Gli autori desiderano ringraziare i bambini ei donatori di plasma adulti, e il personale della Papua Nuova Guinea Institute of Medical Research. Gli autori desiderano ringraziare Amandine B Carmagnac, Catherine Q Nie, Danny Wilson W, Ivo Mueller e Diana S Hansen per il loro contributo allo sviluppo di questa tecnica, e ringraziare la Croce Rossa australiana per sangue e siero confezioni. Questo lavoro è stato reso possibile attraverso Victorian Government Stato operativo infrastruttura di supporto e governo australiano NHMRC IRIISS. Questo lavoro è stato sostenuto dal National Health and Medical Research Council concede # 1031212 e # 637406, e National Institutes of Health di sovvenzione # AI089686.

NOTA: Tutte le fasi, oltre a centrifugazione e citometria a flusso, devono essere eseguiti entro una cappa a flusso laminare per mantenere la sterilità. Assicurarsi che siano prese opportune precauzioni per quanto riguarda la manipolazione dei campioni umani. Il test è molto sensibile per piccole quantità di plasma. Le diluizioni previste sono ottimali per la risoluzione delle risposte che vanno 5-78% con il plasma dai bambini semi-immuni da Papua Nuova Guinea (PNG). La diluizione ottimale può variare con i set di plasma in fase di test, e perciò si raccomanda che il plasma essere titolato per determinare le condizioni sperimentali per ciascuna applicazione. Garantire l&#39;inserimento di due controlli negativi cellule THP-1 con merozoites in assenza di plasma; e cellule THP-1 con merozoites opsonizzati con un pool di plasma da malaria persone ingenue. Ciò consentirà di controllo per merozoite aderenza alla cellule THP-1 e per consentire rigorosa citometria a flusso gating di eventi fagocitosi. L&#39;uso di campioni di plasma PNG eraapprovato dal Comitato di Medical Research Advisory, Papua Nuova Guinea Ministero della Salute, il Walter e Eliza Corridoio Comitato di Etica umano della ricerca (numero di progetto 04/04). Il consenso scritto è stato ottenuto da genitori / tutori di tutti i partecipanti. 1. THP-1 Cultura <ol><li> Mantenere la linea cellulare monocitica umana THP-1 in terreno RPMI-1640 integrato con siero di vitello fetale al 10% (FCS) e 55 mM 2-mercapthoethanol (THP-1 medium) ed a 37 ° C in un incubatore umidificato CO 2 5%. </li><li> Mantenere le cellule ad una densità inferiore a 5 x 10 5 cellule / ml. NOTA: Overgrowth si tradurrà in differenziamento in cellule aderenti e down-regulation dei recettori Fc. Una volta che le cellule sono state fatte passare circa 10 volte, scongelare un nuovo flacone di mantenere fenotipo cellulare. </li></ol> 2. Preparazione del campione anticorpo e diluizione <ol><li> Il calore inattivare il plasma da testare e plasma di controllo della malaria-naïve incubando a 56 °; C per 30 min </li><li> Serialmente diluire campioni di plasma a 1/2, 000 in THP-1 medium. </li><li> Conservare il plasma diluito a -20 ° C. </li></ol> 3. Cultura altamente sincronizzata P. falciparum NOTA: La linea parassita-GFP che esprimono D10-PfPHG 27 è stato utilizzato per la sua 48 ore ciclo di vita che aiuta la sincronizzazione dei parassiti e la tempistica controllata di E64 aggiunta. Inoltre, perché questa linea esprime GFP nel citoplasma, questa linea permette di rilevare parassitemia e merozoiti gratuiti da rilevamento mediante citometria a flusso di GFP. Tuttavia, l&#39;intensità di fluorescenza GFP non è sufficiente a fornire la visualizzazione all&#39;interno di cellule THP-1, e quindi, merozoiti sono contrastate con etidio bromuro (EtBr). Altri ceppi di parassiti possono essere utilizzati, a condizione che la sincronia stretto è realizzabile. Sincronizzare i parassiti utilizzando una combinazione di trattamento sorbitolo per lisare forme mature 28 e eparina per inibire l&#39;invasione 15 </sup&gt;. <ol><li> Mantenere P. falciparum parassiti in O + eritrociti umani (RBC) al 3% di ematocrito in terreno RPMI-1640 (pH 7,4) supplementato con 25 mg / ml HEPES, 50 ug / ipoxantina ml, 10% di siero umano riunito, 2 mg / bicarbonato di sodio ml, e 20 mg / ml di gentamicina (Parasite medio). Aggiungere 5 mg / ml Blasticidin S-cloridrato al mezzo di coltura di selezionare per GFP + parassiti. </li><li> Incubare culture in scatole a tenuta d&#39;aria o fiasche di coltura alternativa doppia tenuta a 37 ° C in atmosfera di 1% O 2, 4% di CO 2 e il 95% N 2. </li><li> Preparare vetrini striscio sottile, fissare in 100% di metanolo per 10 secondi, e macchia con il 10% di soluzione di Giemsa a 6,7 ​​mM (pH 7.1) tampone fosfato (soluzione Giemsa) per 10 min per monitorare parassitemia. Dopo la colorazione, sciacquarlo in acqua e aria secca. Valutare parassitemia con un obiettivo a immersione in olio 100X. </li><li> Mantenere culture parassita in un parassitemia di sotto del 5% RBC infetto dividendo culture e aggiungendo infettoRBC come richiesto. </li><li> Per la sincronizzazione con eparina, aggiungere 20 UI / ml di medico-grado eparina a squillare stadio culture. </li><li> Quando la maggior parte dei parassiti sono in fase schizonte, le cellule pellet a 300 xg per 5 minuti, togliere medio contenenti eparina e risospendere in mezzo parassita per consentire la rottura schizonte e merozoite invasione. </li><li> Dopo 4 ore, aggiungere 20 UI / ml di eparina torna a culture, bloccando ogni ulteriore invasione merozoite. NOTA: Diversi cicli di sorbitolo e trattamento con eparina può essere richiesto prima che i parassiti sono sufficientemente sincronizzati. Per generare numeri adeguati di merozoiti, preparare 150 ml di cultura parassita al 3-5% parassitemia. </li></ol> 4. Isolamento di fase avanzata P. falciparum Trofozoiti <ol><li> Trentasei ore dopo il ritorno eparina a culture, pellet cellule in coltura a 300 xg per 5 minuti, e risospendere pellet in mezzo parassita al 25% di ematocrito. </li><li> Attaccare una grande colonna magnetica (volume matrice di 6,3ml) ad un magnete, ed equilibrare la colonna con mezzo parassita, assicurandosi tutte le bolle d&#39;aria vengono rimosse. </li><li> Aggiungere il P. risospeso cultura falciparum alla colonna, e regolare la velocità di flusso di una goccia al sec. </li><li> Una volta che la cultura è passato attraverso la colonna, lavare la colonna con il mezzo parassita fino a quando il flow-through è pulita. </li><li> Parassiti eluire dalla colonna in 30 ml di 37 ° C media parassita. </li><li> Preparare uno striscio sottile di parassiti, fissare in 100% di metanolo per 10 secondi, e macchiare con la soluzione Giemsa per 3 min. Esaminare il vetrino sotto il microscopio, e garantire che i parassiti quasi riempire il globulo rosso, e sembrano essere nelle fasi iniziali schizonte. Se i parassiti non hanno raggiunto la fase di maturazione appropriato, ritorno parassiti purificati ad un incubatore a 37 ° C in atmosfera di 1% O 2, 4% di CO 2 e il 95% N 2 fino adeguatamente sviluppato. NOTA: purezza superiore al 90% infette globuli rossi è necessaria per garantire RBCs Non contaminare le preparazioni merozoite. </li><li> Trattare schizonti isolati con 10 pM E64 (Epoxysuccinyl-L-leucylamido (4 guanidino) butano (E64) per 6-10 ore. NOTA: i tempi di incubazione più lunghi con E64 sono possibili, ma i merozoiti prodotti non saranno più invasivi. </li></ol> 5. Isolamento di P. falciparum merozoiti <ol><li> Dopo l&#39;incubazione con E64, striscio parassiti, fissare le cellule in 100% di metanolo, e macchia con soluzione Giemsa per valutare la formazione di merozoiti membrana chiusa. NOTA: Una buona resa di merozoiti sarà ottenuta se superiore al 50% dei parassiti si sono formate membrana merozoiti chiusi. </li><li> Schizonti Pellet E64-trattato a 1.900 xg per 8 min. Lavare con 50 ml di RT mezzo RPMI-1640 (pH 7.4) supplementato con 25 mg / ml HEPES, 50 pg / ml ipoxantina, 2 mg / ml di bicarbonato di sodio, e 20 ug / ml di gentamicina (lavare medio) per rimuovere i residui di siero umano . </li><li> Risospendere il pellet in 2 ml di terreno di