JQW, SZ, SD and KC are supported by grant from the National Institutes of Health and the Staman Ogilvie Fund&#8212;Memorial Hermann Foundation.

1. EML coltura cellulare e la separazione delle cellule Lin-CD34 + e CD34- Lin-Utilizzo di cellule del sistema magnetico e ordinamento fluorescenza-attivato delle cellule metodo di ordinamento <ol><li> Preparazione di criceti neonati rene (BHK) terreno di coltura di cellule staminali per il fattore di cella di raccolta: <ol><li> Culture cellule BHK in DMEM contenente 10% FBS nel 25 cm 2 beuta (Tabella 1) a 37 ° C, 5% CO 2 in un incubatore di coltura cellulare. </li><li> Quando le cellule crescono al 80 - 90% di confluenza, le cellule lavare una volta con 10 ml di PBS. Aggiungere 5 ml di 0,25% soluzione di tripsina-EDTA al monostrato e incubare le cellule per 1-5 minuti a temperatura ambiente (RT) fino a quando le cellule vengono staccate. </li><li> Preparare la soluzione su e giù delicatamente per rompere grumi di cellule. Aggiungere 5 ml di DMEM completo al pallone per fermare le attività tripsina. Raccogliere le cellule per centrifugazione a 200 xg per 5 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Rimuovere il mezzo e risospendere il pellet cellulare in 10 ml di BHK fresco mezzo di coltura cellulare. </li&gt; <li> Trasferire 2 ml della sospensione cellulare dal punto 1.1.4 a un nuovo pallone 75 centimetri 2 e aggiungere 48 ml di mezzo di coltura cellulare fresca BHK al pallone. </li><li> Coltivare le cellule BHK per due giorni e raccolgono il terreno di coltura. Passaggio il mezzo attraverso un filtro da 0,45 micron. Conservare il mezzo di -20 ° C fino all&#39;utilizzo. </li></ol></li><li> Coltura cellulare EML: <ol><li> Culture cellule EML (in sospensione) in ambiente basico EML contenenti BHK coltura cellulare (Tabella 1) a 37 ° C, 5% CO 2 in un incubatore di coltura cellulare. </li><li> Mantenere le cellule EML a bassa densità cellulare (0,5-5 x 10 5 cellule / ml) con la densità di picco meno di 6 x 10 5 cellule / ml. Dividere le celle ogni 2-3 giorni nel rapporto di 1: 5. Cellule Passage EML delicatamente e scartare la cultura dopo passaging per 10 generazioni. </li></ol></li><li> L&#39;esaurimento delle cellule positive lignaggio: <ol><li> Raccogliere le cellule EML per centrifugazione a 200 xg for 5 min e lavare le cellule una volta con PBS. Raccogliere le cellule per centrifugazione a 200 xg per 5 min. </li><li> Risospendere le cellule con PBS e contare le cellule con un emocitometro. Determinare la concentrazione dell&#39;anticorpo nella successiva fase di separazione cellulare secondo il numero delle celle (consultare le istruzioni offerte dal gestore del sistema di isolamento delle cellule). </li><li> Isolare il negativo lineage (Lin-) cellule utilizzando un cocktail di anticorpi stirpe (cocktail di anticorpi monoclonali coniugati con biotina CD5, CD45R (B220), CD11b, Anti-Gr-1 (Ly-6G / C), 7-4 e Ter-119 ) ed un sistema magnetico attivato cell sorting secondo le istruzioni del produttore. </li></ol></li><li> Separazione di cellule Lin-CD34 + e Lin-CD34-: <ol><li> Centrifugare le cellule lin- dal punto 1.3.3 a 200 xg per 5 min. Risospendere il pellet di cellule con PBS e contare le cellule con un emocitometro. </li><li> Lavare le cellule due volte con tampone FACS e agglomerare le cellule a 200 xgper 5 min. </li><li> Etichettare cinque provette da microcentrifuga da 1,5 ml con, rispettivamente, il numero 1, 2, 3, 4, 5. Risospendere le cellule con 100 microlitri tampone FACS per 10 6 cellule (10 6 cellule per provetta). </li><li> Aggiungere 1 mg di anticorpo anti-topo CD34 FITC nella provetta 1 e 2 del tubo e mescolare delicatamente le provette. </li><li> Incubare tutte le provette a 4 ° C per 1 ora al buio. </li><li> Aggiungere 0,25 mg di anticorpi anti-Sca1 PE-coniugato e 20 l di APC-coniugato anticorpi Lineage Cocktail a tubo 1, 0,25 mg di PE-coniugato anticorpo anti-Sca1 a tubo 3, e 20 ml di anticorpi APC-coniugati Lineage cocktail a tubo 4. </li><li> Mescolare tutti i tubi delicatamente e incubare le cellule a 4 ° C per altri 30 minuti al buio. </li><li> Aggiungere 300 microlitri di tampone FACS di cellule e centrifugare le cellule a 200 xg per 5 min. </li><li> Lavare le cellule con 500 microlitri di tampone FACS per tre volte. </li><li> Risospendere il pellet di cellule in 500 ml di FACS buffer. </li><li> Utilizzare le cellule in tubi 2, 3, 4 e 5 per l&#39;impostazione di compensazione. Isolare le cellule Lin-SCA + CD34 + e Lin-SCA-CD34- in tubo 1 utilizzando FACS Aria. </li></ol></li></ol> 2. RNA Preparazione e Biblioteca di costruzione di high-throughput Sequencing <ol><li> Isolamento, analisi della qualità e quantificazione di RNA: <ol><li> Estratto RNA totale da Lin-CD34 + e le cellule Lin-CD34- rispettivamente utilizzando TRIzol seguendo il protocollo produce &#39;. </li><li> Rimuovere il DNA utilizzando deossiribonucleasi contaminati I (DNasi I) seguendo il protocollo del produttore. Facoltativamente, conservare l&#39;RNA a -80 ° C in questa fase per un ulteriore uso. </li><li> Valutare la qualità di RNA totale usando Bioanalyzer secondo le indicazioni offerte dal fornitore. Utilizzare campione di RNA con RNA Integrity Number (RIN) lager di 9. </li></ol></li><li> Biblioteca Edilizia e high-throughput sequencing: NOTA: Questo protocollo descrive RNA-Seq utilizzando la piattaforma Illumina. Peraltre piattaforme di sequenziamento, sono necessari diversi metodi di preparazione di libreria. <ol><li> Utilizzare 0,1-4 mg di RNA totale di alta qualità a campione per la preparazione biblioteca. Normalmente 2 mg di RNA totale può essere estratto da 10 5 cellule EML. </li><li> Utilizzare un sistema di preparazione del campione di RNA-sequenziamento per la purificazione dell&#39;RNA e frammentazione, prima e seconda sintesi filamento di cDNA, riparazione fine, 3 &#39;estremità adenylation, adattatore di legatura e amplificazione PCR, seguendo le procedure standard dettagliati di istruzioni del fornitore. <ol><li> Positivamente selezionare Polya mRNA utilizzando oligo-dT biglie magnetiche e frammentare l&#39;mRNA. </li><li> Eseguire la trascrizione inversa utilizzando primer casuali per ottenere il cDNA e successivamente sintetizzare il secondo filone di cDNA per generare doppia elica del DNA. </li><li> Rimuovere le &quot;sporgenze e riempire il 5 &#39;3 sbalzi di DNA polimerasi. Adenylate 3 &#39;estremità per evitare frammenti di cDNA dal legando tra loro.</li><li> Aggiungi adattatori indicizzazione multiplex a entrambe le estremità del dscDNA. Eseguire PCR per l&#39;arricchimento di frammenti di DNA. </li></ol></li><li> Misurare la A260 / A280 per ottenere informazioni sulla concentrazione di libreria utilizzando uno spettrofotometro. </li><li> Valutare la qualità biblioteca e misurare la gamma di dimensioni dei frammenti di DNA utilizzando un Bioanalyzer. </li></ol></li></ol> Analisi 3. Dati Per avere un riferimento del software utilizzato in questa parte, si veda (Tabella 2). <ol><li> L&#39;elaborazione dei file di dati per l&#39;analisi a valle: <ol><li> Convertire .bcl (file chiamata di base) file per .fastq di file utilizzando il software Casava (Illumina, versione 1.8.2). <ol><li> Accendi il &#39;Terminal&#39; nel sistema Linux. Passare alla cartella di dati che contiene i file di dati da una macchina per il sequenziamento Illumina HiSeq2000. Supponiamo che la cartella risultato è &#39;NASboy1 / JiaqianLabData / HiSeq_RUN / 2013_07_11 / 130627_SN860_0309_A_2013-166_H0PW9ADXX /&#39;, tiponel comando in Figura S1A, e inserire la cartella dei dati. </li><li> Installare Casava 1.8.2 nel sistema Linux. Supponiamo che il outputfolder è &#39;Unaligned&#39;, utilizzare il comando in Figura S1B per preparare il file di configurazione per la conversione. Utilizzare l&#39;opzione --fastq-cluster-count 0 per garantire la si crea solo un file .fastq per ogni campione. Il file .fastq generato è in formato .gz. Decomprimerlo per l&#39;analisi a valle (Figura S1 B). </li><li> Dopo che la cartella &#39;Unaligned&#39; è stato generato, passare alla cartella &#39;Unaligned&#39; (Figura S1C). </li><li> Utilizzare il comando nella Figura S1D per iniziare il processo di conversione. Il parametro &#39;-j&#39; fornisce il numero di CPU che verrà utilizzato. </li><li> Dopo che il sistema finito il processo di conversione, passare alla cartella risultato sotto la cartella &#39;Unaligned&#39; (Figura S1E). </li><li> Utilizzare il