Siamo grati a Lonza Group Ltd. per sponsorizzare questa pubblicazione coprendo i costi di pubblicazione. Ringraziamo la Deutsche Infarktforschungshilfe, Wilhelm-Vaillant-Stiftung, Ernest-Solvay-Stiftung, e la Thüringer Ministerium für Bildung, Wissenschaft und Kultur per il sostegno finanziario a SL.

1 Differenziazione degli THP-1 Macrofagi <ol><li> Coltivazione cellule THP-1 in terreno RPMI-1640 supplementato con 10% (v / v) di siero fetale bovino (FCS) e 1% (v / v) di penicillina / streptomicina / L-glutamina (PSG) in CO 2 (5% ) incubatore a 37 ° C. </li><li> Prima di trasfezione, dividere le celle e trasferirli freschi di medie RPMI come prima. Coltivare le cellule per 24 ore. </li><li> Seme 1,0-1,5 x 10 7 cellule in un pallone di coltura di tessuto 75 cm ² o 2,5 x 10 7 cellule in un tessuto pallone di coltura di 150 cm ² in mezzo RPMI-1640 e di aggiungere il 10% (v / v) FCS, 1% (v / v) PSG, 1% (v / v) piruvato di sodio, 1% (v / v) aminoacidi non essenziali, 10 ng / ml di PMA, e 50 mM β-mercaptoetanolo per 48 ore. </li></ol> 2 Preparazione di Nucleofection <ol><li> Posizionare Accutase I e tutti i media in bagno d&#39;acqua a 37 ° C. </li><li> Aspirare il terreno di coltura da pallone e sostituire con 6 ml (boccetta 75 cm ²) o 12 ml (fiasco) di 150 cm ²Accutase I e incubare per 30 minuti a 37 ° C per il pieno distacco delle cellule. Osservare morfologia delle cellule dopo il trattamento Accutase ho per garantire che le cellule hanno un aspetto rotondo. Se alcune cellule ancora sembrano essere allegata, sciacquare accuratamente il pallone con una micropipetta o picchiettare delicatamente per completare il distacco. Non utilizzare raschietti di cellule, in quanto questo avrà un effetto negativo sulla vitalità delle cellule. Trasferimento sospensione cellulare in una provetta da 15 ml. </li><li> Durante il trattamento Accutase io, preparare i seguenti supporti: <ol><li> Preparare mezzo trasfezione: integratore terreno di coltura cellulare con 1% (v / v) PSG, 1% (v / v) di acidi non essenziali amino, 1% (v / v) di sodio piruvato, e 5% (v / v) di siero umano (per siRNA) o al 20% (v / v) di siero umano (per plasmide DNA); preparare un volume finale di una delle 3 ml / campione per una piastra da 6 pozzetti o 4 ml / campione per due piastre da 12 pozzetti. </li><li> Preparare mezzo di coltura: integratore terreno di coltura con 1% (v / v) PSG, 1% (v / v) di aminoacidi non essenziali, 1% (v / v) di sodio piruvato, e il 5% (v / v) husiero uomo (per siRNA) o al 20% (v / v) di siero umano (per il plasmide), 2,5 ng / ml di PMA, e 50 mM β-mercaptoetanolo; preparare un volume finale di una delle 3 ml / campione per una piastra da 6 pozzetti o 4 ml / campione per due piastre da 12 pozzetti. </li></ol></li><li> Sospensione cellulare Centrifugare per 5 minuti a 300 xg a temperatura ambiente. </li><li> Cellule Aspirare Accutase I e risospendere in 1 ml di terreno RPMI pre-riscaldato a 37 ° C; contare le celle per determinare il numero di cellule. NOTA: Quando si utilizzano veloci procedure automatiche di conteggio delle cellule, passi 2.4 e 2.5 possono essere omessi e le cellule possono essere conteggiate immediatamente dopo il distacco a condizione che l&#39;esposizione prolungata a Accutase mi viene evitato. </li><li> Per ogni campione trasfezione preparare aliquote in provette contenenti 2,0-2,5 x 10 6 cellule. </li></ol> 3. Nucleofection di THP-1 Macrofagi <ol><li> Centrifugare tutte le aliquote per 10 min a 250 xg a temperatura ambiente. </li><li> Diluire DNA plasmidico o siRNA in priva di nucleasiacqua o un tampone appropriato. Mantenere il volume di DNA plasmidico o siRNA richiesto più piccolo possibile. </li><li> Preparare una cuvetta Nucleofector sia con 1 mg di siRNA o 0,5 mg di DNA plasmidico per ogni trasfezione. </li><li> Eseguire una trasfezione alla volta. Aspirare il surnatante da un&#39;aliquota delle cellule. </li><li> Risospendere le cellule pellet in soluzione Nucleofector per produrre un volume totale di 100 ml di DNA / siRNA e soluzione Nucleofector. Mantenere il tempo di esposizione a soluzione pura Nucleofector al minimo e assicurare che il tempo di esposizione non supera 15 min. </li><li> Mescolare cellule risospese e DNA / siRNA in Nucleofector cuvette picchiettando leggermente. </li><li> Cellule trasfezione eseguendo il programma Y-001 nel dispositivo 2b Nucleofector. </li><li> Trasferire cellule trasfettate in un flaconcino di reazione utilizzando pipette Pasteur di plastica usa e getta. </li><li> Aggiungere immediatamente 500 ml di mezzo di trasfezione preparato. </li><li> Ripetere i passaggi 3,4-3,9 per ogni campione trasfezione. </li></ol><ol><li> Preparare o 6 pozzetti o 12 e piastre per cellule transfettate. Pipettare 2,5 ml di mezzo di transfezione in ciascun pozzetto di una piastra da 6 pozzetti (1 pozzo / trasfezione) o 1,75 ml di mezzo di transfezione in ciascun pozzetto di una piastra 12 pozzetti (2 pozzetti / trasfezione). </li><li> Mescolare accuratamente sospensioni cellulari con una micropipetta. </li><li> Trasferire le cellule transfettate nei pozzetti preparati (sia un pozzetto in una piastra ben 6 o due in un piatto ben 12). </li><li> Incubare le piastre per 4 ore in un incubatore umidificato (5% di CO 2, 37 ° C). </li><li> Controllare riattacco delle cellule al microscopio. NOTA: La maggior parte delle cellule dovrebbe essere di nuovo aderente. Occasionalmente, estendendo il periodo di incubazione di 1 ora aumenta il numero di cellule aderenti in caso di riattacco insufficiente. </li><li> Aspirare accuratamente medio trasfezione con una micropipetta e sostituire con pari quantità di mezzo di coltura. Un solo Aspirare bene alla volta. </li> &lt;li&gt; Incubare le cellule per il periodo di tempo necessario per il massimo effetto di plasmide o siRNA (24-72 ore). Se i periodi di incubazione superiore a 48 ore, sostituire media dopo 48 ore. </li><li> Per ulteriore trattamento con effettori (ad es., Citochine, agonisti, antagonisti e inibitori) utilizzano siero media liberi senza PMA e β-mercaptoetanolo. Ora la fine del periodo di incubazione della effettore con il tempo di effetto massimo del plasmide o siRNA e pianificare il cambiamento di medie e aggiunta del effettore conseguenza. Non mantenere le cellule in condizioni di libero siero per più di 24 ore. </li></ol>