lavaggio. NOTA: Utilizzando FCS contenenti THP-1 media produrrà la formazione di schiuma durante la filtrazione. </li><li> Filtrare i 2 ml di risospesa E64-schizonti attraverso un filtro a siringa da 1,2 μm/32 mm. Raccogliere il filtrato in una provetta da 10 ml. NOTA: Il filtrato contiene merozoites e cristalli hemozoin, con schizonti non-rottura e detriti raccolti nel filtro. </li><li> Attaccare una piccola colonna magnetica ad un magnete, ed equilibrare con 500 microlitri THP-1 medium. </li><li> Passare il filtrato sopra la colonna magnetica. Raccogliere il flow-through. NOTA: hemozoin si legherà alla colonna, mentre merozoites passeranno attraverso. </li><li> Passare il flow-through sopra la colonna altre due volte per rimuovere hemozoin, raccogliendo il flusso attraverso ogni volta. </li><li> Lavare la colonna con 2 ml di RT THP-1 media per raccogliere eventuali merozoiti rimanenti. </li><li> Aggiungere EtBr a 10 pg / ml (concentrazione finale) e colorazione per 30 minuti a RT. Proteggere dalla luce per evitare photobleaching. Nota: assicurarsi che tutto il liquido e p EtBr contaminatirifiuti lastic vengono smaltiti in modo adeguato per le sostanze chimiche citotossiche. Merozoiti non sono più invasive termine dell&#39;incubazione. </li><li> Spin down merozoiti a 4.000 xg per 10 min. </li><li> Gettare il surnatante in apposito contenitore per rifiuti. </li><li> Risospendere merozoite pellet in 4 ml THP-1 media e spin down a 4000 xg per 10 min. </li><li> Aggiungi THP-1 media fino a un volume di 15 ml, e proteggere dalla luce. </li></ol> 6. Quantificare merozoite Concentrazione mediante citometria di flusso <ol><li> Portare il conteggio perline per RT. </li><li> Preparare PBS con 0,5% BSA per diluire merozoiti. </li><li> Conte merozoiti a 3 diluizioni; 1 a 100; 1 a 50 e 1 a 25. Preparare provette 3 FACS con 940, 930 e 910 microlitri di PBS +0,5% BSA, rispettivamente. Aggiungere 10, 20 e 40 pl di merozoiti purificati per provetta, rispettivamente. </li><li> Perle di conteggio Vortex per 30 secondi, e aggiungere 50 ml di perline per tubo FACS contenente merozoiti diluiti. </li><li> Eseguire i tre dilcampioni merozoite decentrate su un citometro a flusso dotati di un laser a 488 nm. Impostare un cancello rigoroso per merozoiti basato su EtBr e fluorescenza GFP doppia fluorescenza, e il conteggio cancello beads di fluorescenza in un canale separato. Acquisire gli eventi fino a 2.000 perline vengono raccolti. Nota: Queste istruzioni si riferiscono a contare GFP + merozoiti che sono stati contro-colorate con EtBr. Se non utilizzano GFP che esprimono parassiti quindi impostare porte merozoite basati su side scatter e EtBr fluorescenza. </li><li> Determinare il rapporto di merozoiti: perline dividendo il numero di eventi merozoite dai 2.000 eventi tallone conteggio, calcolare un rapporto per ogni diluizione. Utilizzare le specifiche lotti tallone conteggio per determinare il numero di perle in 50 ml di perline aggiunti per provetta. </li><li> Moltiplicare il numero di perline in 50 microlitri per il fattore di diluizione e dal merozoite: branello rapporto per tale fattore di diluizione. Questo numero corrisponde alla concentrazione di merozoiti per ml. Eseguire thESE passaggi per ogni diluizione. </li><li> La media delle concentrazioni misurate merozoite tutti e tre diluizioni. NOTA: Le deviazioni standard superiori al 10% per le concentrazioni stabilite per 1 in 100, 1 in 50, e 1 su 25 diluizioni indicano imprecisioni tecniche di preparazione dei campioni di conteggio. </li><li> Risospendere merozoiti a 8 x 10 6 / ml merozoiti in THP-1 medio per garantire un rapporto finale di quattro merozoiti per THP-1 cella. NOTA: Altro merozoite di THP-1 ratio può essere usato, e concentrazioni devono essere modificati di conseguenza. </li></ol> 7. Fagocitosi Assay <ol><li> Aggiungere 200 ml di calore FCS inattivi per pozzetto di 96 piastre ben inferiori a U, e lasciare a RT O / N per bloccare le piastre. Dopo l&#39;incubazione, rimuovere FCS e lavare i pozzetti due volte con 200 microlitri di PBS sterile. Rimuovere PBS e le piastre conservare a 4 ° C fino al momento. </li><li> Calcolare il numero di cellule THP-1 necessarie per analizzare campioni di plasma e controlli, permettendo pozzetti in triplicato per campione a 1 x 10 <sup&gt; 5 THP-1 le cellule per pozzetto. </li><li> Determinare THP-1 concentrazione cultura caricando 10 ml di coltura su un vetrino emocitometro. Contare il numero di cellule presenti in 4 gruppi di 16 quadrati angolari della emocitometro sotto un microscopio, poi la media dei conteggi. Moltiplicare il conteggio medio da 10.000 a calcolare il numero di cellule per ml. </li><li> Centrifugare il numero di cellule THP-1 a 500 xg per 5 min, e risospendere a 6.7 x 10 5 cellule / ml in THP-1 medium. </li><li> Aggiungere 150 microlitri di cellule THP-1 in THP-1 medium per pozzetto di una FCS-bloccata 96 pozzetti con fondo a U, con conseguente 10 5 cellule / pozzetto. Preparare 3 pozzetti per campione che saranno testati. Piastra Ritorno al incubatore fino al momento di aggiungere merozoiti. </li><li> Aggiungere 150 ml di preparazione merozoite a 8 x 10 6 / ml per pozzetto di una FCS-bloccata 96 pozzetti fondo U-separato. Preparare un pozzetto per ogni campione testato </li><li> Aggiungere 10 ml di campioni di plasma preparati diluiti per bene, per tegli piastra che contiene i merozoiti, e mescolare bene per garantire la soluzione omogenea. </li><li> Rimuovere la piastra THP-1 dal termostato, e aggiungere 50 ml di soluzione di merozoite / plasma per pozzetto contenente cellule THP-1, con pozzetti in triplicato per ogni campione di plasma. </li><li> Mescolare bene e incubare a 37 ° C in 5% di CO 2, incubatore umidificato per 40 min. Coprire con un foglio per proteggere dalla luce. </li><li> Dopo 40 min, campioni di centrifugazione per 5 min a 500 xg in una 4 ° C prechilled centrifuga ad arrestare fagocitosi. </li><li> Rimuovere il surnatante e lavare le cellule due volte in PBS freddo +0,5% BSA 2 mM EDTA (buffer FACS). NOTA: EDTA faciliterà nel mantenere una sospensione singola cella per citometria a flusso. </li><li> Fissare le cellule in 90 ml di 2% paraformaldeide (PFA) in PBS +0,5% BSA 2 mM EDTA (FACS fissativo). Lasciare in ghiaccio fino all&#39;acquisizione, al riparo dalla luce. </li></ol> 8. Citometria a Flusso <ol><li> Acquisire i campioni utilizzando un citofluorimetro wi attrezzatath un laser a 488 nm e throughput elevato lettore di piastra di fissaggio. NOTA: Ciò consentirà fino a 400 campioni di plasma da analizzare da una preparazione merozoite. Le cellule possono anche essere trasferiti in provette per uso caricamento del campione. </li><li> Cancello vitali cellule THP-1 di avanti e scatter laterale. </li><li> Impostare il cancello positivo EtBr basato sulle &#39;cellule THP-1 con merozoites e senza plasma&#39; di controllo. </li><li> Acquisire un minimo di 10.000 eventi per campione. </li></ol> 9. Analisi dei dati <ol><li> Analizzare i dati in citometria a flusso software di analisi, e impostare porte stringenti per gli eventi positivi EtBr. </li><li> Calcolare la fagocitosi percentuale per ogni campione: la% di EtBr + cellule per campione meno le cellule positive% con plasma non immune. </li><li> Risultati medi in tutta triplicati. NOTA: le deviazioni standard per un triplice copia in eccesso del 10% indicano imprecisioni sperimentali. Alcuni retroscena eventi EtBr positivi possono essere osservati a seguito di merozoiTE adesione alla superficie di cellule THP-1, ma dovrebbe essere costante per tutti i campioni contenenti merozoiti. Impostazione del cancello sulla base delle «cellule THP-1 con merozoites e nessun plasma &#39;di controllo, e sottraendo qualsiasi sfondo delle&#39; cellule THP-1 con i non-immune plasma &#39;di controllo si tradurrà in% fagocitosi che riflette la fluorescenza a causa interiorizzato / fagocitati solo merozoiti. </li></ol>