comando nella Figura S1F &lt;/ Strong&gt; per decomprimere il file .fastq.gz in .fastq file in ogni cartella del campione. </li></ol></li></ol></li><li> Rileva nuove trascrizioni e valutare il livello di espressione utilizzando Tuxedo Suite 26: <ol><li> Mappa del-end accoppiato RNA-Seq legge al genoma di riferimento del mouse (UCSC versione MM9, ottenuto da <a href="http://cufflinks.cbcb.umd.edu/igenomes.html" target="_blank">http://cufflinks.cbcb.umd.edu/igenomes.html</a> ) utilizzando il software Tophat (versione 1.3.3) 27, che utilizza la Bowtie leggere mapper (versione 0.12.7) 28. Tophat viene fornito con l&#39;opzione &quot;-no-romanzo-juncs&quot; per migliorare la precisione stima del livello di espressione. <ol><li> Inserire i file .fastq in una cartella in cui sarà attuato il processo di mappatura. Supponiamo che ci siano 2 file .fastq (rinominare in Example1.read1, Example1.read2) per un campione di sequenziamento accoppiato-fine, utilizzare il comando in Figura S2 per fare la mappatura (regolare i parametri in base alle impostazioni di sistema).Il parametro &quot;-p&quot; fornisce il numero di CPU che verrà utilizzato. I parametri &quot;r&quot; e &quot;-mate-STD-dev&quot; può essere ottenuto dalla libreria di controllo di qualità o dedotte da un sottoinsieme di allineamento legge (Figura S2). </li></ol></li><li> Montare il mappato legge in trascrizioni di RNA utilizzando il software Gemelli (versione 1.3.0) 29. Gemelli Run utilizzando il file di annotazione di geni noti (stesso file .gtf usato da Tophat) e il file .bam prodotto da Tophat. <ol><li> Dopo Tophat terminato l&#39;esecuzione, nella stessa cartella, utilizzare il comando in Figura S3A per eseguire gemelli di costruire trascrittoma e stima trascrizione livello di espressione. Il &#39;mm9_repeatMasker.gtf&#39; e file di sequenze del genoma nella cartella &#39;GenomeSeqMM9&#39; sono disponibili presso UCSC Genome Browser. </li><li> I file genes.expr e transcripts.expr risultanti contengono il valore di espressione dei geni e trascritti (isoforme). Copia e incollail contenuto del file in un file Excel e manipolare con foglio di calcolo (Figura S3B). </li><li> Utilizzare il comando nella Figura S3C per confrontare il file risultante &#39;transcripts.gtf&#39; per il file di riferimento &#39;mm9_genes.gtf&#39; al fine di identificare nuove trascrizioni. </li><li> Il file .tmap risultante contiene il risultato del confronto. Copia e incolla il contenuto del file in un file Excel e manipolare con foglio di calcolo. Trascrizioni con il codice della classe &#39;u&#39; possono essere considerati come &#39;romanzo&#39; rispetto al riferimento .gtf file fornito (Figura S3D). NOTA: Per la valle convenienza analisi, impostare i valori FPKM a 0,1 se i valori sono sotto 0.1. NOTA: Punto 3.2.3 - 3.2.6 è facoltativo per coloro che desiderano migliorare la precisione di espressione stima nuove trascrizioni. Questo richiederà un tempo molto più lungo, perché la mappatura e la costruzione del trascrittoma devono essere rdelle Nazioni Unite più di una volta. </li></ol></li><li> Eseguire Tophat con i parametri di default e quindi eseguire gemelli in file .gtf generato utilizzando il comando nella Figura S3E. </li><li> Confrontare il file .gtf risultante al file .gtf genoma di riferimento utilizzando il comando nella Figura S3F. </li><li> Analizzare il file .tmap portato come descritto nel passaggio 3.2.2.4. Copia e incolla il contenuto del file in un file Excel e manipolare con foglio di calcolo. Trascrizioni con il codice della classe &#39;u&#39; possono essere considerati come &#39;romanzo&#39; rispetto al riferimento .gtf file fornito. </li><li> Dopo il punto 3.2.5, esiste un file .combined.gtf nella cartella che può essere usato come file di riferimento .gtf. Una seconda serie di Tophat e gemelli può essere eseguita come descritto nel passaggio 3.2.1 e 3.2.2 per ottenere una più accurata stima FPKM di nuovi trascritti. </li></ol></li><li> Rileva differentially espresso geni utilizzando il pacchetto DESeq 30. <ol><li> L&#39;ingresso di DESeq è una prima tabella di conteggi di lettura. Per ottenere tale tabella, utilizzare lo script htseq-count distribuito con il pacchetto HTSeq Python che può essere scaricato dal sito HTSeq ( <a href="http://www-huber.embl.de/users/anders/HTSeq/doc/count.html" target="_blank">http://www-huber.embl.de/users/anders/HTSeq/doc/count.html</a> ) . <ol><li> Assicurarsi che samtools, pitone, e htseq-count programsare installati nel sistema. Ottenere i numeri di conteggio di lettura prime da produzione tophat utilizzando il comando nella Figura S4A. </li><li> Preparare &#39;Raw_Count_Table.txt&#39;, file &#39;ExperimentDesign.txt&#39; con Excel. Copiare e salvare il contenuto in formato .txt per il pacchetto DESeq R (figura 4J). </li><li> Installare il programma R nel sistema. Nel terminale, tipo &#39;R&#39; e premere ENTER.A messaggio sullo appearas mostrato nella Figura S4C. </li><li> Leggi &#39;Raw_Count_Table.txt &#39;,&#39; ExperimentDesign.txt &#39;in R con il comando in Figura S4D. </li><li> Caricare il pacchetto DESeq utilizzando il comando nella Figura S4E. </li><li> Condizioni di fattorizzare in R (Figura S4F). </li><li> Utilizzare il comando nella Figura S4G per eseguire il test binomiale negativo sul tavolo conteggio normalizzato. </li><li> Utilizzare il comando nella Figura S4H di geni espressi in uscita significativi differenziali in un file .csv. </li></ol></li></ol></li><li> Fattori di trascrizione Lookup &#39;(TFS) valori FPKM attraverso campioni utilizzando Excel. Intersezione DE tavolo gene e tavolo TF. I geni appartengono a entrambi tabella sono differenzialmente espressi fattori di trascrizione. <ol><li> Vai al sito <a href="http://www.bioguo.org/AnimalTFDB/download.php" target="_blank">http://www.bioguo.org/AnimalTFDB/download.php</a> e scaricare i fattori di trascrizione. Poi ricercare i fattori di trascrizione DE in Excel (&lt;<html> strong&gt; Figura S5). </li></ol></li><li> Generazione di file .bigwig per la visualizzazione del browser UCSC genoma. <ol><li> Scaricare il pacchetto software &#39;bedtools&#39; dal sito <a href="https://github.com/arq5x/bedtools2" target="_blank">https://github.com/arq5x/bedtools2</a> e installare il software nel sistema 31. Scarica gli strumenti UCSC &#39;bedGraphToBigWig&#39; dal sito <a href="http://hgdownload.cse.ucsc.edu/admin/exe/" target="_blank">http://hgdownload.cse.ucsc.edu/admin/exe/</a> e installare il software nel sistema. </li><li> Nella cartella che contiene il file .bam, utilizzare il comando in Figura S6A per convertire file .bam generato da tophat in un file .bed. </li><li> Dopo che il file .bed viene prodotto, utilizzare il comando in Figura S6B per generare file di .bigwig. Il file &#39;ChromInfo.txt&#39; può essere ottenuto dal seguente URL:Arget = &quot;_blank&quot;&gt; http://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/mm9/database/chromInfo.txt.gz. </li><li> Osservare una traccia personalizzata su UCSC Genome Browser. Consultare il sito Web <a href="http://genome.ucsc.edu/goldenPath/help/customTrack.html" target="_blank">http://genome.ucsc.edu/goldenPath/help/customTrack.html</a> su come visualizzare un brano personalizzato utilizzando il browser genoma UCSC. </li></ol></li></ol><img alt="Figura S1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52104/52104supplementalfig1.jpg" /> Figura S1: Conversione di file .bcl a .fastq di file utilizzando il software Casava. <img alt="Figura S2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52104/52104supplementalfig2.jpg" /> Figura S2: Mapping legge di riferimento genoma utilizzando Tophat. <img alt="Figura S3" fo:contenda-width = src &quot;5in&quot; = &quot;/ files / ftp_upload / 52104 / 52104supplementalfig3.jpg&quot; /&gt; Figura S3: Individuazione di nuovi trascrizioni e la stima livello di espressione. <img alt="Figura S4" fo:content-width="3.4in" src="/files/ftp_upload/52104/52104supplementalfig4.jpg" /> Figura S4: Richiamo differenziale dei geni espressi utilizzando DESeq pacchetto. <img alt="Figura S5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52104/52104supplementalfig5.jpg" /> Figura S5: Identificazione dei fattori di trascrizione differenzialmente espressi. <img alt="Figura S6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52104/52104supplementalfig6.jpg" /> Figura S6: Conversione risultato della mappatura per la visualizzazione dei dati.

