Questo lavoro è stato sostenuto da Agence Nationale de la Recherche (Jeunes Chercheuses / Jeunes Chercheurs a EFN), Fondation Voir et Entendre e Fondation Bettencourt Schueller (Young Investigator Grants a EFN), Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS, posizione permanente per EFN) , e il National Eye Institute dei National Institutes of Health (R01-EY13295 a SCF). Inoltre, l&#39;Institut de la Vision è finanziato dal Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, Université Pierre et Marie Curie di Parigi-6, Centre National de la Recherche Scientifique e attrezzature de Paris.

Questo esperimento di isolamento POS richiede tempo e può richiedere fino a 12 ore per completare se POS sono etichettati prima di riporlo. Il protocollo è stato adattato da un documento pubblicato da RS Molday e colleghi nel 1987 31 e modificato da SC Finnemann e colleghi nel 1997 10. Gli animali sono stati trattati secondo l&#39;Associazione per la Ricerca e la Visione e Ophthalmology (ARVO) Dichiarazione per l&#39;uso di animali in Oftalmica e Vision Research. Protocolli sono stati esaminati e approvati dal Comitato Etico Charles Darwin dell&#39;Università Pierre e Marie Curie di Parigi-06 e la Istituzionale Animal Care and Use Committee Fordham University. 1. Generale Set Up <ol><li> Ottenere 80 fresche di maiale o vacca occhi fresco come appena dopo la macellazione possibile e tenerli freddo al buio. Fornire istruzioni al provider così l&#39;azienda procede nello stesso modo. Questo protocollo è ottimizzato per 80 occhi. Aprocedere con più occhi e ottenere scorte più grandi (ad esempio, dal 160 occhi), il doppio della quantità di soluzione ed effettuare 2 giri di ultracentrifugazione; campioni piscina più tardi nella fase di raccolta (vedi punto 2.2.2). </li><li> Impostare sulla panchina della lampada luce di sicurezza rossa, tamponi assorbenti, salviette (tavolo Materials). Preparare 15 centimetri piatti e sacchetti per la raccolta dei rifiuti a rischio biologico (parti dell&#39;occhio inutilizzato, vetrose ...). Indossare aderente labcoat, guanti, protezioni maniche e occhiali. </li><li> Precauzioni: <ol><li> Pre-raffreddare tutte le soluzioni poi tenerli freddo durante tutte le fasi. Mantenere occhi e gradienti raffreddata su ghiaccio per quanto possibile. </li><li> Mantenere occhi e tessuti derivati ​​nel buio più possibile fino alla fase di raccolta dopo l&#39;ultracentrifugazione per evitare photobleaching di pigmenti visivi e della perdita del colore rosa-arancio della forma attiva della fotopigmenti. </li></ol></li></ol> 2. Protocollo Azioni <ol><li> Preparare soluzioni e gradienti: <ol><li> Taurina Thaw magazzino completamente con un bagno d&#39;acqua a 37 ° C. </li><li> Preparare tutte le soluzioni di soluzioni madre (Tabella 1, soluzioni di archivio) e mescolare bene il saccarosio con altri ingredienti con un agitatore magnetico per ogni soluzione. <ol><li> Preparare 15 ml della soluzione di omogeneizzazione ad una concentrazione finale del 20% di saccarosio, 20 mM Tris pH7.2 acetato, 2 mM MgCl 2, 10 mM glucosio e taurina 5 mM. </li><li> Preparare la soluzione di saccarosio al 25% ad una concentrazione finale del 25% di saccarosio (utilizzando 70% stock saccarosio), 20 mM tris acetato pH 7,2, glucosio 10 mM e taurina 5 mM. </li><li> Preparare la soluzione di saccarosio al 60% ad una concentrazione finale del 60% di saccarosio (utilizzando polvere saccarosio), 20 mM Tris pH7.2 acetato, glucosio 10 mM e taurina 5 mM. </li><li> Preparare la soluzione di lavaggio 1 per una concentrazione finale di 20 mM acetato tris pH 7,2 e 5 taurina mm. </li><li> Preparare la soluzione di lavaggio 2ad una concentrazione finale del 10% di saccarosio, 20 mM Tris acetato pH 7,2 e 5 mM taurina. </li><li> Preparare la soluzione di lavaggio 3 ad una concentrazione finale del 10% di saccarosio, 20 mM sodio fosfato pH 7,2 taurina e 5 mM. </li></ol></li><li> Fissa Il creatore gradiente su un agitatore magnetico e inserire una ancoretta nella camera vicina all&#39;uscita cui verrà inserita la soluzione al 60%. Utilizzare una cut-off punta P200 pipetta posto all&#39;uscita del tubo per ottenere la corretta velocità di colata. </li><li> Cast gradienti lineari delicatamente diluendo e agitando la soluzione di saccarosio del 60% a quello del 25% con 12 ml di ciascuna soluzione (cioè, totale 6 tubi per 80 occhi) in tubi ultracentrifuga pre-refrigerati. Mescolare bene la soluzione di saccarosio gradualmente-diluizione del 60%. Stazionario il gradiente di velocità del flusso, versando la soluzione uniformemente e non troppo veloce. NOTA: Al fine di ottenere un continuo, gradiente lineare, mantenere l&#39;apertura puntale destra alla superficie della soluzione per l&#39;intero gradiente formation. </li><li> Lasciate che i gradienti sedersi sul ghiaccio per circa 1 ora per la stabilizzazione. Tenere i gradienti refrigerate fino caricato. Non agitare le provette per evitare di disturbare il gradiente. </li></ol></li><li> Collezione Tessuto: <ol><li> Raccogliere tessuti sotto fioca luce rossa. Dai un occhio in una mano e colpire la parte anteriore con bordo di lama di rasoio tenendo l&#39;occhio lontano (per evitare spruzzi; Figura 1). Utilizzare la lama di rasoio per tagliare il bulbo oculare anteriore in 2 metà (cornea più di almeno 5 mm nella sclera). Rimuovere la lente e capovolgere