Imaging è stata condotta su un montante microscopio confocale Leica SP5 si trova all&#39;interno della struttura FILM dell&#39;Imperial College di Londra, gestito dal dottor Martin Spitaler. Il titolare del campione e testata è stata fatta in collaborazione con il dipartimento di Ingegneria Chimica dell&#39;Imperial College di Londra, con la consulenza di Samuel Jones e il dottor Simon Schultz. Nicola Ruivo, Francisco Diaz e personale CBS presso l&#39;Imperial College sono stati fondamentali per la loro assistenza e consulenza sul mouse allevamento. Mark Scott è finanziato dal HFSP e FILM, Olufolake Akinduro da CRUK e Cristina Lo Celso da CRUK, KKLF, BBSRC e HFSP.

Tutte le procedure che comportano l&#39;uso di animali vengono effettuati in base alla legislazione locale. Il nostro lavoro è approvato dalla Home Office del Regno Unito così come il pannello di esame etico Imperial College. Le procedure consentite sono descritte nella documentazione di licenza progetto e seguono le linee guida che garantiscono il benessere degli animali in ogni momento. Assicurarsi di rispettare la legislazione sulla sperimentazione animale del paese in cui viene eseguito il lavoro. 1 Etichettatura e iniezione di HSPCs: <ol><li> Celle di raccolta come descritto da Lo Celso 14-15. </li><li> Preparare le cellule ad una concentrazione di 10 6 cellule / ml in PBS. NOTA: Utilizzare un emocitometro o le informazioni fornite dal cell sorter per contare le cellule; il numero di cellule da etichettare e iniettata varia a seconda del tipo di cellula (per esempio macchia 10.000 - 20.000 cellule staminali emopoietiche, 100.000 - 300.000 HPC); se si lavora con meno di 10 5 cellule, risospendere in 100 ml di PBS; è importante avere le cellule in PBS senza siero, come siero inibisce la colorazione. </li><li> Add fatto per la sospensione cellulare a una concentrazione finale di 5 mM e agitare immediatamente la sospensione al fine di garantire il colorante non precipitare dalla soluzione e non riescono a etichettare le cellule. </li><li> Incubare per 10 min a 37 ° C e poi lavare facendo girare a 500 xg per 5 min, decantazione del liquido e risospendere il pellet in un volume adeguato IV iniezione (~ 100 - 150 microlitri) </li><li> Risospendere le cellule in 200 l di PBS e raccogliere in una siringa da insulina. NOTA: una siringa da insulina è raccomandato su una siringa convenzionale, perché non ha ago spazio morto e quindi permette di amministrare l&#39;intera sospensione cellulare al mouse. </li><li> Iniettare cellule in un topo irradiato tramite iniezione letale coda vena. NOTA: L&#39;irradiazione è noto, un notevole impatto sul microambiente midollare (sia ematopoietiche e stromali componenti), che si sviluppa su TIme. E &#39;quindi molto importante mantenere tempistica coerente per irradiazione, l&#39;iniezione di cellule (da 4 a 24 ore di irradiazione per il miglior attecchimento) e di imaging. Qui irradiazione viene eseguita 6 ore prima dell&#39;iniezione e l&#39;imaging viene eseguita 20 ore dopo l&#39;iniezione. <ol><li> Posizionare il mouse in una camera calda (37 ° C) fino alla vena caudale appare vasodilated. </li><li> Spostare il mouse nel dispositivo di immobilizzazione e far scorrere con attenzione l&#39;ago nella vena della coda. </li><li> Iniettare le cellule nella vena - nessuna resistenza di iniezione deve essere rilevato. </li><li> Lasciare il mouse O / N per permettere alle cellule di migrare verso gli spazi del midollo osseo. </li></ol></li></ol> 2 Preparare il mouse per Imaging <ol><li> Autoclave un paio di pinze sottili e un paio di forbici sottili e un copricapo prima dell&#39;uso e conservare in un ambiente sterile. </li><li> Make up anestetico più fresco possibile, (0.38 ml di ketamina + 0,25 ml Medetomidina + 4,47 ml di acqua). NOTA: otsuoi anestetici approvati, tra cui isoflurano e altri iniettabili, saranno efficaci anche. Il cocktail descritto deve essere somministrato per via intraperitoneale a 0.1 ml per 10 g di peso corporeo, con ricariche di 30 - 50 ml somministrati ogni 45 minuti a 1 ora. </li><li> Accendere il laser a due fotoni, se necessario, quindi avviare il microscopio e software, calibrando la fase in cui viene richiesto. Accendere il laser e permettere loro di riscaldarsi e stabilizzarsi mentre si prepara il mouse per l&#39;imaging. </li><li> Anestetizzare il mouse con la miscela anestetica preparata (punto 2.2) per l&#39;anestetico prescelto tramite iniezione intraperitoneale. Monitorare l&#39;insorgenza di anestesia profonda con pedale reflex ora e ad intervalli regolari durante il protocollo. NOTA: il mouse deve essere attentamente monitorato durante tutta la procedura e se l&#39;anestesia sembra essere alleggerimento (in genere dopo 45 - 60 minuti), poi somministrare una dose di top-up (come indicato in 2.2). Aspettatevi qualche variazione tra i topi di diversa età e sesso. E &#39;important per discutere il protocollo di anestesia con il vostro veterinario locale per garantire adeguate precauzioni sono prese per garantire il benessere del mouse. </li><li> Tampone parte superiore del cuoio capelluto con etanolo al 70% su un tessuto, garantendo di non ottenere qualsiasi etanolo negli occhi del mouse. </li><li> Utilizzando pinze sterili e forbici, rimuovere con attenzione la porzione centrale del cuoio capelluto per esporre l&#39;area cranica da acquisire: fare una piccola incisione nella parte posteriore della testa tra le orecchie sollevando la pelle con le pinze. Tenendo la pelle in su, far scorrere le forbici sotto la pelle e tagliare delicatamente