We thank Dr&#8217;s. Douglas Pittman and Michael Wyatt for their assistance with cell culture and Dr Wyatt and Ms. Erin Anderson for help in development of the binding assays. We acknowledge Mike Walla and Bill Cotham in the Department of Chemistry and Biochemistry at the University of South Carolina for assistance with Mass Spectrometry, Helga Cohen and Dr. Perry Pellechia for NMR spectrometry. This work was funded by the National Institutes of Health through the research project grant, 5R01CA131368.

1. computazionale identificazione di potenziali piccola molecola Tappatrici gruppi Nota: In linea di principio, una varietà di attracco o farmacofori metodi di ricerca può essere utilizzato per prevedere i potenziali gruppi di tappatura. Lo scopo principale di studi computazionali in REPLACE è quello di identificare piccole molecole che mantengono le caratteristiche e le interazioni degli aminoacidi che vengono sostituiti. <ol><li> Validazione del protocollo LigandFit attracco 14 </li></ol> Nota: In studi precedenti, il metodo di aggancio (LigandFit 15, un modulo della suite programma di modellazione molecolare, Discovery Studio 3.0) è stato validato per garantire che questo algoritmo è sufficiente a riprodurre le modalità vincolanti conosciuti Ncaps e dimostrare che i risultati ottenuti per composti sconosciuti sono predittivi 14. <ol style="margin-left: 40px;"><li> Utilizzando la procedura seguente (1,2 - 1,5), identificare i parametri ottimali per LigandFit come segue: PLP1 itGriglia ERGIA per la generazione di posa, la riduzione al minimo di pose generati e la funzione di scoring PLP1 per l&#39;analisi di pose. </li><li> Per limitare le conformazioni ottenuti e posizionare ligandi appropriato per la formazione del legame covalente del peptide capped, impostare l&#39;azoto e azoto ammidico indolo atomi di Trp217 e Gln254 rispettivamente come filtri di interazione per legami idrogeno. </li><li> Progettazione e ancorare una biblioteca di alternative frammento nel CDK2 / ciclina A recettore (2UUE). Dare priorità potenziali gruppi di tappatura per la sintesi e il sourcing commerciale basata su PLP1 punteggio, le interazioni con i filtri di interazione e complementarità con il CBG. Le varie fasi necessarie per LigandFit aggancio sono i seguenti. </li></ol><ol start="2"><li> Preparazione del recettore sito di legame 14 <ol><li> Importare il CDK2 / ciclina A struttura cristallina (PDB id: 2UUE) in una finestra di visualizzazione nel software. Questa struttura contiene il FLIP precedentemente identificato 5-metil-1-fenil-1H-1, 2,4-triazolo-3-carbossammido (3,5-DCPT) RLIF vincolato alla scanalatura ciclina (Figura 3). </li><li> Eliminare o mantenere in essere i residui RLIF (C-terminale). Quando la sequenza peptidica viene mantenuta, utilizzare il gruppo amminico N-terminale del peptide come un filtro per l&#39;interazione ligando. Dalle &quot;recettore-ligando&quot; strumenti, creare una sfera intorno alla N-3,5-cap DCPT da Mostra / Nascondi sito sfera. La sfera viene creato per definire la regione attiva nel sito di legame che accettano le interazioni ligando-recettore a verificarsi durante il collegamento. </li><li> Definire il sito di legame più lontano dalla &quot;trovare posto come volume di legante selezionato&quot; ed eliminare il legante 3,5-DCPT dalla proteina. Eseguire questo passo per definire il volume di legare nell&#39;ambito creato. </li><li> Impostare i azoto e di azoto ammide indolo atomi dei residui Trp217 e Gln254 come filtri di interazione per legami idrogeno. Impostare i filtri di interazione in modo che solo le pose che inteRACT con gli atomi di residui set sarà filtrata durante la procedura di attracco quindi preservare interazioni importanti pose ormeggiate. </li></ol></li><li> Preparazione di ligandi 14 <ol><li> Progettare una biblioteca di 100 potenziali gruppi tappatura sulla base di criteri tra cui peso molecolare inferiore a 500, la presenza di un gruppo carbossilato per legatura con il peptide troncato e inserimento di opportuni gruppi idrofobici (gruppo fenile sostituito) per van der Waals nella tasca secondaria mostrato nella Tabella 1. </li><li> Selezionare anelli eterociclici per mimare interazioni di legame peptidico idrogeno con Trp217 e sostituenti inclusi per sostituire le interazioni ione-accoppiamento delle catene laterali di base del HAKRRLIF. Ancorare la ligandi come rispettive molecole aldeide in modo che l&#39;ossigeno carbonilico può interagire con l&#39;atomo di azoto ammidico di Gln254 simile a scheletro peptidico nel peptide genitore (Tabella 1). </li><li> Prima di docre, ridurre al minimo leganti progettate per una conformazione a bassa energia e di preparare in uno stato di ionizzazione appropriato utilizzando il protocollo &quot;Preparare ligandi&quot;. Disegnare ed esportare tali limiti potenziali N nel formato di file .sdf in ChemDraw per un foglio prima di essere importato nel software. Nota: Preparare protocollo ligandi viene utilizzato per ridurre al minimo tutti i ligandi per essere agganciato ai loro stati energetici più bassi e le cariche di ionizzazione sono stati applicati agli atomi applicabili. I parametri di default vengono utilizzati per questo passaggio. </li></ol></li><li> Docking dei leganti nella ciclina A Groove 14 <ol><li> Selezionare la routine LigandFit da recettore-ligando insieme protocollo interazioni del software. Utilizzare il recettore e leganti preparati come input per questo protocollo. </li><li> Per queste corse selezionare PLP1 come rete energetica, precisano che pone sia