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E., Kremsner, P. G., Luty, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fcgamma+receptor-mediated+phagocytosis+of+Plasmodium+falciparum-infected+erythrocytes+in+vitro.">Fcgamma receptor-mediated phagocytosis of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes in vitro.</a> Clinical and experimental immunology. 130, 300-306 (2002).</li><li>McGilvray, I. D., Serghides, L., Kapus, A., Rotstein, O. D., Kain, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonopsonic+monocyte/macrophage+phagocytosis+of+Plasmodium+falciparum-parasitized+erythrocytes:+a+role+for+CD36+in+malarial+clearance.">Nonopsonic monocyte/macrophage phagocytosis of Plasmodium falciparum-parasitized erythrocytes: a role for CD36 in malarial clearance.</a> Blood. 96, 3231-3240 (2000).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Per misurare merozoite fagocitosi, conoscenza di due tecniche è necessaria: purificazione di merozoiti e THP-1 test fagocitosi. I passaggi più critici per la combinazione di queste due tecniche sono le seguenti: 1) i parassiti altamente sincronizzati; 2) Aggiunta di E64 al momento giusto per produrre membrane merozoites chiusi; 3) Rimozione hemozoin per evitare aggregati; 4) Accurate conteggio merozoite mediante citometria di flusso; 5) la diluizione del plasma utilizzato; e 6) mantenendo bassa densità cellulare e numero passaggio di cellule THP-1. Un&#39;attenta considerazione di questi aspetti fondamentali garantirà risposte fagocitosi robuste siano rispettate. Sebbene, qui descritto è la preparazione di merozoiti per valutare la fagocitosi, la tecnica può essere utilizzata per una vasta gamma di applicazioni. Indipendentemente dalla metodologia a valle, preparazioni ottimali merozoite dipendono temporizzazione corretto E64 aggiunta per generare merozoiti. Il metodo qui descritto E64 ha dimostrato di yield merozoiti invasive per l&#39;uso in microscopia ad alta risoluzione degli eventi di invasione e di saggi di sensibilità ai farmaci 15-20. Mentre la redditività merozoite non è essenziale per la fagocitosi, è necessaria l&#39;integrità del rivestimento superficiale merozoite. Pertanto, il metodo E64 qui descritto consente merozoites alta qualità per essere prodotto per valutare la risposta anticorpale al rivestimento superficiale. Come illustrato in Figura 1, se E64 viene aggiunto troppo presto o membrana merozoiti chiusi troppo tardi non si formano. Per questo motivo, sono necessarie culture parassita altamente sincroni. Qui, l&#39;uso di trattamenti sorbitolo e eparina a stretto sincronizzare culture parassita D10-GFP ad una finestra di 2 ore è descritto. L&#39;eparina può promuovere gametocytogenesis in altri laboratori isolati, e quindi deve essere usato con cautela. Metodi di sincronizzazione alternativi come alanina possono anche essere utilizzati purché parassiti ben sincronizzati vengono prodotti 29. Se E64 viene aggiunto ai parassiti asincroni, un puntello più bassoortion di merozoiti membrana chiusa sarà prodotto e rimanendo parassita-infetti RBC sarà o rottura normalmente o sviluppare morfologia anormale. La presenza di parassiti che non hanno sviluppato in membrana racchiuso merozoiti comporterà intasamento del filtro e ridurre significativamente la resa merozoite ottenuto. Durante la filtrazione di merozoiti membrana chiusa, hemozoin è liberato dai vacuoli digestivi ed è presente come cristalli liberi in soluzione. Hemozoin è altamente pro-infiammatorio ed è stato segnalato per modulare monociti e macrofagi fagocitosi risposte 30, 31. Oltre a modulare la fagocitosi, come mostrato nella Figura 2, hemozoin può formare aggregati merozoiti in soluzione. Come cellule THP-1 possono fagocitare questi aggregati, questo può essere un confounder importante per la risoluzione di anticorpo fagocitosi mediata. Pertanto, la rimozione di hemozoin è necessario in questo saggio di avoid complessità di hemozoin su phagocyte biologia. Inoltre, la mancata rimozione hemozoin può anche essere deleterio quando si utilizza questa tecnica per generare merozoiti libero per altre applicazioni, specialmente dove è richiesta merozoite quantificazione. Come illustrato nella Figura 4, il numero di merozoiti aggiunto al dosaggio può influenzare il grado di fagocitosi da cellule THP-1. Anche se citometria a flusso consente l&#39;enumerazione di concentrazione merozoite, attenta pipettaggio e replicare conti di merozoiti sono necessarie per migliorare la precisione. Ciò è particolarmente importante se più linee parassiti vanno testati side-by-side. È stato precedentemente dimostrato che il plasma dai bambini semi-immuni da PNG può essere notevolmente diluito prima risposte declino 23. Descritto qui è la diluizione ottimale di plasma (1/120, 000 diluizione finale di plasma) per una coorte di 5-12 anni i bambini PNG che ha prodotto la vasta gamma di phagocyt. risposte OSIS descritte nella Figura 5 Questa gamma ha permesso per la stratificazione delle risposte in quattro gruppi (0-19%, 20-39%, 40-59% e 60-79% fagocitosi), e il modello di regressione ha rivelato che le risposte opsonizzante sono stati associati con protezione dalla malattia clinica e ad alta densità parassitemia 10 Per diverso coorte studi può essere necessario regolare la diluizione del plasma per garantire la fagocitosi da cellule THP-1 non è saturo o al di sotto del livello di rilevazione. Citometria a flusso permette fagocitosi veloce e quantificabile con una migliore precisione in microscopia. Questo protocollo è un alto rendimento, piatto a base di e automatizzata acquisizione di piastre a 96 pozzetti per studiare acquisita naturalmente immunità umorale. Il metodo richiede la colorazione di merozoiti con etidio bromuro, macchie DNA tuttavia alternative come SybrGreen, DAPI e propidio iodio, macchie o macchie proteine ​​di membrana potrebbero essere utilizzati. Questo test potrebbe essere suscettibile di Primarmonociti e neutrofili y, e potrebbero essere adattati se fagociti o FcR biologia sia di interesse. Cellule primarie o cellule THP-1 differenziate in vitro con PMA possono essere utilizzati per studiare la fagocitosi in malaria e altri agenti patogeni 12, 32-34. Tuttavia utilizzando cellule primarie può essere impegnativo in quanto queste cellule sono aderenti e anche la visualizzazione non-mediata anticorpo fagocitosi 35. Inoltre, la variabilità in purezza, vitalità e funzionalità sono alcune limitazioni chiave per l&#39;uso di cellule fagocitarie primarie. I recettori Fc coinvolti nella fagocitosi merozoite rimangono uncharacterized, e quindi utilizzando anticorpi bloccanti a specifici recettori Fc potrebbe chiarire il contributo di ciascun recettore Fc per merozoite fagocitosi. Come THP-1 fagocitosi è FcR dipendente, questo permette interpretazione semplice della fagocitosi osservata. Questo test si presta anche ad affrontare la specificità antigenica dei opsonizzare anticorpi che potrebbero essere raggiunte da utilizing parassiti knock-out per gli antigeni di superficie merozoite, oppure utilizzando anticorpi umani purificati affinità per merozoite proteine ​​di superficie. Inoltre, in studi approfonditi di risposte citochine seguenti merozoite fagocitosi mancano, e potrebbero essere raggiunti da questo test. Queste due tecniche costituiscono notevoli progressi allo studio degli anticorpi antimerozoite funzionali. La purificazione di merozoiti di alta qualità è vantaggioso utilizzare merozoites crioconservati, o microsfere fluorescenti rivestiti con antigeni merozoite. Sebbene questo test è stato utilizzato come strumento di valutazione immunità acquisita naturalmente, può rivelarsi uno strumento importante per affrontare l&#39;acquisizione di immunità in risposta alla vaccinazione. Mentre è stato recentemente dimostrato che la fagocitosi o merozoiti opsonised è associato con protezione da malaria clinica, non è possibile trarre conclusioni dirette dal vitro THP-1 fagocitosi in vivo phagocytosis di merozoiti la fagocitosi in questo saggio si verifica in condizioni statiche e in assenza di competere globuli rossi. I possibili adattamenti di questo test può quindi fornire uno strumento versatile per una maggiore comprensione della malaria e merozoite fagocitosi.

