The Satchi-Fainaro research laboratory is partially supported by The Association for International Cancer Research (AICR), German-Israel Foundation (GIF), THE ISRAEL SCIENCE FOUNDATION (Grant No. 1309/10), Swiss Bridge Award, and by grants from the Israeli National Nanotechnology Initiative (INNI), Focal Technology Area (FTA) program: Nanomedicine for Personalized Theranostics, and by The Leona M. and Harry B. Helmsley Nanotechnology Research Fund.

NOTA: Tutte le procedure di animali sono stati approvati ed eseguiti nel rispetto delle norme di Tel Aviv University Sackler School of Medicine Istituzionale Animal Care and Use Committee (IACUC). 1. Carta Preparazione condizionata <ol><li> Seed 2 x 10 6 U-87 cellule MG in una piastra di coltura 10 cm d&#39;un volume di 8 ml mezzo modificato Eagle di Dulbecco (DMEM) supplementato con 10% siero bovino fetale (FBS) e 1% di soluzione Pencillin / streptomicina / nistatina. </li><li> Incubare le cellule a 37 ° C; 5% di CO 2 fino a raggiungere la piena confluenza in 48 ore. </li><li> Usando una siringa da 10 ml, prelevare tutta medio dalla piastra e filtrare attraverso un filtro da 0,45 micron in un tubo da 15 ml. </li><li> Senza lavare il piatto cellule, aggiungere 1 ml di soluzione di tripsina (0,25%) e incubare. </li><li> Quando tutte le cellule si staccano, disattivare la tripsina utilizzando almeno 5 ml DMEM supplementato con 10% FBS e preforme una conta cellulare. </li><li<html> &gt; Contare il numero di cellule utilizzando un emocitometro o altro dispositivo cellulare conteggio e calcolare il numero di cellule secondo il metodo di conteggio utilizzato. NOTA: Sarà usato in seguito al fine di normalizzare la concentrazione CM. </li><li> Trasferire il CM in un pallone a fondo rotondo vetro e concentrato sotto vuoto spinto evaporatore rotante. Per accelerare il processo, aumentare la temperatura del bagno a 37 ° C, se desiderato. Continuare fino a quando il CM raggiunge una consistenza pastosa. </li><li> Risospendere il CM da ciascuna piastra di coltura in 400 ml di soluzione salina. Quando si utilizza più di una piastra, utilizzare volume equivalente. Ad esempio, per 2 piastre di coltura, usare 800 ml. Usare ogni piatto per 4 topi. </li><li> Per confrontare linee cellulari o trattamenti diversi, regolare il volume in base al rapporto cellulare ricevuto al passo 1.6. Ad esempio, se una piastra contiene 1.5x più celle, aggiungere 200 ml di soluzione salina per 400 microlitri pre-esistenti. Questo sarà il regolare CM </li></ol>title &quot;&gt; 2. ECM-mimico Gel Plug inoculazione in topi <ol><li> Prima di inoculare il gel ECM-mimico in topi, preparare i seguenti materiali: <ol><li> Crescita fattori ridotti gel ECM-mimico senza fenolo (scongelare una notte, un giorno prima dell&#39;esperimento, a 4 ° C in ghiaccio). </li><li> Rasoio elettrico. </li><li> Ketamina e xilazina per anestetizzare i topi. </li><li> Ice-freddo 1.000 punte microlitri sterili. </li><li> Ice-freddo siringa da 1 ml e 27 aghi G. </li></ol></li><li> Preparare per ogni mouse una provetta da 1,5 ml Eppendorf contenente 80 microlitri regolati CM e tenere in ghiaccio. </li><li> Per ogni tubo, aggiungere 600 microlitri di crescita fattori ghiacciate ridotto ECM-mimico gel senza fenolo che è stato scongelato notte a 4 ° C, sul ghiaccio. Il gel ECM-mimico è liquido a 4 ° C e solidifica a temperatura corporea; al fine di impedire il gel ECM-mimico solidificazione, utilizzare 1.000 punte microlitri ghiacciate. Mescolare accuratamente tubi senza formazione di bolle e tenere in ghiaccio. </li><li> Anestetizzare 6 settimane di età BALB topi / c con ketamina (100 mg / kg) e xilazina (12 mg / kg). Confermare l&#39;anestesia corretta in base alla cura degli animali e del comitato istituzionale uso, vale a dire prima di iniziare l&#39;esperimento. Gli animali hanno raggiunto il loro corretto piano di anestesia quando non rispondono più ad una presa punta ferma. </li><li> Radere la zona addominale dei topi e disinfettare con una chirurgica scrub / alcool. </li><li> Utilizzare un freddo siringa da 1 ml e un ago 27 G per iniettare il contenuto della provetta sottocutanea Eppendorf. Effettuare l&#39;iniezione molto lentamente per evitare la formazione di bolle. Una volta che tutto il volume viene somministrato, non estrarre l&#39;ago per alcuni minuti, finché non si verifica solidificazione. </li></ol> 3. Valutazione di ECM-mimico Gel Plug vascolarizzazione con ultrasuoni NOTA: Questa parte del protocollo richiede precedente conoscenza del funzionamento di un sistema di imaging ad ultrasuoni, o l&#39;assistenza di un tecnico autorizzato. <ol><li> Prima di iniziare, avere la fmateriali e strumenti pronti opo: <ol><li> Rasoio elettrico. </li><li> Crema depilatoria. </li><li> Ketamina e xilazina per anestetizzare i topi. </li><li> Microbolle non mirati. </li><li> Dispositivo di attivazione. </li><li> Sistema di imaging US compresa una sonda di 708 MHz e 55 un micromanipolatore acquisizione 3D. </li></ol></li><li> Misurare vascolarizzazione entro i tappi tre settimane dall&#39;inoculazione: NOTA: Nella base di MG-modello animale U-87, tre settimane è stato trovato a rappresentare il punto di tempo ideale per l&#39;imaging. In diverse impostazioni, calibrare cinetiche vascolarizzazione a partire da un paio di giorni dopo l&#39;inoculazione di spine. <ol><li> Anestetizzare topi utilizzando ketamina (100 mg / kg) e xilazina (12 mg / kg). Confermare l&#39;anestesia corretta in base alla cura degli animali e del comitato istituzionale uso, vale a dire prima di iniziare l&#39;esperimento. Gli animali hanno raggiunto il loro corretto piano di anestesia quando non rispondono più ad una presa punta ferma. </li><li> Shave ilzona addominale dei topi e trattare con crema depilatoria. </li><li> Fissare i topi supinamente sul palco del micro-manipolatore. </li><li> Utilizzando una soluzione fisiologica contenente 1 siringa ml e un ago da 30 G, posizionare l&#39;ago dentro la vena della coda, fissare saldamente l&#39;ago e allentare la siringa. </li><li> Impostare per la sessione di contrasto 3D in modalità di acquisizione delle immagini: <ol><li> Premere &quot;3D&quot; per inizializzare la fase del motore 3D e posizionare il trasduttore nel mezzo dell&#39;area di scansione desiderata. </li><li> Premere il tasto &quot;3D&quot; e inserire la distanza e passo formato di scansione, quindi premere &quot;Scan&quot;. </li><li> Assicurarsi che l&#39;intero connettore è stato scansionato nei dati di immagine 3D visualizzati. In caso contrario, regolare il trasduttore in modo che l&#39;intera spina è visibile nella scansione e ripetere il punto 3.5.2. </li><li> Premere &quot;Contrasto&quot; e spingere la compensazione del guadagno