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	<li>Ricardo, S. D., van Goor, H., Eddy, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+diversity+in+renal+injury+and+repair.">Macrophage diversity in renal injury and repair.</a> J Clin Invest. 118 (11), 3522-3530 (2008).</li><li>Mosser, D. M., Edwards, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+full+spectrum+of+macrophage+activation.">Exploring the full spectrum of macrophage activation.</a> Nat Rev Immunol. 8 (12), 958-969 (2008).</li><li>Morille, M., Passirani, C., Vonarbourg, A., Clavreul, A., Benoit, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+developing+cationic+vectors+for+non-viral+systemic+gene+therapy+against+cancer.">Progress in developing cationic vectors for non-viral systemic gene therapy against cancer.</a> Biomaterials. (24-25), 3477-3496 (2008).</li><li>Schnoor, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+non-viral+transfection+of+THP-1+cells.">Efficient non-viral transfection of THP-1 cells.</a> J Immunol Methods. 344 (2), 109-115 (2009).</li><li>Mae&#223;, M. B., Buers, I., Robenek, H., Lorkowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+protocol+for+efficient+nonviral+transfection+of+premature+THP-1+macrophages.">Improved protocol for efficient nonviral transfection of premature THP-1 macrophages.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2011 (5), (2011).</li><li>Ma, W., Liu, Y., Ellison, N., Shen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+C-X-C+chemokine+receptor+type+7+(CXCR7)+switches+stromal+cell-derived+factor-1+(SDF-1)+signaling+and+phagocytic+activity+in+macrophages+linked+to+atherosclerosis.">Induction of C-X-C chemokine receptor type 7 (CXCR7) switches stromal cell-derived factor-1 (SDF-1) signaling and phagocytic activity in macrophages linked to atherosclerosis.</a> J Biol Chem. 288 (22), 15481-15494 (2013).</li><li>Xie, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+surface+localization+of+ABCG1+does+not+require+LXR+activation.">Cell surface localization of ABCG1 does not require LXR activation.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 26 (11), 143-144 (2006).</li><li>Buers, I., Robenek, H., Lorkowski, S., Nitschke, Y., Severs, N. J., Hofnagel, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TIP47,+a+lipid+cargo+protein+involved+in+macrophage+triglyceride+metabolism.">TIP47, a lipid cargo protein involved in macrophage triglyceride metabolism.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 29 (5), 767-773 (2009).</li><li>Robenek, H., Buers, I., Hofnagel, O., Lorkowski, S., Severs, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GFP-tagged+proteins+visualized+by+freeze-fracture+immuno-electron+microscopy:+A+new+tool+in+cellular+and+molecular+medicine.">GFP-tagged proteins visualized by freeze-fracture immuno-electron microscopy: A new tool in cellular and molecular medicine.</a> J Cell Mol Med. 13 (7), 1381-1390 (2009).</li><li>Guh, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+novel+adenosine+monophosphate-activated+protein+kinase+activators.">Development of novel adenosine monophosphate-activated protein kinase activators.</a> J Med Chem. 53 (6), 2552-2561 (2010).</li><li>Park, E. K., Jung, H. S., Yang, H. I., Yoo, M. C., Kim, C., Kim, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+THP-1+differentiation+is+required+for+the+detection+of+responses+to+weak+stimuli.">Optimized THP-1 differentiation is required for the detection of responses to weak stimuli.</a> Inflamm Res. 56 (1), 45-50 (2007).</li><li>Mae&#223;, M. B., Wittig, B., Cignarella, A., Lorkowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+PMA+enhances+the+responsiveness+of+transfected+THP-1+macrophages+to+polarizing+stimuli.">Reduced PMA enhances the responsiveness of transfected THP-1 macrophages to polarizing stimuli.</a> J Immunol Methods. 402 (1-2), 76-81 (2014).</li><li>Angosto, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+inflammasome+functions+in+vertebrates:+Inflammasome+and+caspase-1+trigger+fish+macrophage+cell+death+but+are+dispensable+for+the+processing+of+IL-1b.">Evolution of inflammasome functions in vertebrates: Inflammasome and caspase-1 trigger fish macrophage cell death but are dispensable for the processing of IL-1b.</a> Innate Immun. 18 (6), 815-824 (2012).</li><li>Latz, E., Xiao, T. S., Stutz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+and+regulation+of+the+inflammasomes.">Activation and regulation of the inflammasomes.</a> Nat Rev Immunol. 13 (6), 397-411 (2013).</li><li>Muruve, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inflammasome+recognizes+cytosolic+microbial+and+host+DNA+and+triggers+an+innate+immune+response.">The inflammasome recognizes cytosolic microbial and host DNA and triggers an innate immune response.</a> Nature. 452 (7183), 103-107 (2008).</li></ol>