lungo la parte esterna l&#39;area di esposizione desiderato. </li><li> Pulire l&#39;osso esposto con batuffolo di cotone sterile imbevuto con PBS sterile per mantenerlo umido. </li><li> Fissare il pezzo testa di metallo al cranio del mouse pronto per l&#39;imaging. <ol><li> Miscelare una quantità adeguata di cemento dentale in una barca pesare fino a quando diventa una pasta e applicare rapidamente sulla superficie inferiore del casco che attribuirà alla sKull. </li><li> Prima che il cemento, mettere il casco sul cranio del mouse, facendo attenzione a non ottenere alcun cemento dentale in area di esposizione, quindi attendere che impostare. </li><li> Applicare una piccola quantità di Intrasite Hydrogel che mantiene il cranio umido. </li></ol></li><li> Fissare il casco al titolare e fissarlo in posizione con la vite, assicurando che le scanalature si inseriscono all&#39;interno delle tacche del supporto. </li><li> Rimuovere l&#39;idrogel dal cranio con cotton fioc sterili e pulite con PBS sterile prima del trasferimento al microscopio. </li><li> Inserire il supporto nel palco microscopio, posizionare il tappetino di riscaldamento sotto il mouse, inserire la sonda del termometro rettale e fissare il tutto al suo posto sul palco con del nastro adesivo. </li><li> Mettere una piccola goccia di pomata oftalmica sugli occhi del mouse per assicurarsi che non si asciugano mentre sotto anestesia. NOTA: il mouse non deve essere lasciato incustodito in qualsiasi momento durante il processo di imaging mentre sotto anestesia. </li></ol>in vivo &quot;jove_title&quot;: Pile ad alta risoluzione e Time-lapse acquisizione <ol><li> Focus sul cranio con i pezzi degli occhi. <ol><li> Riempire la finestra di imaging con purificata, acqua sterile e l&#39;utilizzo di una lente immersione acqua, abbassarla in modo che tocchi la goccia d&#39;acqua. </li><li> Focus sulla parte superiore del cranio con gli oculari del microscopio, utilizzando una lampada esterna come sorgente luminosa. </li><li> Posizionare l&#39;area di esposizione sulla sutura centrale e spostare verso la parte posteriore della testa per trovare la sutura coronale come posizione di partenza. </li></ol></li><li> Impostare il microscopio per consentire di eccitazione efficace e rilevazione dei fluorofori rilevanti indicati nella tabella di eccitazione e di emissione. NOTA: mentre una confocale Leica SP5 in posizione verticale con una testa di scansione galvanometro convenzionale esecuzione della piattaforma software LAS-AF è qui utilizzato, la procedura può essere facilmente replicato in altre piattaforme microscopio / software. La lente usata qui è la Leica HCX IRAPO L 25x W / 0,95 NA but lenti equivalenti di altri produttori sono disponibili con idonei di ingrandimento e di alta NA <ol><li> Posizionare il software in una modalità per catturare sia immagini XY e un 3D Z-stack e velocità di esposizione impostata a 400 Hz e la risoluzione di 512 x 512 pixel. NOTA: la configurazione hardware e qui il risultato in un campo visivo di 620 micron e questo può variare su altre piattaforme. </li><li> Impostare il software in modo che più canali / tracce sono in grado di essere catturato, così come assicurare che il metodo di raccolta è destinata a cambiare le impostazioni tra le pile, se possibile, o tra i fotogrammi per lo meno. Montato 3 impostazioni di cattura indipendenti, spegnendo l&#39;illuminazione laser al termine dell&#39;acquisizione di ciascuna pila. NOTA: saranno necessari tre canali per questa procedura per ridurre il crosstalk tra i canali. </li><li> Configurazione delle impostazioni per la prima scansione sequenziale per il segnale dell&#39;osso due fotoni SHG (840 nm di eccitazione; 400-440 nm di emissione); aprire l&#39;otturatore per il laser MP e garantire la MGuadagno P e offset sono configurato correttamente, potenza del laser è del 12,5 - 25% e il laser è acceso. Selezionare un PMT appropriato come l&#39;unico rivelatore e cambiare il colore al bianco. Nota: rivelatori NDD con filtri appropriati dovrebbero essere usati per il rilevamento osso ove disponibili per ottenere un segnale luminoso più profondo. </li><li> Ripetere la procedura di impostazione canale utilizzato per il canale GFP per una autofluorescenza combinato (543 nm di eccitazione; 560 - emissione 600nm) e ha fatto (633 nm di eccitazione; 650-720 nm di emissione) per il secondo impostazioni di scansione, utilizzando due PMT appropriate. Cambiare il colore canale verde per la autofluorescenza e rosso per il DID. Nota: utilizzando verde come il canale auto-fluorescenza permette una facile individuazione del DID cellule positive quando i due canali sono sovrapposti - cellule autofluorescenti appaiono come giallo / arancione a causa di essere in entrambi i canali, mentre DiD cellule appaiono solo come rosso dal momento che appaiono solo nel DiD canale. Il canale auto-fluorescenzaviene utilizzato solo per questo confronto e non è utilizzato in qualsiasi ultima analisi, se l&#39;utente desidera, questo può essere cambiato in un colore diverso per scopi di visualizzazione per evitare confusione con il canale GFP. </li><li> Infine, impostare la terza e ultima scansione per GFP (488 nm di eccitazione; 500-530 nm di emissione); assicurarsi che l&#39;otturatore è aperto, se necessario, e quindi impostare la potenza del laser della linea di laser 488 nm a circa il 15% o un livello adeguato per il laser utilizzato, selezionare un appropriato PMT come l&#39;unico rivelatore attiva e cambiare la sua pseudocolore a verde. </li><li> Attivare una modalità