L&#39;importanza di anticorpi per l&#39;immunità di malaria da Plasmodium falciparum è stato mostrato 40 anni fa, quando immunoglobulina dagli adulti iperimmuni è stato passivamente trasferito a bambini affetti da malaria grave con conseguente malattia alleviato 1. Di conseguenza, ha cercato notevole sforzo per identificare gli obiettivi di protezione dell&#39;immunità malarica, principalmente attraverso la misurazione titoli anticorpali di peptidi o proteine ​​in batteri espresse da ELISA. Sierologia basato ELISA ha anche dimostrato molto variabile tra gli studi, e non affronta la funzionalità anticorpale 2. Molti antigeni malaria inducono una IgG1 cytophilic e IgG3 profilo di anticorpi, in particolare gli antigeni di superficie merozoite 3. Questo pregiudizio sottoclasse suggerisce che l&#39;anticorpo-Fc-recettore (CFR) interazioni con i fagociti sono importanti per le funzioni effettrici delle opsonizzare anticorpi antimerozoite 4. Diversi vaccini antigene merozoite in fase di sviluppo sono progettati persuscitare funzioni effettrici fagocita 5, 6 e sebbene evidenze significative per l&#39;importanza delle interazioni anticorpo-FCR in modelli di roditori malaria esiste 7-9, e alcuni studi recenti sostengono l&#39;importanza di anticorpi funzionali e funzioni dei fagociti effettrici dell&#39;immunità malaria nell&#39;uomo 10, 11, questa zona rimane poco studiato. Studio sulle anticorpi specifici opsonizzante merozoite è stato limitato da due fattori; la difficoltà di isolare merozoiti buona qualità; e le risposte fagocitosi variabili da cellule primarie. Fino a poco tempo, centrifugazione ad alta velocità o densità Percoll gradienti sono stati utilizzati per isolare merozoites da surnatanti di coltura di rottura culture schizonte. Questi merozoiti raramente erano vitali, e spesso ulteriormente manipolati da centrifugazione densità e di lavaggio più passaggi 12, o la crioconservazione 11 prima dell&#39;uso in saggi. Questi processes potenzialmente staccano molte proteine ​​associate perifericamente dalla superficie merozoite, proteine ​​note per essere bersagli antigenici di immunità malarica 13. Recentemente l&#39;inibitore cisteina proteasi trans-Epoxysuccinyl-L-leucylamido (4-guanidino) butano (E64) è stato usato per generare merozoiti vitali. E64 previene la rottura schizonte, generando membrana chiusa merozoites 14, che possono essere interrotti per filtrazione per liberare merozoites vitali 15, 16. Questa tecnica ha portato alla risoluzione spaziale di numerose proteine ​​durante eritrociti invasione 15, 17-19 e ha chiarito l&#39;effetto specifico stadio di numerosi farmaci antimalarici 16, 20. Tuttavia, la generazione di merozoiti vitali rimane tecnicamente difficile. Per facilitare la diffusione di questa tecnica e applicazione di saggi funzionali di immunità, un protocollo dettagliato per la purificazione vitale merozoite e il loro utilizzo in unsaggio funzionale standardizzata di anticorpi: cooperazione cellulare in opsonizzazione e fagocitosi è descritto qui. Questa tecnica dimostra un significativo passo avanti rispetto alle precedenti saggi in vitro di merozoite opsonization, come neutrofili scoppio respiratorio, Antibody Dependent Cellular inibizione (ADCI), e saggi merozoite fagocitosi alternative. Questi test sono scarsamente riproducibile a causa di variazione ingressi parassita e l&#39;attività dei fagociti primarie 11, 21. Contaminanti hemozoin può anche influenzare profondamente la funzione dei fagociti 22. Un recentemente riportato robusto e riproducibile merozoite fagocitosi dosaggio 23 utilizza la linea cellulare promonocytic THP-1 24. Si tratta di un tipo di cellula ideale per saggi flusso elevato throughput citometria com&#39;è non aderente e specificamente esegue Fc-Receptor fagocitosi mediata 25, 26. Un ulteriore complessità, mentre investitoritigating fagocitosi è che il grado di fagocitosi dipende dal numero di merozoiti relativi a cellule THP-1 e la concentrazione plasmatica. Per garantire la riproducibilità tra esperimenti, merozoites devono essere enumerati e una concentrazione definita utilizzati. A causa delle loro piccole dimensioni, il flusso è necessaria la quantificazione citometria. La procedura qui descritta rimuove hemozoin e genera merozoiti vitali, e descrive l&#39;applicazione di questi merozoiti per citometria a flusso conteggio di merozoiti seguita da opsonizzazione e fagocitosi. Anche se tecnicamente impegnativo, le tecniche descritte possono essere utili a chiarire il contributo delle risposte anticorpali specifiche di superficie merozoite per acquisita naturalmente e vaccino indotto l&#39;immunità.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1034">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:317px;">THP-1 cell line</td>
			<td style="width:225px;">American Type Culture Collection</td>
			<td style="width:119px;">TIB-202</td>
			<td style="width:373px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">RPMI-1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:119px;">31800-089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Fetal Calf Serum (FCS)</td>
			<td style="width:225px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">10099-141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-mercapthoethanol&#160;</td>
			<td style="width:225px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250-100ML</td>
			<td>Use in Fume Hood</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Pen/Strep Solution (100x)</td>
			<td style="width:225px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">HEPES</td>
			<td style="width:225px;">SAFC</td>
			<td style="width:119px;">90909C</td>
			<td style="width:373px;">Cell culture grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">hypoxanthine</td>
			<td style="width:225px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:119px;">4010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Human Serum&#160;</td>
			<td style="width:225px;">Donation from Autralian Red Cross</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Available commercially (i.e. Invitrogen)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sodium bicarbonate (NaHCO3)</td>
			<td style="width:225px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">1.06329.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">gentamycin</td>
			<td style="width:225px;">Pfizer</td>
			<td style="width:119px;">61022027</td>
			<td style="width:373px;">Injection Quality</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">heparin Sodium BP (5000IU/mL)</td>
			<td style="width:225px;">Pfizer</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>procine origin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Blasticidin S-hydrochloride</td>
			<td style="width:225px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>15205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D-sorbitol</td>
			<td style="width:225px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">&#160;50-70-4&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">E64 Protease Inhibitor</td>
			<td style="width:225px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3132-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:225px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">98281-100G</td>
			<td>Use for phosphate buffer</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Na2HPO4.2H20</td>
			<td style="width:225px;">Merck&#160;</td>
			<td style="width:119px;">10383.4G</td>
			<td>Use for phosphate buffer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:317px;">Giemsa&#39;s azur eosin methylene blue solution</td>
			<td style="width:225px;">Merck&#160;</td>
			<td style="width:119px;">1.09204.0500</td>
			<td style="width:373px;">1:10 dilution in 6.7mN Phosphate buffer (make fresh each stain)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">EDTA disodium salt</td>
			<td style="width:225px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">10093.5V</td>
			<td style="width:373px;">0.1M, pH 7.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acrodisc Syringe Filters 1.2-&#956;m/32-mm</td>
			<td style="width:225px;">Pall Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">4656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">QuadroMACS Separator (for small column)</td>
			<td style="width:225px;">MACS Miltenyi BioTec</td>
			<td>130-091-051</td>
			<td>Interchangeable with MidiMACS&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">VarioMACS Separator (for large columns)</td>
			<td style="width:225px;">MACS Miltenyi BioTec</td>
			<td>130-090-282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">MACS MultiStand</td>
			<td style="width:225px;">MACS Miltenyi BioTec</td>
			<td style="width:119px;">130-042-303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LS Column (small magnetic column)</td>
			<td style="width:225px;">MACS Miltenyi BioTec</td>
			<td style="width:119px;">130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">large magnetic column</td>
			<td style="width:225px;">MACS Miltenyi BioTec</td>
			<td>130-041-305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Ethidium Bromide</td>
			<td style="width:225px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1510433</td>
			<td>Cytotoxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CountBright Absolute Counting Beads</td>
			<td style="width:225px;">Invitogen</td>
			<td>C36950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:317px;">BD FACSCalibur Flow Cytometer with HTS plate reader</td>
			<td style="width:225px;">BD Biopsciences</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">EDTA disodium salt</td>
			<td style="width:225px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">10093.5V</td>
			<td style="width:373px;">0.1M, pH 7.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">FlowJo cytometry analysis software</td>
			<td style="width:225px;">Tree Star</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high yield purification of plasmodium falciparum merozoites for use in opsonizing antibody assays