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Il protocollo descritto qui presenta un modo affidabile ed efficiente per trasfettare THP-1 macrofagi che di solito sono piuttosto difficili da trasfezione. La trasfezione può essere realizzato con efficienze di trasfezione di sopra del 90% per siRNA senza significativa riduzione della vitalità cellulare. Incrementi di efficienza per plasmidi possono essere meno a causa delle loro dimensioni, ma di trasfezione efficienze di circa il 70% può essere di solito raggiunti. L&#39;efficienza del knockdown siRNA-mediata può raggiungere 80 e il 90% a seconda del siRNA applicata. Un importante vantaggio di questo protocollo è che non interferisce con la differenziazione cellulare. Dopo la trasfezione le cellule ancora rispondono normalmente all&#39;agente differenziazione PMA (Figura 1A 1B e Figura 4) 12. Oltre polarizzazione cellulare da stimoli di citochine quali IL10 o LPS / IFNγ è influenzato 12, anche se questo dipende anche fortemente sul supporto selezionato per la coltivazione dopo trasfezione uns mostrato in Figura 4. Ci sono diverse opzioni all&#39;interno della procedura che può essere modificata al fine di adattare il protocollo delle specifiche esigenze. Come mostrato in figura 4 le cellule reagiscono diversamente allo stesso stimolo IL10 seconda del mezzo di coltura selezionata dopo la trasfezione. Ciò indica che la composizione media ha una forte influenza sul comportamento cellulare. Dato che l&#39;effetto imposto dal mezzo potrebbe differire per vari stimoli sperimentali, è possibile che il mezzo ottimale potrebbe cambiare e quindi vi è la necessità di verificare l&#39;idoneità del mezzo di differenti esperimenti indipendente. Tuttavia il mezzo RPMI-1640, che è il mezzo predefinito utilizzato per la coltivazione di cellule THP-1, ha dimostrato di essere poco adatto per la coltivazione dopo trasfezione come è stata osservata una significativa perdita di vitalità cellulare. Inoltre, il protocollo può essere applicato anche ad THP-1 monociti senza previa differenziazione PMA-indotta questa,ovviamente, elimina la necessità di distacco delle cellule durante la procedura, ma tutti i passaggi rimanenti non devono essere regolati. I monociti THP-1 possono essere differenziati in seguito, se necessario. Gli elementi più critici del protocollo sono in primo luogo il distacco e in secondo luogo il tempo richiesto per la trasfezione. Il distacco deve essere eseguito il più delicatamente possibile, al fine di mantenere alta la vitalità cellulare. Vi consigliamo quindi il distacco enzimatico relativamente mite da Accutase I over metodi molto aggressivi come tripsinizzazione. Altri metodi di distacco come il trattamento con Lidocaina o raschiatura sono risultati piuttosto dannosa e non devono essere utilizzati. Nel caso in cui 30 minuti di trattamento Accutase non dovrebbe essere sufficiente a staccare tutte le cellule correttamente questo è di solito un&#39;indicazione di soluzione Accutase ho erroneamente conservati o scaduti o di un numero eccessivo di cicli di congelamento-scongelamento. Abbiamo ottenuto buoni risultati per la memorizzazione di piccole aliquote di Accutase io a -20 °C per ridurre il numero di cicli di congelamento-scongelamento. Tuttavia, quando vi è il distacco sufficiente sostituire Accutase I con Accutase freschi o aumentare il tempo di incubazione fino a 1 ora. Inoltre picchiettando leggermente o risciacquo del pallone o piastra può aiutare il distacco. Per quanto riguarda il tempo necessario per la trasfezione il tempo di esposizione delle cellule alla soluzione pura Nucleofector ha elevato impatto sulla sopravvivenza cellulare e quindi dovrebbe essere il più breve possibile. Il modo migliore per raggiungere questo obiettivo è quello di eseguire ogni trasfezione alla volta (passi 2,10-2,15) e non più transfezioni in parallelo. Se l&#39;efficienza knockdown è bassa, questo di solito non è causato dalla bassa efficienza di trasfezione, ma questo può essere facilmente verificata mediante citometria a flusso o microscopia a fluorescenza e fluorescente siRNA o un plasmide codifica GFP. Per lo più la causa è un siRNA o il DNA plasmide inefficiente. In queste circostanze dovrebbe essere considerata per aumentare la quantità di siRNA (fino a 2-3 mg) oDNA plasmidico (fino a 1-2 mg) o per utilizzare un diverso siRNA o vettore di espressione, se disponibile. In alternativa, risultati soddisfacenti possono essere ottenuti anche mediante un pool di diversi siRNA differenti diretti contro lo stesso bersaglio. Inoltre, gli esperimenti del corso di tempo potrebbe essere richiesto di determinare con precisione il periodo di massimo effetto, che di solito raggiunge dopo 24-72 ore dopo la trasfezione. Oltre trasfezione mediante elettroporazione ci sono ulteriori tecniche ben consolidate per la trasfezione di cellule di mammifero. Frequentemente sistemi applicati sono agenti di transfezione chimici che possono formare complessi con l&#39;acido nucleico di carico e quindi facilitare il trasporto nelle cellule. I reagenti più comunemente utilizzati si basano sia su diverse specie di lipidi o possono essere scelti da un certo numero di polimeri cationici 3. Per entrambi gli approcci una diversa selezione è disponibile in commercio. Questi reagenti di trasfezione offrono il vantaggio di essere generalmentefacile da usare, non richiedono molto tempo, e lavorare con cellule aderenti pure, eliminando così la necessità di distacco. Purtroppo, i macrofagi sono piuttosto difficili da trasfettare da questi metodi in quanto non proliferano in modo significativo in vitro e possiedono meccanismi di difesa contro il DNA estraneo citosolico 13-15. Così, gli approcci di transfezione chimici spesso si traducono in una grave riduzione della vitalità cellulare. Tuttavia come mostrato in Figura 2 vi sono agenti di transfezione chimici in grado di trasferire con successo siRNA in macrofagi, ma come citofluorimetrica (Figura 2A) e microscopica fluorescente (Figura 2B) analisi indicano che non riescono a raggiungere la stessa distribuzione omogenea dei siRNA all&#39;interno delle cellule come ottenuto da Nucleofection. Infatti, i dati di citometria a flusso indicano che due differenti popolazioni di cellule trasfettate verificano, innanzitutto una popolazione con fluorescenza simile come le cellule dopo Nucleofectisul rilevamento e in secondo luogo vi è una popolazione con più intensa fluorescenza. Conferma definitiva è ancora necessaria, ma supponiamo che la prima popolazione è in microscopia a fluorescenza identici a quelle cellule che mostrano una distribuzione omogenea dei siRNA fluorescente all&#39;interno del citoplasma, mentre la seconda popolazione che rischia corrisponde alle cellule con agglomerati molto luminosi. I dati di citometria a flusso illustrati nella Figura 2A suggeriscono che i risultati nucleofection a meno di siRNA per cella rispetto all&#39;approccio lipofezione alternativo. Tuttavia i dati della figura 3 mostra che anche la relativamente piccola quantità di siRNA incorporate per Nucleofection è già sufficiente per dall&#39;80 al 90% knockdown del gene bersaglio. Pertanto, l&#39;importo aggiuntivo di siRNA inserito dalla seconda popolazione dopo la trasfezione chimica è surplus molto probabile ed è quindi più probabilità di causare effetti collaterali indesiderati che di aumentare ulteriormente l&#39;efficienza knockdown. A parte questoformazione di agglomerati intracellulari è già di per sé auspicabile dal momento che tali molecole di siRNA non sono suscettibili funzionali o comunque meno efficiente di molecole di siRNA liberi e possono causare effetti fuori bersaglio. Inoltre, la vera natura di questi agglomerati non è ancora chiaro. E &#39;possibile che questi punti luminosi rappresentano endosomi che indicano che il siRNA è stato interiorizzato dalle cellule, ma successivamente rilasciare dai endosomi fallito e il siRNA resta intrappolato e quindi inefficace. In alternativa, le macchie potrebbero essere agglomerati che si formano all&#39;interno delle cellule. Valutazioni funzionali del trasfezione chimica sono in sospeso, quindi non affermazioni definitive in materia di efficienza atterramento possono essere ancora fatte, ancora l&#39;esistenza di due distinte popolazioni è già sfavorevole in quanto ciò significa che tutti i risultati descrivono la media di entrambe le popolazioni, ciò non pertanto, corrisponde a una delle popolazioni. Per questo motivo Nucleofection è l&#39;approccio superiore. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Tuttavia ci sono anche limitazioni alla procedura di trasfezione qui delineato. Poiché le cellule devono essere in sospensione per cellule aderenti Nucleofection devono essere staccato, che presenti un ulteriore fattore di stress per le cellule. Inoltre, l&#39;intero protocollo è piuttosto in termini di tempo. Poiché trasfezioni non possono essere eseguite contemporaneamente, ma deve essere eseguita rapidamente per evitare danni cellulari, il numero di campioni è limitato a circa 8 - 10 per esperimento. Così, questo protocollo non è adatto per i progetti di screening ad alto rendimento. Per le applicazioni ad alta velocità effettiva diversi sistemi Nucleofector sono disponibili. In primo luogo, vi è il sistema 4D-Nucleofector che offre un formato nastro 16 bene. Per un throughput ancora più grande, ci sono il sistema Shuttle 96 bene e il 384 ben sistema HT Nucleofector. Tuttavia, come questi nuovi sistemi funzionano con elettrodi conduttivi polimero al posto di alluminio e quindi condizioni elettriche, cioè programmi e composition di soluzione Nucleofector, sono cambiate di conseguenza, esso deve essere determinato se il nostro protocollo può essere trasferito a tali sistemi. Tuttavia, nonostante queste limitazioni il protocollo qui presentato non produrre una trasfezione affidabile ed efficace di cellule THP-1, che è superiore a tutti gli altri metodi non-virali. Questo protocollo consente l&#39;indagine degli effetti di espressione genica alterata in cellule THP-1 che in tutti gli altri aspetti differenziare e polarizzano normalmente e quindi mostrano come piccoli effetti collaterali di trasfezione possibile.