di tempo (TGC) controlla a sinistra per scurire l&#39;immagine. </li></ol></li><li> Attivare le microbolle con un mixer flaconcino che è designated per l&#39;attivazione di microbolle per 45 sec. </li><li> Mescolare in una siringa da 1 ml 50 ml di microbolle con 50 microlitri soluzione salina. </li><li> Sostituire la siringa allentata salina contenente con una siringa contenente microbolle attivati. Iniettare le microbolle diluito nella vena della coda di topi, attendere qualche secondo per le bolle di raggiungere uno stato di equilibrio, e quindi acquisire 3D con mdc cine ciclo del tappo, utilizzando il motore di acquisizione 3D: <ol><li> Premere il tasto &quot;3D&quot; e selezionare &quot;Scan&quot; per acquisire immagini di contrasto-enhanced 3D e quindi premere &quot;Cine Store&quot; per salvare i dati di immagine. </li><li> Premere il tasto &quot;3D&quot; e fare clic su &quot;Destroy 3D&quot; per distruggere le microbolle. </li><li> Premere &quot;3D&quot; di nuovo e selezionare &quot;Scan&quot; per acquisire un ciclo cine post-distruzione, quindi premere &quot;Cine Store&quot;. </li></ol></li><li> Generare la sovrapposizione cornici delle immagini pre e post-distruzione di microbolle: <ol><li> Nel &amp;# 8220; Impostazioni di riferimento &quot;sul lato sinistro dello schermo fare clic su&quot; Create Reference &quot;. </li><li> Premere &quot;Studio Management&quot; per aprire il cine loop pre-distruzione acquisita. </li><li> Fare clic su &quot;Processo Cine&quot; per generare la sovrapposizione contrasto verde, quindi fare clic su &quot;Carica Into 3D&quot;. </li></ol></li><li> Utilizzare il software di imaging Stati Uniti, al fine di quantificare il conseguente immagine 3D per il volume del sangue all&#39;interno dei tasselli: <ol><li> Premere il tasto &quot;Scan / Freeze&quot; e poi premere &quot;impostazioni della modalità&quot;. </li><li> Fare clic su &quot;Volume&quot; e selezionare &quot;parallelo&quot;. </li><li> Creare un volume 3D del tessuto bersaglio segmentando una serie di contorni. </li><li> Fare clic su &quot;Fine&quot; per completare la segmentazione. NOTA: Il volume del mezzo di contrasto viene visualizzato sul lato inferiore sinistro dello schermo. </li></ol></li><li> Al termine della procedura, posizionare topi in un ambiente pulito, ambiente caldo, e asciutto tranquilla lontano dalaltri animali. Fornire calore con un pad disponibile in commercio chirurgica riscaldamento o una lampada ad incandescenza (50-75 watt), collocato 12-14 centimetri di distanza da roditore. Monitorare topi continuamente fino mantenere la postura eretta e camminare normalmente. </li></ol></li></ol> 4. Valutazione della ECM-mimico Gel Plug Vasculature Morfologia Utilizzando fibrata confocale endomicroscopy NOTA: questa parte del protocollo viene eseguita subito dopo l&#39;imaging US e richiede precedente conoscenza del funzionamento del sistema di imaging fibered endomicroscopy confocale, o l&#39;assistenza di un tecnico autorizzato. <ol><li> Prima di iniziare, i seguenti materiali e strumenti pronti: <ol><li> Strumenti di chirurgia, come pinze, forbici e filati cucirini assorbibili. </li><li> Destrano FITC-coniugato (70 KDa). </li><li> Soluzioni di taratura (tre tubi contenenti ciascuno di perossido di idrogeno, acqua o soluzione fluorescente). </li><li> Il sistema di imaging esonda adatto per l&#39;imaging dei vasi sanguigni secondo produttore. </li></ol></li><li> Anestetizzare topi utilizzando ketamina (100 mg / kg) e xilazina (12 mg / kg). </li><li> Somministrare iv, attraverso la vena della coda, 200 ml di 10 mg / ml destrano marcato con FITC. </li><li> Disinfettare la zona addominale con una chirurgica scrub / alcool e applicare una piccola incisione di circa 1 cm dal connettore. </li><li> Posizionare la sonda endomicroscopy sopra della spina delicatamente mantenendo intatta la spina. </li><li> Acquisizione: <ol><li> Una volta che la sonda si trova sul tappo, premere &quot;Start laser&quot; usando il pedale. La fluorescenza deve essere visualizzata sulla schermata. </li><li> Acquisire cortometraggi (fino a 30 sec) premendo &#39;Record&#39; sullo schermo o &#39;Seleziona&#39; usando il pedale. </li><li> Tra i film, lavare la sonda posizionando la punta in una provetta contenente acqua. </li><li> Al termine, rimuovere la sonda e pulire la punta con una punta di cotone. </li></ol></li><li> Per analizzare media veDiametro ssel: <ol><li> Fare clic sull&#39;icona &quot;Rileva microvasi&quot; nel pannello superiore per aprire la finestra del modulo rilevamento delle navi. </li><li> Fare clic su &quot;Preferenze&quot; e segnare &quot;Mean diametro del vaso&quot; in &quot;Statistica di interesse&quot; e &quot;barre degli istogrammi di visualizzazione&quot; in &quot;modalità di visualizzazione&quot;. </li><li> Fare clic su &quot;Rileva&quot; per visualizzare le misure selezionate. </li></ol></li><li> Per analizzare l&#39;intensità del segnale fluorescente aree adiacenti ai vasi sanguigni: <ol><li> Clicca su &quot;Crea cerchio ROI&quot; nel pannello di sinistra e creare un cerchio nella zona di interesse. </li><li> Fare clic su &quot;istogramma Compute entro ROI&quot; per calcolare i valori relativi a questa regione. </li></ol></li></ol> Trattamento 5. post-procedurale di Mice <ol><li> Al termine di ogni procedura di imaging, mettere i topi in un ambiente pulito, ambiente caldo, e asciutto tranquilla, lontano da altri animali. Fornire calore con un in commercio di untermoforo chirurgica alberghi o una lampada ad incandescenza (50-75 W), collocati in 12-14 lontano da roditori. Monitorare topi continuamente fino mantenere la postura eretta e camminare normalmente. </li><li> Per ulteriori analisi di vascolarizzazione spine &#39;in momenti addizionali, si applicano le seguenti condizioni di recupero: <ol><li> Suturare la piccola incisione con punti di sutura riassorbibili. </li><li> Dare analgesia topi come buprenorfina (1 mg / kg) per via sottocutanea, e tornare gabbie individuali. </li><li> Osservare tutti gli animali per determinare se un ulteriore trattamento analgesico è necessario e rivalutare tutti i giorni per monitorare e valutare per angoscia. </li></ol></li><li> Al punto finale dell&#39;esperimento, eutanasia topi applicando dapprima isoflurano, seguita da dislocazione cervicale. </li><li> Se l&#39;imaging aggiuntivo verrà eseguita nelle settimane successive i passi di imaging iniziali, tutte le procedure devono essere il più sterile possibile. Uno scrub chirurgico pelle deve essere eseguita, wa sterilesuggerimenti ter e cotone sterili dovrebbero essere utilizzati per pulire la sonda endomicroscopy, e la sonda dovrebbe essere disinfettati tra ciascun animale con acqua sterile. </li></ol>