di imaging &#39;Live&#39; per iniziare una scansione di anteprima del canale selezionato e regolare rivelatore Gain e Offset per l&#39;esposizione ottimale. Ripetere questa operazione per ogni scansione nella finestra sequenziale. </li><li> Salvare le impostazioni di queste scansioni multi-canale per un facile riutilizzo. NOTA: questo permette all&#39;utente di ricaricare le impostazioni nelle sessioni successive. </li></ol></li><li> Attivare multi-posizione di cattura, denominato &#39;Mark unnd Trovate &#39;nel software dimostrato, e reimpostare i punti di coordinate. </li><li> Eseguire la scansione l&#39;area di esposizione ossea, a partire dalla intersezione tra la sutura centrale e coronale, la scansione della profondità della zona del midollo osseo utilizzando sia autofluorescenza (pseudo colore verde) e ha fatto (pseudo-colore rosso) con una vista composita. NOTA: le cellule autofluorescenti saranno presenti in entrambi i canali e apparire arancione / giallo nell&#39;immagine composita, mentre ha cellule marcate appaiono come-solo globuli rossi nell&#39;immagine composita. </li><li> Quando viene rilevata una cella, segnare questo come una nuova posizione di coordinate (x, y, z) nel &#39;Marco e Trova&#39; strumento facendo clic sulla finestra &quot;Aggiungi nuovo icona Posizionare sul lato sinistro della&quot; Marco e Trova &quot; . </li><li> Quando è stato esaminato il campo di vista attuale, spostare lo stadio la distanza di un campo di vista o sinistra / destra / giù / su. Ripetere questo processo per ogni campo di vista, a poco a poco di lavoro intorno alla intera area della finestra di imaging a sinistra di the sutura centrale, spostando verso il naso del mouse. Una volta che la sutura biforcazione centrale è in vista, spostarsi verso il lato destro della sutura e ripetere la procedura di scansione del lato sinistro nella direzione opposta (cioè verso la sutura coronale). Segnare le coordinate di tutte le nuove cellule di interesse utilizzando il &#39;Marco e Trova&#39; strumento. </li><li> Una volta che la scansione della finestra di imaging è completo, utilizzare il &#39;Marco e Trova&#39; strumento per rivedere i punti (selezionare il punto desiderato e rivedere ogni punto singolarmente). Impostare la parte superiore e inferiore di un Z-stack intorno ad ogni cella per ogni posizione, (molte piattaforme software vi permetterà di eseguire z-stack indipendenti per ogni posizione, che riduce catturando lo spazio vuoto). Per ogni punto, messa a fuoco su e giù e impostare le posizioni superiori e inferiori Z per 3D cattura z-stack e aggiornare il singolo punto nel &#39;Marco e Trova&#39;. Impostare l&#39;intervallo di Z-Stack di 5 micron e una media per ogni canale di scansione sequenziale ad una qualità adeguata: Linea or media Frame. NOTA: Aumentando il numero di scansioni in media aumenta la lunghezza del tempo di acquisizione. </li><li> Acquisire una pila di riferimento di alta qualità per ogni punto di interesse avviando l&#39;intera procedura di scansione (spesso indicato come &#39;Start&#39; piuttosto che &quot;Capture&quot;). NOTA: questa scansione può agire come un riferimento per il futuro l&#39;imaging ad alta velocità. </li><li> Una volta finito con la scansione di alta qualità, attivare un&#39;impostazione time-lapse per la cattura. </li><li> Nelle impostazioni di time-lapse, impostare l&#39;intervallo di tempo di 5 minuti e il tempo complessivo di esecuzione alla lunghezza desiderata (ad esempio, 5 ore). &#39;Applica&#39; queste impostazioni per la scansione globale. NOTA: al fine di ridurre il tempo di scansione per consentire un intervallo di 5 minuti lasso di tempo, si potrebbe essere necessario ridurre il numero di scansioni utilizzate per il calcolo della media, limitare la risoluzione a 512 x 512 pixel, convertire la scansione bidirezionale (con correzione di fase richiesto per allineare entrambe le direzioni di scansione), e / o aumentare la velocità di scansione di 600 Hz o più (oltre 600Hz causerà lo zoom dell&#39;area di imaging per la piattaforma software dimostrata). E &#39;anche importante notare che, mentre una modalità di imaging sequenziale è stato utilizzato per acquisire una serie di immagini di alta qualità, inizialmente, l&#39;acquisizione simultanea viene utilizzato per aumentare la velocità durante il time-lapse imaging - questo può causare qualche lieve cross-talk tra i canali che pone in più importanza sulla cattura iniziale delle pile di riferimento separati accuratamente. </li><li> Iniziare l&#39;imaging (come prima facendo clic sul pulsante &#39;Start&#39; nel software dimostrata). NOTA: assicurarsi di mantenere il livello appropriato di anestesia somministrando ulteriormente, piccole dosi, se necessario, facendo attenzione a non overdose il mouse, regolarmente rabboccare l&#39;acqua di assicurare l&#39;obiettivo non si secca e monitorare i segni vitali e temperatura di riscaldamento-pad tutto. </li><li> Al termine, sollevare la lente dal supporto e quindi rimuovere il supporto dal palco microscopio, assicurando i fili dalla sonda rettale e hmangiare mat non siano danneggiati. </li><li> Svitare la testata dal supporto palco e rimuovere con attenzione il mouse. Abbattere il mouse mediante dislocazione cervicale e rimuovere il capo-pezzo di metallo facendolo scattare fuori dal cranio. Salvare i dati su disco e il trasferimento al server per una successiva analisi. NOTA: Il pezzo testa è idealmente pulita mediante immersione in acetone per poche ore e, infine, strofinando il cemento fuori residuo. </li></ol>

