We would like to acknowledge the Department of Pathology at the University of Illinois at Chicago for financial support. Histology and visible imaging services were provided by the Research Resources Center - Research Histology and Tissue Imaging Core at the University of Illinois at Chicago established with the support of the Vice Chancellor of Research, in particular we would like to thank Ryan Deaton and Andy Hall for their expertise. We would also like to thank Agilent Technologies, in particular Frank Weston for support and loaning of additional IR lens.

1. La creazione di un FT-IR Microscopio e Acquisizione tessuto Images <ol><li> Sezione di un blocco di tessuto fissato in formalina e incluso in paraffina a 4 micron di spessore su un vetrino compatibile IR utilizzando un microtomo. In alternativa, la sezione azoto tessuto congelato liquido a 4 micron di spessore su un vetrino compatibile IR utilizzando un criostato. NOTA: In genere, una sezione di serie sarà anche acquisito su un vetrino e tinto con un speciale (ad esempio ematossilina e eosina (H &amp; E)) o macchia immunoistochimica. Inoltre, linee cellulari in coltura possono essere coltivate su vetrini compatibili IR. Diapositive compatibili IR possono essere diapositive riflettenti IR per la modalità di riflessione per immagini (ad esempio, mirrir scivolo, oro) o IR vetrini trasparenti per la modalità di trasmissione delle immagini (ad esempio, BaF 2, CaF 2). </li><li> Eliminare il microscopio FT-IR e spettrometro utilizzando aria secca o gas azoto secco per rimuovere l&#39;acqua dal sistema atmosferica. Attendere almeno 45 minuti prima di imaging per garantire un Purg completae. </li><li> Raffreddare sia il rivelatore FPA (a 79 K) e il rilevatore MCT interna al microscopio FT-IR usando azoto liquido. Raffreddare i rivelatori circa ogni 6 ore. ATTENZIONE! L&#39;azoto liquido è un fluido criogenico e può causare ustioni, congelamento e in spazi chiusi asfissia. </li><li> Montare il vetrino del campione sul palco microscopio per l&#39;imaging FT-IR. </li><li> Assicurarsi che la luce visibile è &quot;ON&quot; e poi o con il binocolo o il programma di cattura del campione (che fornisce una immagine visibile del tessuto in tempo reale), si concentrano sul campione. </li><li> Aprire il pacchetto software pacchetto quali risoluzioni pro e fare clic su &#39;Collect&#39;, quindi su &#39;Diagnostica&#39; e selezionare &#39;Allinea Spectrometer&#39;. Verificare che il percorso del fascio per il rilevatore interno spettrometro non sia ostruita. </li><li> Clicca su &#39;Imaging Setup&#39;. </li><li> Nella scheda &#39;Elettronica&#39;, selezionare l&#39;appropriata &#39;Speed&#39;, &#39;Under SaRapporto mpling (UDR) &#39;e&#39; Impostazioni Filtri &quot;a seconda del sistema. NOTA: In questo esempio, l&#39;impostazione è di velocità = 2,5 KHz, UDR = 4 e filtri = nessuno. </li><li> Nella scheda &#39;Ottica&#39; verificare che siano selezionate &#39;fonte Mid-IR&#39;, &#39;Open di apertura&#39; e &#39;al 100% fascio attenuatore&#39;. </li><li> Per calibrare il sistema, nella scheda &#39;Ottica&#39;, selezionare &#39;Detector&#39; come &#39;terra&#39;, &#39;Microscope Detector&#39; come &#39;sinistra&#39;, e quindi selezionare &#39;trasmittanza&#39; o &#39;Riflessione&#39; sotto &#39;mode Optics&#39; a seconda del tipo di scivolare in uso. </li><li> Fare clic su Imposta, che aprirà la finestra &#39;Lancer Control&#39;. NOTA: Per la modalità di riflessione seguire le istruzioni in 1.12 e 1.13 e per la modalità di trasmissione seguire le istruzioni a 1,14-1,16. Continuare a 1.17 sia per riflessione e trasmissione. </li><li> Per la modalità di riflessione, in &amp;# 8216; &#39;cliccare su&#39; Lancer controllo Raw &#39;. Utilizzando il joystick di controllo fase e guardare la vista dal vivo dell&#39;immagine interferogramma FT-IR (immagine in alto a destra), spostarsi in una zona pulita della diapositiva. </li><li> Regolare il tempo di integrazione per circa 8.000 conteggi. Successivamente, spostare la fase di trovare un pezzo di tessuto con struttura, preferibilmente il bordo di un tessuto, e perfezionare la messa a fuoco dell&#39;immagine. Change &#39;Calore&#39; e opzioni &#39;di contrasto &quot;per formare un&#39;immagine di migliorare la messa a fuoco, questo non avrà alcun effetto sui dati IR. Continuare dal 1.18. </li><li> Per la modalità di trasmissione, in clic &#39;Lancer controllo&#39; su &#39;Raw&#39;. Utilizzando il joystick di controllo fase e guardare la vista dal vivo dell&#39;immagine interferogramma FT-IR (immagine in alto a destra), spostarsi in una zona pulita della diapositiva. </li><li> Regolare il tempo di integrazione per circa 8.000 conteggi. </li><li> Regolare il fondo focalizzazione / condensatore obiettivo di aumentare il numero di conteggi al suo maximum. Vedere la forma dell&#39;immagine in basso a destra in Lancer controllo per assicurarsi che sia gaussiana aspetto e relativamente uniforme. Regolare di nuovo il tempo di integrazione per circa 8.000 conteggi. NOTA: Se uno dei pixel dell&#39;immagine interferogramma FT-IR, a sua volta bianco, ridurre il tempo di integrazione. </li><li> Spostare la fase di trovare un pezzo di tessuto con struttura, preferibilmente il bordo di un tessuto e perfezionare la messa a fuoco dell&#39;immagine. Facoltativamente, modificare le opzioni di calore e di contrasto per contribuire a formare l&#39;immagine per migliorare la messa a fuoco, ma non avrà alcun effetto sui dati IR. </li><li> Utilizzando il joystick di controllo fase, spostarsi in una zona pulita della diapositiva. Premere il pulsante &#39;Calibra&#39;. Garantire la &#39;Out Of Range (OOR)&#39; valore è inferiore a 50 e la differenza tra il &#39;High Flux&#39; e conta &#39;basso flusso&#39; è di almeno 4.000 conteggi. </li><li> Seleziona &#39;OK&#39; due volte. Nelle schede ottiche selezionare; &#39;MCT&#39; &#39;rivelatore&#39; =, &#39;Microsfar fronte Detector &#39;=&#39; right &#39;e quindi su&#39; Setup &#39;. A questo punto ci sarà un interferogramma FT-IR sullo schermo. Clicca su &#39;Trova Centerburst&#39;. Fare clic su &#39;OK&#39;. </li><li> Nella scheda &#39;Ottica&#39;, riselezionare &#39;rivelatore&#39; = &#39;terra&#39;, &#39;Microscope Detector&#39; = &#39;sinistra&#39; e selezionare &#39;Setup&#39;. </li><li> In Lancer controllo - garantisce che l&#39;immagine è ancora in una zona pulita e fare clic su &#39;Calibra&#39; di nuovo. Fare clic su &#39;OK&#39;. </li><li> Successivamente, il ritiro immagine di sfondo FT-IR per correggere assorbanza dall&#39;atmosfera, sistema e scivolo. Vai alla scheda &#39;Elettronica&#39; e selezionare una risoluzione spettrale opportuno, tipicamente di 4 cm -1 o 8 cm -1 per tessuti. </li><li> Vai alla scheda &#39;sfondo&#39; e digitare 128 in &quot;Scansioni di co-add &#39;. Selezionare il &#39;Nuovo file ...