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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TopHat:+discovering+splice+junctions+with+RNA-Seq.">TopHat: discovering splice junctions with RNA-Seq.</a> Bioinformatics. 25, 1105-1111 (2009).</li><li>Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+and+memory-efficient+alignment+of+short+DNA+sequences+to+the+human+genome.">Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome.</a> Genome biology. 10, 25 (2009).</li><li>Trapnell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcript+assembly+and+quantification+by+RNA-Seq+reveals+unannotated+transcripts+and+isoform+switching+during+cell+differentiation.">Transcript assembly and quantification by RNA-Seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation.</a> Nature. 28, 511-515 (2010).</li><li>Anders, S., Huber, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+analysis+for+sequence+count+data.">Differential expression analysis for sequence count data.</a> Genome biology. 11, 106 (2010).</li><li>Quinlan, A. R., Hall, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BEDTools:+a+flexible+suite+of+utilities+for+comparing+genomic+features.">BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features.</a> Bioinformatics. 26, 841-842 (2010).</li><li>Cheranova, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-seq+analysis+of+transcriptomes+in+thrombin-treated+and+control+human+pulmonary+microvascular+endothelial+cells.">RNA-seq analysis of transcriptomes in thrombin-treated and control human pulmonary microvascular endothelial cells.</a> J Vis Exp. , (2013).</li><li>Zhang, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AnimalTFDB:+a+comprehensive+animal+transcription+factor+database.">AnimalTFDB: a comprehensive animal transcription factor database.</a> Nucleic acids research. 40, 144-149 (2012).</li><li>Wu, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+analysis+of+transcribed+loci+in+ENCODE+regions+using+RACE+sequencing+reveals+extensive+transcription+in+the+human+genome.">Systematic analysis of transcribed loci in ENCODE regions using RACE sequencing reveals extensive transcription in the human genome.</a> Genome Biol. 9, 3 (2008).</li><li>Wu, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+RT-PCR+recovery+of+full-length+cDNA+clones.">Large-scale RT-PCR recovery of full-length cDNA clones.</a> Biotechniques. 36, 690-696 (2004).</li><li>Wu, J. Q., Shteynberg, D., Arumugam, M., Gibbs, R. A., Brent, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+rat+genes+by+TWINSCAN+gene+prediction,+RT-PCR,+and+direct+sequencing.">Identification of rat genes by TWINSCAN gene prediction, RT-PCR, and direct sequencing.</a> Genome Res. 14, 665-671 (2004).</li><li>Dewey, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+identification+of+novel+human+genes+through+simultaneous+gene+prediction+in+human,+mouse,+and+rat.">Accurate identification of novel human genes through simultaneous gene prediction in human, mouse, and rat.</a> Genome Res. 14, 661-664 (2004).</li><li>Wu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Characterize Mammalian Transcriptome Complexity. , (2011).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Trascrittoma mammiferi è molto complessa 34-38. La tecnologia RNA-Seq svolge un ruolo sempre più importante negli studi di analisi del trascrittoma, romanzo di rilevamento trascrizioni e singolo nucleotide variante scoperta ecc Ha molti vantaggi rispetto ad altri metodi di analisi di espressione genica. Come accennato nell&#39;introduzione, supera i manufatti ibridazione di microarray e può essere utilizzato per identificare nuovi trascritti de novo. Una limitazione di RNA-sequenza...