energia ridotto al minimo e che il numero di pose generati 10. Lasciare tutti gli altri parametri ai valori di default. Nota: è LigandFitun metodo di aggancio che può identificare e generare pose di alta complementarità e potenziale affinità con il sito attivo di una proteina mediante un filtro di confronto figura basata che si combina con un Monte Carlo algoritmo di ricerca conformazionale. La griglia di energia utilizzata dal programma di espansione è il campo di forza per generare interazioni ligando-recettore e potenziali pose. PLP1 è potenziale lineare a tratti che privilegia in particolare le interazioni di legame idrogeno e dove viene assegnato il tipo di atomo di PLP per ogni non-idrogeno ligando atomo o non idrogeno recettore atomo. </li></ol></li><li> Analisi dei risultati <ol><li> Nel primo caso, il display pone nel programma visualizzatore e poi ordinare per i valori della partitura PLP1 discendente. Utilizzare funzioni di punteggio come PLP1 stimare l&#39;affinità di legame di un ligando ancorata sulla base di un legante candidato posa geometria e interazione non covalente con la struttura del recettore bersaglio. Nota: Qui, la funzione PLP1 punteggio è risultato give i migliori risultati in quanto include una stima di legami idrogeno. </li><li> Analizzare visivamente il primo 25% delle pose segnati per 1) sovrapponibilità con il gruppo di tappatura noto (con uno scarto quadratico medio relativo RMSD () valore inferiore a 2 A), 2) soddisfatta filtri di interazione e 3) la complementarità visivo con la scanalatura ciclina . E &#39;accettato in quanto un corretto ormeggiata posa (a fronte di una struttura sperimentale) ha un valore RMSD di &lt;2 Å. </li><li> Esaminate pose per complementarietà visivo, che è definita come avente riempimento efficiente della tasca di legame in un modo che è coerente con note relazioni struttura-attività. Interazione filtri sono impostati per includere restrizioni atomo che richiedono contatti intermolecolari notoriamente critica per il legame e / o sono necessari per posizionare il gruppo di potenziale capping nella geometria corretta per la formazione del legame ammidico. Tre esempi di pose attraccate di potenziali gruppi N-capping facendo legami idrogeno con interaction filtri sono mostrati in Figura 4. </li></ol></li></ol> 2. Sintesi e caratterizzazione di potenziali N -capping Gruppi <ol start="1"><li> Sintesi dei gruppi N-capping. </li><li> Per sintesi, utilizzare tutte commerciali a partire materiali, solventi e reagenti come ottenuti. Synthesize potenziali gruppi N-tappatura convenzionale chimica organica sintetica (Figura 5 12,13 per un esempio). </li><li> Eseguire cromatografia su strato sottile (TLC) su gel di silice per reazioni monitoraggio. <ol><li> Sciogliere il materiale di partenza e la miscela di reazione (1 mg) nella fase mobile e posto sulla piastra TLC utilizzando tubi capillari. </li><li> Posizionare la piastra TLC in alla camera contenente fase mobile (acetato di etile ed esano in rapporto 35:65). Una volta che la fase mobile raggiunge il 90% della piastra TLC, rimuovere e aria asciugare la piastra. </li><li> Utilizzare la luce UV per rilevare le miscele materiale di partenza e di reazione come macchie visibili. Calcolare il R f di tutti i punti (rapporto della distanza percorsa dal punto e la fase mobile). Nota: La reazione è completa quando non vi è alcun punto visto alla R f del materiale di partenza. </li></ol></li><li> Dopo il completamento della reazione lavorare la miscela di reazione introducendo in un imbuto separatore e lavaggio con acido acquoso o soluzione di base come appropriato. Raccogliere il solvente organico, evaporare in evaporatore rotante e seccare il prodotto grezzo ottenuto sotto vuoto. </li><li> Sciogliere 500 mg di prodotto grezzo in 3-5 ml di solvente adeguato e aggiungere ad un 1 g di silice o RP18 samplet e secca sotto aria. Posizionare il samplet contenente il prodotto grezzo in / RP SNAP cartucce Flash silice e purificare il materiale grezzo mediante cromatografia automatizzata flash ad alte prestazioni (secondo il protocollo del produttore) che impiega un g colonna SNAP 100 con una corsa di pendenza a partire dal 6% acetato di etile: 94 % esano al 50% di acetato di etile e 50% esani oltre15 volumi di colonna. </li><li> Essiccare il prodotto purificato raccolto in solvente dalla cromatografia flash utilizzando un evaporatore rotativo per evaporazione tutto il solvente a secchezza ed asciugare ulteriormente il prodotto sotto vuoto per eliminare tutti i solventi residui. Eseguire caratterizzazione del prodotto purificato mediante NMR, MS e HPLC analitica. <ol><li> Per 1 H NMR e 13 C NMR, pesare circa 10 mg del campione purificato, scioglierlo in un appropriato solvente deuterato, e trasferire il contenuto di un tubo NMR secco per registrare gli spettri NMR 2,14. </li><li> Registrare il 1H NMR e 13 C NMR con un campo di alta NMR Spectrometer (minimo 300 MHz). Acquisire spettri di massa utilizzando un QTOF (Tandem quadrupla-1 tempo di spettrometro di massa di volo), ionizzazione electrospray (ESI) o di un VG 70S (doppio fuoco spettrometro di massa a settore magnetico, EI) 2,14. </li><li> Analizzare la purezza dei prodotti mediante HPLC con un rivelatore a serie di diodi e dotateun C18 (2) 100 A, 250 x 4.6 mm, 5 micron colonna per l&#39;analisi. Utilizzare una corsa pendenza a partire dal 100% di acqua (0,1% di acido trifluoroacetico) al 60% di acetonitrile (0,1% di acido trifluoroacetico) su 30 minuti e tenere premuto il gradiente per 4 min. Estrarre i