&#39; pulsante e inserire il file di sfondo in appropriate volteer. Controllare scheda &#39;Imaging&#39; per garantire mosaicatura è 1 di 1. Fare clic su &#39;Contesto&#39;, attendere che la scansione per terminare e confermare dove salvare il file. Fare clic su una regione lo sfondo dell&#39;immagine FT-IR e controllare lo spettro. </li><li> Per fare una grande immagine mosaico del campione, selezionare la scheda &#39;Imaging&#39; e inserire il numero di X e Y cornici per le dimensioni del mosaico che si desidera acquistare. </li><li> Fare clic su &#39;Setup&#39; e in Lancer controllo utilizzare la vista a infrarossi dal vivo per trovare l&#39;area di interesse. Se prendere un mosaico, centrare il feed dal vivo nel centro della zona di interesse. Fare clic su &#39;OK&#39;. Vai alla scheda &#39;Elettronica&#39; e digitare il numero di scansioni di co-aggiungere (in genere un valore compreso tra 2 e 16 scansioni per il tessuto). Fare clic su &#39;Scan&#39;. </li><li> Controllare l&#39;immagine FT-IR raccolti sullo schermo per assicurarsi che sembra mirato. Clicca sull&#39;immagine per visualizzare uno spettro IR da quella posizione e controllare che sembra avere un segnale accettabile per il rumore. Acquire un&#39;immagine visibile del campione. </li><li> Salvare l&#39;immagine e esportarlo nel formato richiesto, come ad esempio ENVI-IDL. </li></ol> 2. Adattare un FT-IR Microscopio per capacità ad alta definizione NOTA: La maggior parte dei sistemi FT-IR sono dotati di un obiettivo di circa 15x e 0,5 apertura numerica (NA). Per l&#39;immagine in modalità ad alta definizione, un IR compatibile 36X o 74x obiettivo può essere usato per dare la diffrazione capacità di imaging limitate. <ol><li> Rimuovere obiettivo 15X del sistema svitando in senso antiorario. </li><li> Avvitare la obiettivo 36X o 74x al suo posto. Allineate l&#39;obiettivo prima dell&#39;uso. Utilizzare tubi di prolunga lente di portare l&#39;obiettivo abbastanza vicino al campione. </li><li> Collocare il tessuto sotto il nuovo obiettivo e mettere a fuoco utilizzando la luce visibile utilizzando i binocoli o programma Capture Sample. NOTA: per immagini ad alta definizione deve essere fatto in modo di trasmissione. La distanza molto ravvicinata funzionamento delObiettivi SE (1-2 mm) e molto poca profondità di fuoco richiede fuoco lentamente e con attenzione, prendendo tempo per abbassare l&#39;obiettivo senza toccare il campione. </li><li> Seguire le istruzioni 1,6-1,11. NOTA: A causa di essere molto più difficile mettere a fuoco e molto meno luce che raggiunge il sensore, il seguente protocollo è regolata sulla base di 1,14. </li><li> In modalità di trasmissione, clicca su &#39;Raw&#39;. Utilizzando il joystick di controllo fase e guardare la vista dal vivo dell&#39;immagine interferogramma FT-IR (immagine in alto a destra), passare al tessuto e concentrarsi (idealmente su un bordo). NOTA: Questo può essere difficile, quindi regolare il &#39;calore&#39; e le opzioni di &quot;contrasto&quot; per formare un&#39;immagine di migliorare la messa a fuoco (queste opzioni non hanno effetto sui dati IR). </li><li> Una volta messo a fuoco, utilizzando il joystick di controllo fase e il live view IR recarsi in una zona pulita della diapositiva. Regolare il tempo di integrazione per circa 8.000 conteggi. Regolare il fondo di messa a fuoco dell&#39;obiettivo diaumentare il numero di conteggi al massimo. Regolare di nuovo il tempo di integrazione per circa 8.000 conteggi. </li><li> Spostare la fase di trovare un pezzo di tessuto con struttura, preferibilmente il bordo di un tessuto, e perfezionare la messa a fuoco dell&#39;immagine. </li><li> Se mosaicatura un&#39;immagine ad alta risoluzione, regolare la fase per consentire il movimento corretto richiesto su distanze per mosaicatura precisa. Per modificare le impostazioni della distanza di scena, andare a &#39;fase Setup&#39; in Lancer controllo e regolare le impostazioni di allineamento orizzontale e verticale per consentire il corretto mosaicatura. </li><li> Utilizzando il joystick passaggio di controllo fase verso una zona pulita della diapositiva. Premere il pulsante &#39;Calibra&#39;. Garantire la Out Of Range (OOR) il valore è inferiore al 50 per entrambi 36X e 74x obiettivi. Assicurarsi che la differenza tra l&#39;alto flusso e bassi valori di flusso è almeno 1000 conteggi per l&#39;obiettivo 74x e 2.000 conteggi per l&#39;obiettivo 36X. </li><li> Continuare 1,19-1,27. Il numero di scansioni in 1.23 e1.25 dovranno essere rettificato per segnale ridotto a circa 256 scansioni per l&#39;immagine di sfondo e 16-128 scansioni per l&#39;immagine del tessuto. </li></ol> 3. visualizzare e classificare IR Datasets Spectral NOTA: In questa sezione, parleremo di come visualizzare ed estrarre i dati da immagini spettrali utilizzando l&#39;elaborazione delle immagini geospaziali e analisi software quali ENVI + IDL, ma il processo è molto simile per qualsiasi software alternativo come MATLAB, software libero come CytoSpec , o il software stesso dello sviluppatore strumento. Ci sono un paio di diverse tecniche di lavorazione spettrale che possono essere eseguite sui dati IR. <ol><li> Aprire elaborazione delle immagini geospaziali e software di analisi e caricare il file di dati a infrarossi. </li><li> Applicare un algoritmo di correzione al basale ai dati IR selezionando &quot;strumenti spettrale&quot; e scorrere verso il basso e fare clic su &quot;spettri di assorbimento&quot;. Osservare un menu pop-up e selezionare &quot;Baseline correction &quot; NOTA: la correzione della linea di base rimuoverà una pendenza spostamento della linea di base dai dati a causa di dispersione </li><li> Eseguire normalizzazione spettrale, da ratioing i dati ad un certo picco spettrale (tipicamente Amide I (1650 centimetri -1) o Amide II (1550 centimetri -1)) o area sotto una regione definita degli spettri. Fare questo selezionando &quot;Normal spettri&quot; sotto i &quot;assorbanza Spectra&quot; Opzioni del menu. NOTA: Spectral normalizzazione viene eseguita in modo che eventuali differenze di spettri sono differenze reali biochimiche e non a causa di spessore o di differenze di densità tra i campioni. </li><li> Utilizzare un algoritmo di riduzione del rumore per rimuovere il rumore dagli spettri, se necessario 28. NOTA: Ci sono diversi approcci disponibili per cui correzione al basale, la normalizzazione spettrale e riduzione del rumore possono essere raggiunti, con la maggior parte dei software con algoritmi automatizzati costruito nel In aggiunta, ci sono un numero emergente di approcci che correggerà per.aberrazioni spettrali, che sono state discusse in dettaglio 29-42; tuttavia, la comunità non è ancora d&#39;accordo su quale di questi sono necessari. </li><li> Osservare un elenco di tutte le frequenze IR raccolti all&#39;interno dell&#39;immagine (tipicamente di una gamma spettrale da 900 a 4.000 cm- 1). Istruzioni sulle frequenze corrispondenti alle specifiche biomolecole osservare un&#39;immagine del tessuto alla frequenza selezionata. <ol><li> Per esempio, cliccare su banda 1650 centimetri -1 osservare la distribuzione delle proteine ​​nel campione. Alternativamente cliccare sulla banda 1080 centimetri -1 osservare la distribuzione degli acidi nucleici nel campione. Utilizzare wavenumber 1.650 centimetri -1. </li></ol></li><li> Crea immagini aggiuntive calcolando rapporti spettrali picco di altezza, rapporti zona di punta, ecc che permetteranno per la visualizzazione di diversi componenti biomolecolari. Clicca su &quot;Strumenti spettrali &#39;e quindi selezionare&#39; Rapporti di altezza di picco &#39;o&#39; Calcola Area Immagine &#39;per creare immagini. </li><li> Scansione la sezione corrispondente tessuto adiacente che è macchiato utilizza un intero sistema di scorrimento imager separato che cattura immagini brightfield. L&#39;immagine IR Accanto, visualizzare l&#39;immagine digitale del tessuto macchiato con un programma di immagine visibile. </li><li> Fare clic destro sull&#39;immagine in una regione di interesse e selezionare &#39;profilo Z&#39;. Questo darà le informazioni spettrali al pixel selezionato. </li><li> Guardate gli spettri IR di più pixel di più classi, come ad esempio il confronto tipi di cellule, stati di malattia. Segna i pixel specifici sull&#39;immagine utilizzando il &#39;regioni di interesse&#39; (ROI) strumento. Per eseguire questa operazione, fate clic destro sull&#39;immagine e selezionare &#39;strumento ROI&#39;. Creare le classi che devono essere etichettati, ad esempio normale, displasia, e le classi di cancro. Selezionare quindi, &#39;tipo ROI&#39; - &#39;Point&#39;. Quindi selezionare la classe di selezionare pixel per e disegnare sui pixel appropriate nell&#39;immagine IR via. Ricavare la media spettri fo ciascuna delle classi con lo strumento &#39;ROI medio&#39;. </li><li> Confronta spettri derivata riportando in software grafici. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