<ol>
	<li>Kibbey, M. C., Grant, D. S., Kleinman, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+SIKVAV+site+of+laminin+in+promotion+of+angiogenesis+and+tumor+growth:+an+in+vivo+Matrigel+model.">Role of the SIKVAV site of laminin in promotion of angiogenesis and tumor growth: an in vivo Matrigel model.</a> J Natl Cancer Inst. 84, 1633-1638 (1992).</li><li>Passaniti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple,+quantitative+method+for+assessing+angiogenesis+and+antiangiogenic+agents+using+reconstituted+basement+membrane,+heparin,+and+fibroblast+growth+factor.">A simple, quantitative method for assessing angiogenesis and antiangiogenic agents using reconstituted basement membrane, heparin, and fibroblast growth factor.</a> Lab Invest. 67, 519-528 (1992).</li><li>Norrby, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+models+of+angiogenesis.">In vivo models of angiogenesis.</a> J Cell Mol Med. 10, 588-612 (2006).</li><li>Auerbach, R., Lewis, R., Shinners, B., Kubai, L., Akhtar, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+assays:+a+critical+overview.">Angiogenesis assays: a critical overview.</a> Clin Chem. 49, 32-40 (2003).</li><li>Johns, A., Freay, A. D., Fraser, W., Korach, K. S., Rubanyi, G. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasound+assessment+of+angiogenesis+in+a+matrigel+model+in+rats.">Ultrasound assessment of angiogenesis in a matrigel model in rats.</a> Ultrasound Med Biol. 32, 673-681 (2006).</li><li>Erez, N., Truitt, M., Olson, P., Arron, S. T., Hanahan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer-Associated+Fibroblasts+Are+Activated+in+Incipient+Neoplasia+to+Orchestrate+Tumor-Promoting+Inflammation+in+an+NF-kappaB-Dependent.">Cancer-Associated Fibroblasts Are Activated in Incipient Neoplasia to Orchestrate Tumor-Promoting Inflammation in an NF-kappaB-Dependent.</a> Manner. Cancer Cell. 17, 135-147 (2010).</li><li>Segal, E., Satchi-Fainaro, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+development+of+polymer+conjugates+as+anti-angiogenic+agents.">Design and development of polymer conjugates as anti-angiogenic agents.</a> Adv Drug Deliv Rev. 61, 1159-1176 (2009).</li><li>Satchi-Fainaro, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+identification+of+glioblastoma+cells+generating+dormant+tumors.">Prospective identification of glioblastoma cells generating dormant tumors.</a> PLoS One. 7, 44395 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Combinando metodi di imaging complementari consente l&#39;acquisizione di informazioni su microvasi densità, funzionalità e morfologia diversi componenti angiogenesi. Caricare CM su spine gel ECM-mimico genera un microambiente tumorale, che è separata da altre popolazioni cellulari, come cellule endoteliali, che vengono assunti e stravaso nella spina. Eseguendo, in parallelo, microbolle mdc US imaging e fibrata immagini endomicroscopy confocale, possiamo concludere che un pool di fattori ...