cromatogrammi a 226 e 254 nm 2,14. Nota: purezze analitici di composti sono stati valutati&gt; 95%. </li></ol></li></ol> 3. Sintesi in fase solida per la generazione di lanci 2 <ol start="1"><li> Sintesi di lanci N-capped <ol><li> Montare composti peptidici N-capped attraverso metodi di sintesi in fase solida standard usando la seguente procedura. <ol><li> Attivare 5 equivalenti di aminoacidi C-terminale (Fmoc-Phe) in 4,4 equivalenti di O -Benzotriazole- N, N, N &#39;, N&#39; tetrametil-uronium-esafluoro-fosfato (HBTU, 221,93 mg) in 2 ml di DMF per 5 min. Caricare la miscela HBTU Fmoc-Phe sulla resina di pattinaggio con 6 equivalenti di diisopropylethyl ammina (DIPEA, 103.13mg) per 1 ora a RT. </li><li> Rimuovere il gruppo protettore Fmoc dal residuo C-terminale utilizzando 20% piperidina in 3 ml di DMF per 10 min. Coppia successive amminoacidi (ad esempio, Fmoc-Ile, Fmoc-Leu, Fmoc-Arg-PMC) passo passo. Ad ogni passo, coppia 5 equiv del successivo amminoacido usando 6 equivalenti di DIPEA (103.13 mg) e 4,4 equivalenti di HBTU (221,93 mg) in 2 ml di DMF per 1 ora a RT. </li><li> Applicare cicli di lavaggio (5 x 10 ml di DMF + 5 x 10 ml di DCM) dopo accoppiamento amminoacidi Fmoc e deprotezione fasi sopra descritte. Dopo il montaggio peptide, gruppi che utilizzano 6 equivalenti di DIPEA (103.13 mg) e 4,4 equivalenti di HBTU (221,93 mg) Coppia N-tappatura in 2 ml di DMF per 1 ora a RT. </li><li> Al termine del montaggio peptide, trattare la miscela di reazione con 2 ml della miscela fenditura (90: 5: 5 TFA / H 2 O / TIPS) O / N per rimuovere catena laterale gruppi protettori, e cleave Capovolge dalla resina. Triturare il prodotto risultante con etere etilico freddo per precipitare e iof concentrato necessario in un evaporatore rotante. </li></ol></li></ol></li><li> Sintesi di lanci N-capped-C-capped <ol><li> Pesare e sciogliere il peptide Arg-Leu N-terminale livellata e protetta (16,1 mg, 0,02 mmol) in diclorometano e aggiungere [4- (3-clorofenossi) piridin-2-il] methanamine (C-cap) insieme a O - benzotriazole- N, N, N &#39;, N&#39; esafluorofosfato -tetramethyluronium (HBTU; 16,7 mg, 0,02 mmol) e N, N -diisopropylethylamine (DIPEA; 6,5 mg, 0,02 mmol). </li><li> Mescolare e controllare la reazione a temperatura ambiente fino TLC / HPLC indica il consumo totale di materiale di partenza. Dopo il completamento della reazione, concentrare la miscela di reazione grezza usando un evaporatore rotante e poi partizione tra acetato di etile ed acqua. </li><li> Separare il acquosa e strato organico; lavare la fase organica con 1 N NaOH, 1 N HCl, e salamoia. Essiccare lo strato organico con circa 1 g di solfato di sodio e concentrare il prodotto in evaporatore rotante. Finally trattare il prodotto O / N con la miscela di scissione (95: 2,5: 2,5 acido trifluoroacetico / H 2 O / TIPS) per deprotezione. </li><li> Triturare il prodotto risultante con fredda dietiletere ed eventualmente il concentrato in evaporatore rotante a completo essiccamento per eliminare tutto il solvente. Ulteriori essiccare il prodotto sotto vuoto per eliminare tutti i solventi residui. </li></ol></li><li> Purificazione e caratterizzazione di lanci <ol><li> Purificare ribalta greggio con semi metodi HPLC inversa in fase di preparazione. Lyophilize i lanci purificati e caratterizzare la loro massa molecolare mediante spettrometria di massa 2,14. </li><li> Determinare la purezza dei flips mediante HPLC con un rivelatore a serie di diodi e dotato di C18 (2) 100 A, 250 x 4.6 mm, 5 micron colonna. Utilizzare un metodo del gradiente a partire dal 95% H 2 O (0,1% di acido trifluoroacetico) / 5% acetonitrile (0,1% di acido trifluoroacetico) al 35% H 2 O (0,1% di acido trifluoroacetico) / 65% acetonitrile (0,1% trifluoroaceL&#39;acido tic) su 30 minuti e tenere premuto il gradiente per 4 min. Estratto cromatogrammi a 226 e 254 nm. </li></ol></li></ol> 4. fluorescenza polarizzata Binding Assay per la determinazione del legame competitivo 2,14 <ol start="1"><li> Eseguire il test in nero 384 pozzetti (138 ml) lastre con la seguente procedura. </li><li> Diluire i campioni, peptidi traccianti (4 Nm), e complessi chinasi (CDK2 / ciclina A - 18 mcg / ml, CDK4 / ciclina D - 37 mg / ml) alle concentrazioni necessarie a tampone (25 mM HEPES pH 7, 10 mM NaCl, 0,01% Nonidet P-40, 1 mM ditiotreitolo (DTT). </li><li> In ciascun pozzetto della piastra da 384 pozzetti, aggiungere: 5 ml di CDK4D1 o CDK2CA (0,3 mcg / ben purificata complesso ricombinante umano chinasi), soluzione del composto 5 ml, 5 ml di 30 nm tracciante peptide (fluoresceinyl-Ahx-Pro-Val -Lys-Arg-Arg-Leu- (3ClPhe) -Gly o fluoresceinyl-Ahx-Pro-Val-Lys-Arg-Arg-Leu-Phe-Gly tracciante peptide). Utilizzare 5 ml di ogni DMSO (6%), buffer, tracciante e 5 microlitri DMSO (6%), complesso chinasi, come tracciante pozzetti di controllo </li><li> Dopo l&#39;aggiunta dei tutti i componenti, centrifugare la piastra a 500 rpm per 1 min (41.16 xg) a temperatura ambiente e poi incubare la piastra con agitazione per 45 minuti a temperatura ambiente. Utilizzo di un lettore di piastre multimodale e rilevatore dotato di 485 nm / 535 nm di eccitazione / filtri di emissione e uno specchio dicroico leggere l&#39;intensità fluoresceina di ogni pozzetto della piastra. </li><li> Calcolare la polarizzazione media relativa (mp) per tutti i campioni di prova con l&#39;equazione che mostra sotto. Determinare valori di IC 50 di regressione logaritmica, correlando relativi mps e testare le concentrazioni. </li></ol><img alt="Equazione 1" src="/files/ftp_upload/52441/52441eq1.jpg" />

