Generare modelli cellulari primari o strutture organoidi è la chiave per rispondere a molte domande contemporanee in biologia. Ad esempio, siamo interessati da un bel po 'di tempo ai meccanismi utilizzati dai virus umani per facilitare la replicazione nella ghiandola salivare in quanto è un sito importante per la trasmissione orizzontale. Lo sviluppo del sistema basato sulla salisfera descritto in questo protocollo è un progresso cruciale nella nostra ricerca di rispondere a questo tipo di domande.
Questa tecnica ci consente di generare cellule primarie da una varietà di diversi campioni di pazienti. I modelli cellulari ricordano più la situazione di tipo in vivo in quanto le cellule non sono modellate o trasformate come molti tipi di cellule comunemente usati per esperimenti in vitro. Abbiamo usato questo protocollo per generare cellule simili dalla ghiandola submandibolare primaria del topo e il protocollo sarebbe probabilmente utile per altri organi con strutture cellulari simili.
Entro due o quattro ore dalla rimozione dal paziente, su una piastra di coltura, utilizzare forbici sterilizzate autoclavate e forcelle chirurgiche per tritare il tessuto della ghiandola salivare in pezzi fini delle dimensioni di uno o due millimetri. Aggiungere sei millilitri della soluzione di dispasi/collagenasi al tessuto tritato. Quindi incubare a 37 gradi Celsius per circa 30 minuti a un'ora.
Interrompere il tessuto tubazione con una pipetta sierologica da cinque millilitri da 15 a 20 volte. Incubare a 37 gradi Celsius per altri 30 minuti a un'ora. Ripetere il passaggio di pipettazione e incubazione da due a tre volte o fino a quando il tessuto assomiglia a un liquame e può facilmente passare attraverso l'apertura della pipetta.
Per rivestire i pozzi con BMM, pipettare lentamente 500 microlitri di BMM scongelato durante la notte in ogni pozzo di una piastra a sei pozzi. Ruotare lentamente la piastra per distribuire uniformemente il BMM sui pozzi. Quindi incubare le piastre rivestite a 37 gradi Celsius per almeno 15 minuti prima dell'uso per consentire al BMM di solidificarsi.
In primo luogo, trasferire la soluzione di dispasi/collagenasi contenente tessuto omogeneizzato in un tubo conico da 15 millilitri. Lavare la parete della piastra una volta con sei millilitri di DPBS per trasferire le celle rimanenti nel tubo conico. Quindi, attraverso un filtro cellulare a rete di nylon da 70 micrometri, filtrare l'omogeneato in un nuovo tubo conico da 50 millilitri per rimuovere il tessuto non digerito.
Centrifugare le cellule tese per cinque minuti a 500 volte g. Aspirare il supernatante. Quindi rimescolare il pellet cellulare in 10 millilitri di tampone di lisi 1X RBC.
Incubare per cinque minuti a 37 gradi Celsius. Quindi aggiungere da 20 a 25 millilitri di DPBS per neutralizzare il tampone di lisi RBC e ridurre al minimo la lisi delle cellule salivari. Centrifuga per cinque minuti a 500 volte g.
Il pellet a celle bianche indica lalisi completa di tutta la RBC. Se il pellet ha colore rosso, ripetere il trattamento con tampone di lysis RBC. Aspirare il supernatante e rimescolare il pellet in uno o due millilitri di BEGM e quindi trasferire le celle rimorsi su pozzi rivestiti in BMM.
Incubare a 37 gradi Celsius. Una volta placcate su BMM, le cellule si formeranno in strutture sferiche o salisfere per un periodo di due o tre giorni. Le cellule possono essere mantenute come salisfere per circa cinque-sette giorni prima che il BMM inizi a degradarsi permettendo alle cellule di accedere e aderire alla plastica e crescere come monostrato.