Plasmodium falciparum antigeni merozoite sono in fase di sviluppo come potenziali vaccini contro la malaria. Un aspetto di immunità contro malaria è la rimozione di merozoiti liberi dal sangue da parte delle cellule fagocitiche. Tuttavia valutare l&#39;efficacia funzionale di anticorpi specifici opsonizzante merozoite è impegnativo a causa della breve emivita del merozoiti e la variabilità dei fagociti primarie. Descritto in dettaglio in questa sede è un metodo per la generazione di merozoiti vitali usando l&#39;inibitore della proteasi E64, e un saggio di merozoite opsonina-dipendente fagocitosi utilizzando la linea cellulare pro-monocitica THP-1. E64 previene la rottura schizonte consentendo lo sviluppo di merozoiti che vengono rilasciati da filtrazione di schizonti trattati. Merozoiti etidio bromuro sono etichettati opsonizzati con campioni di plasma umano e aggiunti a cellule THP-1. La fagocitosi è valutata da un protocollo standardizzato alto rendimento. Merozoiti vitali sono una risorsa preziosa per la valutazione numerAspetti DIVERSI DI P. biologia falciparum, compresa la valutazione della funzione immunitaria. Livelli anticorpali misurati da questo test sono associati con l&#39;immunità alla malaria clinica in individui naturalmente esposti. Il dosaggio può anche essere utile per valutare gli anticorpi vaccino ha indotto.

La fase di maturazione dei parassiti prima del trattamento E64 è fondamentale per la generazione di merozoiti membrana chiusa. Figura 1AI mostra il grado di maturazione appropriato di schizonti per l&#39;aggiunta E64. I parassiti dovrebbero essere grandi e quasi riempire il globulo rosso. Un aspetto maculato di Giemsa indica merogonia è iniziato, e E64 dovrebbe essere aggiunto per produrre merozoiti membrana chiusa (Figura 1Aii). Se si aggiunge E64 in precedenza per trofozoita parassiti teatrali, membrana merozoites chiusi non vengono generati anche dopo 12 ore di E64. Invece parassiti assumono morfologia anormale come l&#39;allargamento del vacuolo digestivo (Figura 1BI e 1Bii), e merozoiti non si formano. Se E64 è aggiunto in seguito per schizonti, merozoites membrana chiusa non vengono generati come rottura schizonte è disinibita (Figura 1CI e 1Cii). Occorre un elevato livello di parassita sincronia, altrisaggio una serie di tre risultati descritti si vedrà dopo il trattamento E64. Rimozione di hemozoin è un altro passo fondamentale per merozoiti purificazione. Se merozoiti non vengono purificati da hemozoin allora cluster merozoite-hemozoin forma che non può essere sloggiato da pipettaggio. Questi aggregati eseguiti sul citometro come singoli eventi, anche se con diverse caratteristiche forward-scatter e side-scatter di singoli merozoiti, con conseguente imprecisa conteggio merozoite mediante citometria di flusso (Figura 2A). Come cellule THP-1 possono anche fagocitare hemozoin, questi cluster merozoite-hemozoin possono anche essere fagocitati (Figura 2B). Questi aggregati sono fluorescenti altamente EtBr in quanto contengono più merozoiti. Fagocitosi dei risultati aggregati in un profilo EtBr fluorescenza THP-1 equivalente a quello osservato per la fagocitosi di più singoli merozoiti. Quindi, se hemozoin non viene rimosso, la fluorescenza EtBr di cellule THP-1 sarà un overestimate del potenziale opsonizzante per il plasma in prova. Hemozoin è anche riferito di alterare significativamente la funzione dei fagociti. GFP merozoiti positivi sono bancone colorati con EtBr per aumentare la visualizzazione di merozoiti fagocitati da cellule THP-1. Utilizzando le condizioni descritte in questo protocollo, tutti merozoiti GFP positive sono contrastate con EtBr che ha una intensità di fluorescenza più luminoso (Figura 3A). Valutazione fagocitosi da EtBr fluorescenza permette una risoluzione superiore di merozoite fagocitosi di fluorescenza GFP (Figura 3B). Il numero di merozoiti aggiunte al saggio sarà modulare la quantità di fagocitosi osservato. Per questo motivo, un conteggio preciso mediante citometria a flusso è critica. Aumentando rapporti di merozoiti: THP-1 si tradurrà in maggiore aderenza dei merozoiti di cellule THP-1 in assenza di plasma (Figura 4A). Aumentare merozoite: THP-1 ratio si traduce anche in una maggiore phrisposte agocytosis quando merozoiti sono opsonizzati (Figura 4B). A 4:01 merozoite: THP-1 ratio è raccomandato per le risposte fagocitosi robuste. Usando questo rapporto, e la diluizione del plasma indicato, questo test è in grado di risolvere bassi, intermedi e alti livelli di anticorpi opsonizzante. Tra 0 e 78 per cento di risposte fagocitosi sono state osservate utilizzando campioni di plasma PNG e le altre condizioni descritte. Tali risposte sono state recentemente dimostrato di associarsi con l&#39;immunità clinica acquisita naturalmente alla malaria 10. Figura 5 mostra esempi di 4 quartili di risposte fagocitosi da privati ​​PNG. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51590/51590fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1. Tempi della E64 Inoltre è fondamentale per la generazione di merozoiti membrana chiusa. (A) maturatio appropriato. n fase di parassiti i) prima del trattamento E64, e ii) merozoiti membrana chiusa prodotti dopo 6 ore di trattamento E64 (B) membrana merozoites chiusi non vengono generati se E64 viene aggiunto ai parassiti immaturi; i) trofozoiti tardivamente, e ii) dopo 12 ore di E64 (C) schizonte la rottura non è inibito se E64 è aggiunto segmentato in ritardo schizonti.; i) schizonti fase avanzata, e ii) dopo 6 ore di E64. Barra della scala rappresenta 10 micron. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51590/51590fig2highres.jpg" width="500" /> Figura 2. Rimozione hemozoin è fondamentale per generare una sospensione merozoite cella singola. Aggregati merozoite-hemozoin formano a seguito di filtrazione a membrana merozoiti chiusi, a meno che hemozoin è magneticamente separato dal merozoiti. (A) Forward-scatter e side-scatter appezzamenti di merozoiti con hemozoin rimossoe hemozoin mantenuto. (B) aggregati hemozoin-merozoite possono essere fagocitati dalle cellule THP-1. Diff-Quick colorati diapositive cito spin di cellule THP-1 incubati con PNG plasma opsonizzati preparazioni merozoite con o senza hemozoin. Barra della scala rappresenta 10 micron. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51590/51590fig3highres.jpg" width="500" /> Figura 3. Colorazione con etidio bromuro consente per la risoluzione superiore di merozoite fagocitosi. D10-GFP merozoites purificate sono di contrasto con EtBr per migliorare intensità di fluorescenza. (A) citometria a flusso histrogram di merozoiti purificati con gating su GFP merozoites positivi, e una macchia dot mostra EtBr fluorescenza all&#39;interno di questa popolazione GFP positive gated. (B) scatter in avanti rispetto GFP e scatter in avanti rispetto EtBr di cellule THP-1 a seguito fagocitosi di merozoiti fluorescenti dual GFP e EtBr. Gates sono stati d<html> Rawn basato sulle cellule THP-1 con merozoiti e nessun controllo di plasma. <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51590/51590fig4highres.jpg" width="500" /> Figura 4 Il merozoite:. THP-1 ratio influisce sul grado di fagocitosi osservato. (A) Cinque merozoite: THP-1 ratio sono raffigurate; 50:1, 20:01, 10:01, 04:01, 01:01. Solo le cellule di controllo indica fluorescenza di fondo a causa di cellule THP-1. THP-1 EtBr fluorescenza per ciascun rapporto è indicato per merozoites opsonizzati con un pool di plasma o PNG con il plasma non immune australiano (B) Media fluorescenza intensità di cellule THP-1 per diverso merozoite:. THP-1 ratio, e opsonization con piscina di PNG plasma o plasma non immune australiano (media + SEM). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51590/51590fig4highres.jpg" target="_blank">cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> ove_content &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Figura 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51590/51590fig5highres.jpg" width="500" /> Figura 5. Un&#39;ampia gamma di anticorpi opsonizzante può essere misurata. Merozoiti stati opsonizzati con plasma da individui PNG e incubati con cellule THP-1. Vengono mostrati quattro risposte fagocitosi rappresentativi. Gates sono state elaborate sulla base di cellule THP-1 con merozoites e nessun controllo di plasma e numeri indicano la fagocitosi% dopo la sottrazione delle cellule THP-1 con controllo di plasma non-immune. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51590/51590fig5highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