l&#39;oculare dentro e fuori in modo che possa essere tenuto sopra la punta di un dito esponendo così la retina. </li><li> Utilizzando la lama di rasoio in un angolo, raschiare delicatamente la retina, staccando facilmente e costituirsi strato rosata, la superficie tapetum tagliati a testa del nervo ottico (Figura 1). Raccogliere tutte le retine in 2 x 50 ml tubetti contenenti ciascuno 15 ml di soluzione di omogeneizzazione sul ghiaccio. </li><li> Homo Retinagenization: <ol><li> Agitare la sospensione vigorosamente a mano per 2 minuti per interrompere i diversi strati cellulari, rompere POS fuori dal resto della cellula PR, frammento POS e omogeneizzare la sospensione retina. </li><li> Filtro 3x attraverso un doppio strato di garza pulita per rimuovere frammenti di tessuto di grandi dimensioni e raccogliere il flusso continuo in clean 50 ml tubi (Figura 1). La sospensione della retina di essere abbastanza spessa, per massimizzare la resa, premere delicatamente sulla garza per rilasciare rimanenti tessuti frammentati dopo ogni filtrazione. </li></ol></li></ol></li><li> Fotorecettore esterno frammento segmento (POS) isolamento: <ol><li> Adagiare la retina preparazione greggio, intorno 6-7 ml per provetta, oltre 6 x 30 ml tubi ultracentrifuga ciascuno contenente 24 ml di fresche refrigerate continua 25 - 60% di saccarosio gradiente (Figura 1). Bilanciare i tubi opposte come appropriato per essere utilizzato il rotore. Ultracentrifuga a 106.000 xg per 50 min a 4 ° C. </li&gt; <li> Rimuovere la maggior parte della soluzione sopra la banda rosa-arancio nel terzo superiore del gradiente per aspirazione (Figura 2A). Raccogliere la banda rosa-arancio con un cut-off P1000 punta in un bicchiere. Eliminare il riposo dopo neutralizzazione con candeggina (rifiuti biologici). </li><li> Diluire con ~ 4 - 5 volumi di ghiacciata Wash 1 soluzione. Separare in altrettanti tubi 30 ml come necessario. Centrifugare a 3.000 xg per 10 min a 4 ° C. Eliminare con cautela il surnatante. </li><li> Pellet Risospendere in 10 ml di Wash 2 soluzione e far girare a 3000 g per 10 minuti come descritto sopra. Risospendere pellet in 15 ml Lavare 3 e girano di nuovo a 3000 xg per 10 min. Combina le sospensioni da diverse pellet per ridurre il numero di tubi necessari prima della centrifugazione in Wash 2 e lavare 3 soluzioni. </li></ol></li><li> POS aliquotando senza etichettatura: <ol><li> Risospendere POS in 10-20 ml DMEM. Prediluito 10 ml in 490 microlitri DMEM (1:50) e contano allungata così come POS turbinava in uncamera di conteggio delle cellule (Figura 2B). Calcola la resa e la concentrazione in particelle POS per mL. NOTA: La resa varia a seconda principalmente dall&#39;età e ceppo di suini / mucche e dimensioni degli occhi, per esempio, una buona preparazione varia da 5 - occhi 8 x 10 9 POS da 80 suini. </li><li> Stabilire volume finale DMEM (tipicamente 10 - 20 ml) e aggiungere saccarosio per ottenere una concentrazione finale di 2,5% di saccarosio. </li><li> Preparare aliquote della dimensione desiderata, ad esempio, 5 x 10 7 POS per provetta per un volume risospensione 2 ml per un esperimento a 96 pozzetti a 40 microlitri / pozzetto. Spin 1 aliquota per 5 min a 2300 xg a temperatura ambiente e valutare le dimensioni del pellet. Preparare varie dimensioni aliquote per i diversi volumi di applicazione come POS non deve essere congelato e scongelato due volte. </li><li> Congelare aliquote POS a -80 ° C fino a nuovo uso. NOTA: Aliquote sono stabili per molti mesi. Nelle nostre mani, senza etichetta o con etichetta POS può essere conservato per almeno un anno. </li></ol></li><li> Etichettatura POS e in aliquote: NOTA: Usiamo tipicamente FITC etichettare POS per la quantificazione dei test di fagocitosi, ma altri coloranti possono essere utilizzati come pure a seconda delle esigenze. <ol><li> Risospendere 1 10 mg FITC flaconcino a 2,5 mg / ml in concentrazione 0,1 M Na tampone carbonato pH 9,5 mescolando 2,6 ml 0,1 M NaHCO3 pH 8,4 con 1,4 ml di 0,1 M Na 2 CO 3 pH 11,5 (Tabella 2, Soluzioni di riserva). Ruotare per 1 ora a temperatura ambiente, proteggendo dalla luce e girare per 5 minuti alla massima velocità per far sedimentare i solidi FITC non risospese. </li><li> Risospendere il pellet POS in 10 ml di soluzione di lavaggio 3 (o DMEM) e aggiungere 2 ml di soluzione FITC per 80 occhi. Conservare rimasto FITC congelato a -80 ° C. Ruotare per almeno 1,5 ore a temperatura ambiente. Proteggere dalla luce utilizzando un foglio di alluminio. </li><li> Lavare POS etichettato due volte con soluzione di lavaggio 3 come descritto nel paragrafo 2.3.4, quindi una o due volte in DMEM fino quasi nessun FITC gratuito è visto nel surnatante fraction. Risospendere POS in DMEM e procedere come per il POS senza etichetta per il conteggio e la suddivisione in aliquote (sezione 2.4). </li></ol></li><li> Utilizzando POS in esperimenti: <ol><li> POS Scongelare a temperatura ambiente, e tenerli all&#39;oscuro il più possibile se sono fluorescenza etichettati. Spin per 5 min a 2300 xga RT. Aspirare il surnatante. </li><li> Subito risospendere in volume appropriato di soluzione di dosaggio come dettato dall&#39;esperimento. In caso di diversi momenti della sfida POS, negozio risospeso POS a RT al buio tra i punti temporali per diverse ore. </li></ol></li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interest.