Il saggio angiogenesi spina matrigel è stato descritto da Kibbey et al., Nel 1992, dove è stato utilizzato per valutare la stimolazione dell&#39;angiogenesi dal SIKVAV peptide (Ser-Ile-Lys-Val-Ala-Val) 1. A differenza di altri test angiogenesi in vivo, come l&#39;angiogenesi corneale mouse o pulcino saggi di membrana corio-allantoidea, questo saggio è relativamente facile da eseguire 2. Il gel ECM-mimico iniettato può contenere cellule, pro-angiogenico o un composti e / o fattori anti-angiogenici. Nel valutare l&#39;attività di un composto anti-angiogenico, il tappo contiene normalmente una miscela di vascolare fattore di crescita endoteliale (VEGF) e fattore di crescita dei fibroblasti (FGF), e la sostanza anti-angiogenico può essere somministrata direttamente nella spina o sistemica 3, 4. Il gel ECM-mimico viene iniettato per via sottocutanea in cui si solidifica in pochi minuti. Valutazione del vaso sanguigno assunzioni nella spina risultante è typically effettuato misurando i livelli di emoglobina all&#39;interno del plug, mediante misurazione segnale di fluorescenza dopo l&#39;iniezione di isotiocianato di fluorescina (FITC) -labeled destrano, mediante immunocolorazione di sezioni di istologia di marcatori specifici endoteliali o da cellule fluorescenza attivate (FACS) 2,5, 6. Tuttavia, questa valutazione permette solo analisi end-point e manca informazioni sulla funzionalità e morfologia dei vasi sanguigni. Inoltre, misurazioni di volume plasmatico, sia per livelli di emoglobina o utilizzando destrano-FITC come indicatore, può essere fuorviante dal contenuto sangue è influenzata dalle dimensioni dei vasi sanguigni e la portata delle piscine stagnanti di sangue. Questo è particolarmente importante quando la vascolarizzazione assunto è caratterizzato dalla permeabilità migliorata e ritenzione (EPR) Effetto 7. Noi qui proponiamo un nuovo, più preciso, il metodo per la visualizzazione dei vasi sanguigni reclutati dalla combinazione di due modalità di imaging complementari. Higmicrobolle h risoluzione mdc ecografia (US) in combinazione con intravitale fibrato-confocale endomicroscopy in grado di fornire informazioni non solo su sangue densità dei vasi, ma anche sulla loro morfologia e funzionalità. Inoltre, questa analisi può essere eseguita in diversi intervalli di tempo per permettere così il controllo della cinetica di angiogenesi. Stati Uniti sono un diffuso modalità di imaging che possiede alta risoluzione spaziale per i vasi sanguigni immagini seguenti per via endovenosa (ev) iniezione di microbolle che rimangono esclusivamente nel compartimento vascolare 8-11. Le microbolle sono microbolle contenenti gas che producono un forte segnale ecogena quando eccitato con un impulso degli Stati Uniti e quindi servire come un buon mezzo di contrasto. Immagini 3D della spina sono acquisiti tramite il software di sistema di imaging US seguente microbolle distruzione. Le immagini risultanti sono composti da fotogrammi dell&#39;immagine di pre e post-distruzione delle microbolle e riflettono la differenza di intensità di video a colori. Questi sovrappostoimmagini vengono visualizzate automaticamente dal software. Di conseguenza, la percentuale di vasi funzionali all&#39;interno della spina può essere quantificato. Alta risoluzione fibrata endomicroscopy confocale serve come modalità di imaging complementare riferendo sui vasi sanguigni morfologia. In questo metodo minimamente invasiva, le immagini vengono acquisite in seguito alla somministrazione endovenosa di destrano FITC-coniugato 12. Il polimero tinture fluorescenti nel flusso sanguigno e quindi serve come un &#39;agente di contrasto&#39; per i vasi sanguigni morfologia e il flusso di sangue. Inoltre, poiché il polimero iniettato è ad una dimensione di 70 KDa, può attraversare solo navi perde come si trova nel sistema vascolare del tumore. Ciò comporterà alta sfondo dal destrano marcato con FITC fuori dei vasi sanguigni. Di conseguenza, fibrata endomicroscopy confocale può essere utilizzato per visualizzare le caratteristiche tipiche dell&#39;effetto EPR in tumore neovasculature- allargata, che perde, le navi altamente aggrovigliati, con estremità smussata. Questo modello di sistema è stato descriletto nel confronto tra il potenziale angiogenico di U-87 MG glioblastoma umano e la sua clone dormiente 13. Vascolarizzazione nei tappi è stata valutata tre settimane inviare ECM-mimico gel inoculazione. È stato dimostrato che la vascolarizzazione all&#39;interno spine contenenti CM da U-87 MG rapida crescita delle cellule tumorali generando era significativamente aumentata in termini di numero, densità e funzionalità, rispetto ai tappi vascolarizzazione contenenti CM dalle cellule tumorali generare dormienti. Pertanto, gli autori sono stati in grado di concludere che CM isolato da U-87 MG rapida crescita delle cellule tumorali generando contiene livelli più elevati di fattori pro-angiogenici, rispetto al CM dalle cellule tumorali generando dormienti. Questi fattori stimolano la formazione di vasi sanguigni funzionali influenzando positivamente tutte le fasi della cascata angiogenica (cioè, la proliferazione, germinazione, migrazione e infine, formazione di strutture tubolari di cellule endoteliali).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="864">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:255px;">Name of the Material/Equipment</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">Company</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">Catalog number</td>
			<td dir="LTR" style="width:251px;">Comments/Description&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:255px;">Rotary Vacuum Evaporator</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">-</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">-</td>
			<td style="width:251px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:255px;">Growth-factors reduced phenol-free Matrigel</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">BD Bioscience</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">FAL356231</td>
			<td style="width:251px;">Thaw overnight, at 40C on ice&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:255px;">Depilatory cream&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">-</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">-</td>
			<td dir="LTR" style="width:251px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:255px;">Vevo2100 US imaging system</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">VisualSonics Inc.&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">-</td>
			<td dir="LTR" style="width:251px;">Requires previous knowledge in operating or the assistance of an authorized technician</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:255px;">55 MHz 708 probe</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">VisualSonics Inc.</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">-</td>
			<td dir="LTR" style="width:251px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:255px;">Vevo2100 imaging software</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">VisualSonics Inc.</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">-</td>
			<td dir="LTR" style="width:251px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:255px;">VialMix&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">DEFINITY Imaging</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">VMIX</td>
			<td dir="LTR" style="width:251px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:255px;">DEFINITY microbubbles</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">DEFINITY Imaging</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">DE4</td>
			<td dir="LTR" style="width:251px;">Activate for 45 seconds using Vialmix before use</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:255px;">CellVizio (Fibered confocal endomicroscope)</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">Mauna Kea Technologies</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">-</td>
			<td dir="LTR" style="width:251px;">Requires previous knowledge in operating or the assistance of an authorized technician</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:255px;">ProFlex MiniO/30 probe</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">Mauna Kea Technologies</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">-</td>
			<td dir="LTR" style="width:251px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:255px;">70 kD FITC-labeled Dextran</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">46945</td>
			<td dir="LTR" style="width:251px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:255px;">ImageCell software</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">Mauna Kea Technologies</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">-</td>
			<td dir="LTR" style="width:251px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:255px;">Calibration Kit</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">Mauna Kea Technologies</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">-</td>
			<td dir="LTR" style="width:251px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td align="left" height="40" style="height:40px;">Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM)</td>
			<td align="left">Gibco Life Tecchnologies</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">41965-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td align="left" height="37" style="height:37px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td align="left">Biological Industries&#160;</td>
			<td align="left">04-007-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td align="left" height="39" style="height:39px;">Penicillin-Streptomycin-Nystatin Solution</td>
			<td align="left">Biological Industries&#160;</td>
			<td align="left">03-032-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring functionality and morphology of vasculature recruited by factors secreted by fast-growing tumor-generating cells

