This work was supported by the Walther Cancer Foundation under the Advancing Basic Cancer Research program to the Harper Cancer Research Institute of the University of Notre Dame (DARW) and the 2011 Starter Grant from the Society for Analytical Chemists of Pittsburgh (ABH). Thanks also to the staff of the Mass Spectrometry and Proteomics Facility for useful discussions.

Coltura cellulare 1. 3D e preparazione per Imaging <ol><li> Cultura una linea cellulare adeguata, vale a dire, HCT116 colon carcinoma linea di cellule, in due dimensioni, cultura monostrato. </li><li> Grow HCT 116 cellule in un pallone T-25 con mezzi di McCoy 5A + 10% siero fetale bovino in un incubatore CO 2 5% fino al 50-70% di confluenza, che richiede generalmente un paio di giorni. </li><li> Celle di uscita con 0,25% soluzione di tripsina-EDTA e contano una parte delle cellule utilizzando un emocitometro e trypan blu colorazione per verificare la densità cellulare e la vitalità. </li><li> Dopo conteggio diluire le cellule con mezzo completo per ottenere un adeguato densità di semina di 6000 cellule / pozzetto, o 30.000 cellule / ml. </li></ol> 2. Preparare Agarose Micropiastre 96 pozzetti <ol><li> Aggiungere 0,19 g di agarosio a 10 ml di media normale in una provetta da 50 ml (soluzione di agarosio 1,5% in media) 10. Garantire incorporazione delicatamente miscelazione. Sterilizzare l&#39;agarosio in un bagno d&#39;acquaper 20 min. </li><li> Utilizzando una pipetta multicanale, aspirato 50 ml di miscela agarosio + supporti nei 60 pozzi centrali del fondo 96 e piastra di coltura piatto piano. Come i pozzetti a bordi periferici della piastra hanno tassi di evaporazione leggermente superiori, aggiungere 200 microlitri 1x fosfato salina tamponata (PBS) invece del agarosio a questi bordi. </li><li> Una volta che la miscela agarosio è stato aggiunto ai pozzetti interni, impostare la piastra lasciate raffreddare a ~ 37 ° C prima dell&#39;aggiunta delle cellule. </li></ol> 3. Seed e tendono la cultura tridimensionale NOTA: Più o meno cellule possono essere seminate in funzione delle esigenze della cultura coinvolte, ma è stato determinato che tali condizioni producono strutture 3D coltura cellulare di circa 1 mm di diametro dopo 10-14 giorni di coltura (dati non mostrati) . <ol><li> Aggiungere 200 ml di soluzione di cella appropriata (diluito per contenere ~ 6.000 celle) al agarosio rivestito96 pozzetti. Coprire la piastra e impostare in incubatrice umidificata con 5% di CO 2 a 37 ° C per la crescita cellulare. </li><li> Cambiare supporti cellulari almeno ogni 48 ore, o quando appare il supporto da cambiare colore. <ol><li> Cambiare mezzi aspirando accuratamente il vecchio media di tutto il piccolo coltura cellulare 3D (visibile ad occhio nudo per giorno 2) nella parte inferiore della agarosio. Aggiungere 200 ml di mezzi freschi delicatamente sopra la coltura cellulare 3D. </li><li> (Passo opzionale) Durante questi cambiamenti dei media, aggiungere chemioterapici o altri farmaci per il test. Diluire il farmaco di scelta per la concentrazione finale con i media completo e aggiungere i necessari 200 ml di ogni bene. </li><li> Monitor 3D crescita coltura cellulare al microscopio ottico, finché le colture cellulari 3D sono di circa 1 mm di diametro. </li></ol></li></ol> 4. Harvest colture cellulari 3D <ol><li> Utilizzare un 2 ml pipetta sierologica per rimuovere delicatamente la coltura cellulare 3D dal letto agarosio. </li> &lt;li&gt; Lavare le colture cellulari 3D con PBS da loro pipettando delicatamente circa 1 ml di PBS in un attesa di 24 pozzetti. </li><li> Trasferimento raccolto colture cellulari 3D via pipetta sierologica per provette per l&#39;estrazione di proteine ​​o metaboliti, o incorporare in un mezzo taglio per aiutare nella affettare per applicazioni di imaging. </li></ol> 5. Inserire le colture cellulari 3D in gelatina <ol><li> Preparare una soluzione di ~ 175 mg / ml di gelatina in acqua ad elevata purezza (18 MW preferito). 22,23 Mescolare la gelatina vigorosamente. Osservare la soluzione diventa viscoso e difficile da manipolare. Posizionare il tubo conico-gelatina contenente in un bagno di acqua a 60 ° C e caldo fino a quando la soluzione diventa chiara e facile da aspirare. NOTA: La soluzione di gelatina calda indurisce rapidamente quando si raffredda, quindi effettuare tutte le seguenti fasi rapidamente prima del congelamento. </li><li> Dopo che è riscaldata, prendere immediatamente la gelatina alla cappa coltura cellulare. Mantenere il tubo con gelatina in beaker con acqua preriscaldata a circa 60 ° C per evitare l&#39;indurimento della soluzione di gelatina. </li><li> Usando una pipetta 2 ml sierologica, depositare 0,6 ml della soluzione di gelatina calda nel pozzetto di una piastra a fondo piatto 24. Questo volume è sufficiente a coprire il fondo in un sottile strato. Depositare delicatamente le colture cellulari 3D immediatamente al di sopra dello strato di gelatina utilizzando un diverso pipetta 2 ml per evitare la rottura della struttura 3D. NOTA: Si deve prestare attenzione in questa fase non collocare PBS nella gelatina. In questo caso, però, rimuovere il PBS dalla parte superiore della gelatina con una pipetta 200 microlitri. </li><li> Dopo le colture cellulari 3D sono posti sulla superficie dello strato di gelatina, pipettatura un&#39;altra 0,6 ml della miscela calda gelatina sopra le colture cellulari 3D, in modo da non disturbare la posizione delle culture. Dopo il secondo strato è posto, congelare le colture cellulari 3D gelatina incorporato a -80 ° C. </li></ol> 6. Slice e Thaw Monte the gelatina-integrato colture cellulari 3D per Mass spettrometrica Imaging <ol><li> Rimuovere la piastra ben 24 contenente le colture cellulari in 3D dal congelatore. Scaldare il fondo del piatto con il calore dalla tua mano fino a quando una pinzetta o bisturi scivoleranno dolcemente verso il lato del bene. </li><li> Uniformemente scorrere la pinzetta o bisturi, liberando la gelatina, senza scongelare il centro. Prendere una goccia d&#39;acqua al supporto criostato e utilizzare questa aderire il disco di gelatina al supporto. <ol><li> Colture cellulari 3D incorporati in gelatina sono più suscettibili di affettare a -30 ° C. Pulire la lama criostato e vetro con il 70% di etanolo prima dell&#39;uso. Utilizzare una parte diversa della lama o una nuova lama per ogni cella disco 3D cultura gelatina per impedire opacizzare della lama. </li></ol></li><li> Utilizzando il criostato, delicatamente affronteranno la gelatina in eccesso fino a quando le colture cellulari 3D diventano visibili. </li><li> A questo punto lentamente tagliare le colture cellulari 3D con un movimento regolare in 12-16 micron sezioni. NOTA: fattori critici di affettatura includono la distanza del vetro alla lama, l&#39;angolo della lama, la temperatura del criostato, e l&#39;angolo del disco sul supporto, quindi tutti questi devono essere controllati per garantire risultati coerenti. </li><li> Scongelare delicatamente le fette e li montano sul indio ossido di titanio (ITO) vetrini Rivestiti etichettati in modo appropriato e conservarlo in un essiccatore. Utilizzare le fette più rapidamente possibile per la massima qualità. </li></ol> 7. Matrix applicazione e preparazione del campione per MALDI Imaging <ol><li> Prima di imaging MALDI, preparare fette con matrice appropriata. <ol><li> Per piccola analisi molecola, sono generalmente richieste fasi di lavaggio. Per il rilevamento di proteine ​​intatte, lavare le fette a freddo 100% di acetone, il fluido di Carnoy, o al 70% / 95% isopropanolo per rimuovere piccole molecole, come i lipidi che potrebbero mascherare il segnale 24 -. 