Tre passaggi o condizioni sono cruciali per la purificazione ottimale: qualità del gradiente di colata e delicata manipolazione tubi gradiente, mantenendo tessuti refrigerati e al buio fino alla fase di raccolta, la forza di scuotimento di omogenati retina per ottenere il corretto isolamento POS dal resto del PR cell. Se alcuni problemi sorgono nel vedere il gruppo arancione correttamente, sono molto probabilmente a causa di uno dei tre motivi di cui sopra (si veda anche il secondo paragrafo della sezione Risul...

Nella retina, la visione viene attivato per isomerizzazione di molecole fotosensibili denominate opsine, prima di essere trasformato in un segnale che può essere trasmesso tra i neuroni fino alle aree visive del cervello. Queste molecole sono incorporati in pile di dischi membranose simili a frittelle che costituiscono le porzioni segmento esterno dei fotorecettori (PRS). Essere sottoposti a costante esposizione alla luce e quindi notevoli livelli di stress ossidativo, PR continuamente rinnovare i loro segmenti esterni per limitare il potenziale danno ossidativo. Segmenti esterni dei fotorecettori sono in stretto contatto con microvilli apicale delle retina epiteliali del pigmento (RPE) cellule vicine. Cellule RPE costituiscono la parte esterna della barriera emato-retinica e garantire numerosi compiti che sono cruciali per la salute e la funzione fotorecettori 1, come tempra raggi luminosi con pigmenti di melanina, ri-isomerizzazione del componente opsin fotoreattivo retina, fornendo nutrienti e gCRESCITA fattori, partecipando a disposizione PR metabolita. Inoltre, le cellule RPE eliminano spesi POS e riciclano i loro componenti, un&#39;occupazione quotidiana che è regolato dal ritmo circadiano in retina di mammifero 2,3. La clearance di capannone POS è assolutamente necessario per la sopravvivenza PR. Quando è completamente abrogato, POS detriti si accumulano e PRS degenerano causando una rapida 4,5 perdita della vista. Se il profilo ritmica viene persa e sostituita da un&#39;attività costante, PR e RPE difetti accumulano con l&#39;età 6. Pertanto, è molto importante per caratterizzare la regolazione molecolare di RPE fagocitosi in vitro per comprendere fenotipi legati al suo erettile. È interessante notare che il macchinario molecolare in cellule RPE è molto simile a quello utilizzato dai macrofagi per eliminare cellule apoptotiche ed entrambi sono determinati dal riconoscimento della fosfatidilserina esposta su detriti fagocitica 7-9. Tuttavia, le cellule RPE e macrofagi regolano phagocytosis diversamente, come macrofagi optare per l&#39;eliminazione immediata di cellule apoptotiche al momento dell&#39;incontro, mentre le cellule RPE ritmicamente inghiottire POS solo una volta al giorno, nonostante il loro contatto permanente con i segmenti esterni. Questo suggerisce specifici meccanismi di regolazione che non sono ancora pienamente compresi. Molte delle molecole implicati nel meccanismo RPE fagocitica sono stati identificati o convalidato grazie all&#39;utilizzo di POS isolata e coltura cellulare saggi fagocitosi. Il recettore alphavbeta5 integrina situata sulla superficie cellulare apicale RPE, in coordinamento con il suo ligando MFG-E8, si lega selettivamente al POS 10-12, che vengono poi interiorizzata attraverso il MerTK tirosina chinasi del recettore 13-15. Il recettore scavenger CD36 ha dimostrato di partecipare aspirazione POS ed influenzare la velocità 16,17, e potrebbe essere utilizzato come sensore di fosfolipidi ossidati in superficie POS 18. Internalizzazione deve il reclutamento di F-actina citoscheletro-assproteine ​​ociated quali annessina 2 19, miosina II 20 e miosina VIIA 21,22. Sono utilizzati anche POS Native o ossidato in vitro per capire invecchiamento fenotipi di cellule RPE in vivo legati all&#39;accumulo di mal digerito POS ossidato 23-28. La generazione di cellule RPE derivate da cellule staminali ha avviato una nuova applicazione per POS isolati che vengono utilizzati per dimostrare la funzionalità delle cellule prima di essere trapiantate in animali o pazienti 29,30,27. Prima descritto da Molday e colleghi nel 1987 31, il protocollo per l&#39;isolamento di POS bovina combina un passo ultracentrifugazione di omogenati retiniche sui continui gradienti di saccarosio con l&#39;osservazione del caratteristico aspetto arancione di greggi fotopigmento retinica (portando 11- retinica cis). Negli ultimi 10 anni, a causa di precauzioni prese, al fine di minimizzare il rischio di morbo della mucca pazza, l&#39;uso degli occhi suina è diventato sempre più dinamicongly prominente. Il protocollo qui descritto viene illustrato come ottenere grandi quantità di POS da suina o bovina occhi che possono essere aliquotati e conservati per lunghi periodi di tempo. Questo elimina la necessità di preparare POS da occhi roditore, che richiede l&#39;utilizzo di un gran numero di animali per la preparazione e il dosaggio POS 32,33,21,22. Inoltre, dettagli di etichettatura POS prima memorizzazione utilizzando molecole fluorescenti sono indicati, per quantificare e visualizzare POS in modo semplificato e comparabile per alcune applicazioni rispetto all&#39;etichettatura POS dopo la fagocitosi dosaggio 32,10. Pertanto, queste grandi scorte consentono riproducibilità e facilità d&#39;uso in molti diversi tipi di esperimenti.