Le cellule staminali ematopoietiche sono globuli rari che si trovano soprattutto nel midollo osseo degli adulti nicchia. Essi sono responsabili per la produzione di cellule necessarie per ricostituire il sangue e il sistema immunitario 1. Come una sorta di cellule staminali, cellule staminali emopoietiche sono in grado sia di auto-rinnovamento e differenziazione. Chiarire i meccanismi che controllano la decisione destino delle cellule staminali emopoietiche, nei confronti sia self-renewal o differenziazione, offrirà preziose indicazioni sulla manipolazione di cellule staminali emopoietiche per ricerche di malattie del sangue e l&#39;utilizzo clinico 2. Un problema affrontato dai ricercatori è che CSE possono essere mantenuti e espanse in vitro in misura molto limitata; la maggior parte della loro progenie sono parzialmente differenziati in coltura 2. Al fine di identificare regolatori chiave che controllano i processi di auto-rinnovamento e differenziazione in scala tutto il genoma, abbiamo usato un mouse primitiva linea di cellule progenitrici ematopoietiche EML come sistema modello. Thè linea cellulare è stata derivata da midollo osseo murino 3,4. Quando alimentato con diversi fattori di crescita, le cellule EML possono differenziarsi in eritroide, mieloide e cellule linfoidi in vitro 5. È importante sottolineare che questa linea cellulare può essere propagato in grande quantità nel terreno di coltura contenente fattore delle cellule staminali (SCF) e mantenendo la loro multipotenzialità. Cellule EML possono essere separati in sottopopolazioni di auto-rinnovamento Lin-SCA + CD34 + e le cellule parzialmente differenziate Lin-SCA-CD34- basati su marcatori di superficie CD34 e SCA 6. Simile a breve termine CSE, SCA + CD34 + cellule sono in grado di auto-rinnovamento. Se trattati con cellule CD34 + SCF, Lin-SCA + possono rapidamente rigenerare una popolazione mista di cellule CD34 + e Lin-SCA-CD34- Lin-SCA + e continuano a proliferare 6. Le due popolazioni sono simili nella morfologia e hanno simili livelli di c-kit mRNA e proteina 6. Cellule Lin-SCA-CD34- sono in grado di propagare in mezzi contenenti IL-3, invece di SCF 3. Unveiling i regolatori chiave nella decisione EML destino delle cellule offrirà una migliore comprensione dei meccanismi cellulari e molecolari nei primi mesi di transizione dello sviluppo durante l&#39;ematopoiesi. Al fine di indagare le differenze molecolari alla base tra l&#39;auto-rinnovamento Lin-SCA + CD34 + e le cellule Lin-SCA-CD34- parzialmente differenziati, abbiamo utilizzato l&#39;RNA-Seq per identificare i geni differenzialmente espressi. In particolare, ci concentriamo su fattori di trascrizione, come fattori di trascrizione sono cruciali nel determinare il destino delle cellule. RNA-Seq è un approccio recentemente sviluppato che utilizza le capacità di sequenziamento di prossima generazione di tecnologie (NGS) per analizzare e quantificare RNA trascritto dal genoma 7,8. In breve, l&#39;RNA totale è poli-A selezionato e frammentato come modello iniziale template.The RNA viene poi convertito in cDNA usando trascrittasi inversa. Al fine di mappare full-length trascritti di RNA, utilizzando intatto, RNA non degradato per la costruzione di libreria di cDNA è importante. Per la purposa di sequenziamento, specifiche sequenze adattatore vengono aggiunti a entrambe le estremità di cDNA. Poi, nella maggioranza dei casi, le molecole di cDNA vengono amplificati mediante PCR e sequenziati in un modo ad alta produttività. Dopo la sequenza, la risultante si legge può essere allineato con un genoma di riferimento e un database del trascrittoma. Il numero di letture che mappa il gene di riferimento viene contato e questa informazione può essere utilizzata per stimare il livello di espressione del gene. La legge può anche essere assemblato de novo senza genoma di riferimento, consentendo lo studio di trascrittomi in organismi non modello 9. La tecnologia RNA-Seq è stato utilizzato anche per rilevare isoforme di splicing 10-12, nuove trascrizioni 13 e fusioni geniche 14. Oltre alla rilevazione dei geni codificanti proteine, RNA-Seq può anche essere utilizzato per rilevare romanzo e analizzare il livello di trascrizione di RNA non codificanti, come RNA non codificante lungo 15,16, 17 microRNA, siRNA 18 ecc. A causa di tegli accuratezza di questo metodo, è stata utilizzata per la rilevazione delle variazioni di singoli nucleotidi 19,20. Prima dell&#39;avvento della tecnologia RNA-Seq, microarray è stato il metodo principale utilizzato per l&#39;analisi del profilo di espressione genica. Sonde pre-progettati sono sintetizzati e successivamente attaccati ad una superficie solida per formare una diapositiva microarray 21. mRNA viene estratto e convertito in cDNA. Durante il processo di trascrizione inversa, nucleotidi fluorescente sono incorporati nel cDNA e il cDNA possono essere ibridate sui vetrini microarray. L&#39;intensità del segnale raccolto da un punto specifico dipende dalla quantità di cDNA legame specifico della sonda in quel luogo 21. Rispetto alla tecnologia RNA-Seq, microarray ha diversi limiti. In primo luogo, microarray basa sulla conoscenza preesistente gene annotazione, mentre la tecnologia RNA-Seq è in grado di rilevare nuovi trascritti a relativamente alto livello di fondo, che ne limita l&#39;utilizzo quando gelivello di espressione ne è basso. Inoltre, la tecnologia RNA-Seq ha molto più alta gamma dinamica di rilevazione (8.000 volte) 7, considerando che, a causa di sfondo e la saturazione dei segnali, la precisione di microarray è limitata per entrambi i geni altamente espressi e umile 7,22. Infine, le sonde di microarray si differenziano per la loro efficienza di ibridazione, che rendono i risultati meno affidabili quando si confrontano i livelli di espressione relativa di diverse trascrizioni all&#39;interno di un campione di 23. Sebbene RNA-Seq ha molti vantaggi rispetto microarray, la sua analisi dei dati è complessa. Questo è uno dei motivi che molti ricercatori utilizzano ancora microarray invece di RNA-Seq. Vari strumenti bioinformatici sono necessari per RNA-Seq l&#39;elaborazione e analisi dei dati 24. Tra le diverse sequenziamento di prossima generazione di piattaforme (NGS), 454, Illumina, SOLID e Ion Torrent sono quelli più utilizzati. 454 è stata la prima piattaforma commerciale NGS. In contrasto con le altre piattaforme di sequenziamentolunghezza tale illumina e SOLID, la piattaforma 454 genera leggere più (in media 700 letture di base) 25. Legge più sono migliori per la caratterizzazione iniziale di transcriptiome a causa della loro maggiore efficienza montaggio 25. Lo svantaggio principale della piattaforma 454 è il suo alto costo per megabase di sequenza. Il Illumina e piattaforme SOLIDI generare legge con aumento del numero e lunghezze brevi. Il costo per megabase di sequenza è molto inferiore rispetto alla piattaforma 454. A causa del gran numero di breve recita per la Illumina e piattaforme SOLIDI, l&#39;analisi dei dati è molto più computazionalmente intensive. Il prezzo dello strumento e dei reagenti per sequenziamento per la piattaforma Ion Torrent è più economico e il tempo di sequenza è più breve di 25. Tuttavia, il tasso di errore e il costo per megabase di sequenza sono più alti rispetto al Illumina e piattaforme SOLIDI. Piattaforme diverse hanno i loro vantaggi e svantaggi e richiedono diversi metodi per l&#39;analisi dei dati. Il PLATForm devono essere scelti in base allo scopo di sequenziamento e la disponibilità di fondi. In questo lavoro, prendiamo piattaforma Illumina RNA-Seq come esempio. Abbiamo utilizzato delle cellule EML come sistema modello per studiare i regolatori chiave di EML cellule auto-rinnovamento e differenziazione, e ha fornito una modalità dettagliate di costruzione della libreria di RNA-Seq e analisi dei dati per il calcolo del livello di espressione e di rilevamento romanzo trascrizione. Noi abbiamo indicato nel nostro precedente pubblicazione che lo studio RNA-Seq nel sistema modello EML 2, quando accoppiato con test funzionale (ad esempio shRNA atterramento) fornire un approccio efficace nella comprensione del meccanismo molecolare delle prime fasi di differenziazione ematopoietiche, e in grado di fungere da modello per l&#39;analisi di cellule auto-rinnovamento e differenziazione in generale.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15240-062</td>
			<td>BHK cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD34 FITC</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>11-0341-81</td>
			<td>FACS sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse Ly-6A/E (Sca-1) PE</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-5981-81</td>
			<td>FACS sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Mouse Lineage Antibody Cocktail</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>558074</td>
			<td>FACS sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSAria Cell Sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>Special offer sysmtem</td>
			<td>FACS sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#8482; Cell Culture Treated Flasks 75cm2</td>
			<td>Corning incorporated</td>
			<td>430641</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#8482; Cell Culture Treated Flasks 25cm2</td>
			<td>Corning incorporated</td>
			<td>430639</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I, Amplification Grade</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18068-015</td>
			<td>Library preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11965-092</td>
			<td>BHK cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HI FBS&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16140071</td>
			<td>BHK cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16050-122</td>
			<td>EML cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30228.02</td>
			<td>EML cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25030-081</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lineage Cell Depletion Kit, mouse&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-858</td>
			<td>Isolation of lineage negative cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoVue Plus spectrophotometer&#160;</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28-9569-62</td>
			<td>Quality control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific&#8482; Napco&#8482; 8000 Water-Jacketed CO2 Incubators</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>15-497-002&#160;</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>EML cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol&#174; Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596-018</td>
			<td>RNA exraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruSeq&#8482; RNA Sample Prep Kit v2 -Set B (48rxn)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>RS-122-2002</td>
			<td>Library preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2100 Electrophoresis Bioanalyzer Instrument&#160;</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2939AA</td>
			<td>Quality control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45 &#181;m Syringe Filters</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>190-2545</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of key factors regulating self-renewal and differentiation in eml hematopoietic precursor cells by rna-sequencing analysis