26 </li><li> Lavare delicatamente per non più di 30 secondi alla volta. Nondisturbare eventuali fette. </li></ol></li><li> Preparare matrice in una soluzione di solvente organico e acqua, con 0,1% TFA. Per piccola molecola come α-ciano-4-idrossicinnamico acido (CHCA), utilizzare 60% ​​ACN: 40% H 2 O: 0,1% TFA (10 mg / ml). Per il rilevamento di proteine ​​come l&#39;acido sinapico (30 mg / ml), la stessa soluzione solvente. Per solubilità ottimale dell&#39;acido sinapico, dissolvere in acetonitrile prima dell&#39;aggiunta del TFA: H 2 O soluzione. Altre matrici possono essere utilizzati come appropriato. NOTA: Matrix può essere applicato con metodi diversi, ma va notato alcune matrici sono stati trovati per co-cristallizzare con la gelatina, come l&#39;acido ferulico, rendendo inutilizzabile il campione. Cristalli più piccoli producono spettri di massa più consistente, consentendo specie più molecolari per individuare e attribuire alle differenze biologiche, piuttosto che gli effetti matrice. </li><li> Applicare matrice metodo handspotting. <ol><li> Utilizzare una siringa a punta fine di applicare 0,5 microlitri della matrsoluzione ix sulla fetta coltura cellulare 3D e consentire la matrice di cristallizzare. </li></ol></li><li> In alternativa, utilizzare il metodo aerografo. Riempire un aerografo grado commerciale con la soluzione di matrice. <ol><li> Tenere lo spruzzatore 8-12 centimetri di distanza dalla diapositiva, puntare un vapore in slice. Tra passaggi, permettono la matrice asciugare per 1 min per consentire la migliore formazione di cristalli. Fino a 10-20 passi del airbrush è necessario per produrre un livello ottimale di matrice 22. </li></ol></li><li> In alternativa, utilizzare il metodo di sublimazione dettagliato altrove. 25,27 </li><li> Diapositive secchi in un essiccatore per almeno 30 minuti prima MALDI-MSI, indipendentemente dal metodo di applicazione della matrice. 25 </li></ol> 8. MALDI-MSI analisi utilizzando un sistema MALDI-TOF (ie, Autoflex III) NOTA: Questa sezione contiene le istruzioni e consigli per l&#39;impostazione dei parametri per un esperimento di imaging MALDI-TOF. A seconda delle insproduttore trument e software utilizzato, il processo può variare. <ol><li> Inserire le diapositive in un adattatore fatto per tenere saldamente 75 millimetri x 25 millimetri diapositive immagine le fette di coltura cellulare 3D collegati a diapositive ITO rivestiti. Caricare l&#39;adattatore slitta nello strumento. </li><li> Preparare lo strumento per MALDI-MSI selezionando uno standard di calibrazione appropriato per la gamma messa in questione. Per interrogatori di piccole molecole, i segnali rilevati corrispondenti alla matrice utilizzata, α-CHCA, sono un gruppo comune dei calibranti. Per l&#39;analisi delle proteine, standard proteina nota (ad esempio, l&#39;ubiquitina, tripsinogeno) nel range di massa di interesse vengono selezionati e individuati adiacente alle colture cellulari 3D come calibratori. Calibrare lo strumento prima di procedere con lo sviluppo del metodo. </li><li> Prima di imaging, sviluppare metodi di acquisizione dati per l&#39;intervallo di massa di scelta utilizzando il software fornito dal produttore dello strumento. Vedi figure 1 e 2 perpiccola molecola proteica e di imaging. Per le piccole immagini molecola, utilizzare reflectron modalità per la più alta risoluzione di massa. <ol><li> Regolare l&#39;intervallo di massa per l&#39;acquisizione dati piccola molecola tra 100-1.000 m / z e per le proteine ​​tra 8.000 25.000 m / z. Regolare il range di massa per comprendere la regione scelta fornendo la massima risoluzione di massa possibile con lo strumento. </li><li> Regolare potenza del laser, la frequenza, il numero di scatti laser e dimensione dello spot utilizzando la soluzione di calibrazione e una vicina fetta &#39;sacrificale&#39; coltura cellulare 3D. Rispettare queste impostazioni nel software principale di controllo dello strumento. Utilizzare le seguenti impostazioni come punto di partenza consigliato: potenza del 60%, 400 colpi laser, ultra piccola dimensione del punto. Queste impostazioni varieranno tra strumenti e metodi, così ottimizzare i parametri dello strumento per dare gli spettri più di alta qualità per ogni strumento specifico. Altri parametri che possono essere regolati includono il guadagno del rivelatore, frequenza di campionamento, e il guadagno elettronico. Save questo metodo per l&#39;utilizzo del software di imaging (es., Metodo Esecuzione automatica che FlexImaging si avvarrà). NOTA: ioni Soppressione di sotto del range di massa di interesse (nuovo trovato nel controllo dello strumento) in modo da non interferire con il riconoscimento. </li><li> Sviluppare proteine ​​metodi di acquisizione dati per l&#39;intervallo di massa di scelta. Seguite la stessa procedura di cui sopra, ma per le gamme di massa medio-alto, sopra di circa 3 kDa, utilizzare la modalità lineare. NOTA: Le impostazioni saranno diversi da quelli utilizzati per i piccoli metodi di molecola. </li></ol></li><li> Setup specifici parametri dello strumento MS utilizzando il software di imaging fornito dal costruttore dello strumento, come ad esempio per i sistemi FlexImaging Bruker MALDI-TOF. <ol><li> Creare un nuovo file di immagini e cartelle, utilizzando i metodi sviluppati prima e salvati. Selezionare i parametri dello strumento come il formato di punto raster (cambiamento dal difetto circa 200 micron a 50 micron), impostare il metodo di controllo strumento (impostazione al punto 8.3.2 o 8.3.3), e posizione dove eseguire la scansione in coltura cellulare 3D. </li><li> Selezionare tre punti teach appropriate sul campione, spostando il laser a turno. Ottenere la fotografia ottica dal software di controllo laser MALDI-TOF utilizzando &#39;schermata di stampa&#39;. NOTA: Molti programmi software di imaging richiedono una fotografia ottica del campione &#39;insegnare&#39; il software in cui si trova il laser, che può essere ottenuto con uno scanner o spesso fotocamera strumento. </li></ol></li><li> Quindi avviare il processo di imaging dal software di imaging (non il controllo dello strumento) e di acquisire spettri di massa da ogni fetta. Osservare la maggior parte delle masse attraverso la coltura cellulare 3D e altre localizzate in aree particolari. </li></ol> 9. opzionali Dati metodi di analisi <ol><li> Per l&#39;analisi mirata, effettuare analisi manuale degli spettri facendo clic su una massa nello spettro media, o consentire il software di imaging per raccogliere automaticamente le masse di sopra di una determinata soglia (ad es., Picchi abil sobrio all&#39;inizio soglia del 20%). Per il controllo di qualità, esaminare la distribuzione dei picchi di matrice o spettro media. </li><li> Effettuare analisi statistiche con set di dati estratti nel software matematico, come R o Matlab. <ol><li> Export singolo spettri in formato ASCII, un file di testo leggibile, per il caricamento nel software di scelta. </li><li> Convertire gli spettri individuo a ASCII, mzXML, formato mzML per la lettura da diversi programmi software diversi, 28 -. 31 o esportare i dati come Analyze (.img) file di formato, un formato comune utilizzato per altre applicazioni di imaging come la risonanza magnetica 32 Due opzioni open source per l&#39;analisi sono MSiReader e BioMap 32,33. </li><li> Una volta che i file vengono esportati in un formato leggibile dal software, caricare il set di dati tramite le istruzioni del relativo software. Dopo il caricamento, eseguire l&#39;elaborazione post-acquisizione, come la rimozione di base e la normalizzazione. </li><li> Con questo insieme di dati, eseguire ferrtrattamenti stical quali analisi delle componenti principali di clustering gerarchico utilizzando sia script personalizzati o incorporati in algoritmi in software come Matlab 18. </li></ol></li></ol>