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="811">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:311px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:108px;">Company</td>
			<td style="width:103px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:291px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">Specific Material/Equipment</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">2-chamber gradient maker</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td>gradient maker with 30-ml chambers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">3-mm diameter silicone tubing</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td>tubing for gradient casting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">small size magnetic stir bar</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td>stir bar fitting the gradient maker chamber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">red safelight lamp</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td>inactinic lamp for dissection in the dark</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultra Clear 25x89 cm tubes</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>344058</td>
			<td>ultracentrifugation tubes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PP Oak Ridge tubes</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>3119-0050</td>
			<td>30-mL centrifugation tubes&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Optima LE-80K&#160;</td>
			<td>Beckman Coulter&#160;</td>
			<td>365668</td>
			<td>ultracentrifuge</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SW 32Ti swing rotor</td>
			<td>Beckman Coulter&#160;</td>
			<td>369694</td>
			<td>swing rotor for ultracentrifuge</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Avanti J-26 XP</td>
			<td>Beckman Coulter&#160;</td>
			<td>393124</td>
			<td>centrifuge</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">JA-25.50 rotor</td>
			<td>Beckman Coulter&#160;</td>
			<td>363058</td>
			<td>rotor for Avanti J-26 XP centrifuge</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">FITC Isomer I</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td>F-1906</td>
			<td>fluorescent dye</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">Other Material/Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;">counting chamber (such as Neubauer or Malassez)</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">dark ice buckets with lids</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">scales</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">magnetic stirrer and upholding pole</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">refrigated microcentrifuge</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">37 &#176;C water bath</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">-80 &#176;C freezer</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">Consumables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">labcoat</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td>Health and safety</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">gloves</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sleeve protectors</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">googles</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">absorbent pads</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">biohazard trash bags and bins</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;">Weck-Prep blades (60-mm/2.25-in wide razor blades)</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">15-cm plastic dish</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sterile gauze sheets</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">15- and 50-mL tubes</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td>Common consumables</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">microtubes</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">aluminum foil</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

large-scale purification of porcine or bovine photoreceptor outer segments for phagocytosis assays on retinal pigment epithelial cells