Funzione di misura anticorpo è la chiave per comprendere l&#39;immunità a malaria da Plasmodium falciparum. Questo metodo descrive la purificazione di merozoiti vitali, e la misurazione di opsonizzazione-dipendente fagocitosi mediante citometria di flusso.

High Yield Purificazione di<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; Merozoiti Per l&#39;uso in opsonizzante anticorpo saggi

Plasmodium falciparum merozoite antigens are under development as potential malaria vaccines. One aspect of immunity against malaria is the removal of ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

22.7K Views.  Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research.  Funzione di misura anticorpo è la chiave per comprendere l'immunità a malaria da Plasmodium falciparum. Questo metodo descrive la purificazione di merozoiti vitali, e la misurazione di opsonizzazione-dipendente fagocitosi mediante citometria di flusso. 

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Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

Most human malaria deaths are caused by blood-stage Plasmodium falciparum parasites. Cerebral malaria, the most life-threatening complication of the disease, is characterised by an accumulation of Plasmodium falciparum infected red blood cells (iRBC) at pigmented trophozoite stage in the microvasculature of the brain2-4. This microvessel obstruction (sequestration) leads to acidosis, hypoxia and harmful inflammatory cytokines (reviewed in 5). Sequestration is also found in most microvascular tissues of the human body2, 3. The mechanism by which iRBC attach to the blood vessel walls is still poorly understood.
The immortalized Human Brain microvascular Endothelial Cell line (HBEC-5i) has been used as an in vitro model of the blood-brain barrier6. However, Plasmodium falciparum iRBC attach only poorly to HBEC-5i in vitro, unlike the dense sequestration that occurs in cerebral malaria cases. We therefore developed a panning assay to select (enrich) various P. falciparum strains for adhesion to HBEC-5i in order to obtain populations of high-binding parasites, more representative of what occurs in vivo.
A sample of a parasite culture (mixture of iRBC and uninfected RBC) at the pigmented trophozoite stage is washed and incubated on a layer of HBEC-5i grown on a Petri dish. After incubation, the dish is gently washed free from uRBC and unbound iRBC. Fresh uRBC are added to the few iRBC attached to HBEC-5i and incubated overnight. As schizont stage parasites burst, merozoites reinvade RBC and these ring stage parasites are harvested the following day. Parasites are cultured until enough material is obtained (typically 2 to 4 weeks) and a new round of selection can be performed. Depending on the P. falciparum strain, 4 to 7 rounds of selection are needed in order to get a population where most parasites bind to HBEC-5i. The binding phenotype is progressively lost after a few weeks, indicating a switch in variant surface antigen gene expression, thus regular selection on HBEC-5i is required to maintain the phenotype.
In summary, we developed a selection assay rendering P. falciparum parasites a more "cerebral malaria adhesive" phenotype. We were able to select 3 out of 4 P. falciparum strains on HBEC-5i. This assay has also successfully been used to select parasites for binding to human dermal and pulmonary endothelial cells. Importantly, this method can be used to select tissue-specific parasite populations in order to identify candidate parasite ligands for binding to brain endothelium. Moreover, this assay can be used to screen for putative anti-sequestration drugs7.

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

An in vitro model for cerebral malaria sequestration is described1. Plasmodium falciparum infected red blood cells are selected for binding to immortalized human brain microvascular endothelial cells. The selected parasites show a distinct phenotype. The selection process can be applied using various P. falciparum strains and endothelial cell lines.

Selezione di Plasmodium falciparum Parassiti per Cytoadhesion alle cellule cerebrali umane endoteliali

Most human malaria deaths are caused by blood-stage Plasmodium falciparum parasites. Cerebral malaria, the most life-threatening complication of the ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

Plasmodium falciparum, the causative agent of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important health problems worldwide, being responsible for a total of 4 million deaths annually1. Due to their extensive overlap in developing regions, especially Sub-Saharan Africa, co-infections with malaria and HIV-1 are common, but the interplay between the two diseases is poorly understood. Epidemiological reports have suggested that malarial infection transiently enhances HIV-1 replication and increases HIV-1 viral load in co-infected individuals2,3. Because this viremia stays high for several weeks after treatment with antimalarials, this phenomenon could have an impact on disease progression and transmission.
The cellular immunological mechanisms behind these observations have been studied only scarcely. The few in vitro studies investigating the impact of malaria on HIV-1 have demonstrated that exposure to soluble malarial antigens can increase HIV-1 infection and reactivation in immune cells. However, these studies used whole cell extracts of P. falciparum schizont stage parasites and peripheral blood mononuclear cells (PBMC), making it hard to decipher which malarial component(s) was responsible for the observed effects and what the target host cells were4,5. Recent work has demonstrated that exposure of immature monocyte-derived dendritic cells to the malarial pigment hemozoin increased their ability to transfer HIV-1 to CD4+ T cells6,7, but that it decreased HIV-1 infection of macrophages8. To shed light on this complex process, a systematic analysis of the interactions between the malaria parasite and HIV-1 in different relevant human primary cell populations is critically needed.
Several techniques for investigating the impact of HIV-1 on the phagocytosis of micro-organisms and the effect of such pathogens on HIV-1 replication have been described. We here present a method to investigate the effects of P. falciparum-infected erythrocytes on the replication of HIV-1 in human primary monocyte-derived macrophages. The impact of parasite exposure on HIV-1 transcriptional/translational events is monitored by using single cycle pseudotyped viruses in which a luciferase reporter gene has replaced the Env gene while the effect on the quantity of virus released by the infected macrophages is determined by measuring the HIV-1 capsid protein p24 by ELISA in cell supernatants.