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There is nothing to disclose.

Che cosa è stato realizzato? Il protocollo utilizza l&#39;imaging multi-dimensionale time-lapse per monitorare la migrazione di FACS purificato, ex vivo etichettati, HSPCs trapiantati nel topo cranica midollo osseo. Identificazione delle cellule trapiantate singole è stato raggiunto e queste sono state monitorate per periodi prolungati di tempo (ore) con elevata precisione. Respirazione artefatti da movimento indotte sono state ridotte al minimo e le cellule sono state ripetutamente reimaged nel corso di un tempo-corso prolungato. Quali sono le indicazioni per il futuro? Sviluppo della tecnica potrebbe progredire verso esperimenti di recupero per consentire l&#39;imaging su più giorni, nel corso di una settimana o più e l&#39;uso di anestetici gas come isoflurano per abbreviare e semplificare il processo di recupero per il mouse (Nota: esperimenti di recupero richiedono rigorosamente Condizioni di chirurgia sterili e somministrazione di analgesici appropriati). DevURALE di un grande colore-tavolozza dei coloranti in vivo, nonché l&#39;etichettatura genetica efficiente delle cellule ematopoietiche faciliterà anche esperimenti multi-etichettatura, fornire un quadro più chiaro delle interazioni cellula-cellula all&#39;interno del midollo osseo e consentire esperimenti più complessi in futuro. Inoltre, l&#39;etichettatura simultanea di molteplici strutture del midollo osseo e dei componenti dello stroma fornirà un quadro più completo degli eventi che si svolgono in nicchie HSPC. Immagine stabilità dei film time-lapse potrebbe essere migliorata preacquisition stabilizzando il microscopio ulteriormente e ridurre al minimo i gradienti di temperatura nel campione e postacquisition utilizzando algoritmi di registrazione dell&#39;immagine. Limitazioni: La tecnica descritta presenta alcuni limiti. La sopravvivenza di topi a seguito di somministrazione di anestetici iniettabili è imprevedibile ed è molto facile da complicazioni di esperienza a seconda della risposta individuale alanestetico. In generale, il più a lungo una sessione di imaging, più difficile è per il mouse per recuperare da anestesia ed è quindi importante pianificare con cura se il mouse deve essere recuperato, idealmente limitando la durata delle immagini lasso di tempo. L&#39;uso di anestetici iniettabili limita il tempo di ogni sessione di imaging può durare. Mentre è possibile prolungare l&#39;anestesia da readministering una piccola dose di anestetico, è difficile eseguire questa precisione e sovradosaggio il mouse è una delle più frequenti cause di cessazione anticipata di immagini in vivo. L&#39;anestesia del gas è meno tossico e permette una sessione di imaging più iniziale, ma un rapido recupero del mouse dopo aver&gt; 2 ore lungo la somministrazione di isoflurano è raramente successo. Un&#39;altra limitazione della tecnica è limitata risoluzione delle immagini ottenibili durante multi-point time-lapse imaging, dovuta alla necessità di acquisire rapidamente immagini. Questo, accoppiato con deriva focale o campo di salti (discoussed sopra), può fare il monitoraggio delle cellule difficile. Confronto con metodi alternativi: HSPCs di solito sono etichettati con il colorante lipofilo ha fatto, ma dir e DII coloranti sono alternative equivalenti e altri coloranti cellulari possono essere utilizzati, purché sufficientemente luminoso, come rivisto in [16]. Anche se ex vivo etichettatura di cellule con DID ha mostrato di non pregiudicare la funzionalità a lungo termine di CSE, ha la limitazione che DID (o qualsiasi altro colorante chimico) viene diluita al momento divisione cellulare. Dal CSE proliferano durante i primi giorni successivi al trapianto, il rapporto segnale-rumore di queste cellule si deteriora rapidamente. Etichettatura endogena delle cellule mediante manipolazione genetica ed espressione di proteine ​​fluorescenti è un metodo alternativo praticabile, purché le proteine ​​fluorescenti sono espressi a livelli sufficientemente alti per generare il segnale rilevabile attraverso l&#39;osso del cranio. Ci sono una serie di alternative tecniques disponibili per eseguire l&#39;imaging del HSPCs all&#39;interno dello spazio midollare, ciascuno con i propri vantaggi e limitazioni. Inserimento di dispositivi di imaging a base di fibre ottiche ha permesso per l&#39;imaging del midollo osseo ricostituzione in ossa lunghe [8], mentre l&#39;imaging confocale dopo esposizione chirurgica della tibia e l&#39;assottigliamento dello smalto osso con un trapano chirurgico [12] hanno prodotto immagini dettagliate di HSPCs residenti in le aree periferiche delle ossa lunghe. Questi metodi tuttavia sono molto più invasivo di quello descritto qui e quindi non consentono di ripetere sessioni di imaging incentrate sulla stessa area midollo osseo all&#39;interno del mouse stesso. Inoltre, è possibile che queste tecniche possono influenzare le cellule osservate in risposta inevitabile ingenti danni nel tessuto circostante. HSPCs hanno ripreso per brevi periodi di tempo attraverso lamelle poste sopra asportati, femori fratturati [11], ma l&#39;impatto di questa dura preparazione del tessuto su HSPCs non è clear e la tecnica è stata utilizzata unicamente per ottenere osservazioni singole punto di tempo. Ossa fissi sono stati sezionati in sezioni seriali, macchiato, e le immagini ottenute ricostruito in un modello 3D, fornendo un&#39;eccellente risoluzione in 3D, soprattutto quando si utilizzano calchi vascolari [17], e, recentemente, Laser Scanning Citometria (LASC) è stato utilizzato per ottenere quantitativa Misure circa HSPCs in situ, evidenziate da immunocolorazione [18], ma non sono in grado di fornire alcuna informazione temporale sul comportamento delle cellule. Le tecniche descritte in questa nuova tecnica forniscono una combinazione di buona risoluzione in 3D, sufficiente campionamento temporale per monitorare le cellule in 4D e sono relativamente non invasiva, offrendo quindi un approccio ideale per raggiungere il monitoraggio a lungo termine di HSPCs interagire con il midollo osseo microambiente.