In primo luogo, aspirare il supporto dai pozzi e aggiungere un millilitro di soluzione di dispasi / collagenasi ad ogni pozzo. Incubare a 37 gradi Celsius per circa 15 minuti o fino a quando la BMM non si è per lo più sciolta. Quindi trasferire le cellule in un tubo conico da 15 millilitri e lavare i pozzetti una volta con uno o tre millilitri di DPBS per ottenere le celle rimanenti.
Centrifuga per cinque minuti a 500 volte g. Aspirare il supernatante e rimescolare il pellet in due millilitri di Tripina. Incubare di nuovo a 37 gradi Celsius per 15 minuti.
Aggiungere quindi al tubo qualsiasi supporto completo contenente il 10% di siero per neutralizzare la tripina. Centrifuga per cinque minuti a 500 volte g. Aspirare il supernatante a rimuovere il supporto residuo, la tripsiderina e il siero e quindi rimescolare le cellule in DPBS.
Centrifuga per cinque minuti a 500 volte g. Aspirare il supernatante e rimescolare il pellet in BEGM. Per mantenere il pellet come sfere, placcare le celle rimostrate su piatti di coltura rivestiti in BMM solidificato.
Coltura di tutte le cellule in un incubatore umidificato mantenuto a 37 gradi Celsius con anidride carbonica del 5% per cinque o sette giorni prima della subcultura. Nutrire con BEGM fresco ogni due o tre giorni. Per proliferare le cellule come monostrato su stoviglie di coltura in plastica, aspirare il supporto BEGM dal piatto e lavare una volta con DBPS per rimuovere i mezzi residui.
Aggiungere due millilitri di tripside e incubare a 37 gradi Celsius per 15 minuti o fino a quando le cellule non si sono completamente staccate. Neutralizzare la tripina utilizzando quattro millilitri di qualsiasi supporto completo contenente il 10% di siero. Quindi inclinare delicatamente il piatto e trasferire le cellule in un tubo conico da 15 millilitri.
Lavare la piastra una volta con circa cinque millilitri di DPBS per raccogliere le cellule rimanenti. Centrifuga per cinque minuti a 500 volte g. Aspirare il supernatante.
Per rimuovere i supporti residui, rimorsidire le celle in da sei a 10 millilitri di DPBS. Centrifuga per cinque minuti a 500 volte g. Aspirare il supernatante e resuspend in BEGM.
Quindi placcare le cellule sui piatti di coltura del tessuto plastico trattato. Coltura le cellule in un incubatore umidificato mantenute a 37 gradi Celsius con anidride carbonica del 5% per cinque o sette giorni prima della subcultura. Nutrire con BEGM fresco ogni due o tre giorni.
In questo protocollo, dopo aver placcato le cellule dal tessuto digerito alla BMM per due o tre giorni, le cellule formarono prontamente piccoli cluster che continuarono ad espandersi in dimensioni fino a 15-20 cellule per cluster. Le cellule della salisfera sono state placcate su plastica trattata in cellule coltivate e coltivate come monostrato dove mostrano una morfologia coerente con le cellule di origine epiteliale. È necessaria una corretta tecnica aseptica e cura per evitare contaminazioni batteriche o fungine.
Nessuna quantità di antibiotici o antimicotici salverà una coltura brulicante di microbi. Stiamo rispondendo a domande sulla patogenesi virale e sulla trasmissione. Ma per altri, questo fornisce un modo per studiare le cellule salivari umane per qualsiasi numero di applicazioni come le terapie di rigenerazione tissutale.
Per noi che studiamo il Citomegalovirus umano, questa tecnica ci ha permesso di iniziare ad esplorare i meccanismi molecolari che il virus utilizza per infettare e infine trasmettere a nuovi ospiti. Nulla di ciò che viene utilizzato in questo protocollo è intrinsecamente pericoloso, ma si dovrebbe sempre prestare attenzione quando si maneggiano tessuti umani e qualsiasi tipo di reagente chimico.