FT-IR è una modalità emergente gratis-label di imaging biochimica di sezioni di tessuto, con la possibilità di avere un ruolo importante nel migliorare l&#39;attuale standard di diagnosi in patologia. Il gold standard attuale per la patologia richiede tessuti essere sottoposte a biopsia, fissati in formalina, inclusi in paraffina, sezionati più volte, e colorati con diversi macchie. Un patologo altamente qualificato deve valutare soggettivamente visivamente la struttura del tessuto e la morfologia cellulare per stabilire una diagnosi. Qui vi mostriamo come raccogliere immagini a infrarossi ad alta risoluzione dello stesso tipo di sezioni e discutere alcuni degli approcci computazionali per esaminare le differenze chimiche tra i tipi di cellule e stati di malattia. I passaggi critici all&#39;interno di questo protocollo sono di assicurare che i tessuti sono molto attentamente concentrati e che il sistema è ben calibrato per garantire dati spettroscopici di altissima qualità. La cura durante l&#39;installazione del sistema è particolarmente Criti<html> cal quando si lavora con gli obiettivi ad alto ingrandimento. Per facilitare la risoluzione dei problemi, il seguente elenco descrive alcuni dei potenziali difficoltà incontrate; Problema: bassa intensità IR quando l&#39;imaging in riflessione. Soluzione: Verificare l&#39;orientamento diapositiva IR come il rivestimento riflettente può essere dalla parte sbagliata della diapositiva. Problema: segnale basso / rosso segnale di avvertimento in Lancer controllo. Soluzione: rilevatori raffreddare con LN2. È richiesto azoto liquido per i rivelatori FPA per funzionare e richiede periodicamente di essere ricaricato. Problema: Velocity errori errore / movimento. Soluzione: reimpostare spettrometro e ridurre le vibrazioni. Vibrazioni causeranno lo specchio in movimento nel interferometro essere disturbato. Problema: picchi vapore acqueo in dati. Soluzione: Aumentare spurgo sul sistema e proteggere campione d&#39;aria. Problema: centerburst valido. Soluzione: Trova centerburst di nuovo. e_content &quot;&gt; Problema:. bassa differenza di flusso nella trasmissione, anche se concentrato. Soluzione Regolare condensatore basso Ciò si verifica quando la luce IR non viene focalizzato in un punto sul campione. In questo lavoro, ci siamo concentrati su come acquisire immagini ad alta definizione a infrarossi dei tessuti sia in trasmissione o in modalità trasflettanza. La natura dell&#39;imaging FT-IR, è che ci sono molteplici modifiche che possono essere fatte per l&#39;acquisizione dati, ad esempio, il tipo di substrato, tecniche di fissazione, spessore del campione, risoluzione spettrale, interferometro velocità specchio ecc L&#39;effetto di questi parametri ha stato discusso in ampi dettagli recentemente 4,5,17,51. Ci sono un certo numero di modifiche che possono essere apportate al sistema di imaging compreso l&#39;imaging in modalità ATR 10,24,26 e utilizzando approcci termici nanoscala 52,53 per consentire imaging ad alta risoluzione IR. La limitazione principale con alta risoluzione di imaging IR è che la TIUESTIONI devono essere accuratamente preparati e abbastanza sottili per IR per passare (in genere 4 di spessore micron). Inoltre, la trasmissione e riflettanza FT-IR di imaging richiede i campioni ad essere asciutta a causa della assorbanza IR dall&#39;acqua. Tuttavia, imaging FT-IR ha vantaggi significativi rispetto ad altre tecniche, in quanto può immagine molto rapidamente grandi aree di tessuto mentre derivanti ricca e dettagliata informazioni biochimiche. Altre tecniche simili che derivano informazioni biochimiche in un modo libero-label includono la spettroscopia Raman, ma il tempo di acquisizione dei dati è molto più lento di acquisire immagini. Approcci di imaging Nuovo Raman stanno emergendo tra cui diffusione stimolata Raman (SRS) e Coherent Antistokes Raman (CARS); Tuttavia, essi hanno accesso gamma spettrale limitato o di imaging singola frequenza. I progressi nella velocità di acquisizione dei dati, risoluzione spaziale, e la disponibilità di approcci computazionali sono stati di enorme valore nel fare FT-IR imagzione un approccio più fattibile per la traduzione come un nuovo strumento di imaging in patologia. I recenti progressi nella risoluzione spaziale sono stati particolarmente importanti per la patologia dei tessuti a causa di tipi di cellule non siano risolvibili con sistemi di imaging FT-IR convenzionali. Il recente articolo di Reddy et al. mostrato come modellare un sistema ideale per ottenere la risoluzione spaziale ottimale di un sistema di imaging FT-IR 5. L&#39;esempio tessuto renale presentato in questo documento dimostra l&#39;importanza di risoluzioni spaziali elevate per estrarre informazioni biochimiche dalle strutture glomerulari (Figura 3 e Figura 5). In futuro, nuovi progressi in Quantum Cascade Laser come molto luminose sorgenti di luce IR 54-57, 3D immagini spettrali 58, e innovazioni nel campo delle tecnologie su scala nanometrica IR 52,53,59,60 detengono nuovi entusiasmanti percorsi di ricerca che possono avere enormi implicazioni per il futuro di imaging dei tessuti. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Abbiamo presentato esempi di applicazioni in fegato e malattie renali in cui vi è la necessità di informazioni biochimiche aggiuntivo che può essere di valore diagnostico. La Spectral Patologia Lab presso il Dipartimento di Patologia presso la University of Illinois a Chicago si concentra sulla traduzione delle tecnologie di imaging IR per migliorare la diagnosi della malattia e migliorare la previsione della prognosi del paziente. Imaging FT-IR può superare alcuni dei limiti attuali di pratica patologia che richiedono informazioni quantitative e obiettiva. In particolare, il lavoro futuro si concentra sull&#39;identificazione aree in pratica patologia attuale, in cui le tecniche attuali non riescono a fornire un adeguato sensibilità diagnostica o fornire informazioni limitate. Esiste una chiara necessità di migliorare la pratica attuale di patologia e verso dare più informazioni al patologo sullo stato di malattia del paziente, che può essere realizzabile utilizzando ad alta definizione di immagini FT-IR.