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	<li>Schober, Y., Guenther, S., Spengler, B., R&#246;mpp, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+matrix-assisted+laser+desorption/ionization+mass+spectrometry+imaging.">Single cell matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry imaging.</a> Anal Chem. 84 (15), 6293-6297 (2012).</li><li>Cornett, D., Frappier, S., Caprioli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MALDI-FTICR+imaging+mass+spectrometry+of+drugs+and+metabolites+in+tissue.">MALDI-FTICR imaging mass spectrometry of drugs and metabolites in tissue.</a> Anal Chem. 80 (14), 5648-5653 (2008).</li><li>Reyzer, M. L., Hsieh, Y., Ng, K., Korfmacher, W. a., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+analysis+of+drug+candidates+in+tissue+by+matrix-assisted+laser+desorption/ionization+mass+spectrometry.">Direct analysis of drug candidates in tissue by matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry.</a> J Mass Spectrom. 38 (10), 1081-1092 (2003).</li><li>Reyzer, M. L., Chaurand, P., Angel, P. M., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+molecular+analysis+of+whole-body+animal+tissue+sections+by+MALDI+imaging+mass+spectrometry.">Direct molecular analysis of whole-body animal tissue sections by MALDI imaging mass spectrometry.</a> Methods Mol Biol. 656 (18), 285-301 (2010).</li><li>Cornett, D., Reyzer, M., Chaurand, P., Caprioli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MALDI+imaging+mass+spectrometry:+molecular+snapshots+of+biochemical+systems.">MALDI imaging mass spectrometry: molecular snapshots of biochemical systems.</a> Nat Methods. 4 (10), 828-833 (2007).</li><li>Guenther, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histology+by+mass+spectrometry:+label-free+tissue+characterization+obtained+from+high-accuracy+bioanalytical+imaging.">Histology by mass spectrometry: label-free tissue characterization obtained from high-accuracy bioanalytical imaging.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 49 (22), 3834-3838 (2010).</li><li>Schwamborn, K., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+imaging+by+mass+spectrometry--looking+beyond+classical+histology.">Molecular imaging by mass spectrometry--looking beyond classical histology.</a> Nat Rev Cancer. 10 (9), 639-646 (2010).</li><li>Kunz-Schughart, L. a., Kreutz, M., Knuechel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicellular+spheroids:+a+three-dimensional+in+vitro+culture+system+to+study+tumour+biology.">Multicellular spheroids: a three-dimensional in vitro culture system to study tumour biology.</a> Int J Exp Pathol. 79 (1), 1-23 (1998).</li><li>Hirschhaeuser, F., Menne, H., Dittfeld, C., West, J., Mueller-Klieser, W., Kunz-Schughart, L. a. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicellular+tumor+spheroids:+an+underestimated+tool+is+catching+up+again.">Multicellular tumor spheroids: an underestimated tool is catching up again.</a> J Biotechnol. 148 (1), 3-15 (2010).</li><li>Friedrich, J., Seidel, C., Ebner, R., Kunz-Schughart, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid-based+drug+screen:+considerations+and+practical+approach.">Spheroid-based drug screen: considerations and practical approach.</a> Nat Protoc. 4 (3), 309-324 (2009).</li><li>Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+culture+models+of+normal+and+malignant+breast+epithelial+cells.">Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells.</a> Nat Methods. 4 (4), 359-365 (2007).</li><li>Yamada, K. M., Cukierman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+tissue+morphogenesis+and+cancer+in+3D.">Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D.</a> Cell. 130 (4), 601-610 (2007).</li><li>Fernandes, T. G., Kwon, S. -. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cell+culture+microarray+for+high-throughput+studies+of+stem+cell+fate.">Three-dimensional cell culture microarray for high-throughput studies of stem cell fate.</a> Biotechnol Bioeng. 106 (1), 106-118 (2010).</li><li>Meli, L., Jordan, E. T., Clark, D. S., Linhardt, R. J., Dordick, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+a+three-dimensional,+microarray+environment+on+human+cell+culture+in+drug+screening+systems.">Influence of a three-dimensional, microarray environment on human cell culture in drug screening systems.</a> Biomaterials. 33 (35), 9087-9096 (2012).</li><li>Weaver, E. M., Hummon, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+mass+spectrometry:+From+tissue+sections+to+cell+cultures.">Imaging mass spectrometry: From tissue sections to cell cultures.</a> Adv Drug Deliv Rev. 65 (8), 1039-1055 (2013).</li><li>Li, H., Hummon, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+mass+spectrometry+of+three-dimensional+cell+culture+systems.">Imaging mass spectrometry of three-dimensional cell culture systems.</a> Anal Chem. 83 (22), 8794-8801 (2011).</li><li>Liu, X., Weaver, E. M., Hummon, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+Therapeutics+in+Three-Dimensional+Cell+Culture+Systems+by+MALDI+Imaging+Mass+Spectrometry.">Evaluation of Therapeutics in Three-Dimensional Cell Culture Systems by MALDI Imaging Mass Spectrometry.</a> Anal Chem. 85 (13), 6295-6302 (2013).