Nonostante nicchie di cellule staminali siano riconosciute per decenni 3 e ben caratterizzati in molti tessuti come il bulbo olfattivo, la fibra muscolare, capelli follicolo rigonfiamento o CNS zona subventricolare 4-7, le interazioni tra le cellule staminali ematopoietiche (CSE) e midollo osseo (microambiente BM) sono ancora poco conosciuta a causa della difficoltà di osservare direttamente singole cellule attraverso l&#39;osso e la natura estremamente fluida del tessuto stesso. E &#39;stato dimostrato, attraverso una serie di studi funzionali sulla base di ablazione o sovraespressione di geni specifici in entrambe le cellule staminali emopoietiche o le cellule stromali del microambiente in sé, che una rete intricata di diversi tipi di cellule e segnali di regolamentazione è responsabile della regolazione del delicato equilibrio tra quiescenza , la proliferazione, l&#39;espansione e la differenziazione delle cellule staminali emopoietiche 1-2. Il crosstalk tra CSE e le loro nicchie può essere compresa a fondo solo attraverso l&#39;osservazione diretta. Questo è achievable grazie allo sviluppo di protocolli di imaging avanzate, combinando la tecnologia disponibile non solo in termini di microscopia, ma anche di soluzioni di supporto del campione e del software di acquisizione. Risoluzione cella singola imaging dal vivo di staminali e progenitrici ematopoietiche (cellule trapiantate HSPCs) nel vano BM delle calvaria del mouse ossa ha mostrato che HSPCs engrafting localizzano in prossimità dei vasi SDF-1 e VCAM-1-positivi 8-9 e che le cellule più immature si trovano nel raggio di 15 - 20 micron da cellule osteoblastiche GFP-positive (linea di topi transgenici Col2.3-GFP, in cui il promotore collagene 1α osteoblasti-limitato spinge l&#39;espressione della GFP), mentre la loro progenie sono più distale 10. Osservazioni simili sono stati ottenuti da sezionati e ossa fratturate femore 11 e dalle diluiti ossa tibeal 12. Imaging del cranica midollo osseo rimane l&#39;approccio meno invasivo per ottenere la visualizzazione diretta di HSPCs all&#39;interno thEIR microambiente nativo. Con qualsiasi di imaging esemplare vivo è un bisogno innato di mantenere il campione più fermo possibile per evitare inutili artefatti dovuti al movimento del campione. La respirazione provoca movimenti oscillatori della testa del mouse, che devono essere evitati durante l&#39;imaging cranica midollo osseo. Titolari stereotassica convenzionali, utilizzati ad esempio per l&#39;imaging del cervello e elettrofisiologia, non sono adatti per l&#39;imaging cranica perché ostruiscono le ossa frontali. Partendo da un supporto per mouse utilizzato per minimizzare il disagio durante gli studi di imaging ed elettrofisiologia vivi 13, un supporto 2 componente è stato sviluppato, con un piccolo pezzo fissato alla testa del mouse per creare una finestra di imaging collegato ad un braccio grande garantire tenuta stabile con un piastra di base pesante che assicura saldamente nella fase microscopio. Fissaggio del pezzo testa al cranio del mouse permette respirazione libera mentre ancora immobilizzare la testa a posto e l&#39;eliminazione adeguatamente movements dovuti alla respirazione. Un meccanismo &#39;lock-and-chiave&#39; collega la testa pezzo al corpo porta permette la dimensione della finestra deve essere minimizzata così come una maggiore accuratezza di posizionamento, pertanto semplificare l&#39;intervento chirurgico, e la forma della piastra di base nella fase permette un allineamento accurato sul microscopio. Per monitorare accuratamente cellule mobili, un protocollo lasso di tempo multi-punto è stato progettato per consentire il monitoraggio delle cellule nel tempo di 5 min intervalli tra i punti di tempo. CSE Qui, ha etichettati vengono iniettati in col2.3GFP osteoblasitc giornalista topi 10,14 e ripreso a circa 20 ore più tardi. Il supporto per mouse che è stata creata e le impostazioni di imaging necessari per eseguire una rapida multi-point time-lapse imaging delle stesse aree in un periodo di ore multipli sono descritte in dettaglio.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:71px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ketamine(Narketan 100mg/ml)</td>
			<td style="width:71px;">Vetoquinol</td>
			<td style="width:119px;">407575 0107 C</td>
			<td style="width:167px;">Other anesthetics may be used in place of this.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Medetomidine(Domitor 1mg/ml)</td>
			<td style="width:71px;">Elanco</td>
			<td style="width:119px;">134800-2</td>
			<td style="width:167px;">Other analgesics may b used in place of this.</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">Vibrant DiD cell labeling solution</td>
			<td style="width:71px;">Roche Products Ltd.</td>
			<td style="width:119px;">V22887</td>
			<td style="width:167px;">Other colors are available and may be used if required.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Lacrilube ophtalmic ointment</td>
			<td style="width:71px;">Allergan</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td style="width:167px;">avaliable by prescription by the local vet</td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:216px;">Kemdent &#34;Diamond Carve&#34; glass ionomer cement</td>
			<td style="width:71px;">Associated Dental Products Ltd. via Kemdent</td>
			<td>SUN527</td>
			<td style="width:167px;">We use shade A3, but any shade of cement can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">PBS</td>
			<td style="width:71px;">multiple equivalent</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Sterile water</td>
			<td style="width:71px;">multiple equivalent</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:216px;">Insulin syringes</td>
			<td style="width:71px;">Terumo Medical Corporation</td>
			<td style="width:119px;">SS10M3109</td>
			<td style="width:167px;">1mL, 31G</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Mouse restrainer</td>
			<td style="width:71px;">Harvard Apparatus</td>
			<td align="right" style="width:119px;">340031</td>
			<td style="width:167px;">Cone type (small)</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">Autoclaved forceps and scissors</td>
			<td style="width:71px;">Agar Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AGT577 
			AGT5034</td>
			<td style="width:167px;">Iris scissors - 90mm; Dumont HP tweezers (0.06mm tip)</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">Weigh boat and cement stirrer</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td>611-1996/231-0370</td>
			<td style="width:167px;">5mL weigh-boat (black)/ Wooden tongue depressor</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">Leica SP5 upright confocal microscope with motorized stage and two-photon laser</td>
			<td style="width:71px;">Leica Microsystems</td>
			<td>Not available</td>
			<td style="width:167px;">Call for quote</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">25x water dipping objective lens (N.A. = 0.95)</td>
			<td style="width:71px;">Leica Microsystems</td>
			<td align="right" style="width:119px;">11506323</td>
			<td style="width:167px;">HCX IRAPO L lens</td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:216px;">Custom designed mouse holder</td>
			<td style="width:71px;">Imperial College Engineering Workshop</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:167px;">See Figure 1 for details</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">Heating pad with rectal thermometer probe</td>
			<td style="width:71px;">BASi Instrumentation</td>
			<td style="width:119px;">FHC-40902/ FHC-40908/ FHC-4090502</td>
			<td style="width:167px;">Heat mat/ Control box/ Thermometer probe</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo 4-dimensional tracking of hematopoietic stem and progenitor cells in adult mouse calvarial bone marrow

Attraverso un delicato equilibrio tra quiescenza e la proliferazione, auto rinnovamento e produzione della progenie differenziate, le cellule staminali ematopoietiche (CSE) mantengono il fatturato di tutte le linee cellulari del sangue mature. Il coordinamento dei segnali complessi che portano a specifici sorti HSC si basa su l&#39;interazione tra cellule staminali emopoietiche e l&#39;intricato microambiente del midollo osseo, che è ancora poco conosciuta [1-2]. Noi descriviamo come combinando un portacampione di nuova concezione per il posizionamento stabile animale con multi-step e confocale a due fotoni in tecniche di imaging in vivo, è possibile ottenere pile 3D ad alta risoluzione contenenti HSPCs e le loro nicchie circostanti e di monitorarle nel tempo attraverso multi-point time-lapse imaging. Imaging ad alta definizione permette ex vivo di cellule staminali e progenitrici ematopoietiche etichettati rilevamento (HSPCs) che risiedono all&#39;interno del midollo osseo. Inoltre, multi-point time-lapse imaging 3D, obtained con le impostazioni di acquisizione più veloci, fornisce informazioni precise sul movimento HSPC e le interazioni reciproche tra HSPCs e cellule dello stroma. Monitoraggio di HSPCs in relazione alla GFP cellule osteoblastiche positivo è dato come applicazione esemplare di questo metodo. Questa tecnica può essere utilizzata per monitorare qualsiasi ematopoietiche o cellule stromali adeguatamente etichettati di interesse all&#39;interno del mouse cranica spazio midollo osseo.