Spettroscopia IR è stato uno strumento di analisi disponibili in qualche forma dal 1930; tuttavia, è stato solo nell&#39;ultimo decennio che l&#39;area di imaging dei tessuti con FT-IR è esploso. I progressi nella FT-IR per l&#39;imaging dei tessuti sono stati guidati in gran parte da tre sviluppi fondamentali: 1) aumento della velocità di acquisizione dei dati a causa della disponibilità di grandi Focal Plane Array (FPA) rilevatori che in genere hanno migliaia di IR rivelatori sensibili 1 , 2, 2) lo sviluppo di algoritmi di elaborazione avanzate e la potenza di calcolo per gestire grandi quantità di dati iperspettrali set 3, e 3) la modellazione di sistemi di imaging FT-IR per massimizzare la risoluzione spaziale di 4,5. Ci sono stati numerosi di alta qualità e molto ampi articoli rivedere il campo della spettroscopia FT-IR recentemente 6-16, oltre a un documento di natura protocolli che illustra le fasi per ottenere punto spettri o le mappe da tessuti 17. In questo articolo, ci concentreremo sulla protocol di ottenere immagini di tessuti utilizzando un rivelatore FPA 128 x 128 in un sistema FT-IR modificato con capacità ad alta definizione. Imaging FT-IR è stato a lungo suggerito uno strumento potenzialmente auspicabile per l&#39;imaging cellulare e tissutale dovuta alla capacità di ottenere immagini in cui ogni pixel ha una ricchezza di informazioni biochimiche. Imaging FT-IR si basa sul principio che diverse biomolecole in un campione saranno quantitativamente assorbire diverse regioni del medio infrarosso; questo consente la derivazione di un &#39;impronta digitale biochimico&#39;. Questa impronta digitale era stato dimostrato in molti studi di modificare tra i diversi tipi di cellule e stati di malattia. Diversamente pratica patologia convenzionale quando macchie e marcatori immunoistochimici devono essere utilizzati per la visualizzazione e identificare i tipi cellulari e strutture tissutali che vengono utilizzati per guidare opzioni diagnosi e trattamento, le immagini da FT-IR sono formate sulla base biochimica intrinseca del tessuto. Il techniq attualeue di tessuto colorazione per la diagnosi è in termini di tempo, distruttivo, laborioso, e richiede competenze personale di patologo, mentre FT-IR offre la possibilità di rendere questo processo rapido, non distruttivo, altamente automatizzato, e più obiettivo. Inoltre, FT-IR fornisce un nuovo percorso per ottenere ulteriori informazioni biochimiche che potrebbe non essere prontamente accessibili usando tecniche di colorazione convenzionali. Uno dei progressi più interessanti degli ultimi anni è stata la disponibilità di approcci di imaging ad alta risoluzione che può ora permettere per la visualizzazione e la caratterizzazione di tipi di cellule e strutture del tessuto che sono fondamentali per una completa diagnosi della malattia. Una di queste tecniche è Attenuated Total Reflectance (ATR) FT-IR che incorpora un obiettivo a immersione solido (SIL) di un alto indice di rifrazione, che consente per imaging ad alta risoluzione 18, con molti studi molto interessanti che mostra le sue applicazioni 19-25. Inoltre, wcome ha recentemente dimostrato che la risoluzione spaziale maggiore associato a immagini ATR può permettere per la visualizzazione e la classificazione delle cellule endoteliali e mioepiteliali nel tessuto mammario che costituiscono una componente chiave della diagnosi di cancro al seno 26. Mentre l&#39;imaging ATR è molto utile, questa tecnica richiede la SIL di entrare in contatto con il tessuto per formare immagini FT-IR; Pertanto, il suo uso è un po &#39;limitato per patologia dei tessuti in cui le grandi regioni di tessuti devono essere rapidamente ripreso. Un secondo approccio è stata dimostrata accoppiando un obiettivo ad alto ingrandimento un sistema FT-IR esistente che utilizza un sincrotrone come fonte luminosa di IR, è possibile illuminare completamente un FPA e l&#39;immagine con una dimensione di pixel effettiva di 0,54 x 0,54 micron. Questo ha permesso a noi di visualizzare strutture chiave in seno e della prostata tessuti che non erano risolvibili con sistemi convenzionali FT-IR 4. Mentre questi aumenti drammatici in immagine IR resolutio spazialen fosse emozionante, il suo uso è rimasto limitato a causa di richiedere un sincrotrone. Successivamente, un sistema ottimale creata che potrebbe anche consentire funzionalità di imaging ad alta definizione con una dimensione di pixel 1,1 x 1,1 micron, senza il requisito di una sorgente di sincrotrone bensì utilizzando una sorgente IR Globar tradizionale 5. In questo articolo, vi mostriamo come modificare un sistema di imaging esistente commerciale FT-IR per consentire la diffrazione IR limitato l&#39;imaging dei tessuti con un segnale accettabile per rumore con obiettivi multipli IR (15X, 36X, e 74x). Il formato di pixel effettivi con i tre obiettivi è 5.5 x 5.5 micron (15X), 2,2 x 2,2 micron (36X) e 1.1 x 1.1 micron (74x). Abbiamo poi diamo alcuni esempi dell&#39;importanza dei guadagni in risoluzione spaziale per la rilevazione della malattia in fegato e reni biopsie 27.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1102">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Cary 600 Series FT-IR system</td>
			<td style="width:308px;">Agilent</td>
			<td style="width:192px;">Multiple configurations&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Alternate FT-IR imaging systems exist</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Adjustable ReflX Objective 74X/0.65NA IR</td>
			<td style="width:308px;">Edmund Optics</td>
			<td style="width:192px;">66-592</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Adjustable ReflX Objective 36X/0.5NA IR</td>
			<td style="width:308px;">Edmund Optics</td>
			<td style="width:192px;">66-586</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">MirrIR slide</td>
			<td style="width:308px;">Kevley Technologies</td>
			<td style="width:192px;">CFR</td>
			<td>For FT-IR reflection-mode measurements</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Barium Fluoride slides</td>
			<td style="width:308px;">International Crystal Laboratories</td>
			<td style="width:192px;">Multiple sizes</td>
			<td>For FT-IR transmission-mode measurements</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Calcium Fluoride slides</td>
			<td style="width:308px;">International Crystal Laboratories</td>
			<td style="width:192px;">Multiple sizes</td>
			<td>For FT-IR transmission-mode measurements</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Dry Nitrogen/Dry Air gas</td>
			<td style="width:308px;">Multiple gas suppliers</td>
			<td style="width:192px;">Multiple sizes</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Hexane</td>
			<td style="width:308px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:192px;">Multiple sizes</td>
			<td>For deparafinizing tissue</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Liquid Nitrogen</td>
			<td style="width:308px;">Multiple cryogenic liquid suppliers</td>
			<td style="width:192px;">Multiple sizes</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">ENVI-IDL software</td>
			<td style="width:308px;">Exelis-Vis</td>
			<td style="width:192px;"></td>
			<td>Other software packages available</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:336px;">Whole slide Imager</td>
			<td style="width:308px;">Scanscope (Aperio) or Nanozoomer (Hamamatsu)</td>
			<td style="width:192px;"></td>
			<td>To image stained slides</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-definition fourier transform infrared (ft-ir) spectroscopic imaging of human tissue sections towards improving pathology