Analisi di una delle funzioni vitali epiteliale pigmentato retinico (RPE) cellule, la fagocitosi delle passate età frammenti distali dei segmenti esterni fotorecettori (POS) può essere eseguita in vitro. Fotorecettore segmenti esterni con pile di dischi membranose contenenti la macchina phototransduction vengono continuamente rinnovati nella retina. POS esausti vengono eliminati tutti i giorni dalle cellule RPE. Roditore, suina / bovini e cellule RPE umani riconoscono POS da varie specie in un modo simile. Per facilitare l&#39;esecuzione di grandi serie di esperimenti con poca variabilità, un grande magazzino di POS può essere isolato da occhi suini e conservato congelato in aliquote. Questo protocollo sfrutta la caratteristica di fotopigmenti che visualizzano un colore arancione quando tenuti all&#39;oscuro. Sotto fioca luce rossa, retine sono raccolti in un buffer da paraocchi aperte tagliate a metà. La sospensione cellulare retina viene omogeneizzata, filtrata e caricato su un gradiente di saccarosio continuo. Dopo centrifugation, POS sono situati in una banda discreta nella parte superiore della sfumatura che ha un caratteristico colore arancione. POS vengono poi raccolti, filato, risospese in sequenza in tamponi di lavaggio, contati e aliquotati. POS ottenute in questo modo possono essere utilizzati per saggi di fagocitosi ed analisi di attivazione della proteina, localizzazione o interazione in vari momenti dopo sfida POS. In alternativa, POS può essere etichettato con fluorofori, e. G., FITC, prima che si dispensa per la successiva quantificazione di fluorescenza di POS vincolanti o engulfment. Altre possibili applicazioni includono l&#39;uso di modificato POS o POS sfida combinato con condizioni di stress per studiare l&#39;effetto dello stress ossidativo o invecchiamento sulle cellule RPE.

La combinazione del gradiente di saccarosio lineare e l&#39;ultracentrifugazione permette la separazione dei vari componenti della sospensione retinica per densità. Cellule e detriti RPE grande retiniche pesanti si depositano o vicino al fondo del gradiente (Figura 2A). Accendino POS e cellule singole leggeri o detriti cellulari dalla retina migrano bande come separati per raggiungere la metà superiore del gradiente entro la fine del periodo di centrifugazione. Mantenendo gli occhi ed i campioni al bu...

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Large-Scale Purification of Porcine or Bovine Photoreceptor Outer Segments for Phagocytosis Assays on Retinal Pigment Epithelial Cells

This article describes the protocol for the purification of photoreceptor outer segment fragments (POS) via ultracentrifugation from porcine/bovine retinae using homogenization and sucrose gradient centrifugation. This protocol allows the preparation of large stocks of POS aliquots, labeled or unlabeled, that can then be stored at -80 &#176;C.

Large-Scale Purificazione di suino o bovino fotorecettore Outer Segmenti per fagocitosi saggi su cellule retiniche dell&#39;epitelio pigmentato

Analysis of one of the vital functions of retinal pigment epithelial (RPE) cells, the phagocytosis of spent aged distal fragments of photoreceptor outer ...

large-scale-purification-porcine-or-bovine-photoreceptor-outer

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.9K Views.  INSERM, U968. This article describes the protocol for the purification of photoreceptor outer segment fragments (POS) via ultracentrifugation from porcine/bovine retinae using homogenization and sucrose gradient centrifugation. This protocol allows the preparation of large stocks of POS aliquots, labeled or unlabeled, that can then be stored at -80 °C.

Video: Large-Scale Purification of Porcine or Bovine Photoreceptor Outer Segments for Phagocytosis Assays on Retinal Pigment Epithelial Cells

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed to them and occasionally to pathogens. The gut-associated lymphoid tissue (GALT) play a key role for induction of the mucosal immune response to these microbes1, 2. To initiate the mucosal immune response, the mucosal antigens must be transported from the gut lumen across the epithelial barrier into organized lymphoid follicles such as Peyer's patches. This antigen transcytosis is mediated by specialized epithelial M cells3, 4. M cells are atypical epithelial cells that actively phagocytose macromolecules and microbes. Unlike dendritic cells (DCs) and macrophages, which target antigens to lysosomes for degradation, M cells mainly transcytose the internalized antigens. This vigorous macromolecular transcytosis through M cells delivers antigen to the underlying organized lymphoid follicles and is believed to be essential for initiating antigen-specific mucosal immune responses. However, the molecular mechanisms promoting this antigen uptake by M cells are largely unknown. We have previously reported that glycoprotein 2 (Gp2), specifically expressed on the apical plasma membrane of M cells among enterocytes, serves as a transcytotic receptor for a subset of commensal and pathogenic enterobacteria, including Escherichia coli and Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium), by recognizing FimH, a component of type I pili on the bacterial outer membrane 5. Here, we present a method for the application of a mouse Peyer's patch intestinal loop assay to evaluate bacterial uptake by M cells. This method is an improved version of the mouse intestinal loop assay previously described 6, 7. The improved points are as follows: 1. Isoflurane was used as an anesthetic agent. 2. Approximately 1 cm ligated intestinal loop including Peyer's patch was set up. 3. Bacteria taken up by M cells were fluorescently labeled by fluorescence labeling reagent or by overexpressing fluorescent protein such as green fluorescent protein (GFP). 4. M cells in the follicle-associated epithelium covering Peyer's patch were detected by whole-mount immunostainig with anti Gp2 antibody. 5. Fluorescent bacterial transcytosis by M cells were observed by confocal microscopic analysis. The mouse Peyer's patch intestinal loop assay could supply the answer what kind of commensal or pathogenic bacteria transcytosed by M cells, and may lead us to understand the molecular mechanism of how to stimulate mucosal immune system through M cells.