La misura, supporto per mouse ad alta precisione tra cui una finestra di imaging cranica permette l&#39;imaging prolungato di FACS purificati, HSPCs etichettati iniettate in topi riceventi letale irradiati (Figura 1A). In genere, dopo l&#39;iniezione di tra 15-20.000 cellule marcate, da 8 a 15 cellule sono solitamente riconoscibili all&#39;interno dell&#39;area di imaging midollo osseo del cranio del giorno successivo. Qui viene mostrato come acquisire stack 3D risoluzione singola cellula di HSPC contenenti aree del midollo osseo di circa 90-120 micron di spessore, (Figura 1B), seguita da 4D time-lapse film dei HSPCs individuati (Figura 1C e film). Risultati ottimali si ottengono se il cemento dentale non è preparato ottimamente, per esempio l&#39;acqua potrebbe fuoriuscire dalle zone non sigillate, e anche se può essere ricaricato dalla parte superiore del supporto, qualsiasi periodo di tempo in cui l&#39;obiettivo non è tuffato in acqua porta al nero f<html> Rames. Alcuni deriva nelle immagini è inevitabile dovuto alla dilatazione termica dei materiali di supporto per mouse, tuttavia può essere accentuata da subottimale adesione cemento, con conseguente progressivo distacco del mouse, e da perturbazioni del dell&#39;imaging istituito, portando a salti improvvisi della messa a fuoco durante l&#39;imaging time-lapse. Drift durante multi-point time-lapse imaging può anche essere causato da imprecisioni nei movimenti di scena quando rivisitando posizioni precedentemente esaminato. Drift e balbuziente artefatti nei film time-lapse possono essere corretti per utilizzando algoritmi di registrazione dell&#39;immagine. Tabella 1 eccitazione e le impostazioni di emissione. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td style="width:204px;"> Colore Canale </td><td style="width:213px;"> Eccitazione </td><td style="width:208px;"> Emissione </td></tr><tr><td style="width:204px;"> GFP </td>13px; &quot;&gt; 488 nm </td><td style="width:208px;"> 500-530 nm </td></tr><tr><td style="width:204px;"> Autofluorescenza </td><td style="width:213px;"> 543 nm </td><td style="width:208px;"> 560-610 nm </td></tr><tr><td style="width:204px;"> DiD </td><td style="width:213px;"> 633 nm </td><td style="width:208px;"> 640-700 nm </td></tr><tr><td style="width:204px;"> SHG </td><td style="width:213px;"> 840 nm (MP) </td><td style="width:208px;"> 400-450 nm </td></tr></tbody></table><img alt="Figura 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51683/51683fig1highres.jpg" width="600" /> Figura 1 in vivo imaging 4D HSPCs nel topo cranica. Cellule esempi dei risultati ottenuti (B) 2D fette da una pila 3D (profondità totale è di 114 micron), contenente il segnale da collagene osseo (bianco), ha etichettati (rosso) - (A) Schema dell&#39;esperimento (C B).. , cel autofluorescentils (giallo) e le cellule osteoblastiche (verde). Barre di scala.: 100 micron (C) 2D fette da un filmato time-lapse 4D mostra un DID etichetta HSC (rosso) la migrazione in prossimità delle cellule osteoblastiche (verde). La linea tratteggiata evidenzia lo spostamento della cella. Barre di scala: 50 micron (B) e 100 micron (C). NOTA:. Il film ottenuto dall&#39;acquisizione time-lapse in (C) viene visualizzato durante l&#39;articolo video <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51683/51683fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

La natura delle interazioni tra staminali e progenitrici di cellule ematopoietiche (HSPCs) e nicchie di midollo osseo è poco conosciuta. Modifiche hardware personalizzato e un protocollo di acquisizione multi-step consentono l&#39;utilizzo di due fotoni e microscopia confocale per immagine ex vivo HSPCs etichettati homed all&#39;interno delle aree del midollo osseo, interazioni monitoraggio e movimento.

In Vivo inseguimento 4-dimensionale di emopoietiche staminali e progenitrici celle di topo adulto cranica di Midollo Osseo

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

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Research

JoVE Journal

Biology

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

13.8K Views.  Imperial College London.  La natura delle interazioni tra staminali e progenitrici di cellule ematopoietiche (HSPCs) e nicchie di midollo osseo è poco conosciuta. Modifiche hardware personalizzato e un protocollo di acquisizione multi-step consentono l'utilizzo di due fotoni e microscopia confocale per immagine ex vivo HSPCs etichettati homed all'interno delle aree del midollo osseo, interazioni monitoraggio e movimento. 

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Transplantation of Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafish

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an organism. The functional definition of a HSC is a transplanted cell that has the ability to reconstitute all the blood lineages of an irradiated recipient long term. This designation was established by decades of seminal work in mammalian systems. Using hematopoietic cell transplantation (HCT) and reverse genetic manipulations in the mouse, the underlying regulatory factors of HSC biology are beginning to be unveiled, but are still largely under-explored. Recently, the zebrafish has emerged as a powerful genetic model to study vertebrate hematopoiesis. Establishing HCT in zebrafish will allow scientists to utilize the large-scale genetic and chemical screening methodologies available in zebrafish to reveal novel mechanisms underlying HSC regulation. In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish. We show the dissection and preparation of zebrafish whole kidney marrow, the site of adult hematopoiesis in the zebrafish, and the introduction of these donor cells into the circulation of irradiated recipient fish via intracardiac injection. Additionally, we describe the post-transplant care of fish in an "ICU" to increase their long-term health. In general, gentle care of the fish before, during, and after the transplant is critical to increase the number of fish that will survive more than one month following the procedure, which is essential for assessment of long term (&lt;3 month) engraftment. The experimental data used to establish this protocol will be published elsewhere. The establishment of this protocol will allow for the merger of large-scale zebrafish genetics and transplant biology.

In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish.

Il trapianto di midollo renale intero in Zebrafish adulti

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an ...

Ricerca

Biologia

Homing of Hematopoietic Cells to the Bone Marrow

Homing is the phenomenon whereby transplanted hematopoietic cells are able to travel to and engraft or establish residence in the bone marrow. Various chemomkines and receptors are involved in the homing of hematopoietic stem cells. [1, 2]
This paper outlines the classic homing protocol used in hematopoietic stem cell studies. In general this involves isolating the cell population whose homing needs to be investigated, staining this population with a dye of interest and injecting these cells into the blood stream of a recipient animal. The recipient animal is then sacrificed at a pre-determined time after injection and the bone marrow evaluated for the percentage or absolute number of cells which are positive for the dye of interest. In one of the most common experimental schemes, the homing efficiency of hematopoietic cells from two genetically distinct animals (a wild type animal and the corresponding knock-out) is compared. This article describes the hematopoietic cell homing protocol in the framework of such as experiment.

This article describes a protocol used to study the homing of hematopoietic cells to their niches in the bone marrow.

Homing delle cellule ematopoietiche del midollo osseo

Homing is the phenomenon whereby transplanted hematopoietic cells are able to travel to and engraft or establish residence in the bone marrow.  Various ...

Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult human peripheral blood within a mean of 12 days. After large scale expansion &gt;1x108 ECFCs can be obtained for further tests. Advantageously by using pHPL the contact of human cells with bovine serum antigens can be excluded. By flow cytometry and immunohistochemistry the isolated cells can be characterized as ECFC and their in vitro functionality to form vascular like structures can be tested in a matrigel assay. Further these cells can be subcutaneously injected in a mouse model to form functional, perfused vessels in vivo. After long term expansion and cryopreservation proliferation, function and genomic stability appear to be preserved. 3,4
This animal-protein free isolation and expansion method is easily applicable to generate a large quantity of ECFCs.

Endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) are a promising tool to study vascular homeostasis and repair.1,2 This paper introduces a novel animal-serum free method for isolation and expansion of ECFC from heparinised adult human peripheral blood with pooled human platelet lysate (pHPL) diminishing the risk of anti-bovine immunisation.

Isolamento e di espansione su vasta scala di umano adulto cellule progenitrici endoteliali che formano colonie

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult ...