</li><li>Ahlf, D. R., Masyuko, R. N., Hummon, A. B., Bohn, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlated+Mass+Spectrometry+Imaging+and+Confocal+Raman+Microscopy+for+Studies+of+Three-Dimensional+Cell+Culture+Sections.">Correlated Mass Spectrometry Imaging and Confocal Raman Microscopy for Studies of Three-Dimensional Cell Culture Sections.</a> Analyst. 139 (18), 4578-4585 (2014).</li><li>Derda, R., Tang, S. K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multizone+paper+platform+for+3D+cell+cultures.">Multizone paper platform for 3D cell cultures.</a> PloS one. 6 (5), 18940 (2011).</li><li>Imbeault, S., Valenzuela, N., Fai, S., Bennett, S. a. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localizing+protein+in+3D+neural+stem+cell+culture:+a+hybrid+visualization+methodology.">Localizing protein in 3D neural stem cell culture: a hybrid visualization methodology.</a> J Vis Exp. 2 (46), 2-7 (2010).</li><li>He, W., Kuang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+Comparison+of+3D+and+2D+Glioma+Models+Reveals+Increased+HLA-E+Expression+in+3D+Models+is+Associated+with+Resistance+to+NK+Cell-Mediated+Cytotoxicity.">Proteomic Comparison of 3D and 2D Glioma Models Reveals Increased HLA-E Expression in 3D Models is Associated with Resistance to NK Cell-Mediated Cytotoxicity.</a> J Proteome Res. 13 (5), 2272-2281 (2014).</li><li>Chen, R., Cape, S. S., Sturm, R. M., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+Spectrometric+Imaging+of+Neuropeptides+in+Decapod+Crustacean+Neuronal+Tissues.">Mass Spectrometric Imaging of Neuropeptides in Decapod Crustacean Neuronal Tissues.</a> Methods Mol Biol. 656, 451-463 (2010).</li><li>DeKeyser, S. S., Kutz-Naber, K. K., Schmidt, J. J., Barrett-Wilt, G. A., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Mass+Spectrometry+of+Neuropeptides+in+Decapod+Crustacean+Neuronal+Tissues.">Imaging Mass Spectrometry of Neuropeptides in Decapod Crustacean Neuronal Tissues.</a> J Proteome Res. 6 (5), 1782-1791 (2007).</li><li>Van Hove, E. R. A., Smith, D. F., Fornai, L., Glunde, K., Heeren, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+alternative+paper+based+tissue+washing+method+for+mass+spectrometry+imaging:+localized+washing+and+fragile+tissue+analysis.">An alternative paper based tissue washing method for mass spectrometry imaging: localized washing and fragile tissue analysis.</a> J Am Soc Mass Spectrom. 22 (10), 1885-1890 (2011).</li><li>Yang, J., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+Sublimation/Recrystalization+for+Imaging+Proteins+by+Mass+Spectrometry+at+High+Spatial+Resolution.">Matrix Sublimation/Recrystalization for Imaging Proteins by Mass Spectrometry at High Spatial Resolution.</a> Anal Chem. 83 (14), 5728-5734 (2012).</li><li>Seeley, E. H., Oppenheimer, S. R., Mi, D., Chaurand, P., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+protein+sensitivity+for+MALDI+imaging+mass+spectrometry+after+chemical+treatment+of+tissue+sections.">Enhancement of protein sensitivity for MALDI imaging mass spectrometry after chemical treatment of tissue sections.</a> J Am Soc Mass Spectrom. 19 (8), 1069-1077 (2008).</li><li>Gemperline, E., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MALDI-mass+spectrometric+imaging+for+the+investigation+of+metabolites+in+Medicago+truncatula+root+nodules.">MALDI-mass spectrometric imaging for the investigation of metabolites in Medicago truncatula root nodules.</a> J Vis Exp. 1 (85), 1-11 (2014).</li><li>Deutsch, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mzML:+a+single,+unifying+data+format+for+mass+spectrometer+output).">mzML: a single, unifying data format for mass spectrometer output).</a> Proteomics. 8 (14), 2776-2777 (2008).</li><li>Pedrioli, P. G. a., Eng, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+common+open+representation+of+mass+spectrometry+data+and+its+application+to+proteomics+research.">A common open representation of mass spectrometry data and its application to proteomics research.</a> Nat Biotechnol. 22 (11), 1459-1466 (2004).</li><li>Lin, S., Zhu, L., Winter, A., Sasinowski, M., Kibbe, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+mzXML+good+for.">What is mzXML good for.</a> Expert Rev Proteomics. 2 (6), 839-845 (2005).</li><li>Orchard, S., Hoogland, C., Bairoch, A., Eisenacher, M., Kraus, H. -. J., Binz, P. -. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Managing+the+data+explosion.+A+report+on+the+HUPO-PSI+Workshop.+August+2008,+Amsterdam,+The+Netherlands.">Managing the data explosion. A report on the HUPO-PSI Workshop. August 2008, Amsterdam, The Netherlands.</a> Proteomics. 9 (3), 499-501 (2009).</li><li>Robichaud, G., Garrard, K. P., Barry, J. a., Muddiman, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MSiReader:+an+open-source+interface+to+view+and+analyze+high+resolving+power+MS+imaging+files+on+Matlab+platform.">MSiReader: an open-source interface to view and analyze high resolving power MS imaging files on Matlab platform.</a> J Am Soc Mass Spectrom. 24 (5), 718-721 (2013).</li><li>Andersson, M., Groseclose, M. R., Deutch, A. Y., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+mass+spectrometry+of+proteins+and+peptides+3D+volume+reconstruction.">Imaging mass spectrometry of proteins and peptides 3D volume reconstruction.</a> Nat Methods. 5 (1), 101-108 (2008).</li></ol>