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

We have developed an in vitro malaria-HIV-1 co-infection model to study the impact of Plasmodium falciparum on the HIV-1 replicative cycle in human primary monocyte-derived macrophages. This versatile system can easily be adapted to other primary cell types susceptible to HIV-1 infection.

Un<em&gt; In vitro</em&gt; Co-infezione da modello per lo studio<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt;-HIV-1 in Interazioni umane Le cellule immunitarie primarie derivate da monociti

Plasmodium falciparum, the causative agent  of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important ...

A Simple Protocol for Platelet-mediated Clumping of Plasmodium falciparum-infected Erythrocytes in a Resource Poor Setting

P. falciparum causes the majority of severe malarial infections. The pathophysiological mechanisms underlying cerebral malaria (CM) are not fully understood and several hypotheses have been put forward, including mechanical obstruction of microvessels by P. falciparum-parasitized red blood cells (pRBC). Indeed, during the intra-erythrocytic stage of its life cycle, P. falciparum has the unique ability to modify the surface of the infected erythrocyte by exporting surface antigens with varying adhesive properties onto the RBC membrane. This allows the sequestration of pRBC in multiple tissues and organs by adhesion to endothelial cells lining the microvasculature of post-capillary venules 1. By doing so, the mature forms of the parasite avoid splenic clearance of the deformed infected erythrocytes 2 and restrict their environment to a more favorable low oxygen pressure 3. As a consequence of this sequestration, it is only immature asexual parasites and gametocytes that can be detected in peripheral blood.
Cytoadherence and sequestration of mature pRBC to the numerous host receptors expressed on microvascular beds occurs in severe and uncomplicated disease. However, several lines of evidence suggest that only specific adhesive phenotypes are likely to be associated with severe pathological outcomes of malaria. One example of such specific host-parasite interactions has been demonstrated in vitro, where the ability of intercellular adhesion molecule-1 to support binding of pRBC with particular adhesive properties has been linked to development of cerebral malaria 4,5. The placenta has also been recognized as a site of preferential pRBC accumulation in malaria-infected pregnant women, with chondrotin sulphate A expressed on syncytiotrophoblasts that line the placental intervillous space as the main receptor 6. Rosetting of pRBC to uninfected erythrocytes via the complement receptor 1 (CD35)7,8 has also been associated with severe disease 9.
One of the most recently described P. falciparum cytoadherence phenotypes is the ability of the pRBC to form platelet-mediated clumps in vitro. The formation of such pRBC clumps requires CD36, a glycoprotein expressed on the surface of platelets. Another human receptor, gC1qR/HABP1/p32, expressed on diverse cell types including endothelial cells and platelets, has also been shown to facilitate pRBC adhesion on platelets to form clumps 10. Whether clumping occurs in vivo remains unclear, but it may account for the significant accumulation of platelets described in brain microvasculature of Malawian children who died from CM 11. In addition, the ability of clinical isolate cultures to clump in vitro was directly linked to the severity of disease in Malawian 12 and Mozambican patients 13, (although not in Malian 14).
With several aspects of the pRBC clumping phenotype poorly characterized, current studies on this subject have not followed a standardized procedure. This is an important issue because of the known high variability inherent in the assay 15. Here, we present a method for in vitro platelet-mediated clumping of P. falciparum with hopes that it will provide a platform for a consistent method for other groups and raise awareness of the limitations in investigating this phenotype in future studies. Being based in Malawi, we provide a protocol specifically designed for a limited resource setting, with the advantage that freshly collected clinical isolates can be examined for phenotype without need for cryopreservation.

A Simple Protocol for Platelet-mediated Clumping of Plasmodium falciparum-infected Erythrocytes in a Resource Poor Setting

This method investigates the platelet-mediated clumping phenotype of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes (pRBC) in clinical isolates. This is performed by isolating and co-incubating platelet-rich plasma and a suspension of pRBC.

Un semplice protocollo per Clumping piastrinica mediata da<em&gt; Plasmodium falciparum</emEritrociti&gt; infette in una risorsa Povero Setting

P. falciparum causes the majority of severe malarial infections. The pathophysiological mechanisms underlying cerebral malaria (CM) are not fully ...

Separation of Plasmodium falciparum Late Stage-infected Erythrocytes by Magnetic Means

Unlike other Plasmodium species, P. falciparum can be cultured in the lab, which facilitates its study 1. While the parasitemia achieved can reach the &asymp;40% limit, the investigator usually keeps the percentage at around 10%. In many cases it is necessary to isolate the parasite-containing red blood cells (RBCs) from the uninfected ones, to enrich the culture and proceed with a given experiment. 
When P. falciparum infects the erythrocyte, the parasite degrades and feeds from haemoglobin 2, 3. However, the parasite must deal with a very toxic iron-containing haem moiety 4, 5. The parasite eludes its toxicity by transforming the haem into an inert crystal polymer called haemozoin 6, 7. This iron-containing molecule is stored in its food vacuole and the metal in it has an oxidative state which differs from the one in haem 8. The ferric state of iron in the haemozoin confers on it a paramagnetic property absent in uninfected erythrocytes. As the invading parasite reaches maturity, the content of haemozoin also increases 9, which bestows even more paramagnetism on the latest stages of P. falciparum inside the erythrocyte.
Based on this paramagnetic property, the latest stages of P. falciparum infected-red blood cells can be separated by passing the culture through a column containing magnetic beads. These beads become magnetic when the columns containing them are placed on a magnet holder. Infected RBCs, due to their paramagnetism, will then be trapped inside the column, while the flow-through will contain, for the most part, uninfected erythrocytes and those containing early stages of the parasite.
Here, we describe the methodology to enrich the population of late stage parasites with magnetic columns, which maintains good parasite viability 10. After performing this procedure, the unattached culture can be returned to an incubator to allow the remaining parasites to continue growing.

Separation of Plasmodium falciparum Late Stage-infected Erythrocytes by Magnetic Means

The paramagnetic properties of hemozoin are used to isolate late stages of Plasmodium falciparum-infected red blood cells growing in culture. The method is simple and fast and does not affect the subsequent invasive capabilities of the parasites.

Separazione dei<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; Fine Stage-eritrociti infettati da mezzi magnetici

Unlike other Plasmodium species, P. falciparum can be cultured in the lab, which facilitates its study 1. While the parasitemia achieved can reach the ...

Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

The genetic variation responsible for the sickle cell allele (HbS) enables erythrocytes to resist infection by the malaria parasite, P. falciparum. The molecular basis of this resistance, which is known to be multifactorial, remains incompletely understood. Recent studies found that the differential expression of erythrocyte microRNAs, once translocated into malaria parasites, affect both gene regulation and parasite growth. These miRNAs were later shown to inhibit mRNA translation by forming a chimeric RNA transcript via 5&#39; RNA fusion with discreet subsets of parasite mRNAs. Here, the techniques that were used to study the functional role and putative mechanism underlying erythrocyte microRNAs on the gene regulation and translational potential of P. falciparum, including the transfection of modified synthetic microRNAs into host erythrocytes, will be detailed.&#160; Finally, a polysome gradient method is used to determine the extent of translation of these transcripts. Together, these techniques allowed us to demonstrate that the dysregulated levels of erythrocyte microRNAs contribute to cell-intrinsic malaria resistance of sickle erythrocytes.

Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

Human microRNAs translocate from host erythrocytes to Plasmodium falciparum parasites. Here, the techniques used to transfect synthetic microRNAs into host erythrocytes and isolate all RNAs from P. falciparum are described. In addition, this paper will detail a method of polysome isolation in P. falciparum to determine the ribosomal occupancy and translational potential of parasite transcripts.

Metodi per studiare il ruolo di regolamentazione dei piccoli RNA ribosomiale e di occupazione<em&gt; Plasmodium falciparum</em

The genetic variation responsible for the sickle cell allele (HbS) enables erythrocytes to resist infection by the malaria parasite, P. falciparum. The ...