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The authors declare that they have no competing financial interests.

Targeting protein-protein interactions (PPI) in drug discovery is highly challenging as these typically involve a large shallow contact interface comprised of numerous and diffuse contacts19. Furthermore, peptidic compounds which inhibit PPI&#8217;s that are amenable to drug discovery are problematic due to their higher molecular mass, metabolic instability and poor bioavailability20. Current strategies that have been applied for the development of PPI inhibitors include design of proteomimetics and...

In questo articolo, un caso di studio di applicare il REPLACE (sostituzione con alternative ligando parziali utilizzando computazionale arricchimento) strategia per convertire inibitori peptidici di interazioni proteina-proteina in più molecole farmacologicamente rilevanti è descritta 1-3. Mentre PPI rappresentano una ricca ma poco sfruttato fonte di potenziali bersagli farmacologici, metodologie esistenti sono largamente insufficienti a rendere questi ampiamente accessibile. Le attuali strategie, tra cui frammento basato design a 4, high-throughput di screening 5 e peptidi pinzati 6 sono previsti anticipi, ma questi sono in molti casi inefficace. Di conseguenza, sono necessari ulteriori progressi e approcci più efficienti. SOSTITUIRE è stato pienamente convalidato per lo sviluppo di inibitori della chinasi che hanno migliorato le proprietà farmaco-simili e hanno il potenziale per un ulteriore sviluppo come terapie antitumorali. Questa strategia è esemplificato nello sviluppo di inibitori non-ATP della cellaCDK ciclabili e coinvolge i seguenti: 1) ottenere informazioni strutturali 3D sulle interazioni di HAKRRLIF / RRLIF con la ciclina solco vincolante; 2) determinare i fattori determinanti vincolanti per l&#39;interazione peptide; 3) troncamento del peptide N-terminale contenente uno o più determinanti vincolanti; 4) identificazione di potenziali computazionale piccole molecole alternative (alternative ligando parziali, PLA) per la parte troncata del peptide e che mantengono interazioni chiave del peptide controllante; 5) sintesi o approvvigionamento commerciale di PLA previsto di impegnare avidamente con il sito sub precedentemente occupato da residuo peptide soppresso (s); 6) sintesi di sfoglia legatura dei migliori PLA al peptide troncato utilizzando sintesi in fase solida; 7) prove di lanci in un in vitro di legame o saggio funzionale (polarizzazione di fluorescenza nel contesto / ciclina CDK), seguita da un&#39;ulteriore caratterizzazione in un test di vitalità cellulare. Una rappresentazione schematica di REPLACE strategy è mostrato in Figura 1. In questo articolo, iterazioni della strategia REPLACE sono discussi e l&#39;applicazione di CDK2 / ciclina A descritto in dettaglio. CDK si crede di essere, direttamente o indirettamente deregolato nella maggior parte dei tumori e sono quindi considerati bersagli tumorali appropriata droga 7. CDK richiede associazione con cicline per la piena attivazione e successivamente fosforilare proteine ​​chiave coinvolte nella regolazione del ciclo cellulare 8. I due principali gruppi di CDK sono gli isotipi che controllano i punti di controllo del ciclo cellulare [G1 / S (CDK4 / ciclina D, CDK6 / ciclina D e CDK4 / ciclina E), fase S (CDK2 / ciclina A) e G2 / M (CDK1 / ciclina B)] e le autorità di regolamentazione di RNA polimerasi, attraverso la fosforilazione (CDK7 / ciclina H, CDK8 / ciclina C, CDK9 / ciclina T). Un passaggio chiave nella progressione fase S si verifica quando il fattore di trascrizione E2F1 forma un complesso con la proteina DP, che poi si lega al DNA e inizia la trascrizione del gene. CDK2 / ciclina A è necessario per neutralizzare E2F1 trascrizionaleattività attraverso la fosforilazione determinando così liberare del complesso E2F1-DP e la sua successiva degradazione. Inibizione di CDK2 / ciclina A si ritiene di mantenere E2F1 nel suo stato legato DNA che porta all&#39;attivazione persistente. Del conseguente livello di E2F-1 supererà la soglia necessaria per indurre l&#39;apoptosi p53 indipendente suggerendo quindi una strategia terapeutica. A causa di p53 deregolamentato e percorsi pRb, alti livelli di E2F-1 spesso si verificano nelle cellule tumorali e l&#39;inibizione della CDK2 / ciclina A dovrebbe portare all&#39;apoptosi selettivi nei tumori e può essere considerato come un obiettivo cancro convalidato 7. Clinicamente inibitori CDK indagati bersaglio il sito altamente conservata ATP legame che porta ad attraversare reattività tra le proteine ​​chinasi maggiore di 500 nel kinome umano e potenzialmente dando luogo a effetti collaterali e la tossicità 9. Un approccio alternativo è non-ATP inibizione competitiva di mira substrato reclutamento attraverso il CBGpresente su ciclina subunità normativo positivo, e che è quindi distinto e distante dal sito ATP 10,11 vincolante. La CBG è principalmente un solco idrofobico presente in ciclina A, ciclina D e ciclina E e ha dimostrato di riconoscere una sequenza di consenso trovata in substrati e soppressori tumorali. Come un peptide isolato, il legame ciclina motivo (CBM) si lega al CBG e ha dimostrato di inibire l&#39;attività chinasica del CDK ciclo cellulare. Il CBM è stato ottimizzato per un octapeptide (HAKRRLIF, CDK2 / ciclina A IC50 