Il sottocutanea spina dosaggio matrigel nei topi è un metodo di scelta per la valutazione in vivo di fattori pro e anti-angiogenici. In questo metodo, i fattori desiderati vengono introdotti freddo gel liquido ECM-mimico che, dopo l&#39;iniezione sottocutanea, solidifica per formare un ambiente simulando l&#39;ambiente cancro. Questa matrice permette la penetrazione di cellule ospiti, come le cellule endoteliali, e di conseguenza, la formazione di vasi. Qui proponiamo un nuovo saggio spina matrigel modificata, che può essere sfruttata per illustrare il potenziale angiogenico di un pool di fattori secreti dalle cellule tumorali, al contrario di un fattore specifico (ad esempio, bFGF e VEGF) o all&#39;agente. La spina contenente gel ECM-mimico viene utilizzato per introdurre l&#39;host (cioè, mouse) con un pool di fattori secreti al CM di cellule di glioblastoma-tumorali generando in rapida crescita. Abbiamo precedentemente descritto un ampio confronto del potenziale angiogenicaU-87 MG glioblastoma umano e la sua dormiente derivato clone, in questo modello di sistema, mostrando angiogenesi indotta nelle cellule parentali MG U-87. Il CM è preparato filtrando mezzi raccolti da piastre di coltura tissutale confluente di entrambe le linee di cellule seguenti 48 ore di incubazione. Quindi, esso contiene solo fattori secreti dalle cellule, senza le cellule stesse. Descritto qui è la combinazione di due modalità di imaging, microbolle mdc ecografia e intravitale endomicroscopy fibered-confocale, per un accurato, in tempo reale, la caratterizzazione della misura, la morfologia e la funzionalità dei vasi sanguigni di nuova formazione all&#39;interno delle spine.

Impiantare spine gel ECM-mimico con CM dalla rapida crescita linea di cellule tumorali-angiogenica generazione U-87 MG, si traduce in una vasta angiogenesi. Questo sistema vascolare può essere ampiamente esplorato usando due metodi di imaging complementari. Le microbolle di contrasto potenziato di imaging US rivela vasta reclutamento di vasi sanguigni funzionali nella spina illustrando vasta flusso di sangue all&#39;interno U-87 MG CM spine caricati, a differenza rilevabile flusso di sangue...