An Efficient and High Yield Method for Isolation of Mouse Dendritic Cell Subsets

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen presenting molecules to initiate T-cell-mediated immunity. Dendritic cells can be separated into several phenotypically and functionally heterogeneous subsets. Three important subsets of splenic dendritic cells are plasmacytoid, CD8&#945;Pos and CD8&#945;Neg cells. The plasmacytoid DCs are natural producers of type I interferon and are important for anti-viral T cell immunity. The CD8&#945;Neg DC subset is specialized for MHC class II antigen presentation and is centrally involved in priming CD4 T cells. The CD8&#945;Pos DCs are primarily responsible for cross-presentation of exogenous antigens and CD8 T cell priming. The CD8&#945;Pos DCs have been demonstrated to be most efficient at the presentation of glycolipid antigens by CD1d molecules to a specialized T cell population known as invariant natural killer T (iNKT) cells. Administration of Flt-3 ligand increases the frequency of migration of dendritic cell progenitors from bone marrow, ultimately resulting in expansion of dendritic cells in peripheral lymphoid organs in murine models. We have adapted this model to purify large numbers of functional dendritic cells for use in cell transfer experiments to compare in vivo proficiency of different DC subsets.

Distinct dendritic cell subsets exist as rare populations in lymphoid organs, and therefore are challenging to isolate in sufficient numbers and purity for immunological experiments. Here we describe a high efficiency, high yield method for isolation of all of the currently known major subsets of mouse splenic dendritic cells.

Un metodo del rendimento efficiente e di alta per l&#39;isolamento di mouse dendritiche sottopopolazioni cellulari

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen ...

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to A(H3N2) Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

Neutralizing antibodies against hemagglutinin (HA) of influenza viruses are considered the main immune mechanism that correlates with protection for influenza infections. Microneutralization (MN) assays are often used to measure neutralizing antibody responses in human sera after influenza vaccination or infection. Madine Darby Canine Kidney (MDCK) cells are the commonly used cell substrate for MN assays. However, currently circulating 3C.2a and 3C.3a A(H3N2) influenza viruses have acquired altered receptor binding specificity. The MDCK-SIAT1 cell line with increased &#945;-2,6 sialic galactose moieties on the surface has proven to provide improved infectivity and more faithful replications than conventional MDCK cells for these contemporary A(H3N2) viruses. Here, we describe a MN assay using MDCK-SIAT1 cells that has been optimized to quantify neutralizing antibody titers to these contemporary A(H3N2) viruses. In this protocol, heat inactivated sera containing neutralizing antibodies are first serially diluted, then incubated with 100 TCID50/well of influenza A(H3N2) viruses to allow antibodies in the sera to bind to the viruses. MDCK-SIAT1 cells are then added to the virus-antibody mixture, and incubated for 18 - 20 h at 37 &#176;C, 5% CO2 to allow A(H3N2) viruses to infect MDCK-SIAT1 cells. After overnight incubation, plates are fixed and the amount of virus in each well is quantified by an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using anti-influenza A nucleoprotein (NP) monoclonal antibodies. Neutralizing antibody titer is defined as the reciprocal of the highest serum dilution that provides &#8805;50% inhibition of virus infectivity.

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to AH3N2 Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

Influenza neutralizing antibodies correlate with protection of influenza infections. Microneutralization assays measure neutralizing antibodies in human sera and are often used for influenza human serology. We describe a microneutralization assay using MDCK-SIAT1 cells to measure neutralizing antibody titers to contemporary 3C.2a and 3C.3a A(H3N2) viruses following influenza vaccination or infection.

Neutralizzando le risposte dell'anticorpo al virus A(H3N2) in sieri umani di Microneutralization l'Influenza di misurazione analisi utilizzando cellule MDCK-SIAT1

Neutralizing antibodies against hemagglutinin (HA) of influenza viruses are considered the main immune mechanism that correlates with protection for ...

Electrochemiluminescence Assays for Human Islet Autoantibodies

Pinpointing islet autoantibodies associated with type 1 diabetes (T1D) leads the way to project and deter this disease in the general population. A novel ECL assay is a nonradioactive fluid phase assay for islet autoantibodies with higher sensitivity and specificity than the current 'gold' standard radio-binding assay (RBA). ECL assays can more precisely define the onset of presymptomatic T1D by distinguishing the high-risk, high-affinity autoantibodies from the low-risk, low-affinity autoantibodies generated in RBAs, and conventional enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA). The antigen protein used in this ECL assay is labeled with Sulfo-tag and Biotin, respectively. Each ECL autoantibody assay that uses a particular antigen protein needs an optimization step before it can be used for laboratory application. This step is especially vital in determining the requirements for serum acid treatments, concentrations, and ratios of the two different antigens labeled with Sulfo-tag and Biotin. To perform the assay, serum samples are mixed with Sulfo-tag-conjugated and biotinylated capture antigen protein in phosphate buffered solution (PBS), containing 5% Bovine Serum Albumin (BSA). Afterwards, the samples are incubated overnight at 4 &#176;C. The same day, a streptavidin-coated plate is prepared with blocker buffer and incubated overnight at 4 &#176;C. On the second day, wash the streptavidin plate and transfer the serum-antigen mixture onto the plate. Place the plate on the plate shaker, set it at low speed, and incubate at room temperature for 1 h. Subsequently, the plate is washed again, and reader buffer is added. The plate is then counted on the plate reader machine. The results are conveyed through an index, which is generated from internal standard positive and negative control serum samples.

Here, we presented the methods to detect human islet autoantibodies using electrochemiluminescence (ECL) assays. The protocol, used to predict type 1 diabetes, can be expanded upon to detect autoantibodies for other autoimmune diseases.

Saggi di elettrochemiluminescenza autoanticorpi anti-umano dell'isolotto

Pinpointing islet autoantibodies associated with type 1 diabetes (T1D) leads the way to project and deter this disease in the general population. A novel ...

Purification of a High Molecular Mass Protein in Streptococcus mutans

Elucidation of a gene&#39;s function typically involves comparison of phenotypic traits of wild-type strains and strains in which the gene of interest has been disrupted. Loss of function following gene disruption is subsequently restored by exogenous addition of the product of the disrupted gene. This helps to determine the function of the gene. A method previously described involves generating a gtfC gene-disrupted Streptococcus mutans strain. Here, an undemanding method is described for purifying the gtfC gene product from the newly generated S. mutans strain following the gene disruption. It involves the addition of a polyhistidine-coding sequence at the 3&#8242; end of the gene of interest, which allows simple purification of the gene product using immobilized metal affinity chromatography. No enzymatic reactions other than PCR are required for the genetic modification in this method. The restoration of the gene product by exogenous addition after gene disruption is an efficient method for determining gene function, which may also be adapted to different species.

Purification of a High Molecular Mass Protein in Streptococcus mutans

Described here is a simple method for the purification of a gene product in Streptococcus mutans. This technique may be advantageous in the purification of proteins, especially membrane proteins and high molecular mass proteins, and can be used with various other bacterial species.

Purificazione di una proteina di massa molecolare elevata in Streptococcus mutans

Elucidation of a gene&#39;s function typically involves comparison of phenotypic traits of wild-type strains and strains in which the gene of interest has ...

Purification of High Yield Extracellular Vesicle Preparations Away from Virus

One of the major hurdles in the field of extracellular vesicle (EV) research today is the ability to achieve purified EV preparations in a viral infection setting. The presented method is meant to isolate EVs away from virions (i.e., HIV-1), allowing for a higher efficiency and yield compared to conventional ultracentrifugation methods. Our protocol contains three steps: EV precipitation, density gradient separation, and particle capture. Downstream assays (i.e., Western blot, and PCR) can be run directly following particle capture. This method is advantageous over other isolation methods (i.e., ultracentrifugation) as it allows for the use of minimal starting volumes. Furthermore, it is more user friendly than alternative EV isolation methods requiring multiple ultracentrifugation steps. However, the presented method is limited in its scope of functional EV assays as it is difficult to elute intact EVs from our particles. Furthermore, this method is tailored towards a strictly research-based setting and would not be commercially viable.

This protocol isolates extracellular vesicles (EVs) away from virions with high efficiency and yield by incorporating EV precipitation, density gradient ultracentrifugation, and particle capture to allow for a streamlined workflow and a reduction of starting volume requirements, resulting in reproducible preparations for use in all EV research.

Purificazione dei preparati vescicoli extracellulari ad alto rendimento lontano dal virus

One of the major hurdles in the field of extracellular vesicle (EV) research today is the ability to achieve purified EV preparations in a viral infection ...