Tra le componenti cellulari del sistema immunitario umano, i macrofagi sono di grande importanza per la risposta immunitaria innata. I loro compiti sono diversi; sono coinvolti nella fagocitosi dei patogeni e materiale necrotico, essi svolgono un ruolo importante nella omeostasi tissutale e producono e secernono un gran numero di citochine per regolare e orchestrare la risposta immunitaria 1. Pertanto, i macrofagi sono integralmente coinvolti in molti processi fisiologici e condizioni fisiopatologiche. A causa della diversità dei loro compiti, i macrofagi sono un tipo di cellule molto eterogeneo e multiforme. Ciò si ottiene diverse polarizzazioni; seconda macrofagi stimoli esterni può svilupparsi in differenti fenotipi 2. Variabilità macrofagi &#39;e impatto sulla risposta immunitaria loro un tema di ricerca molto interessante fanno. Al fine di chiarire la complessa metaboliche e funzioni di regolamentazione, del caso dei macrofagi in vitro sono required che riflettono correttamente macrofagi eterogeneità e variabilità. Trasfezione di cellule con vettori plasmide di DNA o di piccoli RNA interferenti (siRNA), al fine di alterare l&#39;espressione genica cellulare è diventato uno strumento ampiamente utilizzato e potente in biologia cellulare per lo studio sia per regolazione genica e la funzione del gene. Attualmente c&#39;è una grande selezione di diversi strumenti disponibili per la trasfezione di cellule eucariotiche. Questi strumenti includono l&#39;applicazione di vettori virali, metodi meccanici (come pistole geniche), approcci chimici (che si basano su polimeri o lipidi che possono formare complessi con gli acidi nucleici), ed elettroporazione di cellule 3. Tutti questi approcci hanno i loro vantaggi e svantaggi e scegliendo il più adatto da questa vasta gamma per un tipo di cellula specifico e l&#39;applicazione può essere un processo che richiede difficile e richiede tempo. I macrofagi sono notoriamente difficili da transfettare transfe come quasi tutti ben consolidataapprocci ction riducono drasticamente la redditività macrofagi o interferire con il loro comportamento, cioè la differenziazione e in particolare polarizzazione. Pertanto, vi presentiamo qui un protocollo efficiente, non virale per trasfettare umani THP-1 macrofagi che utilizzano la tecnologia basata Nucleofector elettroporazione-, che rappresenta un approccio ottimizzato elettroporazione richiedono ridotte quantità di DNA. Nucleofection è particolarmente adatto per le cellule sensibili come monociti e macrofagi. Questo protocollo è un adattamento di versioni precedentemente pubblicati 4,5. In breve, forbolo 12-miristato 13-acetato (PMA) è usato per differenziare umani THP-1 monociti per 48 ore in macrofagi prematuri prima della trasfezione con siRNA o DNA plasmidico. Per la trasfezione i macrofagi predifferentiated sono staccati enzimaticamente dal trattamento Accutase I. La trasfezione viene eseguita utilizzando un dispositivo 2b Nucleofector per elettroporazione delle cellule. Dopo la trasfezione, differireziazione è continuato per un altro 24 a 48 ore, come richiesto. Infine, macrofagi maturi trasfettate vengono incubate con differenti tipi di mescole per studi funzionali. Questo approccio consente la trasfezione di linee cellulari come umani THP-1 monociti e macrofagi ed è stato applicato con successo in passato 6-10. Contrariamente alla maggior parte degli approcci di trasfezione chimica, la nostra procedura Nucleofection modificata utilizzando macrofagi prematuri produce alte efficienze di trasfezione in combinazione con la vitalità cellulare intatta, senza la necessità di utilizzare vettori virali o aggiungere ulteriori composti vettore con effetti collaterali sconosciuti. Inoltre, i macrofagi mantengono la loro piena potenzialità di differenziazione e polarizzazione consentendo indagini funzionali senza ostacoli seguente trasfezione 11. Inoltre, il mezzo di coltura cellulare applicare dopo Nucleofection influenza fortemente studi funzionali seguente transfection; in particolare, la capacità dei macrofagi di polarizzazione può essere influenzato a seconda del mezzo di coltura applicato. Qui quattro diversi tipi di mezzi di coltura cellulare (IMDM, X-VIVO 20, LGM3 e mouse T cellulare Nucleofector medio) sono stati testati in condizioni di disattivazione utilizzando interleuchina (IL) 10 Uso THP-1 macrofagi, abbiamo osservato che la risposta delle cellule a IL10 è forte quando il mouse T cellulare Nucleofector terreno è usato in confronto agli altri mezzi di coltura di cui sopra. Questi risultati dimostrano che appropriata ottimizzazione di tutte le condizioni di coltura cellulare è fondamentale per il successo di transfezione und successivi studi funzionali come questi possono migliorare significativamente i risultati sperimentali. Come macrofagi sono coinvolti in varie malattie umane, gran parte della ricerca si concentra su chiarire comportamento macrofagi nonché meccanismi regolativi che influenzano macrofagi o, a sua volta controllata da parte dei macrofagi. Pertanto, questo protocollo è rilevante inmolte aree di ricerca diverse.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="777">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:145px;">Company</td>
			<td style="width:145px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Accutase I</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:145px;">A6964</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Amino acids, nonessential</td>
			<td style="width:145px;">PAA</td>
			<td style="width:145px;">M11-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Centrifuge tubes (15 ml)</td>
			<td style="width:145px;">TPP</td>
			<td style="width:145px;">TPP91015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Fetal calf serum (FCS gold)</td>
			<td style="width:145px;">PAA</td>
			<td style="width:145px;">A15-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Human Monocyte Nucleofector Kit</td>
			<td style="width:145px;">Lonza</td>
			<td style="width:145px;">VPA-1007</td>
			<td>Contains Nucleofector Solution, cuvettes and Pasteur pipettes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Human serum off the clot</td>
			<td style="width:145px;">Lonza</td>
			<td style="width:145px;">C11-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:320px;">Isove&#39;s Modified Dulbecco&#39;s Medium (IMDM) with 25 mM HEPES and 25 mM L-glutamine</td>
			<td style="width:145px;">Lonza</td>
			<td style="width:145px;">12-722F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Lymphocyte Growth Medium 3 (LGM3)</td>
			<td style="width:145px;">Lonza</td>
			<td style="width:145px;">CC-3211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Mouse T Cell Nucleofector Medium</td>
			<td style="width:145px;">Lonza</td>
			<td style="width:145px;">VZB-1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Nucleofector 2b</td>
			<td style="width:145px;">Lonza</td>
			<td style="width:145px;">AAD-1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Penicillin / Streptomycin / L-glutamine (100&#215;)</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:145px;">G1146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)</td>
			<td style="width:145px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:145px;">BP685</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:320px;">Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium (RPMI 1640)</td>
			<td style="width:145px;">PAA</td>
			<td style="width:145px;">E15-840</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">siRNA / plasmid</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Sodium pyruvate (100 mM)</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:145px;">S8636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">THP-1 human leukemia monocytes</td>
			<td style="width:145px;">CLS</td>
			<td style="width:145px;">300356</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Tissue culture flasks (75 cm&#178;; 150 cm&#178;)</td>
			<td style="width:145px;">TPP</td>
			<td style="width:145px;">TPP90076/TPP90151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Tissue culture plates (6-well; 12-well)</td>
			<td style="width:145px;">TPP</td>
			<td style="width:145px;">TPP92406/TPP92012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Tubes (1.5 ml)</td>
			<td style="width:145px;">StarLab</td>
			<td style="width:145px;">S 1615-5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:320px;">Water (nuclease-free) or appropriate siRNA/plasmid buffer</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">X-Vivo 20 with Gentamycin</td>
			<td style="width:145px;">Lonza</td>
			<td style="width:145px;">BE04-448Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:145px;">M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

highly efficient transfection of human thp-1 macrophages by nucleofection

I macrofagi, come i giocatori chiave della risposta immunitaria innata, sono al centro della ricerca che fare con l&#39;omeostasi tissutale o varie patologie. Trasfezione con siRNA e il DNA plasmidico è uno strumento efficace per studiare la loro funzione, ma trasfezione di macrofagi non è cosa da poco. Anche se molti approcci diversi per la trasfezione di cellule eucariotiche sono disponibili, solo alcuni permettono trasfezione affidabile ed efficiente dei macrofagi, ma ridotto la vitalità delle cellule e il comportamento delle cellule gravemente alterato come capacità diminuita di differenziazione o polarizzazione sono frequentemente osservati. Pertanto un protocollo di trasfezione è necessario che sia in grado di trasferire siRNA e DNA plasmidico in macrofagi senza causare gravi effetti collaterali permettendo così l&#39;indagine dell&#39;effetto del siRNA o plasmide nel contesto del comportamento delle cellule normali. Il protocollo qui presentato fornisce un metodo affidabile ed efficiente per la trasfezione umani THP-1 macrofagi e monocytes con la vitalità delle cellule elevata, ad alta efficienza di trasfezione, e effetti minimi sul comportamento delle cellule. Questo approccio si basa sulla Nucleofection e il protocollo è stato ottimizzato per mantenere la massima capacità di attivazione delle cellule dopo la trasfezione. Il protocollo è adeguata per cellule aderenti dopo distacco così come le cellule in sospensione, e può essere utilizzato per piccole e medie numeri di esempio. Pertanto, il metodo presentato è utile per studiare gene effetti regolatori durante il differenziamento macrofagi e polarizzazione. Oltre a presentare i risultati che caratterizzano macrofagi trasfettate in base a questo protocollo rispetto ad un metodo chimico alternativo, l&#39;impatto della coltura cellulare selezione medio dopo la trasfezione sul comportamento delle cellule è anche discusso. I dati presentati indicano l&#39;importanza di convalidare la selezione di diverse impostazioni sperimentali.