This article is part of a special issue on Multimodal Pre-Clinical Imaging, sponsored by Bruker Biospin. The MALDI-TOF system used to obtain the representative results is a Bruker AutoFlex III.

Utilizzando i metodi di cui sopra, colture cellulari 3D possono essere coltivate e analizzati con MALDI-MSI. Molte linee cellulari immortali formeranno strutture 3D quando coltivate in modo appropriato. 9,10 deve prestare attenzione a coltivare le cellule che non sono stati superati troppe volte, cioè, hanno numeri di passaggio basso. In generale, le cellule con numeri passaggio di dieci e inferiore sono ottimali per la coltivazione di colture cellulari 3D. Crescere le colture cellulari in 3D in un supporto tradizionale agarosio fornisce un modo conveniente per gruppi di ricerca interessati alla coltura cellulare 3D per provare questo sistema. Questo metodo utilizza pochi componenti non già nella maggior parte dei laboratori di coltura cellulare di mammifero. Particolare attenzione deve essere rivolta alla preparazione dei piatti agarosio per la crescita in modo che le colture cellulari 3D sono coerenti per forma e dimensioni; alcuni aspetti che richiedono attenzione includono controllando che bolle d&#39;aria sono intrappolate alla miscela e che un adeguato menisco viene formato nella parte inferiore di ciascun well. Se il menisco non forma correttamente, le cellule possono crescere in forme non sferoidali o in piccoli grumi. Inoltre, bisogna fare attenzione a non mettere PBS in gelatina con sferoidi. Se questo accade, rimuovere il PBS dalla parte superiore della gelatina con una pipetta 200 microlitri. Se il costo non è un fattore, piastre inferiori rotonde vincolanti ultra-basse sono commercialmente disponibili e offrono la semplificazione di questi passi. Mentre altri metodi all&#39;incorporamento tessuti possono anche essere compatibile spettrometria costosa e non di massa, gelatina-embedding ha dimostrato di essere sia poco costoso e versatile. Strategie di preparazione di cui sopra sono state ottimizzate per colture cellulari in 3D per ottenere i dati di altissima qualità. Mentre gelatina-embedding ha dimostrato di essere compatibile con l&#39;analisi di spettrometria di massa, questo processo non restringere le matrici disponibili a causa di co-cristallizzazione. Una volta congelato, le colture cellulari in 3D sono stabili per mesi fino a quando non sono congelamento-scongelamento. La gelatina diventa opaco quando congelato, e la cellula 3Dculture sono di un colore simile, quindi è consigliabile prima del congelamento per documentare il posizionamento coltura cellulare 3D per aiutare a taglio. Nel preparare diapositive, matrice può essere applicato con metodi diversi, ma va notato che alcune matrici sono stati trovati per co-cristallizzare con la gelatina, come l&#39;acido ferulico, rendendo inutilizzabile il campione. Cristalli di matrice più piccoli producono spettri di massa più consistente. Mentre handspotting è il metodo più semplice di applicazione della matrice, il volume di solvente più grande può comportare misure di cristallo più grandi e significative migrazioni analiti. Al spettrometro di massa, i progressi nelle tecnologie MALDI-MSI hanno ridotto le competenze necessarie per le analisi inizio. L&#39;acquisizione dei dati e l&#39;analisi è semplice sulla maggior parte dei sistemi, permettendo anche un principiante di ottenere informazioni di alta qualità da diapositive ITO-rivestiti. Un&#39;attenta selezione dei parametri dello strumento, ottimizzato sulla vicina non un&#39;immagine degna 3D cultur cellularees, è fondamentale per ottenere dati di alta qualità. Ad esempio, aumentando la potenza del laser può aumentare l&#39;intensità di picco ma diminuire la potenza del laser può migliorare la risoluzione e dare forma dei picchi più simmetrici. Colture cellulari 3D devono essere utilizzati rapidamente dopo il taglio al fine di garantire una qualità ottimale del campione. Degradazione del segnale di proteina può essere visto in meno di una settimana senza corretta conservazione (essiccatore / -80 ° C freezer), in particolare nella regione ad alta massa (circa 20 kDa). A causa della crescente domanda, sono stati sviluppati molti programmi software di visualizzazione differenti e sono liberi al pubblico di ricerca. La maggior parte degli spettrometri di massa di imaging hanno installato il software necessario per visualizzare i singoli masse con i formati proprietari utilizzati su ogni strumento. Questi programmi software possono essere utilizzati per ottenere immagini single-massa ed esportare i dati. La maggior parte del software permetterà anche la sovrapposizione di due o più masse di interesse. Inoltre, molti spettatori diversi per i dati MSI sono da scaricare gratuitamente, come ad esempio un MSiReaderd BioMap. 32,33 I dati di spettrometria di massa ottenuti possono anche essere trattati post-acquisizione con facilità, portando informazioni più utili alla ribalta. Da farmaceutici a lipidi alle proteine, il sistema sopra descritto permette una rapida acquisizione di dati per valutare la distribuzione delle molecole di interesse in una struttura di coltura cellulare 3D. Sezioni seriali possono essere adottate per immagine dell&#39;intera struttura 3D costruendo da ogni immagine 2D di una fetta di coltura cellulare 3D. Le tecniche e le note del protocollo saranno di utilità per i ricercatori che desiderano iniziare a coltura cellulare tridimensionale come un ponte tra la cultura monostrato e modelli animali. Una volta masterizzato, queste tecniche possono essere applicate a diversi tipi di colture cellulari 3D, tessuti e colture cellulari, consentendo ai ricercatori di immagine a seconda di quale dei campioni che scelgono.

Mass spectrometry imaging (MSI) is a powerful technique to examine the distribution of molecular species across samples of interest. Researchers have imaged biological samples from whole animals down to single cells with this technique.1&#8211;4 Using MSI hundreds of analytes may be imaged at a single time, rather than single-substrate techniques requiring the development of additional fluorophores for traditional confocal microscopy, or staining for histology.5&#8211;7 Additionally, MSI can be used in either a targeted or a discovery-based fashion, making it an attractive approach to look at the overlap between the distribution of chemical species. Presented within are methods for the growth, preparation, and matrix assisted laser desorption ionization/desorption (MALDI) imaging of small samples (~1 mm in diameter) of three-dimensional multicellular cell cultures.8&#8211;11
3D cell cultures are of particular interest to the biological community as an intermediary between traditional monolayer culture and in vivo tumors. As the name implies, 3D cell cultures are heterogeneous cellular aggregates that contain many of the chemical gradients in the microenvironment observed in small avascular tumor nodules, making them a more realistic model system to the native tumor environment than monolayer culture.10 Many human cell lines can be grown as 3D cultures, including cell lines derived from colon, breast, ovary, prostate, kidney and lung tissues.10 There are inherent challenges in imaging three dimensional cell cultures as they are smaller than many samples commonly used for mass spectrometry imaging and therefore require careful sample preparation.7 However, the advantages of these tractable model systems include lower cost and faster growth and analysis time compared to animal models. As a result, studies involving three dimensional cell cultures can be higher throughput than traditional animal studies.12&#8211;14
All of these advantages have resulted in increasing popularity for three dimensional cell cultures in biological research; there is a corresponding need to develop new analytical strategies to explore both the composition and spatial distribution of molecules in these systems.12,15&#8211;21 The goal of this manuscript is to describe the adaptation of mass spectrometry imaging methods and sample preparation to three dimensional cell cultures.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="600">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Name of Material/Equipment</td>
			<td style="width:103px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:175px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HCT116 Cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC CCL-247</td>
			<td>Potential hazard, handle with care</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">McCoy&#39;s 5A media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16600-108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine serum</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.25% Trypsin-EDTA solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gelatin, unflavored</td>
			<td>Knox</td>
			<td>--</td>
			<td>Available at most grocery stores in single-packets</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ITO-coated glass slides</td>
			<td>Delta Technologies, Limited</td>
			<td>CG-90IN-S115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#945;-Cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8982</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sinapic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>85429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.3mm Gravity Feed Dual-Action Airbrush Paint Spray Gun Kit Set</td>
			<td>RoyalMax Airbrush</td>
			<td>--</td>
			<td>Many options available on sites such as Amazon.com</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sample preparation strategies for mass spectrometry imaging of 3d cell culture models

Three dimensional cell cultures are attractive models for biological research. They combine the flexibility and cost-effectiveness of cell culture with some of the spatial and molecular complexity of tissue. For example, many cell lines form 3D structures given appropriate in vitro conditions. Colon cancer cell lines form 3D cell culture spheroids, in vitro mimics of avascular tumor nodules. While immunohistochemistry and other classical imaging methods are popular for monitoring the distribution of specific analytes, mass spectrometric imaging examines the distribution of classes of molecules in an unbiased fashion. While MALDI mass spectrometric imaging was originally developed to interrogate samples obtained from humans or animal models, this report describes the analysis of in vitro three dimensional cell cultures, including improvements in sample preparation strategies. Herein is described methods for growth, harvesting, sectioning, washing, and analysis of 3D cell cultures via matrix-assisted laser desorption/ionization-mass spectrometry (MALDI-MS) imaging. Using colon carcinoma 3D cell cultures as a model system, this protocol demonstrates the ability to monitor analytes in an unbiased fashion across the 3D cell culture system with MALDI-MSI.