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Monitoring Functionality and Morphology of Vasculature Recruited by Factors Secreted by Fast-growing Tumor-generating Cells

We describe a matrigel plug assay to illustrate angiogenic potential of a pool of factors secreted by cancer cells using two complementary imaging modalities, ultrasound and endomicroscopy. The matrigel, an extracellular matrix (ECM)-mimic gel, is utilized to introduce the host (mouse) with angiogenic factors secreted to the conditioned media (C.M.).&#160;

Funzionalità di monitoraggio e di Morfologia Vasculature Reclutato da fattori secreti dalle cellule a crescita rapida, la generazione di tumore

The subcutaneous matrigel plug assay in mice is a method of choice for the in vivo evaluation of pro- and anti-angiogenic factors. In this method, desired ...

monitoring-functionality-morphology-vasculature-recruited-factors

Research

JoVE Journal

Biology

9.7K Views.  Tel Aviv University. We describe a matrigel plug assay to illustrate angiogenic potential of a pool of factors secreted by cancer cells using two complementary imaging modalities, ultrasound and endomicroscopy. The matrigel, an extracellular matrix (ECM)-mimic gel, is utilized to introduce the host (mouse) with angiogenic factors secreted to the conditioned media (C.M.). 

Video: Monitoring Functionality and Morphology of Vasculature Recruited by Factors Secreted by Fast-growing Tumor-generating Cells

Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass. 


The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass.

Derivazione di cellule staminali embrionali umane da Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both ...

Ricerca

Biologia

Monitoring Acupuncture Effects on Human Brain by fMRI

Functional MRI is used to study the effects of acupuncture on the BOLD response and the functional connectivity of the human brain.  Results demonstrate that acupuncture mobilizes a limbic-paralimbic-neocortical network and its anti-correlated sensorimotor/paralimbic network at multiple levels of the brain and that the hemodynamic response is influenced by the psychophysical response.  Physiological monitoring may be performed to explore the peripheral response of the autonomic nerve function. This video describes the studies performed at LI4 (hegu), ST36 (zusanli) and LV3 (taichong), classical acupoints that are commonly used for modulatory and pain-reducing actions. Some issues that require attention in the applications of fMRI to acupuncture investigation are noted.

FMRI and physiological monitoring is used to study the effects of Acupuncture on the central and peripheral nervous systems. Acupuncture mobilizes a limbic-paralimbic-neocortical network, with great overlap with the default mode network, to modulate neurological activity, possibly related to its autonomic effect in the peripheral nervous system.

Agopuntura Effetti monitoraggio cervello umano da fMRI

Functional MRI is used to study the effects of acupuncture on the BOLD response and the functional connectivity of the human brain.  Results demonstrate ...

Fate Mapping of Human Embryonic Stem Cells by Teratoma Formation

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three embryonic germ layers (1). Directed differentiation of hESCs into specific cell types has generated much interest in the field of regenerative medicine (e.g., (2-5)), and methods for determining the in vivo fate of selected or manipulated hESCs are essential to this endeavor. We have adapted a highly efficient teratoma formation assay for this purpose. A small number of specifically selected hESCs is mixed with undifferentiated wild type hESCs and Phaseolus vulgaris lectin to form a cell pellet. This is grafted beneath the kidney capsule in an immunodeficient mouse. As few as 2.5 x 105 hESCs are needed to form a 16 cm3 teratoma within 8-12 weeks. The fate of the originally selected hESCs can then be determined by immunohistochemistry. This method provides a valuable tool for characterizing tissue-specific reagents for cell-based therapy.

Directed differentiation of hESCs into specific cells has generated much interest in regenerative medicine. We provide a concise, step-by-step protocol for determining the in vivo fate of selected hESCs that provides a valuable tool for characterizing tissue-specific reagents for cell-based therapy.

Mappatura destino di cellule staminali embrionali umane per la formazione teratoma

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three ...

In vivo Liver Endocytosis Followed by Purification of Liver Cells by Liver Perfusion

The liver is the metabolic center of the mammalian body and serves as a filter for the blood. The basic architecture of the liver is illustrated in figure 1 in which more than 85% of the liver mass is composed of hepatocytes and the remaining 15% of the cellular mass is composed of Kupffer cells (KCs), stellate cells (HSCs), and sinusoidal endothelial cells (SECs). SECs form the blood vessel walls within the liver and contain specialized morphology called fenestrae within in the cytoplasm. Fenestration of the cytoplasm is the appearance of holes (&tilde;100 &mu;m) within the cells so that the SECs act as a sieve in which most chylomicrons, chylomicron remnants and macromolecules, but not cells, pass through to the hepatocytes and HSCs 1 (Fig. 1). Due to the lack of a basement membrane, the gap between the SECs and hepatocytes form the Space of Disse. HSCs occupy this space and play a prominent role in regulation and response to injury, storage of retinoic acid and immunoregulation of the liver 2.
SECs are among the most endocytically active cells of the body displaying an array of scavenger receptors on their cell surface 3. These include SR-A, Stabilin-1 and Stabilin-2. Generally, small colloidal particles less than 230 nm and macromolecules in buffer phase are taken up by SECs, whereas, large particles and cellular debris is endocytosed (phagocytosed) by KCs 4. Thus, the bulk clearance of extracellular material such as the glycosaminoglycans from blood is largely dependent on the health and endocytic functions of SECs 5,6. For example, an increase in blood hyaluronan levels is indicative of liver disease ranging from mild to more severe forms 7.
With the exception of one report 8, there are no immortalized SEC cell lines in existence. Even this immortalized cell line is de-differentiated in that it does not express scavenger receptors that are present on primary SECs (our data, not shown). All cell biological studies must be performed on primary cells obtained freshly from the animal. Unfortunately, SECs dedifferentiate under standard culture conditions and must be used within 1 or 2 days upon isolation from the animal. Differentiation of SECs is marked by the expression of Stabilin-2 or HARE receptor 9 , CD31, and the presence of cytoplasmic fenestration 1. Differentiation of SECs can be extended by the addition of VEGF in culture media or by culturing cells in hepatocyte conditioned medium 10,11.
In this report, we will demonstrate the endocytic activity of SECs in the intact organ using radio-labeled heparin for hyaluronan for the SEC-specific Stabilin-2 receptor. We will then purify hepatocytes and SECs from the perfused liver to measure endocytosis.