Usando questo protocollo per la trasfezione di THP-1 macrofagi con siRNA di solito raggiungere tassi di trasfezione di sopra del 90%, senza una significativa riduzione della vitalità cellulare. Figura 1 mostra i dati rappresentativi che caratterizzano lo stato delle celle 24 ore dopo la trasfezione con fluorescente siRNA contro un untransfected controllo, che non sono stati trattati con reagenti nucleofection e impulsi o siRNA ma ha ricevuto tutti i cambiamenti della cultura dei media come campioni trasfettati. Nella Figura 1A la morfologia cellulare è mostrato secondo la misura citometria a flusso. Immagini microscopiche sono illustrati nella Figura 1B figure 1C e 1D rappresentano i tassi bassi per apoptosi (controllo: 1,5%; Nucleofection: 5,4%). E necrosi (controllo: 2,0%; Nucleofection: 3,2%) che indicano la vitalità delle cellule inalterati. Necrosi e apoptosi sono leggermente superiori per il campione transfettate come trasfettate THP-1 macrofagi sono piùdifficile da staccare di cellule untransfected, quindi la probabilità di danno cellulare durante il distacco aumenta. Infine efficienza di trasfezione è presentato in Figura 1E. Come l&#39;intera popolazione transfettate è spostata contro il controllo, significa che tutte le cellule sono transfettate che è confermato da immagini microscopiche di fluorescenza (Figura 2b). Sia il flusso dei dati di citometria così come le immagini microscopiche di fluorescenza indicano che tutte le cellule sono costantemente trasfettate con distribuzione omogenea dei siRNA tra cellule così come all&#39;interno delle cellule. Questo è in contrasto con molti reagenti di trasfezione chimici, per le figure di confronto 2A e 2B mostrano i rispettivi dati di citometria a flusso e fluorescenza immagini microscopiche per un agente chimico trasfezione utilizzando un approccio basato lipidica. Queste cifre dimostrano che due popolazioni distinte di cellule transfettate possono essere rilevati. La prima frazione è simile alle cellule trasfettate folloala Nucleofection. Sono caratterizzati da bassa fluorescenza complessiva e distribuzione omogenea dei siRNA all&#39;interno delle cellule. La seconda popolazione è caratterizzata da una fluorescenza più intensa che proviene da molto luminose agglomerati intracellulari di siRNA. La morfologia cellulare rimane invariato per entrambi i metodi di trasfezione come dimostrato dal contrasto di interferenza differenziale nella Figura 2C. Transfezioni resa in DNA plasmidico efficacemente risultati analoghi, per gli esempi si rimanda al Robenek et al. (2009) 9 o Xie et al. (2006) 7. La scelta del mezzo di coltura cellulare dopo trasfezione è di grande rilevanza; quindi diversi terreni di coltura di cellule sono stati testati in confronto. I media selezionati sono tutti adatti per la coltivazione di cellule THP-1 e sono stati scelti in base alle raccomandazioni della Lonza i media applicabile per la post-Nucleofection coltivazione. Figura 3 rappresenta il mediat siRNAEd knockdown efficienza utilizzando un siRNA diretto contro IL10RB (interleuchina 10 recettore catena β) mRNA. Per tutti i supporti esaminati l&#39;espressione di IL10RB era significativamente ridotto a circa il 10 al 20% del livello di controllo (Figura 3). Tuttavia le cellule trasfettate variano a seconda del terreno di coltura nel loro potenziale di polarizzazione. THP-1 macrofagi trasfettate sia con siRNA di controllo non specifica o IL10RB-specifici siRNA sono state coltivate in diversi media dopo la transfezione e trattati con IL10. Successivamente i livelli di espressione del gene IL10 SOCS3-indotta (soppressore di segnalazione citochine 3) a livello di mRNA sono stati misurati mediante RT-qPCR. Differenze tra coltura verificano per quanto riguarda l&#39;entità della induzione dell&#39;espressione dell&#39;mRNA SOCS3 (figura 4), ​​le induzioni per ciascuno dei mezzi testati mouse T cellulare Nucleofector Piano, LGM3, X-VIVO 20 e IMDM erano 19,5 [17,7-21,5 ], 11.5 [8,5-15,7], 8.0 [4,6-14,2] e 7,2 [5,6-9,5] volte, rispettivamente. Ilapplicazione refore del mouse T cellulare Nucleofector medio è di vitale importanza. Inoltre, le differenze di effetto del knockdown di IL10RB sull&#39;espressione SOCS3 dopo il trattamento IL10 erano osservabili, i livelli di espressione di mRNA SOCS3 sono stati ridotti a 9,5 [8,8-10,3] piegare in topo T cellule Nucleofector media, 2,1 [1,1-4,1] piegano in LGM3, 4,8 [3,2-7,2] piega in X-VIVO 20 e 3,3 [2,7-3,9] piegare in IMDM. Questi valori corrispondono a riduzioni di espressione SOCS3 nei diversi media al 49%, 18%, 60% e 45%, rispettivamente. Riduzione di espressione SOCS3-IL-10 indotta dopo la trasfezione di siRNA IL10RB conferma la downregulation successo IL10RB dalla trasfezione. <img alt="Figura 1" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/51960/51960fig1highres.jpg" width="300" /> Figura 1 Caratterizzazione di trasfettate THP-1 macrofagi. Lo stato caratteristico delle cellule non è influenzato, come rivelato da microscopio ottico e citometria a flusso analisi di co untransfectedcellule ntrol contro THP-1 trasfettate macrofagi secondo il protocollo presentato. THP-1 macrofagi sono stati differenziati con 10 ng / ml PMA per 48 ore e trasfettate con fluorescente (Alexa 488) di controllo non specifico siRNA. 24 ore dopo la trasfezione o sono state scattate le immagini di cellule vive (B), o le cellule sono state staccate dal Accutase trattamento I e analizzate mediante citometria di flusso (A). L&#39;apoptosi e necrosi colorazione è stata eseguita utilizzando annessina V-ficoeritrina (PE) (C) e 7-aminoactinomycin (7-AAD) (D). Efficienza di trasfezione (E) è stata determinata mediante citometria di flusso utilizzando la fluorescenza etichetta attaccata al siRNA. Il segnale di fluorescenza delle cellule trasfettate (nero) viene mostrata contro il segnale di controllo (grigio). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51960/51960fig1highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 2" fo:content-width src = &quot;4in&quot; = &quot;/ files / ftp_upload / 51960 / 51960fig2highres.jpg&quot; width = &quot;400&quot; /&gt; Figura 2 Confronto della distribuzione intracellulare di siRNA dopo Nucleofection contro lipofezione. THP-1 le cellule sono state differenziate per 48 ore in base a questo protocollo e quindi trasfettate mediante Nucleofection o da lipofezione. I risultati lipofezione presentati sono stati ottenuti utilizzando il kit Xtremegene siRNA secondo le raccomandazioni del costruttore con un rapporto carica di reagente siRNA di 4: 1. 24 ore dopo la trasfezione le cellule sono state sia staccato con Accutase I per l&#39;analisi di citometria di flusso o valutata microscopicamente con cellule vive. (A) efficienza di trasfezione e distribuzione di siRNA per cella all&#39;interno della popolazione è stata determinata mediante citometria a flusso utilizzando la fluorescenza etichetta attaccata al siRNA, controlli trasfettate senza siRNA sono mostrati in grigio, campioni trasfettate con siRNA sono mostrati in nero. (B) microscopia a fluorescenzaimmagini che mostrano la distribuzione intracellulare di fluorescente siRNA (Alexa Fluor 488); la barra di scala rappresenta 40 micron. (C) immagine differenziale contrasto interferenziale corrispondente all&#39;immagine di fluorescenza; la barra di scala rappresenta 40 micron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51960/51960fig2highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51960/51960fig3highres.jpg" width="500" /> Atterramento di IL10RB Figura 3 siRNA-mediata in trasfettate THP-1 macrofagi. Macrofagi THP-1 sono state trasfettate secondo il protocollo descritto. Dopo trasfezione le cellule sono state coltivate in quattro differenti mezzi di coltura, cioè Topo T cellulare Nucleofector media (A), IMDM (B), LGM3 (C), e X-VIVO 20 (D), completati come descritto nella sezione Protocollo. Cells erano o trasfettate con siRNA di controllo aspecifico (Ctrl) o IL10RB-specifici siRNA (IL10RB). Come ulteriori controlli seguenti campioni sono stati inclusi: Comando ad impulsi, vale a dire. cellule che hanno subito trasfezione in assenza di siRNA (Pulse), e un controllo del mezzo, cioè. cellule che hanno ricevuto solo le modifiche di terreni di coltura, ma rimasero altrimenti non trattati. 24 ore dopo la trasfezione le cellule sono state incubate in terreno privo di siero con o senza 50 ng / ml IL10 per ulteriori 24 ore. Espressione IL10RB è stata misurata mediante RT-qPCR; diagrammi mostrano la media di tre esperimenti indipendenti, barre di errore rappresentano l&#39;errore standard della media; * P &lt;0,05; ** P &lt;0.01; *** P &lt;0.001 vs Ctrl. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51960/51960fig3highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51960/51960fig4highres.jpg" width= &quot;500&quot; /&gt; Figura 4 regolazione IL10-dipendente di SOCS3 dopo atterramento di IL10RB in trasfettate THP-1 macrofagi. Macrofagi THP-1 sono state trasfettate secondo il protocollo descritto. Dopo trasfezione le cellule sono state coltivate in quattro diversi terreni di coltura delle cellule T mouse Nucleofector media (A), IMDM (B), LGM3 (C) e X-VIVO 20 (D) supplementato come descritto nella sezione Protocollo. Le cellule sono state trasfettate sia con il controllo non specifico siRNA (Ctrl) o IL10RB-specifici siRNA (IL10RB). Come ulteriori controlli seguenti campioni sono stati inclusi: Comando ad impulsi, cioè le cellule che hanno subito trasfezione in assenza di siNRA (Pulse), e un controllo del mezzo, vale a dire. cellule che hanno ricevuto solo le modifiche di terreni di coltura, ma rimasero altrimenti non trattati. 24 ore dopo la trasfezione le cellule sono state incubate in terreno privo di siero con o senza 50 ng / ml IL10 per ulteriori 24 ore. SOCS3 espresfissione è stata misurata mediante RT-qPCR; diagrammi mostrano la media di tre esperimenti indipendenti, barre di errore rappresentano l&#39;errore standard della media; *, # P &lt;0,05; **, ## P &lt;0.01; ***, ### P &lt;0.001 vs Ctrl e contro Ctrl + IL-10, rispettivamente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51960/51960fig4highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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Highly Efficient Transfection of Human THP-1 Macrophages by Nucleofection