0,07 ± 0,02 micron, CDK4 / ciclina D, IC50 0,88 ± 0,34 micron) e inoltre troncato a un pentapeptide che rappresenta un buon compromesso tra peso molecolare per droga somiglianza e potenza (RRLIF, CDK2 / ciclina A IC50 1,01 ± 0,17 micron, CDK4 / ciclina D, IC50 25.12 ± 2.97 micron) 12,13. I CBGs costituiti da un grande primario e più piccola tasca idrofobica secondario che sono collegate da un ACIDIc regione (include Glu220, Glu224 e Asp283). Le principali determinanti vincolanti HAKRRLIF includono l&#39;interazione dei Ala2 con la tasca idrofoba secondaria, accoppiamento ionico e legami di idrogeno Lys3, Arg 4 e Arg5 con la regione acida e un alto grado di complementarità di Leu6 e Phe8 con il sito primario lipofilo. Inoltre, numerosi legami idrogeno sono fornite dal scheletro peptidico mentre Ile7 agisce come residuo spaziatore consente un contatto ottimale con la tasca principale. La modalità di rilegatura e le interazioni di HAKRRLIF con CBG è mostrato nella Figura 2. Targeting l&#39;interazione proteina-proteina CBM / CBG inibisce l&#39;attività chinasi CDK2 / ciclina A, CDK2 / ciclina E e CDK4 / ciclina D e questo dovrebbe far scattare E2F1 apoptosi mediata delle cellule tumorali mentre non interessano le cellule normali 7. Anche se CBM derivati ​​peptidi sono efficaci inibitori di CDK ciclo cellulare, è improbabile che essi saranno utili come farmaci a causa del loro metabolismoinstabilità e mancanza generale di permeabilità cellulare. A tal fine, abbiamo applicato la strategia REPLACE al fine di convertire questi inibitori peptidici potenti in più composti farmaco-simili per l&#39;ulteriore sviluppo di terapie antitumorali sfruttando E2F1 liberalizzato attraverso CDK2 / ciclina A inibizione. Il protocollo seguente riassume lavoro che è stato completato l&#39;applicazione della REPLACE alla scanalatura ciclina. Nel primo caso, sono state identificate sostituzioni gruppo capping-farmaci per il tetrapeptide N-terminale di HAKRRLIF. Inoltre, i miglioramenti in questi gruppi sono stati esaminati in un ulteriore studio di validazione per REPLACE. Risultati rappresentativi di questi studi sono anche presentati.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Computational Chemistry</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accelyrs Discovery studio 3.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dell Optiplex Workstations</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthetic Organic Chemistry</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica gel (GF-254 plates) for TLC, Biotage (Uppsala, Sweden) for flash chromatography, Waters Alliance 2695 HPLC with a 2996 diode-array detector and equipped with a C18 (2) 100 A, 250 x 4.6mm, 5&#956;m column (Phenomenox Luna) for purity determination, 1H NMR and 13C NMR spectra were recorded with a Varian Mercury 300 and 400 Spectrometer, respectively. Mass spectra were measured with a Micromass QTOF (Tandem quadruple-1 time of flight mass spectrometer), electrospray ionization (ESI) and VG 70S (Double-focusing magnetic sector mass spectrometer, EI).</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flourescence Polarization Assay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384 micro well plates, ,&#160; Micro pipets,&#160;</td>
			<td>Grenier Bio-one</td>
			<td>110256602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CDK4D1 and CDK2CA (well purified recombinant human kinase complex)</td>
			<td>BPS Bio Sciences</td>
			<td>40094(CDK4/Cyclin D), 41101(CDK2/Cyclin A)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>assay buffer (25 nM HEPES pH 7, 10 mM NaCl, 0.01% Nonidet P-40, 1mM dithiothretiol (DTT),</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 nM HEPES</td>
			<td>CALBIOCHEM</td>
			<td>375368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>127838</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P-40</td>
			<td>US Biological</td>
			<td>N3500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-70c freezer</td>
			<td>Revco (Ultima II)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTX880 multimode detector&#160; fitted with 485 nm/535 nm excitation/emission filters and a dichroic mirror suitable for fluorescein</td>
			<td>Beckman Coulter, Brea, CA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plates, &#160;&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frozen stocks of U2OS (osteosarcoma) and DU145 (prostate cancer) cell lines</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NU serum, DMEM media, trypsin, PEN/STRIP,&#160; MTT reagent,</td>
			<td colspan="2">Fisher, Life technology, Alfa Aesar</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Heamocytometer</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-70c freezer</td>
			<td>Revco (Ultima II)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Thermo electron corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf&#160;</td>
			<td>5804 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerator 4-8C</td>
			<td>Isotemp Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTX880 multimode detector fitted with 595nm filter.</td>
			<td>Beckman Coulter, Brea, CA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development of inhibitors of protein-protein interactions through replace: application to the design and development non-atp competitive cdk inhibitors