Application of a Mouse Ligated Peyer&amp;#8217;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

M cells in a specialized follicle-associated epithelium covering Peyer&#x2019;s patches play an important role for the mucosal immunosurveillance in gut-associated lymphoid tissue. Here we described the evaluation method for bacterial transcytosis by M cells in vivo. This method provides a method to understand M-cell function in the immune system.

Applicazione di un mouse legatura Patch Peyer Assay intestinale Loop per valutare assorbimento da parte delle cellule batteriche M

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen presenting cell (APC) types found in a normal thymus and it is well established that they play distinct roles during thymic selection. These cells are localized in distinct microenvironments in the thymus and each APC type makes up only a minor population of cells. To further understand the biology of these cell types, characterization of these cell populations is highly desirable but due to their low frequency, isolation of any of these cell types requires an efficient and reproducible procedure. This protocol details a method to obtain cells suitable for characterization of diverse cellular properties. Thymic tissue is mechanically disrupted and after different steps of enzymatic digestion, the resulting cell suspension is enriched using a Percoll density centrifugation step. For isolation of myeloid DC (CD11c+), cells from the low-density fraction (LDF) are immunoselected by magnetic cell sorting. Enrichment of TEC populations (mTEC, cTEC) is achieved by depletion of hematopoietic (CD45hi) cells from the low-density Percoll cell fraction allowing their subsequent isolation via fluorescence activated cell sorting (FACS) using specific cell markers. The isolated cells can be used for different downstream applications.

This protocol details a method to isolate antigen presenting cells from human thymus via different steps of enzymatic digestion of the tissue followed by density centrifugation of the single cell suspension and finally magnetic and/or FACS sorting of the cell populations of interest.

Isolamento di cellule dendritiche mieloidi e cellule epiteliali di timo umano

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

Plasmodium falciparum merozoite antigens are under development as potential malaria vaccines. One aspect of immunity against malaria is the removal of free merozoites from the blood by phagocytic cells. However assessing the functional efficacy of merozoite specific opsonizing antibodies is challenging due to the short half-life of merozoites and the variability of primary phagocytic cells. Described in detail herein is a method for generating viable merozoites using the E64 protease inhibitor, and an assay of merozoite opsonin-dependent phagocytosis using the pro-monocytic cell line THP-1. E64 prevents schizont rupture while allowing the development of merozoites which are released by filtration of treated schizonts. &#160;Ethidium bromide labelled merozoites are opsonized with human plasma samples and added to THP-1 cells. Phagocytosis is assessed by a standardized high throughput protocol. Viable merozoites are a valuable resource for assessing numerous aspects of P. falciparum biology, including assessment of immune function. Antibody levels measured by this assay are associated with clinical immunity to malaria in naturally exposed individuals. The assay may also be of use for assessing vaccine induced antibodies. &#160;

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

Measuring antibody function is key to understanding immunity to Plasmodium falciparum malaria. This method describes the purification of viable merozoites, and measurement of opsonization-dependent phagocytosis by flow cytometry.

High Yield Purificazione di<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; Merozoiti Per l&#39;uso in opsonizzante anticorpo saggi

Plasmodium falciparum merozoite antigens are under development as potential malaria vaccines. One aspect of immunity against malaria is the removal of ...

Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple stages of T cell development: T cell commitment, positive selection and negative selection. However, the function of TECs in the thymus remains incompletely understood. In the article, we provide a method to isolate TEC subsets from fresh mouse thymus using a combination of mechanical disruption and enzymatic digestion. The method allows thymic stromal cells and thymocytes to be efficiently released from cell-cell and cell-extracellular matrix connections and to form a single-cell suspension. Using the isolated cells, multiparameter flow cytometry can be applied to identification and characterization of TECs and dendritic cells. Because TECs are a rare cell population in the thymus, we also describe an effective way to enrich and purify TECs by depleting thymocytes, the most abundant cell type in the thymus. Following the enrichment, cell sorting time can be decreased so that loss of cell viability can be minimized during purification of TECs. Purified cells are suitable for various downstream analyses like Real Time-PCR, Western blot and gene expression profiling. The protocol will promote research of TEC function and as well as the development of in vitro T cell reconstitution.

Here we describe an efficient method for isolation, identification, and purification of mouse thymic epithelial cells (TECs). The protocol can be utilized for studies of thymus function for normal T cell development, thymus dysfunction, and T cell reconstitution.

Isolamento, identificazione e purificazione di cellule murine timica epiteliali

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple ...