Alta definizione Fourier Transform Infrared (FT-IR) di imaging spettroscopico è un approccio emergente per ottenere immagini dettagliate che sono associate informazioni biochimiche. Imaging FT-IR di tessuto si basa sul principio che diverse regioni del medio infrarosso sono assorbiti dai diversi legami chimici (ad esempio, C = O, CH, NH) all&#39;interno delle cellule o tessuti che possono poi essere legati alla presenza e alla composizione di biomolecole (ad esempio, lipidi, DNA, glicogeno, proteine, collagene). In un&#39;immagine FT-IR, ogni pixel all&#39;interno dell&#39;immagine comprende un intero infrarossi (IR) dello spettro che può dare informazioni sullo stato biochimico delle cellule che possono essere sfruttati per tipo cellulare o malattia tipo di classificazione. In questo articolo, vi mostriamo: come ottenere immagini a infrarossi da tessuti umani mediante un sistema di FT-IR, come modificare la strumentazione esistente per consentire la funzionalità di imaging ad alta definizione, e come visualizzare le immagini FT-IR. Abbiamo poi presentiamo alcune applicazioni di FT-IRper patologia utilizzando il fegato ei reni come esempi. Imaging FT-IR detiene applicazioni interessanti nel fornire un percorso romanzo di ottenere informazioni biochimiche dalle cellule e tessuti in un percorso che non generi completamente libero-label verso dando nuova visione cambiamenti biomolecolari come parte di processi di malattia. Inoltre, queste informazioni biochimiche può potenzialmente consentire un&#39;analisi obiettiva e automatizzato di alcuni aspetti della diagnosi della malattia.

Imaging FT-IR consente la derivazione di immagini IR di tessuto che possono dare diversi contrasti seconda della frequenza IR di interesse. Inoltre, in un&#39;immagine IR, ogni pixel comprende l&#39;intero spettro IR, con differenti picchi corrispondenti a differenti biomolecole che possono dare informazioni sulle proprietà biochimiche di tipi cellulari o stati di malattia (Figura 1). Qui, abbiamo dimostrato come confrontare le firme spettrali tra le classi, ma più avanzato classificazione automatica è possibile utilizzando algoritmi aggiuntivi 3,43-50, quali la classificazione bayesiana, foreste casuali, reti neurali artificiali e gerarchiche Cluster Analysis è possibile eseguire sul dati. Approcci classificazione supervisionata consentiranno per la costruzione di un classificatore che può essere addestrato per consentire il riconoscimento automatico di tipi cellulari o stati di malattia. Approcci classificazione non supervisionata possono essere utilizzati per cercare naturale difrenze nei tessuti o cellule a causa della varianza biochimica. Strumentazione FT-IR si è evoluta nel corso degli ultimi decenni, dalla misurazione in un unico punto modalità / mapping tramite IR aperture opachi alla modalità di imaging con obiettivi Cassegrain, utilizzando un obiettivo illuminante accoppiato con un obiettivo di raccolta nella trasmissione-mode o un unico obiettivo che entrambi illumina e raccoglie in riflessione-mode (Figura 2). È stato recentemente dimostrato che l&#39;obiettivo di raccolta in trasmissione potrebbe essere commutata per un ingrandimento maggiore e oggettivo apertura numerica per consentire diffrazione limitata immagini IR, che porta a sostanziali aumenti la risoluzione spaziale delle immagini IR raccolti 4,5. I progressi nella risoluzione spaziale per l&#39;imaging dei tessuti sono stati di fondamentale importanza come ora siamo in grado di identificare i tipi di cellule e strutture del tessuto, per esempio, le unità funzionali del rene, i glomeruli, utilizzando adattato in-houseSistemi FT-IR (Figura 3). Ad alta definizione di immagini FT-IR consente di ottenere immagini dettagliate di tessuti da esaminare per identificare le regioni anormali e di identificare le differenze biochimiche tra diversi tipi di cellule. In un nucleo tessuto epatico, è possibile visualizzare epatociti e regioni di infiltrazione fibrosi che divide due distinte aree di displasia e cirrosi non displastiche (Figura 4). Stiamo lavorando per sfruttare questo per rendere gli strumenti diagnostici automatizzati per l&#39;utilizzo in casi difficili di malattia del fegato. È importante sottolineare che la maggiore risoluzione spaziale può ora permettere di isolare specifiche caratteristiche strutturali che possono essere modificati chimicamente dalla malattia prima alterazioni istologiche sono evidenti. Ad esempio, siamo concentrati sull&#39;identificazione cambiamenti biochimici nelle strutture glomerulari renali come capsula di Bowman, mesangio, membrana basale glomerulare e membrana tubolare seminterrato, prima<html> modifiche individuate dal patologo può essere osservato (Figura 5). In particolare, siamo interessati a individuare cambiamenti associati con la progressione della nefropatia diabetica e rigetto cronico nei pazienti sottoposti a trapianto, dove le tecniche attuali non riescono a identificare i cambiamenti in modo abbastanza presto per un intervento di successo. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52332/52332fig1.jpg" /> Figura 1. immagini FT-IR e spettro di un nucleo fegato. Immagine di (A) H &amp; E macchiato nucleo da biopsia epatica e immagini di assorbanza IR della sezione di serie della stessa core a (B) 3.286 centimetri -1 e (C) 2.603 cm -1, che ha evidenziato diverse caratteristiche strutturali. (D) tipico spettro IR del tessuto, con picchi importanti etichettati. Bar Scala = 100 micron.fig1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52332/52332fig2.jpg" /> Figura 2. Ottica dettaglio i modi di funzionamento microscopio FT-IR schematici. (A) in modalità di trasmissione, il campione è illuminato attraverso l&#39;obiettivo di fondo, e la luce che passa attraverso il campione viene raccolto dall&#39;obiettivo top. (B) In modalità di riflessione, l&#39;obiettivo prioritario serve sia per illuminare il campione e per raccogliere la luce riflessa. L&#39;obiettivo di fondo non viene utilizzato. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52332/52332fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52332/52332fig3.jpg" /> Figura 3. Confronto di different obiettivi del microscopio sulle immagini FT-IR di un glomerulo renale a 2.925 centimetri -1. (A) 15X oggettivi raccolta con NA = 0.5 (dimensioni 5.5 x 5.5 micron pixel). (B) 36X obiettivo di raccolta con NA = 0.5 (dimensioni 2,2 x 2,2 micron pixel). (C) 74x raccolta obiettivo con NA = 0,65 (dimensioni 1,1 x 1,1 micron pixel). Bar Scala = 50 micron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52332/52332fig3large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52332/52332fig4.jpg" /> Figura 4. differenze spettrali tra fibrosi e epatociti in un nucleo del fegato. (A) H &amp; E macchiato nucleo da biopsia epatica. (B) L&#39;immagine di un nucleo sezione seriale digitalizzata in FT-IR (36X impostazione oggettiva). (C) Repspettri rappresentativi della epatociti e fibrosi, presi dalle regioni di tessuto indicati dalle frecce in (A) e (B). Scala bar = 100 micron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52332/52332fig4large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52332/52332fig5.jpg" /> Figura 5. La differenziazione delle caratteristiche biopsia del tessuto renale attraverso l&#39;uso di imaging ad alta definizione FT-IR. (A) periodica sezione colorata acido Schiff con le caratteristiche da estrarre etichettato. (B) ad alta definizione FT-IR immagine della regione che si estende CH 2 asimmetrica (36X configurazione oggettiva) di una sezione di serie del tessuto stesso. (C) Caratteristiche etichettato (A) estratto utilizzando l&#39;immagine FT-IR in (B) per poter chimicamente differentiate le quattro caratteristiche del tessuto. Bar Scala = 50 micron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52332/52332fig5large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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High-definition Fourier Transform Infrared FT-IR Spectroscopic Imaging of Human Tissue Sections towards Improving Pathology