Le cellule staminali ematopoietiche (CSE) sono utilizzati per il trattamento clinico del trapianto di ricostruire il sistema ematopoietico di un paziente in molte malattie come la leucemia e linfoma. Chiarire i meccanismi che controllano HSC self-renewal e la differenziazione è importante per l&#39;applicazione di cellule staminali emopoietiche per la ricerca e usi clinici. Tuttavia, non è possibile ottenere grandi quantità di CSE causa della loro incapacità a proliferare in vitro. Per superare questo ostacolo, abbiamo utilizzato una linea cellulare derivata midollo osseo di topo, la linea cellulare EML (eritroide, mieloide, e linfocitaria), come sistema modello per questo studio. RNA-sequencing (RNA-Seq) è stata sempre più utilizzata per sostituire microarray per studi di espressione genica. Riportiamo qui un metodo dettagliato di utilizzare la tecnologia RNA-Seq per indagare i potenziali fattori chiave nella regolazione delle cellule EML self-renewal e la differenziazione. Il protocollo fornito in questo documento è diviso in tre parti. La prima part spiega come la cultura cellule EML e separato Lin-CD34 + e le cellule Lin-CD34-. La seconda parte del protocollo offre procedure dettagliate per la preparazione di RNA totale e la costruzione della libreria successiva per alta sequenziamento. L&#39;ultima parte descrive il metodo per l&#39;analisi dei dati di RNA-Seq e spiega come utilizzare i dati per identificare i fattori di trascrizione espressi in modo differenziale tra Lin-CD34 + e le cellule Lin-CD34-. I fattori di trascrizione più significativamente differenzialmente espressi sono stati identificati come potenziali regolatori chiave di controllo delle cellule EML self-renewal e la differenziazione. Nella sezione di discussione di questo documento, si segnalano i passaggi chiave per performance di successo di questo esperimento. In sintesi, questo lavoro offre un metodo di utilizzare la tecnologia RNA-Seq per identificare i potenziali regolatori di self-renewal e la differenziazione in cellule EML. I fattori chiave individuati sono sottoposti ad analisi funzionale a valle in vitro ed in vivo.