Questo protocollo rappresenta un metodo efficiente e affidabile per transfettare umani THP-1 macrofagi con siRNA o il DNA plasmidico mediante elettroporazione con alta efficienza di trasfezione, pur mantenendo alta la vitalità delle cellule e la piena capacità dei macrofagi per la differenziazione e la polarizzazione.

Trasfezione altamente efficiente di umani THP-1 da macrofagi Nucleofection

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. ...

highly-efficient-transfection-human-thp-1-macrophages

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

46.2K Views.  Friedrich Schiller University Jena.  Questo protocollo rappresenta un metodo efficiente e affidabile per transfettare umani THP-1 macrofagi con siRNA o il DNA plasmidico mediante elettroporazione con alta efficienza di trasfezione, pur mantenendo alta la vitalità delle cellule e la piena capacità dei macrofagi per la differenziazione e la polarizzazione. 

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A Simple and Efficient Method to Isolate Macrophages from Mixed Primary Cultures of Adult Liver Cells

Kupffer cells are liver-specific resident macrophages and play an important role in the physiological and pathological functions of the liver1-3. Although the isolation methods of liver macrophages have been well-described4-6, most of these methods require sophisticated equipment, such as a centrifugal elutriator and technical skills. Here, we provide a novel method to obtain liver macrophages in sufficient number and purity from mixed primary cultures of adult rat liver cells, as schematically illustrated in Figure 1.
After dissociation of the liver cells by two-step perfusion method7,8,a fraction mostly composed of parenchymal hepatocytes is prepared and seeded into T75 tissue culture flasks with culture medium composed of DMEM and 10% FCS.Parenchymal hepatocytes lose the epithelial cell morphology within a few days in culture, degenerate or transform into fibroblast-like cells (Figure 2). As the culture proceeds, around day 6, phase contrast-bright, round macrophage-like cells start to proliferate on the fibroblastic cell sheet (Figure 2). The growth of the macrophage-like cells continue and reach to maximum levels around day 12, covering the cell sheet on the flask surface. By shaking of the culture flasks, macrophages are readily suspended into the culture medium. Subsequent transfer and short incubation in plastic dishes result in selective adhesion of macrophages(Figure 3), where as other contaminating cells remain suspended. After several rinses with PBS, attached macrophages are harvested. More than 106 cells can be harvested repeatedly from the same T75 tissue culture flask at two to three day intervals for more than two weeks(Figure 3).The purities of the isolated macrophages were 95 to 99%, as evaluated by flow cytometry or immunocytochemistry with rat macrophage-specific antibodies (Figure 4).The isolated cells show active phagocytosis of polystylene beads (Figure 5), proliferative response to recombinant GM-CSF, secretion of inflammatory/anti-inflammatory cytokines upon stimulation with LPS, and formation of multinucleated giant cells9.
In conclusion, we provide a simple and efficient method to obtain liver macrophages in sufficient number and purity without complex equipment and skills.This method might be applicable to other mammalian species.

A novel method to obtain macrophages from primary culture of rat liver cells is described. This method utilizes the proliferation of macrophages in the culture, followed by shaking of culture flasks and purification by selective attachment to plastic dishes. This technique efficiently provides liver macrophages without complex equipment and skills.

Un metodo semplice ed efficace per isolare i macrofagi da Mixed colture primarie di cellule del fegato degli adulti

Kupffer cells are liver-specific resident macrophages and play an important role in the physiological and pathological functions of the liver1-3. Although ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Optimized Protocol for Efficient Transfection of Dendritic Cells without Cell Maturation

Dendritic cells (DCs) can be considered sentinels of the immune system which play a critical role in its initiation and response to infection1. Detection of pathogenic antigen by na&iuml;ve DCs is through pattern recognition receptors (PRRs) which are able to recognize specific conserved structures referred to as pathogen-associated molecular patterns (PAMPS). Detection of PAMPs by DCs triggers an intracellular signaling cascade resulting in their activation and transformation to mature DCs. This process is typically characterized by production of type 1 interferon along with other proinflammatory cytokines, upregulation of cell surface markers such as MHCII and CD86 and migration of the mature DC to draining lymph nodes, where interaction with T cells initiates the adaptive immune response2,3. Thus, DCs link the innate and adaptive immune systems. 
The ability to dissect the molecular networks underlying DC response to various pathogens is crucial to a better understanding of the regulation of these signaling pathways and their induced genes. It should also help facilitate the development of DC-based vaccines against infectious diseases and tumors. However, this line of research has been severely impeded by the difficulty of transfecting primary DCs4.
Virus transduction methods, such as the lentiviral system, are typically used, but carry many limitations such as complexity and bio-hazardous risk (with the associated costs)5,6,7,8. Additionally, the delivery of viral gene products increases the immunogenicity of those transduced DCs9,10,11,12. Electroporation has been used with mixed results13,14,15, but we are the first to report the use of a high-throughput transfection protocol and conclusively demonstrate its utility.
In this report we summarize an optimized commercial protocol for high-throughput transfection of human primary DCs, with limited cell toxicity and an absence of DC maturation16. Transfection efficiency (of GFP plasmid) and cell viability were more than 50% and 70% respectively. FACS analysis established the absence of increase in expression of the maturation markers CD86 and MHCII in transfected cells, while qRT-PCR demonstrated no upregulation of IFN&beta;. Using this electroporation protocol, we provide evidence for successful transfection of DCs with siRNA and effective knock down of targeted gene RIG-I, a key viral recognition receptor16,17, at both the mRNA and protein levels.