In vivo Liver Endocytosis Followed by Purification of Liver Cells by Liver Perfusion

The study of liver sinusoidal endothelial cells (SECs) must be performed with primary cells obtained from the animal as no cell lines exist. This method relies on liver digestion and differential centrifugation for SEC purification for subsequent culturing and experimentation.

In Endocitosi Fegato vivo seguita da purificazione delle cellule del fegato da parte di perfusione epatica

The liver is the metabolic center of the mammalian body and serves as a filter for the blood.  The basic architecture of the liver is illustrated in ...

Monitoring Equilibrium Changes in RNA Structure by 'Peroxidative' and 'Oxidative' Hydroxyl Radical Footprinting

RNA molecules play an essential role in biology. In addition to transmitting genetic information, RNA can fold into unique tertiary structures fulfilling a specific biologic role as regulator, binder or catalyst. Information about tertiary contact formation is essential to understand the function of RNA molecules. Hydroxyl radicals (&bull;OH) are unique probes of the structure of nucleic acids due to their high reactivity and small size.1 When used as a footprinting probe, hydroxyl radicals map the solvent accessible surface of the phosphodiester backbone of DNA1 and RNA2 with as fine as single nucleotide resolution. Hydroxyl radical footprinting can be used to identify the nucleotides within an intermolecular contact surface, e.g. in DNA-protein1 and RNA-protein complexes. Equilibrium3 and kinetic4 transitions can be determined by conducting hydroxyl radical footprinting as a function of a solution variable or time, respectively. A key feature of footprinting is that limited exposure to the probe (e.g., 'single-hit kinetics') results in the uniform sampling of each nucleotide of the polymer.5
In this video article, we use the P4-P6 domain of the Tetrahymena ribozyme to illustrate RNA sample preparation and the determination of a Mg(II)-mediated folding isotherms. We describe the use of the well known hydroxyl radical footprinting protocol that requires H2O2 (we call this the 'peroxidative' protocol) and a valuable, but not widely known, alternative that uses naturally dissolved O2 (we call this the 'oxidative' protocol). An overview of the data reduction, transformation and analysis procedures is presented.

Monitoring Equilibrium Changes in RNA Structure by &#039;Peroxidative&#039; and &#039;Oxidative&#039; Hydroxyl Radical Footprinting

This protocol describes how to quantify the Mg(II)-dependent formation of RNA tertiary structure by two methods of hydroxyl radical footprinting.

Cambiamenti di equilibrio nella struttura di monitoraggio RNA da &#39;perossidativi&#39; e &#39;ossidativo&#39; Footprinting radicale ossidrile

RNA molecules play an essential role in biology. In addition to transmitting genetic information, RNA can fold into unique tertiary structures fulfilling ...

Monitoring Kinase and Phosphatase Activities Through the Cell Cycle by Ratiometric FRET

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)-based reporters1 allow the assessment of endogenous kinase and phosphatase activities in living cells. Such probes typically consist of variants of CFP and YFP, intervened by a phosphorylatable sequence and a phospho-binding domain. Upon phosphorylation, the probe changes conformation, which results in a change of the distance or orientation between CFP and YFP, leading to a change in FRET efficiency (Fig 1). Several probes have been published during the last decade, monitoring the activity balance of multiple kinases and phosphatases, including reporters of PKA2, PKB3, PKC4, PKD5, ERK6, JNK7, Cdk18, Aurora B9 and Plk19. Given the modular design, additional probes are likely to emerge in the near future10. 
Progression through the cell cycle is affected by stress signaling pathways 11. Notably, the cell cycle is regulated differently during unperturbed growth compared to when cells are recovering from stress12.Time-lapse imaging of cells through the cell cycle therefore requires particular caution. This becomes a problem particularly when employing ratiometric imaging, since two images with a high signal to noise ratio are required to correctly interpret the results. Ratiometric FRET imaging of cell cycle dependent changes in kinase and phosphatase activities has predominately been restricted to sub-sections of the cell cycle8,9,13,14.
Here, we discuss a method to monitor FRET-based probes using ratiometric imaging throughout the human cell cycle. The method relies on equipment that is available to many researchers in life sciences and does not require expert knowledge of microscopy or image processing.

FRET-based reporters are increasingly used to monitor kinase and phosphatase activities in live cells. Here we describe a method on how to use FRET-based reporters to assess cell cycle-dependent changes in target phosphorylation.

Monitoraggio Attività chinasi e fosfatasi attraverso il ciclo cellulare da raziometrica FRET

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)-based reporters1 allow the assessment of endogenous kinase and phosphatase activities in living cells. Such ...

Monitoring Plasmid Replication in Live Mammalian Cells over Multiple Generations by Fluorescence Microscopy