Fourier Transform Infrared (FT-IR) spectroscopic imaging is a fast and label-free approach to obtain biochemical data sets of cells and tissues. Here, we demonstrate how to obtain high-definition FT-IR images of tissue sections towards improving disease diagnosis.

Alta definizione Fourier Transform Infrared (FT-IR) spettroscopica Imaging di sezioni di tessuto umano verso Migliorare Patologia

High-definition Fourier Transform Infrared (FT-IR) spectroscopic imaging is an emerging approach to obtain detailed images that have associated ...

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High-definition Fourier Transform Infrared (FT-IR) Spectroscopic Imaging of Human Tissue Sections towards Improving Pathology

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33.0K Views.  University of Illinois at Chicago. Fourier Transform Infrared (FT-IR) spectroscopic imaging is a fast and label-free approach to obtain biochemical data sets of cells and tissues. Here, we demonstrate how to obtain high-definition FT-IR images of tissue sections towards improving disease diagnosis. 

Video: High-definition Fourier Transform Infrared FT-IR Spectroscopic Imaging of Human Tissue Sections towards Improving Pathology

Technique and Considerations in the Use of 4x1 Ring High-definition Transcranial Direct Current Stimulation (HD-tDCS)

High-definition transcranial direct current stimulation (HD-tDCS) has recently been developed as a noninvasive brain stimulation approach that increases the accuracy of current delivery to the brain by using arrays of smaller "high-definition" electrodes, instead of the larger pad-electrodes of conventional tDCS. Targeting is achieved by energizing electrodes placed in predetermined configurations. One of these is the 4x1-ring configuration. In this approach, a center ring electrode (anode or cathode) overlying the target cortical region is surrounded by four return electrodes, which help circumscribe the area of stimulation. Delivery of 4x1-ring HD-tDCS is capable of inducing significant neurophysiological and clinical effects in both healthy subjects and patients. Furthermore, its tolerability is supported by studies using intensities as high as 2.0 milliamperes for up to twenty minutes.
Even though 4x1 HD-tDCS is simple to perform, correct electrode positioning is important in order to accurately stimulate target cortical regions and exert its neuromodulatory effects. The use of electrodes and hardware that have specifically been tested for HD-tDCS is critical for safety and tolerability. Given that most published studies on 4x1 HD-tDCS have targeted the primary motor cortex (M1), particularly for pain-related outcomes, the purpose of this article is to systematically describe its use for M1 stimulation, as well as the considerations to be taken for safe and effective stimulation. However, the methods outlined here can be adapted for other HD-tDCS configurations and cortical targets.

Technique and Considerations in the Use of 4x1 Ring High-definition Transcranial Direct Current Stimulation HD-tDCS

High-definition transcranial direct current stimulation (HD-tDCS), with its 4x1-ring montage, is a noninvasive brain stimulation technique that combines both the neuromodulatory effects of conventional tDCS with increased focality. This article provides a systematic demonstration of the use of 4x1 HD-tDCS, and the considerations needed for safe and effective stimulation.

Tecnica e Considerazioni nell&#39;utilizzo dei 4x1 anello ad alta definizione transcranica diretta Current Stimulation (HD-tDCS)

High-definition transcranial direct current stimulation (HD-tDCS) has recently been developed as a noninvasive brain stimulation approach that increases ...

Ricerca

Medicina

Tissue-simulating Phantoms for Assessing Potential Near-infrared Fluorescence Imaging Applications in Breast Cancer Surgery

Inaccuracies in intraoperative tumor localization and evaluation of surgical margin status result in suboptimal outcome of breast-conserving surgery (BCS). Optical imaging, in particular near-infrared fluorescence (NIRF) imaging, might reduce the frequency of positive surgical margins following BCS by providing the surgeon with a tool for pre- and intraoperative tumor localization in real-time. In the current study, the potential of NIRF-guided BCS is evaluated using tissue-simulating breast phantoms for reasons of standardization and training purposes.
Breast phantoms with optical characteristics comparable to those of normal breast tissue were used to simulate breast conserving surgery. Tumor-simulating inclusions containing the fluorescent dye indocyanine green (ICG) were incorporated in the phantoms at predefined locations and imaged for pre- and intraoperative tumor localization, real-time NIRF-guided tumor resection, NIRF-guided evaluation on the extent of surgery, and postoperative assessment of surgical margins. A customized NIRF camera was used as a clinical prototype for imaging purposes.
Breast phantoms containing tumor-simulating inclusions offer a simple, inexpensive, and versatile tool to simulate and evaluate intraoperative tumor imaging. The gelatinous phantoms have elastic properties similar to human tissue and can be cut using conventional surgical instruments. Moreover, the phantoms contain hemoglobin and intralipid for mimicking absorption and scattering of photons, respectively, creating uniform optical properties similar to human breast tissue. The main drawback of NIRF imaging is the limited penetration depth of photons when propagating through tissue, which hinders (noninvasive) imaging of deep-seated tumors with epi-illumination strategies.

