used to enrich for specific cell populations. This protocol provides a straightforward, standard approach for translational studies with highly complex, varied human specimens.

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

We have developed a novel ex vivo model to study hormone action in the human breast. It is based on tissue microstructures isolated from surgical breast tissue specimens which preserve tissue architecture, intercellular interactions, and paracrine signaling.

Un<em&gt; Ex vivo</em&gt; Modello per studiare Hormone azione in seno umano

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial ...

Mammosphere Formation Assay from Human Breast Cancer Tissues and Cell Lines

Similar to healthy tissues, many blood and solid malignancies are now thought to be organised hierarchically, with a subset of stem-like cancer cells that self-renew while giving rise to more differentiated progeny. Understanding and targeting these cancer stem cells in breast cancer, which may possess enhanced chemo- and radio-resistance compared to the non-stem tumor bulk, has become an important research area. Markers including CD44, CD24, and ALDH activity can be assessed using fluorescence activated cell sorting (FACS) to prospectively isolate cells that display enhanced tumorigenicity when implanted into immunocompromised mice: the mammosphere assay has also become widely used for its ability to retrospectively identify sphere-forming cells that develop from single stem cell-like clones. Here we outline approaches for the appropriate culturing of mammospheres from cell lines or primary patient samples, their passaging, and calculations to estimate sphere forming efficiency (SFE). First we discuss key considerations and pitfalls in the appropriate planning and interpretation of mammosphere experiments.

Floating mammosphere assays can investigate the subset of stem-like breast cancer cells that survive in suspension conditions and show enhanced tumorigenesis when implanted into mice. This protocol provides a convenient in vitro measure of sphere-forming ability, a proxy for in vivo tumorigenesis, while facilitating analysis of the stem-associated transcriptional landscape.

Mammosphere saggio Formazione di Human Breast Cancer tessuti e linee cellulari

Similar to healthy tissues, many blood and solid malignancies are now thought to be organised hierarchically, with a subset of stem-like cancer cells that ...