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are able to replicate in the deep lung. Phagocytosis of Cryptococcus by macrophages is one of the ways that the disease is able to spread into the central nervous system to cause lethal meningoencephalitis. Therefore, study of the association between Cryptococcus and macrophages is important to understanding the progression of the infection. The present study describes a step-by-step protocol to study macrophage infectivity by C. neoformansin vitro. Using this protocol, the role of host sterols on host-pathogen interactions is studied. Different concentrations of methyl--cyclodextrin (MCD) were used to deplete cholesterol from murine reticulum sarcoma macrophage-like cell line J774A.1. Cholesterol depletion was confirmed and quantified using both a commercially available cholesterol quantification kit and thin layer chromatography. Cholesterol depleted cells were activated using Lipopolysacharide (LPS) and Interferon gamma (IFN&#947;) and infected with antibody-opsonized Cryptococcus neoformans wild-type H99 cells at an effector-to-target ratio of 1:1. Infected cells were monitored after 2 hr of incubation with C. neoformans and their phagocytic index was calculated. Cholesterol depletion resulted in a significant reduction in the phagocytic index. The presented protocols offer a convenient method to mimic the initiation of the infection process in a laboratory environment and study the role of host lipid composition on infectivity.

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

In this article, a protocol for infection of macrophages with Cryptococcus neoformans is described. Also, a method for sterol depletion from the macrophages is explained. These protocols provide a guide to study fungal infections in vitro and examine the role of sterols in such infections.

Macrofagi Colesterolo Depletion e il suo effetto sulla fagocitosi di<em&gt; Cryptococcus neoformans</em

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are ...

Generation of Lymphocytic Microparticles and Detection of their Proapoptotic Effect on Airway Epithelial Cells

Interest in the biological roles of cell membrane&#8211;derived vesicles in cell&#8211;cell communication has increased in recent years. Microparticles (MPs) are one such type of vesicles, ranging in diameter from 0.1 &#956;m to 1 &#956;m, and typically shed from the plasma membrane of eukaryotic cells undergoing activation or apoptosis. Here we describe the generation of T lymphocyte&#8211;derived microparticles (LMPs) from apoptotic CEM T cells stimulated with actinomycin D. LMPs are isolated through a multistep differential centrifugation process and characterized using flow cytometry. This protocol also presents an in situ cell death detection method for demonstrating the proapoptotic effect of LMPs on bronchial epithelial cells derived from mouse primary respiratory bronchial tissue explants. Methods described herein provide a reproducible procedure for isolating abundant quantities of LMPs from apoptotic lymphocytes in vitro. LMPs derived in this manner can be used to evaluate the characteristics of various disease models, and for pharmacology and toxicology testing. Given that the airway epithelium offers a protective physical and functional barrier between the external environment and underlying tissue, use of bronchial tissue explants rather than immortalized epithelial cell lines provides an effective model for investigations requiring airway tract tissue.

Cell membrane&#8211;shed microparticles (MPs) are active biological vesicles that can be isolated and their pathophysiological effects investigated in various models. Here we describe a method for generating MPs derived from T lymphocytes (LMPs) and for demonstrating their proapoptotic effect on airway epithelial cells.

Generazione di linfocitica microparticelle e rilevamento del loro effetto pro-apoptotico su cellule delle vie aeree epiteliali

Interest in the biological roles of cell membrane&#8211;derived vesicles in cell&#8211;cell communication has increased in recent years. Microparticles ...

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or directly into another cell, Gram-negative bacteria can also form outer membrane vesicles (OMVs). These membrane vesicles can deliver their cargo over long distances, and the cargo is protected from degradation by proteases and nucleases. 
Legionella pneumophila (L. pneumophila) is an intracellular, Gram-negative pathogen that causes a severe form of pneumonia. In humans, it infects alveolar macrophages, where it blocks lysosomal degradation and forms a specialized replication vacuole. Moreover, L. pneumophila produces OMVs under various growth conditions. To understand the role of OMVs in the infection process of human macrophages, we set up a protocol to purify bacterial membrane vesicles from liquid culture. The method is based on differential ultracentrifugation. The enriched OMVs were subsequently analyzed with regard to their protein and lipopolysaccharide (LPS) amount and were then used for the treatment of a human monocytic cell line or murine bone marrow-derived macrophages. The pro-inflammatory responses of those cells were analyzed by enzyme-linked immunosorbent assay. Furthermore, alterations in a subsequent infection were analyzed. To this end, the bacterial replication of L. pneumophila in macrophages was studied by colony-forming unit assays. 
Here, we describe a detailed protocol for the purification of L. pneumophila OMVs from liquid culture by ultracentrifugation and for the downstream analysis of their pro-inflammatory potential on macrophages.

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Here, we describe the purification of Legionella pneumophila (L. pneumophila) outer membrane vesicles (OMVs) from liquid cultures. These purified vesicles are then used for the treatment of macrophages to analyze their pro-inflammatory potential.

Legionella pneumophila membrana esterna Vescicole: Isolamento e analisi del loro potenziale pro-infiammatori sui macrofagi

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or ...