Near-infrared fluorescence (NIRF) imaging may improve therapeutic outcome of breast cancer surgery by enabling intraoperative tumor localization and evaluation of surgical margin status. Using tissue-simulating breast phantoms containing fluorescent tumor-simulating inclusions, potential clinical applications of NIRF imaging in breast cancer patients can be assessed for standardization and training purposes.

Tissue-simulando Phantoms per valutare il potenziale vicino infrarosso applicazioni di imaging di fluorescenza nella chirurgia del cancro al seno

Inaccuracies in intraoperative tumor localization and evaluation of surgical margin status result in suboptimal outcome of breast-conserving surgery ...

Cerenkov Luminescence Imaging of Interscapular Brown Adipose Tissue

Brown adipose tissue (BAT), widely known as a &#8220;good fat&#8221; plays pivotal roles for thermogenesis in mammals. This special tissue is closely related to metabolism and energy expenditure, and its dysfunction is one important contributor for obesity and diabetes. Contrary to previous belief, recent PET/CT imaging studies indicated the BAT depots are still present in human adults. PET imaging clearly shows that BAT has considerably high uptake of 18F-FDG under certain conditions. In this video report, we demonstrate that Cerenkov luminescence imaging (CLI) with 18F-FDG can be used to optically image BAT in small animals. BAT activation is observed after intraperitoneal injection of norepinephrine (NE) and cold treatment, and depression of BAT is induced by long anesthesia. Using multiple-filter Cerenkov luminescence imaging, spectral unmixing and 3D imaging reconstruction are demonstrated. Our results suggest that CLI with 18F-FDG is a practical technique for imaging BAT in small animals, and this technique can be used as a cheap, fast, and alternative imaging tool for BAT research.

In this video report, we show the application of Cerenkov Luminescence Imaging (CLI) for interscapular brown adipose tissue in mice under activated and depressed conditions.

Cerenkov Luminescenza Imaging di interscapolare Brown Tessuto adiposo

Brown adipose tissue (BAT), widely known as a &#8220;good fat&#8221; plays pivotal roles for thermogenesis in mammals. This special tissue is closely ...

Working with Human Tissues for Translational Cancer Research

Medical research for human benefit is greatly impeded by the necessity for human tissues and subjects. However, upon obtaining consent for human specimens, precious samples must be handled with the greatest care in order to ensure integrity of organs, tissues, and cells to the highest degree. Unfortunately, tissue processing by definition requires extraction of tissues from the host, a change which can cause great cellular stress and have major repercussions on subsequent analyses. These stresses could result in the specimen being no longer representative of the site from which it was retrieved. Therefore, a strict protocol must be adhered to while processing these specimens to ensure representativeness. The desired assay(s) must also be taken into consideration in order to ensure that an optimal technique is used for sample processing. Outlined here is a protocol for tissue retrieval, processing and various analyses which may be performed on processed tissue in order to maximize downstream production from limited tissue samples.

Translational cancer research is dependent on extraction of human tissues. Much work has gone into optimizing extraction methods for ex vivo analysis. Here, we describe tissue processing methods allowing for maximal data output from limited samples.

Lavorare con tessuti umani per Translational Cancer Research

Medical research for human benefit is greatly impeded by the necessity for human tissues and subjects. However, upon obtaining consent for human ...

Combined Near-infrared Fluorescent Imaging and Micro-computed Tomography for Directly Visualizing Cerebral Thromboemboli

Direct thrombus imaging visualizes the root cause of thromboembolic infarction. Being able to image thrombus directly allows far better investigation of stroke than relying on indirect measurements, and will be a potent and robust vascular research tool. We use an optical imaging approach that labels thrombi with a molecular imaging thrombus marker&#160;&#8212; a Cy5.5 near-infrared fluorescent (NIRF) probe that is covalently linked to the fibrin strands of the thrombus by the fibrin-crosslinking enzymatic action of activated coagulation factor XIIIa during the process of clot maturation. A micro-computed tomography (microCT)-based approach uses thrombus-seeking gold nanoparticles (AuNPs) functionalized to target the major component of the clot: fibrin. This paper describes a detailed protocol for the combined in vivo microCT and ex vivo NIRF imaging of thromboemboli in a mouse model of embolic stroke. We show that in vivo microCT and fibrin-targeted glycol-chitosan AuNPs (fib-GC-AuNPs) can be used for visualizing both in situ thrombi and cerebral embolic thrombi. We also describe the use of in vivo microCT-based direct thrombus imaging to serially monitor the therapeutic effects of tissue plasminogen activator-mediated thrombolysis. After the last imaging session, we demonstrate by ex vivo NIRF imaging the extent and the distribution of residual thromboemboli in the brain. Finally, we describe quantitative image analyses of microCT and NIRF imaging data. The combined technique of direct thrombus imaging allows two independent methods of thrombus visualization to be compared: the area of thrombus-related fluorescent signal on ex vivo NIRF imaging vs. the volume of hyperdense microCT thrombi in vivo.

This protocol describes the application of combined near-infrared fluorescent (NIRF) imaging and micro-computed tomography (microCT) for visualizing cerebral thromboemboli. This technique allows the quantification of thrombus burden and evolution. The NIRF imaging technique visualizes fluorescently labeled thrombus in excised brain, while the microCT technique visualizes thrombus inside living animals using gold-nanoparticles.

Imaging fluorescente combinata vicino infrarosso e la tomografia micro-computerizzata per Direttamente Visualizzazione cerebrale tromboembolie

Direct thrombus imaging visualizes the root cause of thromboembolic infarction. Being able to image thrombus directly allows far better investigation of ...

3D Ultrasound Imaging: Fast and Cost-effective Morphometry of Musculoskeletal Tissue

The developmental goal of 3D ultrasound imaging (3DUS) is to engineer a modality to perform 3D morphological ultrasound analysis of human muscles. 3DUS images are constructed from calibrated freehand 2D B-mode ultrasound images, which are positioned into a voxel array. Ultrasound (US) imaging allows quantification of muscle size, fascicle length, and angle of pennation. These morphological variables are important determinants of muscle force and length range of force exertion. The presented protocol describes an approach to determine volume and fascicle length of m.&#160;vastus lateralis and m.&#160;gastrocnemius medialis. 3DUS facilitates standardization using 3D anatomical references. This approach provides a fast and cost-effective approach for quantifying 3D morphology in skeletal muscles. In healthcare and sports, information on the morphometry of muscles is very valuable in diagnostics and/or follow-up evaluations after treatment or training.