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs constitute a minute cell population of pluripotent cells capable of generating all blood cell lineages for a life-time1. The molecular dissection of HSCs homeostasis in the bone marrow has important implications in hematopoiesis, oncology and regenerative medicine. We describe the labeling protocol with fluorescent antibodies and the electronic gating procedure in flow cytometry to score hematopoietic progenitor subsets and HSCs distribution in individual mice (Fig. 1). In addition, we describe a method to extensively enrich hematopoietic progenitors as well as long-term (LT) and short term (ST) reconstituting HSCs from pooled bone marrow cell suspensions by magnetic enrichment of cells expressing c-Kit. The resulting cell preparation can be used to sort selected subsets for in vitro and in vivo functional studies (Fig. 2).
Both trabecular osteoblasts2,3 and sinusoidal endothelium4 constitute functional niches supporting HSCs in the bone marrow. Several mechanisms in the osteoblastic niche, including a subset of N-cadherin+ osteoblasts3 and interaction of the receptor tyrosine kinase Tie2 expressed in HSCs with its ligand angiopoietin-15 concur in determining HSCs quiescence. "Hibernation" in the bone marrow is crucial to protect HSCs from replication and eventual exhaustion upon excessive cycling activity6. Exogenous stimuli acting on cells of the innate immune system such as Toll-like receptor ligands7 and interferon-&alpha;6 can also induce proliferation and differentiation of HSCs into lineage committed progenitors. Recently, a population of dormant mouse HSCs within the lin- c-Kit+ Sca-1+ CD150+ CD48- CD34- population has been described8. Sorting of cells based on CD34 expression from the hematopoietic progenitors-enriched cell suspension as described here allows the isolation of both quiescent self-renewing LT-HSCs and ST-HSCs9. A similar procedure based on depletion of lineage positive cells and sorting of LT-HSC with CD48 and Flk2 antibodies has been previously described10. In the present report we provide a protocol for the phenotypic characterization and ex vivo cell cycle analysis of hematopoietic progenitors, which can be useful for monitoring hematopoiesis in different physiological and pathological conditions. Moreover, we describe a FACS sorting procedure for HSCs, which can be used to define factors and mechanisms regulating their self-renewal, expansion and differentiation in cell biology and signal transduction assays as well as for transplantation.

A method to analyse the distribution of bone marrow hematopoietic progenitors in flow cytometry as well as to efficiently isolate highly purified hematopoietic stem cells (HSCs) is described. The isolation procedure is essentially based on magnetic enrichment of c-Kit+ cells and cell sorting to purify HSCs for cellular and molecular studies.

L&#39;analisi fenotipica e l&#39;isolamento di murini cellule staminali ematopoietiche e Lineage-committed progenitori

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and temporal resolution to study in vivo hematopoiesis using the murine bone marrow transplant experimental model. Genetic combinatorial marking using lentiviral vectors encoding fluorescent proteins (FPs) enabled cell fate mapping through advanced microscopy imaging. Vectors encoding five different FPs: Cerulean, EGFP, Venus, tdTomato, and mCherry were used to concurrently transduce HSPCs, creating a diverse palette of color marked cells. Imaging using confocal/two-photon hybrid microscopy enables simultaneous high resolution assessment of uniquely marked cells and their progeny in conjunction with structural components of the tissues. Volumetric analyses over large areas reveal that spectrally coded HSPC-derived cells can be detected non-invasively in various intact tissues, including the bone marrow (BM), for extensive periods of time following transplantation. Live studies combining video-rate multiphoton and confocal time-lapse imaging in 4D demonstrate the possibility of dynamic cellular and clonal tracking in a quantitative manner.

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

Combinatorial 5 fluorescent proteins marking of hematopoietic stem and progenitor cells allows in vivo clonal tracking via confocal and two-photon microscopy, providing insights into bone marrow hematopoietic architecture during regeneration. This method allows non-invasive fate mapping of spectrally-coded HSPCs-derived cells in intact tissues for extensive periods of time following transplantation.

In vivo clonale Monitoraggio di staminali ematopoietiche e cellule progenitrici Contrassegnato da cinque proteine ​​fluorescenti che utilizzano confocale e microscopia Multiphoton

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

Osteoclast Derivation from Mouse Bone Marrow

Osteoclasts are highly specialized cells that are derived from the monocyte/macrophage lineage of the bone marrow. Their unique ability to resorb both the organic and inorganic matrices of bone means that they play a key role in regulating skeletal remodeling. Together, osteoblasts and osteoclasts are responsible for the dynamic coupling process that involves both bone resorption and bone formation acting together to maintain the normal skeleton during health and disease.
As the principal bone-resorbing cell in the body, changes in osteoclast differentiation or function can result in profound effects in the body. Diseases associated with altered osteoclast function can range in severity from lethal neonatal disease due to failure to form a marrow space for hematopoiesis, to more commonly observed pathologies such as osteoporosis, in which excessive osteoclastic bone resorption predisposes to fracture formation.
An ability to isolate osteoclasts in high numbers in vitro has allowed for significant advances in the understanding of the bone remodeling cycle and has paved the way for the discovery of novel therapeutic strategies that combat these diseases. 
Here, we describe a protocol to isolate and cultivate osteoclasts from mouse bone marrow that will yield large numbers of osteoclasts.

Osteoclasts are the principal bone-resorbing cell in the body. An ability to isolate osteoclasts in large numbers has resulted in significant advances in the understanding of osteoclast biology. In this protocol, we describe a method for isolation, cultivating and quantifying osteoclast activity in vitro.

Osteoclasti derivazione dal midollo osseo di topo

Osteoclasts are highly specialized cells that are derived from the monocyte/macrophage lineage of the bone marrow. Their unique ability to resorb both the ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex signaling mechanisms underlying filopodial initiation, elongation and subsequent stabilization or retraction, it is crucial to determine the spatio-temporal protein activity in these dynamic structures. To analyze protein function in filopodia, we recently developed a semi-automated tracking algorithm that adapts to filopodial shape-changes, thus allowing parallel analysis of protrusion dynamics and relative protein concentration along the whole filopodial length. Here, we present a detailed step-by-step protocol for optimized cell handling, image acquisition and software analysis. We further provide instructions for the use of optional features during image analysis and data representation, as well as troubleshooting guidelines for all critical steps along the way. Finally, we also include a comparison of the described image analysis software with other programs available for filopodia quantification. Together, the presented protocol provides a framework for accurate analysis of protein dynamics in filopodial protrusions using image analysis software.

We present a software solution for semi-automated tracking of relative protein concentration along the length of dynamic cellular protrusions.