Al fine di analizzare i geni differenzialmente espressi in Lin-CD34 + e le cellule Lin-CD34- EML, abbiamo utilizzato la tecnologia RNA-Seq. La figura 1 mostra l&#39;iter delle procedure. Dopo l&#39;isolamento di cellule negative lignaggio di separazione delle cellule magnetiche, ci siamo separati Lin-SCA + CD34 + e le cellule Lin-SCA-CD34- mediante FACS Aria. Cellule EML Lin-arricchiti sono state colorate con anticorpi anti-CD34, anti-Sca1 e anticorpi cocktail lignaggio. Solo le cellule lin- stati gated...

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Identification of Key Factors Regulating Self-renewal and Differentiation in EML Hematopoietic Precursor Cells by RNA-sequencing Analysis

RNA-sequenziamento e bioinformatica analisi sono stati utilizzati per identificare i fattori di trascrizione espressi in maniera significativa e differenziale in Lin-CD34 + e CD34- Lin-sottopopolazioni di EMLcells mouse. Questi fattori di trascrizione potrebbero svolgere un ruolo importante nel determinare lo switch tra le cellule Lin-CD34- auto-rinnovamento Lin-CD34 + e parzialmente differenziato.

Identificazione dei fattori chiave di regolazione auto-rinnovamento e differenziazione in cellule ematopoietiche precursori EML da Analysis RNA-sequencing

Hematopoietic stem cells (HSCs) are used clinically for transplantation treatment to rebuild a patient&#39;s hematopoietic system in many diseases such as ...

identification-key-factors-regulating-self-renewal-differentiation

Research

JoVE Journal

Biology

12.2K Views.  The University of Texas Graduate School of Biomedical Sciences at Houston.  RNA-sequenziamento e bioinformatica analisi sono stati utilizzati per identificare i fattori di trascrizione espressi in maniera significativa e differenziale in Lin-CD34 + e CD34- Lin-sottopopolazioni di EMLcells mouse. Questi fattori di trascrizione potrebbero svolgere un ruolo importante nel determinare lo switch tra le cellule Lin-CD34- auto-rinnovamento Lin-CD34 + e parzialmente differenziato. 

Video: Identification of Key Factors Regulating Self-renewal and Differentiation in EML Hematopoietic Precursor Cells by RNA-sequencing Analysis

Isolation and Analysis of Hematopoietic Stem Cells from the Placenta

Hematopoietic stem cells (HSCs) have the ability to self-renew and generate all cell types of the blood lineages throughout the lifetime of an individual. All HSCs emerge during embryonic development, after which their pool size is maintained by self-renewing cell divisions. Identifying the anatomical origin of HSCs and the critical developmental events regulating the process of HSC development has been complicated as many anatomical sites participate during fetal hematopoiesis. Recently, we identified the placenta as a major hematopoietic organ where HSCs are generated and expanded in unique microenvironmental niches (Gekas, et al 2005, Rhodes, et al 2008). Consequently, the placenta is an important source of HSCs during their emergence and initial expansion.
In this article, we show dissection techniques for the isolation of murine placenta from E10.5 and E12.5 embryos, corresponding to the developmental stages of initiation of HSCs and the peak in the size of the HSC pool in the placenta, respectively. In addition, we present an optimized protocol for enzymatic and mechanical dissociation of placental tissue into single-cell suspension for use in flow cytometry or functional assays. We have found that use of collagenase for single-cell suspension of placenta gives sufficient yields of HSCs. An important factor affecting HSC yield from the placenta is the degree of mechanical dissociation prior to, and duration of, enzymatic treatment.
We also provide a protocol for the preparation of fixed-frozen placental tissue sections for the visualization of developing HSCs by immunohistochemistry in their precise cellular niches. As hematopoietic specific antigens are not preserved during preparation of paraffin embedded sections, we routinely use fixed frozen sections for localizing placental HSCs and progenitors.

We have identified the placenta as a major hematopoietic organ during development. We found that hematopoietic stem cells (HSCs) are both generated and expanded in the placenta in unique microenvironmental niches. Here, we describe experimental techniques required for isolation and visualization of HSCs in the mouse placenta.

Isolamento e analisi delle cellule staminali ematopoietiche dalla placenta

Hematopoietic stem cells (HSCs) have the ability to self-renew and generate all cell types of the blood lineages throughout the lifetime of an individual. ...

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Biologia

The use of SC1 (Pluripotin) to Support mESC Self-renewal in the Absence of LIF

Mouse embryonic stem (ES) cells are conventionally cultured with Leukemia Inhibitory Factor (LIF) to maintain self-renewal.1 However, LIF is expensive and activation of the LIF/JAK/STAT3 pathway is not absolutely required to maintain the self-renewal state.2 The SC1 small molecule may be an economical alternative to LIF. SC1 functions through dual inhibition of Ras-GAP and ERK1.3 Illustration of its mechanism of action makes it a useful tool to study the fundamental molecular mechanism of self-renewal. Here we demonstrate the procedure for culturing mouse ES cells in the presence of SC1 and show that they are able to maintain self-renewal in the absence of LIF. Cells cultured with SC1 showed similar morphology compared to cells maintained with LIF. Both exhibited typical mouse ES morphology after five passages. Expression of typical pluripotency markers (Oct4, Sox2, Nanog, and SSEA1) was observed after five passages in the presence of SC1. Furthermore, SC1 caused no overt toxicity on mouse ES cells.

The use of SC1 Pluripotin to Support mESC Self-renewal in the Absence of LIF

SC1 functions through dual inhibition of Ras- GAP and ERK1. We tested the function of SC1 in supporting mouse ES cell self-renewal in the absence of LIF and showed that SC1 is able to maintain self-renewal of mouse ES cell cultures.

L&#39;uso di SC1 (Pluripotin) a supporto Mesc auto-rinnovamento in assenza di LIF

Mouse embryonic stem (ES) cells are conventionally cultured with Leukemia Inhibitory Factor (LIF) to maintain self-renewal.1 However, LIF is expensive and ...