REPLACE è una strategia unica sviluppata per indirizzare più efficacemente le interazioni proteina-proteina (PPI). Ha lo scopo di ampliare lo spazio disponibile altro obiettivo fornendo una migliore metodologia per l&#39;identificazione di inibitori di tali siti di legame e che rappresentano la maggior parte dei potenziali bersagli farmacologici. L&#39;obiettivo principale di questo lavoro è quello di fornire una visione metodologica di utilizzo e applicazione della strategia REPLACE che prevede approcci di chimica computazionale e sintetiche. Replace è esemplificata attraverso la sua applicazione allo sviluppo di non-ATP chinasi ciclina dipendenti competitivo (CDK) inibitori come terapie antitumorali. CDK sono spesso deregolamentati nel cancro e, quindi, sono considerati come obiettivi importanti per lo sviluppo di farmaci. Inibizione di CDK2 / ciclina A in fase S è stato segnalato a promuovere l&#39;apoptosi selettiva delle cellule tumorali in modo indipendente p53 attraverso la via E2F1. Targeting l&#39;interazione proteina-proteina in bindin ciclinag scanalatura (CBG) è un approccio che permetterà l&#39;inibizione specifica del ciclo cellulare nel corso CDK trascrizionali. La CBG è riconosciuto da una sequenza consenso derivato da substrati CDK e proteine ​​oncosoppressori definito il legame motivo (CBM) ciclina. Il CBM è stato precedentemente ottimizzato per un octapeptide da p21Waf (HAKRRIF) e poi ulteriormente troncato ad un pentapeptide ritegno sufficiente attività (RRLIF). Peptidi, in generale, non sono delle cellule permeabili, sono metabolicamente instabile e quindi il REPLACE (sostituzione con Parziale Ligand Alternative attraverso computazionale arricchimento) strategia è stata applicata al fine di generare inibitori più farmaco-simili. La strategia inizia con la progettazione di Frammento legatura peptidi inibitori (flip), che inibiscono selettivamente ciclo cellulare complessi CDK / ciclina. Capovolge sono stati generati da iterativamente sostituendo residui di HAKRRLIF / RRLIF con frammento come piccole molecole (gruppi capping), a partire dalla N-terminale (Ncaps), seguita da sostituzione inil C-terminale. Questi composti sono punti di partenza per la generazione di non-ATP inibitori CDK competitivi come terapie anti-tumorali.