We present our optimized high-throughput nucleofection protocol as an efficient way of transfecting primary human monocyte-derived dendritic cells with either plasmid DNA or siRNA without causing cell maturation. We further provide evidence for successful siRNA silencing of targeted gene RIG-I at both the mRNA and protein levels.

Protocollo ottimizzato per Transfection efficiente delle cellule dendritiche, senza la maturazione delle cellule

Dendritic cells (DCs) can be considered sentinels of the immune system which play a critical role in its initiation and response to infection1. Detection ...

A Simple and Efficient Method to Detect Nuclear Factor Activation in Human Neutrophils by Flow Cytometry

Neutrophils are the most abundant leukocytes in peripheral blood. These cells are the first to appear at sites of inflammation and infection, thus becoming the first line of defense against invading microorganisms. Neutrophils possess important antimicrobial functions such as phagocytosis, release of lytic enzymes, and production of reactive oxygen species. In addition to these important defense functions, neutrophils perform other tasks in response to infection such as production of proinflammatory cytokines and inhibition of apoptosis. Cytokines recruit other leukocytes that help clear the infection, and inhibition of apoptosis allows the neutrophil to live longer at the site of infection. These functions are regulated at the level of transcription. However, because neutrophils are short-lived cells, the study of transcriptionally regulated responses in these cells cannot be performed with conventional reporter gene methods since there are no efficient techniques for neutrophil transfection. Here, we present a simple and efficient method that allows detection and quantification of nuclear factors in isolated and immunolabeled nuclei by flow cytometry. We describe techniques to isolate pure neutrophils from human peripheral blood, stimulate these cells with anti-receptor antibodies, isolate and immunolabel nuclei, and analyze nuclei by flow cytometry. The method has been successfully used to detect NF-&kappa;B and Elk-1 nuclear factors in nuclei from neutrophils and other cell types. Thus, this method represents an option for analyzing activation of transcription factors in isolated nuclei from a variety of cell types.

Neutrophils are the most abundant leukocytes in blood. Neutrophils possess transcriptionally regulated functions such as production of proinflammatory cytokines and inhibition of apoptosis. These functions can be studied with the method presented here, which allows detection and quantification of nuclear factors by flow cytometry in isolated nuclei

Un metodo semplice ed efficace per rilevare l&#39;attivazione del Fattore Nucleare in neutrofili umani mediante citometria a flusso

Neutrophils  are the most abundant leukocytes in peripheral blood. These cells are the first  to appear at sites of inflammation and infection, thus ...

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable alternative to animal model systems for the study of a specific step of microbial pathogen infection. A human monocytic cell line THP-1 which, upon phorbol ester treatment, is differentiated into macrophages, has previously been used to study virulence strategies of many intracellular pathogens including Mycobacterium tuberculosis. Here, we discuss a protocol to enact an in vitro cell culture model system using THP-1 macrophages to delineate the interaction of an opportunistic human yeast pathogen Candida glabrata with host phagocytic cells. This model system is simple, fast, amenable to high-throughput mutant screens, and requires no sophisticated equipment. A typical THP-1 macrophage infection experiment takes approximately 24 hr with an additional 24-48 hr to allow recovered intracellular yeast to grow on rich medium for colony forming unit-based viability analysis. Like other in vitro model systems, a possible limitation of this approach is difficulty in extrapolating the results obtained to a highly complex immune cell circuitry existing in the human host. However, despite this, the current protocol is very useful to elucidate the strategies that a fungal pathogen may employ to evade/counteract antimicrobial response and survive, adapt, and proliferate in the nutrient-poor environment of host immune cells.

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

The current article outlines a protocol to establish an in vitro cell culture model system to study the interaction of a facultative intracellular human fungal pathogen Candida glabrata with human macrophages which will be a useful tool to advance our knowledge of fungal virulence mechanisms.

Istituzione di un<em&gt; In vitro</em&gt; Sistema per studiare intracellulare Comportamento<em&gt; Candida glabrata</em&gt; In umani THP-1 macrofagi

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

Isolation of Human Monocytes by Double Gradient Centrifugation and Their Differentiation to Macrophages in Teflon-coated Cell Culture Bags

Human macrophages are involved in a plethora of pathologic processes ranging from infectious diseases to cancer. Thus they pose a valuable tool to understand the underlying mechanisms of these diseases. We therefore present a straightforward protocol for the isolation of human monocytes from buffy coats, followed by a differentiation procedure which results in high macrophage yields. The technique relies mostly on commonly available lab equipment and thus provides a cost and time effective way to obtain large quantities of human macrophages. Briefly, buffy coats from healthy blood donors are subjected to a double density gradient centrifugation to harvest monocytes from the peripheral blood. These monocytes are then cultured in fluorinated ethylene propylene (FEP) Teflon-coated cell culture bags in the presence of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF). The differentiated macrophages can be easily harvested and used for subsequent studies and functional assays. Important methods for quality control and validation of the isolation and differentiation steps will be highlighted within the protocol. In summary, the protocol described here enables scientists to routinely and reproducibly isolate human macrophages without the need for cost intensive tools. Furthermore, disease models can be studied in a syngeneic human system circumventing the use of murine macrophages.

We present a simple and efficient protocol for the generation of human macrophages. Buffy coats are processed by double density gradient centrifugation and isolated monocytes are then differentiated to macrophages in Teflon-coated cell culture bags. This maximizes macrophage yields and facilitates cell harvesting for subsequent experiments.

Isolamento di monociti umani con un doppio centrifugazione in gradiente e la loro differenziazione a macrofagi in coltura cellulare Borse teflonato

Human macrophages are involved in a plethora of pathologic processes ranging from infectious diseases to cancer. Thus they pose a valuable tool to ...

Proteomic Profiling of Macrophages by 2D Electrophoresis

The goal of the two-dimensional (2D) electrophoresis protocol described here is to show how to analyse the phenotype of human cultured macrophages. The key role of macrophages has been shown in various pathological disorders such as inflammatory, immunological, and infectious diseases. In this protocol, we use primary cultures of human monocyte-derived macrophages that can be differentiated into the M1 (pro-inflammatory) or the M2 (anti-inflammatory) phenotype. This in vitro model is reliable for studying the biological activities of M1 and M2 macrophages and also for a proteomic approach. Proteomic techniques are useful for comparing the phenotype and behaviour of M1 and M2 macrophages during host pathogenicity. 2D gel electrophoresis is a powerful proteomic technique for mapping large numbers of proteins or polypeptides simultaneously. We describe the protocol of 2D electrophoresis using fluorescent dyes, named 2D Differential Gel Electrophoresis (DIGE). The M1 and M2 macrophages proteins are labelled with cyanine dyes before separation by isoelectric focusing, according to their isoelectric point in the first dimension, and their molecular mass, in the second dimension. Separated protein or polypeptidic spots are then used to detect differences in protein or polypeptide expression levels. The proteomic approaches described here allows the investigation of the macrophage protein changes associated with various disorders like host pathogenicity or microbial toxins.