Immagini MSI ha il potenziale per rivelare molte distribuzioni molecolari diversi in colture cellulari 3D. Utilizzando il metodo descritto sopra, specie da piccole molecole (Figura 1) per grandi proteine ​​(Figura 2) possono essere monitorati attraverso la cultura. Questi risultati mostrano la visualizzazione di un singolo ione con lo strumento gratuito MSiReader. 32 I risultati possono essere analizzati per singoli ioni di interesse attraverso la coltura cellulare 3D con software di visualizzazione in una regione di interesse o l&#39;intera regione scansionata. Inoltre la maggior parte del software visualizzerà automaticamente ioni di sopra di una certa soglia impostata dall&#39;utente, che può aiutare gli sforzi di scoperta. Una volta che si ottengono mappe singolo ione, più software include la capacità di sovrapporre le immagini per vedere la colocalizzazione di ioni. Sia in approcci discovery-based o in modo mirato, l&#39;imaging spettrometria di massa è un potente strumento per analizzare colture cellulari 3D. Figura 1. Risultati rappresentativi del 3D crescita coltura cellulare e sezionamento. Sinistra) ottico di immagine di una struttura di coltura cellulare colorettale HCT-116 3D intatta come visto il giorno 14 prima della raccolta. Destra) ottico di immagine di una fetta di circa equatoriale un colorettale 3D coltura cellulare disgelo montato su uno scivolo di ITO rivestito per l&#39;imaging. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52313/52313fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52313/52313fig2highres.jpg" /> Figura 2. Risultati rappresentativi di piccola molecola MALDI-MSI di una sezione equatoriale di una coltura cellulare 3D. Top) spettri di massa medio ottenuto con α-CHCA in gamma bassa massa (piccola molecola). Basso) Immagini rappresentative dellauna massa unica: 327,8 m / z localizzata principalmente all&#39;interno della coltura cellulare 3D e 429,7 m / z localizzata principalmente al bordo della coltura cellulare 3D. La linea tratteggiata indica il margine approssimativo della sferoide. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52313/52313fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52313/52313fig3highres.jpg" /> Figura 3. Risultati rappresentativi dell&#39;imaging proteine ​​di MALDI-MSI di una sezione equatoriale di una coltura cellulare 3D. Top) spettri di massa medio ottenuto con l&#39;acido sinapico in alto (intervallo di proteine) di massa. Inferiore) Immagini rappresentative di una massa unica: 10.871 m / z localizzata principalmente al bordo dello sferoide, e 12.184 m / z localizzato più verso l&#39;interno dello sferoide. La linea tratteggiata indica il bordo approssimativa dello sferoide. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52313/52313fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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Sample Preparation Strategies for Mass Spectrometry Imaging of 3D Cell Culture Models

Linee cellulari di cancro immortalato può essere coltivata come colture cellulari in 3D, un modello importante per la ricerca biologica. Questo protocollo descrive massa spettrometria di imaging di colture cellulari 3D, tra cui il miglioramento della piattaforma di preparazione del campione. L&#39;obiettivo di questo protocollo è quello di istruire gli utenti a preparare colture cellulari in 3D per l&#39;analisi di imaging spettrometria di massa.

Campione strategie di preparazione per la Spettrometria di Massa Imaging di 3D Models Cultura cellulare

Three dimensional cell cultures are attractive models for biological research. They combine the flexibility and cost-effectiveness of cell culture with ...

sample-preparation-strategies-for-mass-spectrometry-imaging-3d-cell

Research

JoVE Journal

Bioengineering

18.0K Views.  University of Notre Dame.  Linee cellulari di cancro immortalato può essere coltivata come colture cellulari in 3D, un modello importante per la ricerca biologica. Questo protocollo descrive massa spettrometria di imaging di colture cellulari 3D, tra cui il miglioramento della piattaforma di preparazione del campione. L'obiettivo di questo protocollo è quello di istruire gli utenti a preparare colture cellulari in 3D per l'analisi di imaging spettrometria di massa. 

Video: Sample Preparation Strategies for Mass Spectrometry Imaging of 3D Cell Culture Models

A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids

Studies of cell-cell cohesion and cell-substratum adhesion have historically been performed on monolayer cultures adherent to rigid substrates. Cells within a tissue, however, are typically encased within a closely packed tissue mass in which cells establish intimate connections with many near-neighbors and with extracellular matrix components. Accordingly, the chemical milieu and physical forces experienced by cells within a 3D tissue are fundamentally different than those experienced by cells grown in monolayer culture. This has been shown to markedly impact cellular morphology and signaling. Several methods have been devised to generate 3D cell cultures including encapsulation of cells in collagen gels1or in biomaterial scaffolds2. Such methods, while useful, do not recapitulate the intimate direct cell-cell adhesion architecture found in normal tissues. Rather, they more closely approximate culture systems in which single cells are loosely dispersed within a 3D meshwork of ECM products. Here, we describe a simple method in which cells are placed in hanging drop culture and incubated under physiological conditions until they form true 3D spheroids in which cells are in direct contact with each other and with extracellular matrix components. The method requires no specialized equipment and can be adapted to include addition of any biological agent in very small quantities that may be of interest in elucidating effects on cell-cell or cell-ECM interaction. The method can also be used to co-culture two (or more) different cell populations so as to elucidate the role of cell-cell or cell-ECM interactions in specifying spatial relationships between cells. Cell-cell cohesion and cell-ECM adhesion are the cornerstones of studies of embryonic development, tumor-stromal cell interaction in malignant invasion, wound healing, and for applications to tissue engineering. This simple method will provide a means of generating tissue-like cellular aggregates for measurement of biomechanical properties or for molecular and biochemical analysis in a physiologically relevant model.

We describe a simple, rapid method of generating 3D tissue-like spheroids and their potential application to quantify differences in cell-cell interactions.

Un semplice Hanging goccia Cultura protocollo cellulare per la generazione di sferoidi 3D

Studies of cell-cell cohesion and cell-substratum adhesion have historically been performed on monolayer cultures adherent to rigid substrates. Cells ...

Ricerca

Bioingegneria

Preparation of 3D Fibrin Scaffolds for Stem Cell Culture Applications

Stem cells are found in naturally occurring 3D microenvironments in vivo, which are often referred to as the stem cell niche 1. Culturing stem cells inside of 3D biomaterial scaffolds provides a way to accurately mimic these microenvironments, providing an advantage over traditional 2D culture methods using polystyrene as well as a method for engineering replacement tissues 2. While 2D tissue culture polystrene has been used for the majority of cell culture experiments, 3D biomaterial scaffolds can more closely replicate the microenvironments found in vivo by enabling more accurate establishment of cell polarity in the environment and possessing biochemical and mechanical properties similar to soft tissue.3 A variety of naturally derived and synthetic biomaterial scaffolds have been investigated as 3D environments for supporting stem cell growth. While synthetic scaffolds can be synthesized to have a greater range of mechanical and chemical properties and often have greater reproducibility, natural biomaterials are often composed of proteins and polysaccharides found in the extracelluar matrix and as a result contain binding sites for cell adhesion and readily support cell culture. Fibrin scaffolds, produced by polymerizing the protein fibrinogen obtained from plasma, have been widely investigated for a variety of tissue engineering applications both in vitro and in vivo 4. Such scaffolds can be modified using a variety of methods to incorporate controlled release systems for delivering therapeutic factors 5. Previous work has shown that such scaffolds can be used to successfully culture embryonic stem cells and this scaffold-based culture system can be used to screen the effects of various growth factors on the differentiation of the stem cells seeded inside 6,7.
 This protocol details the process of polymerizing fibrin scaffolds from fibrinogen solutions using the enzymatic activity of thrombin. The process takes 2 days to complete, including an overnight dialysis step for the fibrinogen solution to remove citrates that inhibit polymerization. These detailed methods rely on fibrinogen concentrations determined to be optimal for embryonic and induced pluripotent stem cell culture. Other groups have further investigated fibrin scaffolds for a wide range of cell types and applications - demonstrating the versatility of this approach 8-12.