Un&#39;interfaccia utente grafica per il monitoraggio assistito della concentrazione di proteine ​​in protrusioni cellulari dinamiche

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

Improving the Accuracy of Flow Cytometric Assessment of Mitochondrial Membrane Potential in Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Through the Inhibition of Efflux Pumps

As cellular metabolism is a key regulator of hematopoietic stem cell (HSC) self-renewal, the various roles played by the mitochondria in hematopoietic homeostasis have been extensively studied by HSC researchers. Mitochondrial activity levels are reflected in their membrane potentials (&#916;&#936;m), which can be measured by cell-permeant cationic dyes such as TMRM (tetramethylrhodamine, methyl ester). The ability of efflux pumps to extrude these dyes from cells can limit their usefulness, however. The resulting measurement bias is particularly critical when assessing HSCs, as xenobiotic transporters exhibit higher levels of expression and activity in HSCs than in differentiated cells. Here, we describe a protocol utilizing Verapamil, an efflux pump inhibitor, to accurately measure &#916;&#936;m across multiple bone marrow populations. The resulting inhibition of pump activity is shown to increase TMRM intensity in hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs), while leaving it relatively unchanged in mature fractions. This highlights the close attention to dye-efflux activity that is required when &#916;&#936;m-dependent dyes are used, and as written and visualized, this protocol can be used to accurately compare either different populations within the bone marrow, or the same population across different experimental models.

Xenobiotic efflux pumps are highly active in hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and cause extrusion of TMRM, a mitochondrial membrane potential fluorescent dye. Here, we present a protocol to accurately measure mitochondrial membrane potential in HSPCs by TMRM in the presence of Verapamil, an efflux pump inhibitor.

Migliorare l'accuratezza del flusso Valutazione citometrica del potenziale della membrana mitocondriale nelle cellule staminali ematopoietiche e progenitrici attraverso l'inibizione delle pompe di efflusso

As cellular metabolism is a key regulator of hematopoietic stem cell (HSC) self-renewal, the various roles played by the mitochondria in hematopoietic ...

In Vivo Two-photon Imaging of Megakaryocytes and Proplatelets in the Mouse Skull Bone Marrow

Platelets are produced by megakaryocytes, specialized cells located in the bone marrow. The possibility to image megakaryocytes in real time and their native environment was described more than 10 years ago and sheds new light on the process of platelet formation. Megakaryocytes extend elongated protrusions, called proplatelets, through the endothelial lining of sinusoid vessels. This paper presents a protocol to simultaneously image in real time fluorescently labeled megakaryocytes in the skull bone marrow and sinusoid vessels. This technique relies on a minor surgery that keeps the skull intact to limit inflammatory reactions. The mouse head is immobilized with a ring glued to the skull to prevent movements from breathing.
Using two-photon microscopy, megakaryocytes can be visualized for up to a few hours, enabling the observation of cell protrusions and proplatelets in the process of elongation inside sinusoid vessels. This allows the quantification of several parameters related to the morphology of the protrusions (width, length, presence of constriction areas) and their elongation behavior (velocity, regularity, or presence of pauses or retraction phases). This technique also allows simultaneous recording of circulating platelets in sinusoid vessels to determine platelet velocity and blood flow direction. This method is particularly useful to study the role of genes of interest in platelet formation using genetically modified mice and is also amenable to pharmacological testing (study the mechanisms, evaluating drugs in the treatment of platelet production disorders). It has become an invaluable tool, especially to complement in vitro studies as it is now known that in vivo and in vitro proplatelet formation rely on different mechanisms. It has been shown, for example, that in vitro microtubules are required for proplatelet elongation per se. However, in vivo, they rather serve as a scaffold, elongation being mainly promoted by blood flow forces.

In Vivo Two-photon Imaging of Megakaryocytes and Proplatelets in the Mouse Skull Bone Marrow

We describe here the method for imaging megakaryocytes and proplatelets in the marrow of the skull bone of living mice using two-photon microscopy.

In vivo Imaging a due fotoni di megacariociti e proplatati nel midollo osseo del cranio del topo

Platelets are produced by megakaryocytes, specialized cells located in the bone marrow. The possibility to image megakaryocytes in real time and their ...

Assessment of Cellular Bioenergetics in Mouse Hematopoietic Stem and Primitive Progenitor Cells using the Extracellular Flux Analyzer

Under steady state, hematopoietic stem cells (HSCs) remain largely quiescent and are believed to be predominantly reliant on glycolysis to meet their energetic needs. However, under stress conditions such as infection or blood loss, HSCs become proliferative and rapidly produce downstream progenitor cells, which in turn further differentiate, ultimately producing mature blood cells. During this transition and differentiation process, HSCs exit from quiescence and rapidly undergo a metabolic switch from glycolysis to oxidative phosphorylation (OxPHOS). Various stress conditions, such as aging, cancer, diabetes, and obesity, can negatively impact mitochondrial function and thus can alter the metabolic reprogramming and differentiation of HSCs and progenitors during hematopoiesis. Valuable insights into glycolytic and mitochondrial functions of HSCs and progenitors under normal and stress conditions can be gained through the assessment of their extracellular acidification rate (ECAR) and oxygen consumption rate (OCR), which are indicators of cellular glycolysis and mitochondrial respiration, respectively. 
Here, a detailed protocol is provided to measure ECAR and OCR in mouse bone marrow-derived lineage-negative cell populations, which include both hematopoietic stem and primitive progenitor cells (HSPCs), using the extracellular flux analyzer. This protocol describes approaches to isolate lineage-negative cells from mouse bone marrow, explains optimization of cell seeding density and concentrations of 2-deoxy-D-glucose (2-DG, a glucose analog that inhibits glycolysis) and various OxPHOS-targeted drugs (oligomycin, FCCP, rotenone, and antimycin A) used in these assays, and describes drug treatment strategies. Key parameters of glycolytic flux, such as glycolysis, glycolytic capacity, and glycolytic reserve, and OxPHOS parameters, such as basal respiration, maximal respiration, proton leak, ATP production, spare respiratory capacity, and coupling efficiency, can be measured in these assays. This protocol allows ECAR and OCR measurements on non-adherent HSPCs and can be generalized to optimize analysis conditions for any type of suspension cells.

The method presented here summarizes optimized protocols for assessing cellular bioenergetics in non-adherent mouse hematopoietic stem and primitive progenitor cells (HSPCs) using the extracellular flux analyzer to measure the extracellular acidification rate (ECAR) and oxygen consumption rate (OCR) of HSPCs in real time.

Valutazione della bioenergetica cellulare in cellule staminali ematopoietiche di topo e progenitrici primitive utilizzando l'analizzatore di flusso extracellulare

Under steady state, hematopoietic stem cells (HSCs) remain largely quiescent and are believed to be predominantly reliant on glycolysis to meet their ...