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs constitute a minute cell population of pluripotent cells capable of generating all blood cell lineages for a life-time1. The molecular dissection of HSCs homeostasis in the bone marrow has important implications in hematopoiesis, oncology and regenerative medicine. We describe the labeling protocol with fluorescent antibodies and the electronic gating procedure in flow cytometry to score hematopoietic progenitor subsets and HSCs distribution in individual mice (Fig. 1). In addition, we describe a method to extensively enrich hematopoietic progenitors as well as long-term (LT) and short term (ST) reconstituting HSCs from pooled bone marrow cell suspensions by magnetic enrichment of cells expressing c-Kit. The resulting cell preparation can be used to sort selected subsets for in vitro and in vivo functional studies (Fig. 2).
Both trabecular osteoblasts2,3 and sinusoidal endothelium4 constitute functional niches supporting HSCs in the bone marrow. Several mechanisms in the osteoblastic niche, including a subset of N-cadherin+ osteoblasts3 and interaction of the receptor tyrosine kinase Tie2 expressed in HSCs with its ligand angiopoietin-15 concur in determining HSCs quiescence. "Hibernation" in the bone marrow is crucial to protect HSCs from replication and eventual exhaustion upon excessive cycling activity6. Exogenous stimuli acting on cells of the innate immune system such as Toll-like receptor ligands7 and interferon-&alpha;6 can also induce proliferation and differentiation of HSCs into lineage committed progenitors. Recently, a population of dormant mouse HSCs within the lin- c-Kit+ Sca-1+ CD150+ CD48- CD34- population has been described8. Sorting of cells based on CD34 expression from the hematopoietic progenitors-enriched cell suspension as described here allows the isolation of both quiescent self-renewing LT-HSCs and ST-HSCs9. A similar procedure based on depletion of lineage positive cells and sorting of LT-HSC with CD48 and Flk2 antibodies has been previously described10. In the present report we provide a protocol for the phenotypic characterization and ex vivo cell cycle analysis of hematopoietic progenitors, which can be useful for monitoring hematopoiesis in different physiological and pathological conditions. Moreover, we describe a FACS sorting procedure for HSCs, which can be used to define factors and mechanisms regulating their self-renewal, expansion and differentiation in cell biology and signal transduction assays as well as for transplantation.

A method to analyse the distribution of bone marrow hematopoietic progenitors in flow cytometry as well as to efficiently isolate highly purified hematopoietic stem cells (HSCs) is described. The isolation procedure is essentially based on magnetic enrichment of c-Kit+ cells and cell sorting to purify HSCs for cellular and molecular studies.

L&#39;analisi fenotipica e l&#39;isolamento di murini cellule staminali ematopoietiche e Lineage-committed progenitori

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

Oct4GiP Reporter Assay to Study Genes that Regulate Mouse Embryonic Stem Cell Maintenance and Self-renewal

Pluripotency and self-renewal are two defining characteristics of embryonic stem cells (ES cells). Understanding the underlying molecular mechanism will greatly facilitate the use of ES cells for developmental biology studies, disease modeling, drug discovery, and regenerative medicine (reviewed in 1,2).
To expedite the identification and characterization of novel regulators of ES cell maintenance and self-renewal, we developed a fluorescence reporter-based assay to quantitatively measure the self-renewal status in mouse ES cells using the Oct4GiP cells 3. The Oct4GiP cells express the green fluorescent protein (GFP) under the control of the Oct4 gene promoter region 4,5. Oct4 is required for ES cell self-renewal, and is highly expressed in ES cells and quickly down-regulated during differentiation 6,7. As a result, GFP expression and fluorescence in the reporter cells correlates faithfully with the ES cell identity 5, and fluorescence-activated cell sorting (FACS) analysis can be used to closely monitor the self-renewal status of the cells at the single cell level 3,8.
Coupled with RNAi, the Oct4GiP reporter assay can be used to quickly identify and study regulators of ES cell maintenance and self-renewal 3,8. Compared to other methods for assaying self-renewal, it is more convenient, sensitive, quantitative, and of lower cost. It can be carried out in 96- or 384-well plates for large-scale studies such as high-throughput screens or genetic epistasis analysis. Finally, by using other lineage-specific reporter ES cell lines, the assay we describe here can also be modified to study fate specification during ES cell differentiation.

We describe a fluorescence reporter assay to quickly identify and characterize genes that regulate mouse embryonic stem cell maintenance and self-renewal.

Oct4GiP Reporter Assay per studiare i geni che regolano il mouse sulle cellule staminali embrionali di manutenzione e di auto-rinnovamento

Pluripotency and self-renewal are two defining characteristics of embryonic stem cells (ES cells). Understanding the underlying molecular mechanism will ...

In vivo Reprogramming of Adult Somatic Cells to Pluripotency by Overexpression of Yamanaka Factors

Induced pluripotent stem (iPS) cells that result from the reprogramming of somatic cells to a pluripotent state by forced expression of defined factors are offering new opportunities for regenerative medicine. Such clinical applications of iPS cells have been limited so far, mainly due to the poor efficiency of the existing reprogramming methodologies and the risk of the generated iPS cells to form tumors upon implantation.
We hypothesized that the reprogramming of somatic cells towards pluripotency could be achieved in vivo by gene transfer of reprogramming factors. In order to efficiently reprogram cells in vivo, high levels of the Yamanaka (OKSM) transcription factors need to be expressed at the target tissue. This can be achieved by using different viral or nonviral gene vectors depending on the target tissue. In this particular study, hydrodynamic tail-vein (HTV) injection of plasmid DNA was used to deliver the OKSM factors to mouse hepatocytes. This provided proof-of-evidence of in vivo reprogramming of adult, somatic cells towards a pluripotent state with high efficiency and fast kinetics. Furthermore no tumor or teratoma formation was observed in situ.
It can be concluded that reprogramming somatic cells in vivo may offer a potential approach to induce enhanced pluripotency rapidly, efficiently, and safely compared to in vitro performed protocols and can be applied to different tissue types in the future.

In vivo Reprogramming of Adult Somatic Cells to Pluripotency by Overexpression of Yamanaka Factors

This study demonstrates the reprogramming of somatic cells towards pluripotency in vivo without the generation of teratomas. We used hydrodynamic tail vein injection of plasmid DNA encoding the Yamanka factors to induce the in vivo reprogramming of adult hepatocytes into cells of enhanced pluripotency.

In vivo riprogrammazione di età somatiche celle a pluripotenza da iperespressione di fattori Yamanaka

Induced pluripotent stem (iPS) cells that result from the reprogramming of somatic cells to a pluripotent state by forced expression of defined factors ...