Few naturally-occurring plasmids are maintained in mammalian cells. Among these are genomes of gamma-herpesviruses, including Epstein-Barr virus (EBV) and Kaposi's Sarcoma-associated herpesvirus (KSHV), which cause multiple human malignancies 1-3. These two genomes are replicated in a licensed manner, each using a single viral protein and cellular replication machinery, and are passed to daughter cells during cell division despite their lacking traditional centromeres 4-8.
Much work has been done to characterize the replications of these plasmid genomes using methods such as Southern blotting and fluorescence in situ hybridization (FISH). These methods are limited, though. Quantitative PCR and Southern blots provide information about the average number of plasmids per cell in a population of cells. FISH is a single-cell assay that reveals both the average number and the distribution of plasmids per cell in the population of cells but is static, allowing no information about the parent or progeny of the examined cell.
Here, we describe a method for visualizing plasmids in live cells. This method is based on the binding of a fluorescently tagged lactose repressor protein to multiple sites in the plasmid of interest 9. The DNA of interest is engineered to include approximately 250 tandem repeats of the lactose operator (LacO) sequence. LacO is specifically bound by the lactose repressor protein (LacI), which can be fused to a fluorescent protein. The fusion protein can either be expressed from the engineered plasmid or introduced by a retroviral vector. In this way, the DNA molecules are fluorescently tagged and therefore become visible via fluorescence microscopy. The fusion protein is blocked from binding the plasmid DNA by culturing cells in the presence of IPTG until the plasmids are ready to be viewed.
This system allows the plasmids to be monitored in living cells through several generations, revealing properties of their synthesis and partitioning to daughter cells. Ideal cells are adherent, easily transfected, and have large nuclei. This technique has been used to determine that 84% of EBV-derived plasmids are synthesized each generation and 88% of the newly synthesized plasmids partition faithfully to daughter cells in HeLa cells. Pairs of these EBV plasmids were seen to be tethered to or associated with sister chromatids after their synthesis in S-phase until they were seen to separate as the sister chromatids separated in Anaphase10. The method is currently being used to study replication of KSHV genomes in HeLa cells and SLK cells. HeLa cells are immortalized human epithelial cells, and SLK cells are immortalized human endothelial cells. Though SLK cells were originally derived from a KSHV lesion, neither the HeLa nor SLK cell line naturally harbors KSHV genomes11. In addition to studying viral replication, this visualization technique can be used to investigate the effects of the addition, removal, or mutation of various DNA sequence elements on synthesis, localization, and partitioning of other recombinant plasmid DNAs.

A method of observing individual DNA molecules in live cells is described. The technique is based on the binding of a fluorescently tagged lac repressor protein to binding sites engineered into the DNA of interest. This method can be adapted to follow many recombinant DNAs in live cells over time.

Monitoraggio replica plasmide in cellule di mammifero in diretta nel corso di generazioni multiple mediante microscopia a fluorescenza

Few naturally-occurring plasmids are maintained in mammalian cells.  Among these are genomes of gamma-herpesviruses, including Epstein-Barr virus  (EBV) ...

In vivo Reprogramming of Adult Somatic Cells to Pluripotency by Overexpression of Yamanaka Factors

Induced pluripotent stem (iPS) cells that result from the reprogramming of somatic cells to a pluripotent state by forced expression of defined factors are offering new opportunities for regenerative medicine. Such clinical applications of iPS cells have been limited so far, mainly due to the poor efficiency of the existing reprogramming methodologies and the risk of the generated iPS cells to form tumors upon implantation.
We hypothesized that the reprogramming of somatic cells towards pluripotency could be achieved in vivo by gene transfer of reprogramming factors. In order to efficiently reprogram cells in vivo, high levels of the Yamanaka (OKSM) transcription factors need to be expressed at the target tissue. This can be achieved by using different viral or nonviral gene vectors depending on the target tissue. In this particular study, hydrodynamic tail-vein (HTV) injection of plasmid DNA was used to deliver the OKSM factors to mouse hepatocytes. This provided proof-of-evidence of in vivo reprogramming of adult, somatic cells towards a pluripotent state with high efficiency and fast kinetics. Furthermore no tumor or teratoma formation was observed in situ.
It can be concluded that reprogramming somatic cells in vivo may offer a potential approach to induce enhanced pluripotency rapidly, efficiently, and safely compared to in vitro performed protocols and can be applied to different tissue types in the future.

In vivo Reprogramming of Adult Somatic Cells to Pluripotency by Overexpression of Yamanaka Factors

This study demonstrates the reprogramming of somatic cells towards pluripotency in vivo without the generation of teratomas. We used hydrodynamic tail vein injection of plasmid DNA encoding the Yamanka factors to induce the in vivo reprogramming of adult hepatocytes into cells of enhanced pluripotency.

In vivo riprogrammazione di età somatiche celle a pluripotenza da iperespressione di fattori Yamanaka

Induced pluripotent stem (iPS) cells that result from the reprogramming of somatic cells to a pluripotent state by forced expression of defined factors ...

Monitoring Intraspecies Competition in a Bacterial Cell Population by Cocultivation of Fluorescently Labelled Strains

Many microorganisms such as bacteria proliferate extremely fast and the populations may reach high cell densities. Small fractions of cells in a population always have accumulated mutations that are either detrimental or beneficial for the cell. If the fitness effect of a mutation provides the subpopulation with a strong selective growth advantage, the individuals of this subpopulation may rapidly outcompete and even completely eliminate their immediate fellows. Thus, small genetic changes and selection-driven accumulation of cells that have acquired beneficial mutations may lead to a complete shift of the genotype of a cell population. Here we present a procedure to monitor the rapid clonal expansion and elimination of beneficial and detrimental mutations, respectively, in a bacterial cell population over time by cocultivation of fluorescently labeled individuals of the Gram-positive model bacterium Bacillus subtilis. The method is easy to perform and very illustrative to display intraspecies competition among the individuals in a bacterial cell population.

Bacteria may accumulate either detrimental or beneficial mutations during their lifetime. In a population of cells individuals that have accumulated beneficial mutations may rapidly outcompete their fellows. Here we present a simple procedure to visualize intraspecies competition in a bacterial cell population over time using fluorescently labeled individuals.&#160;

Monitoraggio della concorrenza intraspecie in una popolazione di cellule batteriche mediante cocultivazione di ceppi marcati fluorescentmente

Many microorganisms such as bacteria proliferate extremely fast and the populations may reach high cell densities. Small fractions of cells in a ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

In Vivo inseguimento 4-dimensionale di emopoietiche staminali e progenitrici celle di topo adulto cranica di Midollo Osseo

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...