Le interazioni di HAKRRLIF con scanalatura ciclina sono mostrati in Figura 2. I residui peptidici che rappresentano le principali determinanti di legame includono Ala2, Arg4, Leu6 e Phe8 con altri residui fornendo contributi piccole 12,13,18. In questo caso di studio la strategia REPLACE è stato utilizzato al fine di trovare alternative frammento di residui nel tetrapeptide N-terminale HAKRRLIF, imitando soprattutto le interazioni di Ala2 e Arg4. Una libreria di potenziali f...

Watch this Scientific Journal Video about Development of Inhibitors of Protein-protein Interactions through REPLACE: Application to the Design and Development Non-ATP Competitive CDK Inhibitors at JoV

Development of Inhibitors of Protein-protein Interactions through REPLACE: Application to the Design and Development Non-ATP Competitive CDK Inhibitors

We describe implementation of the REPLACE strategy for targeting protein-protein interactions. REPLACE is an iterative strategy involving synthetic and computational approaches for the conversion of optimized peptidic inhibitors into drug like molecules.

Sviluppo di inibitori di interazioni proteina-proteina attraverso REPLACE: Applicazione alla progettazione e allo sviluppo non ATP inibitori CDK competitivo

REPLACE is a unique strategy developed to more effectively target protein-protein interactions (PPIs). It aims to expand available drug target space by ...

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Research

JoVE Journal

Biology

11.2K Views.  University of South Carolina. We describe implementation of the REPLACE strategy for targeting protein-protein interactions. REPLACE is an iterative strategy involving synthetic and computational approaches for the conversion of optimized peptidic inhibitors into drug like molecules.

Video: Development of Inhibitors of Protein-protein Interactions through REPLACE: Application to the Design and Development Non-ATP Competitive CDK Inhibitors

The use of SC1 (Pluripotin) to Support mESC Self-renewal in the Absence of LIF

Mouse embryonic stem (ES) cells are conventionally cultured with Leukemia Inhibitory Factor (LIF) to maintain self-renewal.1 However, LIF is expensive and activation of the LIF/JAK/STAT3 pathway is not absolutely required to maintain the self-renewal state.2 The SC1 small molecule may be an economical alternative to LIF. SC1 functions through dual inhibition of Ras-GAP and ERK1.3 Illustration of its mechanism of action makes it a useful tool to study the fundamental molecular mechanism of self-renewal. Here we demonstrate the procedure for culturing mouse ES cells in the presence of SC1 and show that they are able to maintain self-renewal in the absence of LIF. Cells cultured with SC1 showed similar morphology compared to cells maintained with LIF. Both exhibited typical mouse ES morphology after five passages. Expression of typical pluripotency markers (Oct4, Sox2, Nanog, and SSEA1) was observed after five passages in the presence of SC1. Furthermore, SC1 caused no overt toxicity on mouse ES cells.

The use of SC1 Pluripotin to Support mESC Self-renewal in the Absence of LIF

SC1 functions through dual inhibition of Ras- GAP and ERK1. We tested the function of SC1 in supporting mouse ES cell self-renewal in the absence of LIF and showed that SC1 is able to maintain self-renewal of mouse ES cell cultures.

L&#39;uso di SC1 (Pluripotin) a supporto Mesc auto-rinnovamento in assenza di LIF

Mouse embryonic stem (ES) cells are conventionally cultured with Leukemia Inhibitory Factor (LIF) to maintain self-renewal.1 However, LIF is expensive and ...

Ricerca

Biologia

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, preventing their identification and analysis through traditional biochemical methods such as co-immunoprecipitation. In this regard, the genetically encodable fluorescent proteins (GFP, RFP, etc.) and their associated overlapping fluorescence spectrum have revolutionized our ability to monitor weak interactions in vivo using F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)1-3. Here, we detail our use of a FRET-based proximity assay for monitoring receptor-receptor interactions on the endothelial cell surface.

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

This protocol describes how to image protein-protein interactions using a FRET-based proximity assay.

Imaging interazioni proteina-proteina In vivo</em

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, ...

Blastomere Explants to Test for Cell Fate Commitment During Embryonic Development

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal which tissues descend from each cell of the embryo. Although fate maps are very useful for identifying the precursors of an organ and for elucidating the developmental path by which the descendant cells populate that organ in the normal embryo, they do not illustrate the full developmental potential of a precursor cell or identify the mechanisms by which its fate is determined. To test for cell fate commitment, one compares a cell's normal repertoire of descendants in the intact embryo (the fate map) with those expressed after an experimental manipulation. Is the cell's fate fixed (committed) regardless of the surrounding cellular environment, or is it influenced by external factors provided by its neighbors? Using the comprehensive fate maps of the Xenopus embryo, we describe how to identify, isolate and culture single cleavage stage precursors, called blastomeres. This approach allows one to assess whether these early cells are committed to the fate they acquire in their normal environment in the intact embryo, require interactions with their neighboring cells, or can be influenced to express alternate fates if exposed to other types of signals.