Monitoring Functionality and Morphology of Vasculature Recruited by Factors Secreted by Fast-growing Tumor-generating Cells

The subcutaneous matrigel plug assay in mice is a method of choice for the in vivo evaluation of pro- and anti-angiogenic factors. In this method, desired factors are introduced into cold-liquid ECM-mimic gel which, after subcutaneous injection, solidifies to form an environment mimicking the cancer milieu. This matrix permits the penetration of host cells, such as endothelial cells, and therefore, the formation of vasculature.
Herein we propose a new modified matrigel plug assay, which can be exploited to illustrate the angiogenic potential of a pool of factors secreted by cancer cells, as opposed to a specific factor (e.g., bFGF and VEGF) or agent. The plug containing ECM-mimic gel is utilized to introduce the host (i.e., mouse) with a pool of factors secreted to the C.M. of fast-growing tumor-generating glioblastoma cells. We have previously described an extensive comparison of the angiogenic potential of U-87 MG human glioblastoma and its dormant-derived clone, in this system model, showing induced angiogenesis in the U-87 MG parental cells. The C.M. is prepared by filtering collected media from confluent tissue culture plates of either cell line following 48 hr incubation. Hence, it contains only factors secreted by the cells, without the cells themselves. Described here is the combination of two imaging modalities, microbubbles contrast-enhanced ultrasound imaging and intravital fibered-confocal endomicroscopy, for an accurate, real-time characterization of the extent, morphology and functionality of newly-formed blood vessels within the plugs.

We describe a matrigel plug assay to illustrate angiogenic potential of a pool of factors secreted by cancer cells using two complementary imaging modalities, ultrasound and endomicroscopy. The matrigel, an extracellular matrix (ECM)-mimic gel, is utilized to introduce the host (mouse) with angiogenic factors secreted to the conditioned media (C.M.).&#160;

Funzionalità di monitoraggio e di Morfologia Vasculature Reclutato da fattori secreti dalle cellule a crescita rapida, la generazione di tumore

The subcutaneous matrigel plug assay in mice is a method of choice for the in vivo evaluation of pro- and anti-angiogenic factors. In this method, desired ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

In Vivo inseguimento 4-dimensionale di emopoietiche staminali e progenitrici celle di topo adulto cranica di Midollo Osseo

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Retroviral Infection of Murine Embryonic Stem Cell Derived Embryoid Body Cells for Analysis of Hematopoietic Differentiation

Embryonic stem cells (ESCs) are an outstanding model for elucidating the molecular mechanisms of cellular differentiation. They are especially useful for investigating the development of early hematopoietic progenitor cells (HPCs). Gene expression in ESCs can be manipulated by several techniques that allow the role for individual molecules in development to be determined. One difficulty is that expression of specific genes often has different phenotypic effects dependent on their temporal expression. This problem can be circumvented by the generation of ESCs that inducibly express a gene of interest using technology such as the doxycycline-inducible transgene system. However, generation of these inducible cell lines is costly and time consuming. Described here is a method for disaggregating ESC-derived embryoid bodies (EBs) into single cell suspensions, retrovirally infecting the cell suspensions, and then reforming the EBs by hanging drop. Downstream differentiation is then evaluated by flow cytometry. Using this protocol, it was demonstrated that exogenous expression of a microRNA gene at the beginning of ESC differentiation blocks HPC generation. However, when expressed in EB derived cells after nascent mesoderm is produced, the microRNA gene enhances hematopoietic differentiation. This method is useful for investigating the role of genes after specific germ layer tissue is derived.

Manipulating temporal gene expression in differentiating embryonic stem cells (ESCs) can be achieved using inducible gene systems. However, generation of these cell lines is costly and time consuming. This protocol achieves rapid expression of a transgene in differentiating ES-derived cells and subsequent analysis of downstream hematopoietic differentiation.

L&#39;infezione retrovirale di Murine staminali embrionali cellulari derivate Cellule embrionali di corpo per l&#39;analisi di differenziazione emopoietiche

Embryonic stem cells (ESCs) are an outstanding model for elucidating the molecular mechanisms of cellular differentiation. They are especially useful for ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, corticotrophin releasing hormone (CRH) is released from the hypothalamus in the brain. This stimulates the release of adrenocorticotrophic hormone (ACTH) from the pituitary gland, which in turn stimulates release of glucocorticoids from the adrenal gland. In horses the glucocorticoid corticosterone is responsible for several adaptations needed to support equine flight behaviour and subsequent removal from the aversive situation. Corticosterone metabolites can be detected in the feces of horses and assessment offers a non-invasive option to evaluate long term patterns of adrenal activity. Fecal assessment offers advantages over other techniques that monitor adrenal activity including blood plasma and saliva analysis. The non-invasive nature of the method avoids sampling stress which can confound results. It also allows the opportunity for repeated sampling over time and is ideal for studies in free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay (EIA) used to assess feces for corticosterone, in addition to the associated biochemical validation.

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. The method offers a non-invasive option to assess long term patterns in both domestic and free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay involved and the associated biochemical validation.

Fecale Analisi glucocorticoidi: non invasivo di monitoraggio surrenale in equidi

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...

Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to the analysis of a few fluorochromes, currently there are dozens of different fluorescent dyes, and up to 14-18 different dyes can be combined at a time. However, several limitations still impair the analytical capabilities. Because of the multiplicity of fluorescent probes, data analysis has become increasingly complex due to the need of large, multi-parametric compensation matrices. Moreover, mutant mouse models carrying fluorescent proteins to detect and trace specific cell types in different tissues have become available, so the analysis (by flow cytometry) of auto-fluorescent cell suspensions obtained from solid organs is required. Spectral flow cytometry, which distinguishes the shapes of emission spectra along a wide range of continuous wavelengths, addresses some of these problems. The data is analyzed with an algorithm that replaces compensation matrices and treats auto-fluorescence as an independent parameter. Thus, spectral flow cytometry should be capable of discriminating fluorochromes with similar emission peaks and can provide a multi-parametric analysis without compensation requirements.
This protocol describes the spectral flow cytometry analysis, allowing for a 21-parameter (19 fluorescent probes) characterization and the management of an auto-fluorescent signal, providing high resolution in minor population detection. The results presented here show that spectral flow cytometry presents advantages in the analysis of cell populations from tissues difficult to characterize in conventional flow cytometry, such as the heart and the intestine. Spectral flow cytometry thus demonstrates the multi-parametric analytical capacity of high-performing conventional flow cytometry without the requirement for compensation and enables auto-fluorescence management.

This article describes spectral cytometry, a new approach in flow cytometry that uses the shapes of emission spectra to distinguish fluorochromes. An algorithm replaces compensations and can treat auto-fluorescence as an independent parameter. This new approach allows for the proper analysis of cells isolated from solid organs.

Analisi delle sospensioni cellulari isolate da tessuti solidi da Spectral citometria a flusso

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to ...