This work details the preparation of 3D fibrin scaffolds for culturing and differentiating plutipotent stem cells. Such scaffolds can be used to screen the effects of various biological compounds on stem cell behavior as well as modified to contain drug delivery systems.

Preparazione del 3D fibrina ponteggi per le applicazioni delle cellule staminali Cultura

Stem cells are found in naturally occurring 3D microenvironments in vivo, which are often referred to as the stem cell niche 1. Culturing stem cells ...

Imaging of Biological Tissues by Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Mass spectrometry imaging (MSI) provides untargeted molecular information with the highest specificity and spatial resolution for investigating biological tissues at the hundreds to tens of microns scale. When performed under ambient conditions, sample pre-treatment becomes unnecessary, thus simplifying the protocol while maintaining the high quality of information obtained. Desorption electrospray ionization (DESI) is a spray-based ambient MSI technique that allows for the direct sampling of surfaces in the open air, even in vivo. When used with a software-controlled sample stage, the sample is rastered underneath the DESI ionization probe, and through the time domain, m/z information is correlated with the chemical species' spatial distribution. The fidelity of the DESI-MSI output depends on the source orientation and positioning with respect to the sample surface and mass spectrometer inlet. Herein, we review how to prepare tissue sections for DESI imaging and additional experimental conditions that directly affect image quality. Specifically, we describe the protocol for the imaging of rat brain tissue sections by DESI-MSI.

Desorption electrospray ionization mass spectrometry (DESI-MS) is an ambient method by which samples, including biological tissues, can be imaged with minimal sample preparation. By rastering the sample below the ionization probe, this spray-based technique provides sufficient spatial resolution to discern molecular features of interest within tissue sections.

Imaging dei tessuti biologici per desorbimento Electrospray ionizzazione Spettrometria di Massa

Mass spectrometry imaging (MSI) provides untargeted molecular information with the highest specificity and spatial resolution for investigating biological ...

Selective Cell Elimination from Mixed 3D Culture Using a Near Infrared Photoimmunotherapy Technique

Recent developments in tissue engineering offer innovative solutions for many diseases. For example, tissue engineering using induced pluripotent stem cell (iPS) emerged as a new method in regenerative medicine. Although this tissue regeneration is promising, contamination with unwanted cells during tissue cultures is a major concern. Moreover, there is a safety concern regarding tumorigenicity after transplantation. Therefore, there is an urgent need for eliminating specific cells without damaging other cells that need to be protected, especially in established tissue. Here, we present a method for specific cell elimination from a mixed 3D cell culture in vitro with near infrared photoimmunotherapy (NIR-PIT) without damaging non-targeted cells. This technique enables the elimination of specific cells from mixed cell cultures or tissues.

Eliminating specific cells without damaging other cells is extremely difficult, especially in established tissue, yet there is an urgent need for a cell elimination method in the tissue engineering field. Here, we present a method for specific cell elimination from a mixed 3D cell culture using near infrared photoimmunotherapy (NIR-PIT).

Selective cellulare eliminazione dalla misto Cultura 3D utilizzando una tecnica Near Infrared Photoimmunotherapy

Recent developments in tissue engineering offer innovative solutions for many diseases. For example, tissue engineering using induced pluripotent stem ...

Whole-body Mass Spectrometry Imaging by Infrared Matrix-assisted Laser Desorption Electrospray Ionization (IR-MALDESI)

Ambient ionization sources for mass spectrometry (MS) have been the subject of much interest in the past decade. Matrix-assisted laser desorption electrospray ionization (MALDESI) is an example of such methods, where features of matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) (e.g., pulsed nature of desorption) and electrospray ionization (ESI) (e.g., soft-ionization) are combined. One of the major advantages of MALDESI is its inherent versatility. In MALDESI experiments, an ultraviolet (UV) or infrared (IR) laser can be used to resonantly excite an endogenous or exogenous matrix. The choice of matrix is not analyte dependent, and depends solely on the laser wavelength used for excitation. In IR-MALDESI experiments, a thin layer of ice is deposited on the sample surface as an energy-absorbing matrix. The IR-MALDESI source geometry has been optimized using statistical design of experiments (DOE) for analysis of liquid samples as well as biological tissue specimens. Furthermore, a robust IR-MALDESI imaging source has been developed, where a tunable mid-IR laser is synchronized with a computer controlled XY translational stage and a high resolving power mass spectrometer. A custom graphical user interface (GUI) allows user selection of the repetition rate of the laser, number of shots per voxel, step-size of the sample stage, and the delay between the desorption and scan events for the source. IR-MALDESI has been used in variety of applications such as forensic analysis of fibers and dyes and MSI of biological tissue sections. Distribution of different analytes ranging from endogenous metabolites to exogenous xenobiotics within tissue sections can be measured and quantified using this technique. The protocol presented in this manuscript describes major steps necessary for IR-MALDESI MSI of whole-body tissue sections.

Whole-body Mass Spectrometry Imaging by Infrared Matrix-assisted Laser Desorption Electrospray Ionization IR-MALDESI

A mass spectrometry imaging (MSI) source operated at atmospheric pressure was developed by coupling mid-infrared laser desorption and electrospray post-ionization. Exogenous ice matrix was used as the energy-absorbing matrix to facilitate resonant desorption of tissue-related material. This manuscript provides a step-by-step protocol for performing IR-MALDESI MSI of whole-body neonatal mouse.

Tutto il corpo Imaging Mass Spectrometry da Infrared Matrix-Assisted Laser desorbimento per ionizzazione elettrospray (IR-Maldesi)

Ambient ionization sources for mass spectrometry (MS) have been the subject of much interest in the past decade. Matrix-assisted laser desorption ...

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions. While these studies have been informative about general cell signaling mechanisms, they neglect important cellular cues received from the structural and mechanical properties of the local microenvironment and extracellular matrix (ECM). To understand how cells interact within a physiological ECM, it is important to study them in the context of 3 dimensional assays. Cell migration, cell differentiation, and cell proliferation are only a few processes that have been shown to be impacted by local changes in the mechanical properties of a 3-dimensional ECM. Collagen I, a core fibrillar component of the ECM, is more than a simple structural element of a tissue. Under normal conditions, mechanical cues from the collagen network direct morphogenesis and maintain cellular structures. In diseased microenvironments, such as the tumor microenvironment, the collagen network is often dramatically remodeled, demonstrating altered composition, enhanced deposition and altered fiber organization. In breast cancer, the degree of fiber alignment is important, as an increase in aligned fibers perpendicular to the tumor boundary has been correlated to poorer patient prognosis1. Aligned collagen matrices result in increased dissemination of tumor cells via persistent migration2,3. The following is a simple protocol for embedding cells within a 3-dimensional, fibrillar collagen hydrogel. This protocol is readily adaptable to many platforms, and can reproducibly generate both aligned and random collagen matrices for investigation of cell migration, cell division, and other cellular processes in a tunable, 3-dimensional, physiological microenvironment.