Phagocytosis Assay for Apoptotic Cells in Drosophila Embryos

The molecular mechanisms underlying the phagocytosis of apoptotic cells need to be elucidated in more detail because of its role in immune and inflammatory intractable diseases. We herein developed an experimental method to investigate phagocytosis quantitatively using the fruit fly Drosophila, in which the gene network controlling engulfment reactions is evolutionally conserved from mammals. In order to accurately detect and count engulfing and un-engulfing phagocytes using whole animals, Drosophila embryos were homogenized to obtain dispersed cells including phagocytes and apoptotic cells. The use of dispersed embryonic cells enables us to measure in vivo phagocytosis levels as if we performed an in vitro phagocytosis assay in which it is possible to observe all phagocytes and apoptotic cells in whole embryos and precisely quantify the level of phagocytosis. We confirmed that this method reproduces those of previous studies that identified the genes required for the phagocytosis of apoptotic cells. This method allows the engulfment of dead cells to be analyzed, and when combined with the powerful genetics of Drosophila, will reveal the complex phagocytic reactions comprised of the migration, recognition, engulfment, and degradation of apoptotic cells by phagocytes.

Phagocytosis Assay for Apoptotic Cells in Drosophila Embryos

We herein describe a phagocytosis assay using the dispersed embryonic cells of Drosophila. It enables us to easily and precisely quantify in vivo phagocytosis levels, and to identify new molecules required for the phagocytosis of apoptotic cells.

Analisi della fagocitosi per le cellule apoptotiche in<em&gt; Drosophila</em&gt; Embrioni

The molecular mechanisms underlying the phagocytosis of apoptotic cells need to be elucidated in more detail because of its role in immune and ...

Laminar Flow-based Assays to Investigate Leukocyte Recruitment on Cultured Vascular Cells and Adherent Platelets

The recruitment of leukocytes upon injury or inflammation to sites of injury or tissue damage has been investigated during recent decades and has resulted in the concept of the leukocyte adhesion cascade. However, the exact molecular mechanisms involved in leukocyte recruitment have not yet been fully identified. Since leukocyte recruitment remains an important subject in the field of infection, inflammation, and (auto-) immune research, we present a straightforward laminar flow-based assay to study underlying mechanisms of the adhesion, de-adhesion, and transmigration of leukocytes under venous and arterial flow regimes. The in vitro assay can be used to study the molecular mechanisms that underlie the interactions between leukocytes and their cellular partners in different models of vascular inflammation. This protocol describes a laminar flow-based assay using a parallel-flow chamber and an inverted phase contrast microscope connected to a camera to study the interactions of leukocytes and endothelial cells or platelets, which can be visualized and recorded then analyzed offline. Endothelial cells, platelets, or leukocytes can be pretreated with inhibitors or antibodies to determine the role of specific molecules during this process. Shear conditions, i.e. arterial or venous shear stress, can be easily adapted by the viscosity and flow rate of the perfused fluids and the height of the channel.

Leukocytes avidly interact with vascular cells and platelets after vessel wall injury or during inflammation. Here, we describe a straightforward laminar flow-based assay to characterize the molecular mechanisms that underlie the interactions between leukocytes and their cellular partners.

Analisi di flusso laminare-based per indagare il reclutamento leucocitario su cellule vascolari coltivate e piastrine aderenti

The recruitment of leukocytes upon injury or inflammation to sites of injury or tissue damage has been investigated during recent decades and has resulted ...

Isolation of Salivary Epithelial Cells from Human Salivary Glands for In Vitro Growth as Salispheres or Monolayers

The salivary glands are a site of significant interest for researchers interested in multiple aspects of human disease. One goal of researchers is to restore function of glands damaged by radiation therapies or due to pathologies associated with Sj&#246;gren's syndrome. A second goal of researchers is to define the mechanisms by which viruses replicate within glandular tissue where they can then gain access to salivary fluids important for horizontal transmission. These goals highlight the need for a robust and accessible in vitro salivary gland model that can be utilized by researchers interested in the above mentioned as well as related research areas. Here we discuss a simple protocol to isolate epithelial cells from human salivary glands and propagate them in vitro. Our protocol can be further optimized to meet the needs of individual studies. Briefly, salivary tissue is mechanically and enzymatically separated to isolate single cells or small clusters of cells. Selection for epithelial cells occurs by plating onto a basement membrane matrix in the presence of media optimized to promote epithelial cell growth. These resulting cultures can be maintained as three-dimensional clusters, termed "salispheres", or grown as a monolayer on treated plastic tissue culture dishes. This protocol results in the outgrowth of a heterogenous population of mainly epithelial cells that can be propagated for 5-8 passages (15-20 population doublings) before undergoing cellular senescence.

We present a method for isolating and cultivating primary human salivary gland-derived epithelial cells. These cells exhibit gene expression patterns consistent with them being of salivary epithelial origin and can be grown as salispheres on basement membrane matrices derived from Engelbreth-Holm-Swarm tumor cells or as monolayers on treated culture dishes.

Isolamento delle cellule epiteliali salivari dalle ghiandole salivari umane per la crescita in vitro come Salispheres o Monostrati

The salivary glands are a site of significant interest for researchers interested in multiple aspects of human disease. One goal of researchers is to ...