3D ultrasound imaging (3DUS) allows fast and cost-effective morphometry of musculoskeletal tissues. We present a protocol to measure muscle volume and fascicle length using 3DUS.

Ecografia 3D: veloce e conveniente morfometria del tessuto muscolo-scheletrico

The developmental goal of 3D ultrasound imaging (3DUS) is to engineer a modality to perform 3D morphological ultrasound analysis of human muscles. 3DUS ...

Skeletal Muscle Neurovascular Coupling, Oxidative Capacity, and Microvascular Function with 'One Stop Shop' Near-infrared Spectroscopy

Exercise represents a major hemodynamic stress that demands a highly coordinated neurovascular response in order to match oxygen delivery to metabolic demand. Reactive hyperemia (in response to a brief period of tissue ischemia) is an independent predictor of cardiovascular events and provides important insight into vascular health and vasodilatory capacity. Skeletal muscle oxidative capacity is equally important in health and disease, as it determines the energy supply for myocellular processes. Here, we describe a simple, non-invasive approach using near-infrared spectroscopy to assess each of these major clinical endpoints (reactive hyperemia, neurovascular coupling, and muscle oxidative capacity) during a single clinic or laboratory visit. Unlike Doppler ultrasound, magnetic resonance images/spectroscopy, or invasive catheter-based flow measurements or muscle biopsies, our approach is less operator-dependent, low-cost, and completely non-invasive. Representative data from our lab taken together with summary data from previously published literature illustrate the utility of each of these end-points. Once this technique is mastered, application to clinical populations will provide important mechanistic insight into exercise intolerance and cardiovascular dysfunction.

Skeletal Muscle Neurovascular Coupling, Oxidative Capacity, and Microvascular Function with &#039;One Stop Shop&#039; Near-infrared Spectroscopy

Here, we describe a simple, non-invasive approach using near-infrared spectroscopy to assess reactive hyperemia, neurovascular coupling and skeletal muscle oxidative capacity in a single clinic or laboratory visit.

Muscolo scheletrico Neurovascular accoppiamento, capacità ossidativa e funzione microvascolare con 'One Stop Shop' spettroscopia nel vicino infrarosso

Exercise represents a major hemodynamic stress that demands a highly coordinated neurovascular response in order to match oxygen delivery to metabolic ...

Characterization of Immune Cells in Human Adipose Tissue by Using Flow Cytometry

Infiltration of immune cells in the subcutaneous and visceral adipose tissue (AT) deposits leads to a low-grade inflammation contributing to the development of obesity-associated complications such as type 2 diabetes. To quantitatively and qualitatively investigate the immune cell subsets in human AT deposits, we have developed a flow cytometry approach. The stromal vascular fraction (SVF), containing the immune cells, is isolated from subcutaneous and visceral AT biopsies by collagenase digestion. Adipocytes are removed after centrifugation. The SVF cells are stained for multiple membrane-bound markers selected to differentiate between immune cell subsets and analyzed using flow cytometry. As a result of this approach, pro- and anti-inflammatory macrophage subsets, dendritic cells (DCs), B-cells, CD4+ and CD8+ T-cells, and NK cells can be detected and quantified. This method gives detailed information about immune cells in AT and the amount of each specific subset. Since there are numerous fluorescent antibodies available, our flow cytometry approach can be adjusted to measure various other cellular and intracellular markers of interest.

This article describes a method to analyze immune cell content of adipose tissue by isolation of immune cells from adipose tissue and subsequent analysis using flow cytometry.

Caratterizzazione di cellule immunitarie nel tessuto adiposo umano mediante citometria a flusso

Infiltration of immune cells in the subcutaneous and visceral adipose tissue (AT) deposits leads to a low-grade inflammation contributing to the ...

Nanoscopic Imaging of Human Tissue Sections via Physical and Isotropic Expansion

In modern pathology, optical microscopy plays an important role in disease diagnosis by revealing microscopic structures of clinical specimens. However, the fundamental physical diffraction limit prevents interrogation of nanoscale anatomy and subtle pathological changes when using conventional optical imaging approaches. Here, we describe a simple and inexpensive protocol, called expansion pathology (ExPath), for nanoscale optical imaging of common types of clinical primary tissue specimens, including both fixed-frozen or formalin-fixed paraffin embedded (FFPE) tissue sections. This method circumvents the optical diffraction limit by chemically transforming the tissue samples into tissue-hydrogel hybrid and physically expanding them isotropically across multiple scales in pure water. Due to expansion, previously unresolvable molecules are separated and thus can be observed using a conventional optical microscope.

Nanoscale imaging of clinical tissue samples can improve understanding of disease pathogenesis. Expansion pathology (ExPath) is a version of expansion microscopy (ExM), modified for compatibility with standard clinical tissue samples, to explore the nanoscale configuration of biomolecules using conventional diffraction limited microscopes.

Imaging nanoscopico delle sezioni dei tessuti umani attraverso l'espansione fisica e isotropica

In modern pathology, optical microscopy plays an important role in disease diagnosis by revealing microscopic structures of clinical specimens. However, ...

DIPLOMA Approach for Standardized Pathology Assessment of Distal Pancreatectomy Specimens

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is one of the most lethal malignant cancers. A minority (20%) of PDACs are found in the pancreatic body and tail. Accurate pathology assessment of the pancreatic specimen is essential for providing prognostic information and it may guide further treatment strategies. The recent 8th edition of the American Joint Committee on Cancer/Union for International Cancer Control (AJCC/UICC) staging system for pancreatic tumors has incorporated significant changes to tumor (pT) stage, which is predominantly based on tumor size. This change emphasizes the importance of careful block selection. Owing to the greater prevalence of tumors in the head of the pancreas, efforts are made to standardize the assessment of pancreatoduodenectomy specimens. However, consensus regarding the macroscopic assessment of distal (i.e., left) pancreatectomy specimens is lacking. The DIPLOMA approach includes the standardized measurement of pancreas and other resected organs, inking of relevant surgical margins and anatomical surfaces without removing covering layers of fat, measurement of tumor size (for T-stage), together with assessment of splenic vessel involvement (and other organs if present). All relevant margins are assessed, and relevant blocks are selected to confirm these parameters microscopically. The current protocol describes a standardized approach to the macroscopic assessment of distal pancreatectomy specimens. This approach was developed during several meetings with pathologists and surgeons during the preparation phase for an international multicenter trial (DIPLOMA, ISRCTN44897265), which focuses on radicality of distal pancreatectomy for pancreatic ductal adenocarcinoma. This standardized approach can be instrumental in the design of studies and will uniform reporting on the outcomes of distal pancreatectomy. The described technique is used in the DIPLOMA trial for pancreatic ductal adenocarcinoma but may also be useful for other indications.

The current study highlights a standardized approach to the macroscopic assessment of distal pancreatectomy specimens for pancreatic ductal adenocarcinoma, with special emphasis on the measurement of pancreatic dimensions and those of other organs, inking of margins, measurement of tumor size and proximity to margins, lymph node sampling and block selection.

Approccio DIPLOMA per la valutazione della patologia standardizzata degli spettri disfale Pancreatectomia

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is one of the most lethal malignant cancers. A minority (20%) of PDACs are found in the pancreatic body and tail. ...