Macrophages are the key cells involved in host pathogenicity. Macrophages display phenotypic and functional diversity that can be analysed and detected by proteomic analysis. This article describes how to perform 2D electrophoresis of primary cultures of human macrophages differentiated into M1 or M2 phenotype.

Proteomica Profiling dei macrofagi da 2D elettroforesi

The goal of the two-dimensional (2D) electrophoresis protocol described here is to show how to analyse the phenotype of human cultured macrophages. The ...

Phenotypic Characterization of Macrophages from Rat Kidney by Flow Cytometry

There is increasing evidence suggesting the important role of inflammation and, subsequently, macrophages in the development and progression of renal disease. Macrophages are heterogeneous cells that have been implicated in kidney injury. Macrophages may be classified into two different phenotypes: classically activated macrophages (M1 macrophages), that release pro-inflammatory cytokines and promote fibrosis; and alternatively activated macrophages (M2 macrophages) that are associated with immunoregulatory and tissue-remodeling functions. These macrophage phenotypes need to be discriminated and analyzed to determine their contribution to renal injury. However, there are scarce studies reporting consistent phenotypic and functional information about macrophage subtypes in inflammatory renal disease models, especially in rats. This fact may be related to the limited macrophage markers used in rats, contrary to mice. Therefore, novel strategies are necessary to quantify and characterize the renal content of these infiltrating cells in a reliable way. This manuscript details a protocol for kidney digestion and further phenotypic and quantitative analysis of macrophages from rat kidneys by flow cytometry. Briefly, kidneys were incubated with collagenase and total macrophages were identified according to the dual presence of CD45 (leukocytes common antigen) and CD68 (PAN macrophage marker) in live cells.This was followed by surface staining of CD86 (M1 marker) and CD163 (M2 marker). Rat peritoneal macrophages were used as positive control for macrophage marker detection by flow cytometry. Our protocol resulted in low cellular mortality and allowed characterization of different intracellular and surface protein markers, thus limiting the loss of cellular integrity observed in other protocols. Moreover, this procedure allows the use of macrophages for further techniques, including cell sorting and mRNA or protein expression studies, among others.

This manuscript describes a detailed protocol for phenotypic and quantitative analysis of resident macrophages from rat kidneys by flow cytometry. The resulting stained cells can be also used for other applications, including cell sorting, gene expression analysis or functional studies, thus increasing the information obtained in the experimental model.

Caratterizzazione fenotipica dei macrofagi dal rene di ratto mediante citometria di flusso

There is increasing evidence suggesting the important role of inflammation and, subsequently, macrophages in the development and progression of renal ...

Small RNA Transfection in Primary Human Th17 Cells by Next Generation Electroporation

CD4+ T cells can differentiate into several subsets of effector T helper cells depending on the surrounding cytokine milieu. Th17 cells can be generated from na&#239;ve CD4+ T cells in vitro by activating them in the presence of the polarizing cytokines IL-1&#946;, IL-6, IL-23, and TGF&#946;. Th17 cells orchestrate immunity against extracellular bacteria and fungi, but their aberrant activity has also been associated with several autoimmune and inflammatory diseases. Th17 cells are identified by the chemokine receptor CCR6 and defined by their master transcription factor, ROR&#947;t, and characteristic effector cytokine, IL-17A. Optimized culture conditions for Th17 cell differentiation facilitate mechanistic studies of human T cell biology in a controlled environment. They also provide a setting for studying the importance of specific genes and gene expression programs through RNA interference or the introduction of microRNA (miRNA) mimics or inhibitors. This protocol provides an easy to use, reproducible, and highly efficient method for transient transfection of differentiating primary human Th17 cells with small RNAs using a next generation electroporation device.

Next generation electroporation is an efficient method for transfecting human Th17 cells with small RNAs to alter gene expression and cell behavior.

Piccolo RNA trasfezione in cellule primarie Th17 Human Next Generation elettroporazione

CD4+ T cells can differentiate into several subsets of effector T helper cells depending on the surrounding cytokine milieu. Th17 cells can be generated ...

Time-lapse 3D Imaging of Phagocytosis by Mouse Macrophages

Phagocytosis plays a key role in host defense, as well as in tissue development and maintenance, and involves rapid, receptor-mediated rearrangements of the actin cytoskeleton to capture, envelop and engulf large particles. Although phagocytic receptors, downstream signaling pathways, and effectors, such as Rho GTPases, have been identified, the dynamic cytoskeletal remodeling of specific receptor-mediated phagocytic events remain unclear. Four decades ago, two distinct mechanisms of phagocytosis, exemplified by Fc&#947; receptor (Fc&#947;R)- and complement receptor (CR)-mediated phagocytosis, were identified using scanning electron microscopy. Binding of immunoglobulin G (IgG)-opsonized particles to Fc&#947;Rs triggers the protrusion of thin membrane extensions, which initially form a so-called phagocytic cup around the particle before it becomes completely enclosed and retracted into the cell. In contrast, complement opsonized particles appear to sink into the phagocyte following binding to complement receptors. These two modes of phagocytosis, phagocytic cup formation and sinking in, have become well established in the literature. However, the distinctions between the two modes have become blurred by reports that complement receptor-mediated phagocytosis may induce various membrane protrusions. With the availability of high resolution imaging techniques, phagocytosis assays are required that allow real-time 3D (three dimensional) visualization of how specific phagocytic receptors mediate the uptake of individual particles. More commonly used approaches for the study of phagocytosis, such as end-point assays, miss the opportunity to understand what is happening at the interface of particles and phagocytes. Here we describe phagocytic assays, using time-lapse spinning disk confocal microscopy, that allow 3D imaging of single phagocytic events. In addition, we describe assays to unambiguously image Fc&#947; receptor- or complement receptor-mediated phagocytosis.

Here we describe methods using spinning disk confocal microscopy to image single phagocytic events by mouse resident peritoneal macrophages. The protocols can be extended to other phagocytic cells.

Time-lapse Imaging 3D della fagocitosi dai macrofagi del topo

Phagocytosis plays a key role in host defense, as well as in tissue development and maintenance, and involves rapid, receptor-mediated rearrangements of ...

Experimental Analysis of Apoptotic Thymocyte Engulfment by Macrophages

Cell apoptosis is a natural process and plays a critical role in embryonic development, homeostatic regulation, immune tolerance induction, and resolution of inflammation. Accumulation of apoptotic debris in the body may trigger chronic inflammatory responses that lead to systemic autoimmune diseases over time. Impaired apoptotic cell clearance has been implicated in a variety of autoimmune diseases. Apoptotic clearance is a complex process rarely detected under physiological conditions. It involves abundant surface receptors and signaling molecules. Studying the process of apoptotic cell clearance provides insightful molecular mechanisms and subsequent biological responses, which may lead to the development of new therapeutics. Here, we describe protocols for the induction of apoptotic thymocytes, the preparation of peritoneal macrophages, and the analysis of apoptotic cell clearance by flow cytometry and microscopy. All cells will undergo apoptosis at a certain stage, and many residential and circulating cells can uptake apoptotic debris. Therefore, the protocol described here can be used in many applications to characterize apoptotic cell binding and ingestion by many other cell types.

Here, we present a protocol to prepare apoptotic thymocytes and peritoneal macrophages and analyze the efficiency of efferocytosis and the specific inhibitor-mediated blocking of apoptotic thymocytes engulfment. This protocol has a broad application in cell-mediated clearance of other particles including artificial beads and bacteria.

Analisi sperimentale di apoptotic thymocyte engulfment da macrofagi

Cell apoptosis is a natural process and plays a critical role in embryonic development, homeostatic regulation, immune tolerance induction, and resolution ...