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Collagen is a core component of the ECM, and provides essential cues for several cellular processes ranging from migration to differentiation and proliferation. Provided here is a protocol for embedding cells within 3D collagen hydrogels, and a more advanced technique for generating randomized or aligned collagen matrices using PDMS microchannels.

Preparazione del 3D collagene Gel e microcanali per lo studio delle interazioni 3D<em&gt; In Vivo</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung tissue from porcine, rat, or mouse, the tissue is perfused and submerged in subsequent chemical detergents to remove the cellular debris. Histological comparison of the tissue before and after processing confirms removal of over 95% of double stranded DNA and alpha galactosidase staining suggests the majority of cellular debris is removed. After decellularization, the tissue is lyophilized and then cryomilled into a powder. The matrix powder is digested for 48 hr in an acidic pepsin digestion solution and then neutralized to form the pregel solution. Gelation of the pregel solution can be induced by incubation at 37 &#176;C and can be used immediately following neutralization or stored at 4 &#176;C for up to two weeks. Coatings can be formed using the pregel solution on a non-treated plate for cell attachment. Cells can be suspended in the pregel prior to self-assembly to achieve a 3D culture, plated on the surface of a formed gel from which the cells can migrate through the scaffold, or plated on the coatings. Alterations to the strategy presented can impact gelation temperature, strength, or protein fragment sizes. Beyond hydrogel formation, the hydrogel stiffness may be increased using genipin.

This is a method to create a 3-dimensional cell culture scaffold from pulmonary extracellular matrix. Intact lung is processed into hydrogels that can support the growth of cells in three-dimensions.

Sintonizzabile idrogel da polmonare matrice extracellulare per colture cellulari 3D

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

Simultaneous Quantification of Selected Kynurenines Analyzed by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry in Medium Collected from Cancer Cell Cultures

The kynurenine pathway and the tryptophan catabolites called kynurenines have received increased attention for their involvement in immune regulation and cancer biology. An in vitro cell culture assay is often used to learn about the contribution of different tryptophan catabolites in a disease mechanism and for testing therapeutic strategies. Cell culture medium that is rich in secreted metabolites and signaling molecules reflects the status of tryptophan metabolism and other cellular events. New protocols for the reliable quantification of multiple kynurenines in the complex cell culture medium are desired to allow for a reliable and quick analysis of multiple samples. This can be accomplished with liquid chromatography coupled with mass spectrometry. This powerful technique is employed in many clinical and research laboratories for the quantification of metabolites and can be used for measuring kynurenines.
Presented here is the use of liquid chromatography coupled with single quadrupole mass spectrometry (LC-SQ) for the simultaneous determination of four kynurenines, i.e., kynurenine, 3-hydroxykynurenine, 3-hydroxyanthranilic, and xanthurenic acid in the medium collected from in vitro cultured cancer cells. SQ detector is simple to use and less expensive compared to other mass spectrometers. In the SQ-MS analysis, multiple ions from the sample are generated and separated according to their specific mass-to-charge ratio (m/z), followed by the detection using a Single Ion Monitoring (SIM) mode.
This paper draws the attention on the advantages of the reported method and indicates some weak points. It is focused on critical elements of LC-SQ analysis including sample preparation along with chromatography and mass spectrometry analysis. The quality control, method calibration conditions and matrix effect issues are also discussed. We described a simple application of 3-nitrotyrosine as one analog standard for all target analytes. As confirmed by experiments with human ovary and breast cancer cells, the proposed LC-SQ method&#160;generates reliable results and can be further applied to other in vitro cellular models.

Described here is a protocol for the determination of four different tryptophan metabolites generated in the kynurenine pathway (kynurenine, 3-hydroxykynurenine, xanthurenic acid, 3-hydroxyanthranilic acid) in the medium collected from cancer cell cultures analyzed by liquid chromatography coupled with a single quadrupole mass spectrometry.

Quantificazione simultanea di kynurenine selezionate analizzate dalla cromatografia liquida-spettrometria di massa in mezzo raccolto da colture cellulari tumorali

The kynurenine pathway and the tryptophan catabolites called kynurenines have received increased attention for their involvement in immune regulation and ...

Establishing the 3D Stromal-Endothelial Cell Co-Culture

To begin, take the pellet of the GFP-HUVECs grown to a confluence level of 80 to 100%and resuspend the cells in an appropriate volume of basal medium to achieve a concentration of one times 10 to the seventh cells per milliliter of stock solution. Prepare 50-milliliter conical centrifuge tubes containing the required volume of basal medium supplemented with the respective growth factors. Add the GFP-HUVECs from the stock solution at a dilution of one to 66.67 to achieve a concentration of 1.5 times 10 to the fifth cells per microliter.Then aspirate the medium from the plate containing the stromal monoculture and add 200 microliters per well of the prepared GFP-HUVECs suspension. Incubate at 37 degrees Celsius in 5%carbon dioxide in a humidified atmosphere, changing the medium every three to four days. Monitor the development of the culture by bright-field and fluorescence microscopy using a five times objective.Differences between the cultures could be observed from the bright-field and fluorescence images showing only the GFP-HUVECs. The cultures appeared less developed without any growth factor, However, faster development was observed in the presence of FGF-2. In contrast, the bright-field images showed the densest cultures in the presence of BMP-2.However, vascular like networks formed in both growth factor-containing conditions and the most extensive and interconnected networks were formed with FGF-2.

Stabilire la co-coltura 3D di cellule stromale-endoteliali

Generazione scalabile di sferoidi cellulari uniformi utilizzando un dispositivo di assemblaggio acustico 3D

Three-Dimensional Acoustic Assembly Device for Mass Manufacturing of Cell Spheroids

Cell spheroids are promising three-dimensional (3D) models that have gained wide applications in many biological fields. This protocol presents a method for manufacturing high-quality and high-throughput cell spheroids using a 3D acoustic assembly device through maneuverable procedures. The acoustic assembly device consists of three lead zirconate titanate (PZT) transducers, each arranged in the X/Y/Z plane of a square polymethyl methacrylate (PMMA) chamber. This configuration enables the generation of a 3D dot-array pattern of levitated acoustic nodes (LANs) when three signals are applied. As a result, cells in the gelatin methacryloyl (GelMA) solution can be driven to the LANs, forming uniform cell aggregates in three dimensions. The GelMA solution is then UV-photocured and crosslinked to serve as a scaffold that supports the growth of cell aggregates. Finally, masses of matured spheroids are obtained and retrieved by subsequently dissolving the GelMA scaffolds under mild conditions. The proposed new 3D acoustic cell assembly device will enable the scale-up fabrication of cell spheroids, and even organoids, offering great potential technology in the biological field.

Autore in primo piano: Sviluppo di un metodo di assemblaggio acustico senza scaffold per colture cellulari sferoidi 3D di alta qualità 

Cell spheroids have been considered one potential model in the field of biological applications. This article describes protocols for scalably generating cell spheroids using a 3D acoustic assembly device, which provides an efficient method for the robust and rapid fabrication of uniform cell spheroids.

Dispositivo di assemblaggio acustico tridimensionale per la produzione di massa di sferoidi cellulari

Cell spheroids are promising three-dimensional (3D) models that have gained wide applications in many biological fields. This protocol presents a method ...