The fate of an individual embryonic cell can be influenced by inherited molecules and/or by signals from neighboring cells. Utilizing fate maps of the cleavage stage Xenopus embryo, single blastomeres can be identified for culture in isolation to assess the contributions of inherited molecules versus cell-cell interactions.

Espianti blastomero al test per l&#39;Impegno cellulare Fate durante lo sviluppo embrionale

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal  which tissues descend from each cell of the embryo.  Although fate maps ...

Probing High-density Functional Protein Microarrays to Detect Protein-protein Interactions

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an affinity purified yeast kinase fusion protein containing a V5-epitope tag for read-out. Purified kinase is obtained through culture of a yeast strain optimized for high copy protein production harboring a plasmid containing a Kinase-V5 fusion construct under a GAL inducible promoter. The yeast is grown in restrictive media with a neutral carbon source for 6 hr followed by induction with 2% galactose. Next, the culture is harvested and kinase is purified using standard affinity chromatographic techniques to obtain a highly purified protein kinase for use in the assay. The purified kinase is diluted with kinase buffer to an appropriate range for the assay and the protein microarrays are blocked prior to hybridization with the protein microarray. After the hybridization, the arrays are probed with monoclonal V5 antibody to identify proteins bound by the kinase-V5 protein. Finally, the arrays are scanned using a standard microarray scanner, and data is extracted for downstream informatics analysis1,2 to determine a high confidence set of protein interactions for downstream validation in vivo.

Using protein microarrays containing nearly the entire S. cerevisiae proteome is probed for rapid unbiased interrogation of thousands of protein-protein interactions in parallel. This method can be utilized for protein-small molecule, posttranslational modification, and other assays in high-throughput.

Probing ad alta densità di microarrays della proteina funzionali per rilevare le interazioni proteina-proteina

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an ...

Efficient iPS Cell Generation from Blood Using Episomes and HDAC Inhibitors

This manuscript illustrates a protocol for efficiently creating integration-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) from peripheral blood using episomal plasmids and histone deacetylase (HDAC) inhibitors. The advantages of this approach include: (1) the use of a minimal amount of peripheral blood as a source material; (2) nonintegrating reprogramming vectors; (3) a cost effective method for generating vector free iPSCs; (4) a single transfection; and (5) the use of small molecules to facilitate epigenetic reprogramming. Briefly, peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) are isolated from routine phlebotomy samples and then cultured in defined growth factors to yield a highly proliferative erythrocyte progenitor cell population that is remarkably amenable to reprogramming. Nonintegrating, nontransmissible episomal plasmids expressing OCT4, SOX2, KLF4, MYCL, LIN28A, and a p53 short hairpin (sh)RNA are introduced into the derived erythroblasts via a single nucleofection. Cotransfection of an episome that expresses enhanced green fluorescent protein (eGFP) allows for easy identification of transfected cells. A separate replication-deficient plasmid expressing Epstein-Barr nuclear antigen 1 (EBNA1) is also added to the reaction mixture for increased expression of episomal proteins. Transfected cells are then plated onto a layer of irradiated mouse embryonic fibroblasts (iMEFs) for continued reprogramming. As soon as iPSC-like colonies appear at about twelve days after nucleofection, HDAC inhibitors are added to the medium to facilitate epigenetic remodeling. We have found that the inclusion of HDAC inhibitors routinely increases the generation of fully reprogrammed iPSC colonies by 2 fold. Once iPSC colonies exhibit typical human embryonic stem cell (hESC) morphology, they are gently transferred to individual iMEF-coated tissue culture plates for continued growth and expansion.

Here we describe a protocol for generating human induced pluripotent stem cells from peripheral blood using an episome based reprogramming strategy and histone deacetylase inhibitors.

Generazione efficiente delle cellule iPS da Blood Utilizzando episomi e HDAC inibitori

This manuscript illustrates a protocol for efficiently creating integration-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) from peripheral blood using ...

Design and Development of Aptamer&#8211;Gold Nanoparticle Based Colorimetric Assays for In-the-field Applications

The design and development of an aptamer&#8211;gold nanoparticle (AuNP) colorimetric assay for the detection of small molecules for in-the-field applications was examined. Target selective AuNP based color assays have been developed in controlled proof-of-concept laboratory settings. However, these schemes have not been exerted to a point of failure to determine their practical use beyond laboratory settings. This work describes a generic approach to design, develop, and troubleshoot an aptamer-AuNP colorimetric assay for small molecule analytes and using the assay for in-the-field settings. The assay is advantageous because adsorbed aptamers passivate the nanoparticle surfaces and provide a means to reduce and eliminate false positive responses to non-target analytes. Transitioning this system to practical uses required defining not only the shelf-life of the aptamer-AuNP assay, but establishing methods and procedures for extending the long-term storage capabilities. Also, one of the recognized concerns with colorimetric readout is the burden placed on analysts to accurately identify often subtle changes in color. To lessen the responsibility on analysts in the field, a color analysis protocol was designed to perform the color identification duties without the need for performing this task on laboratory grade equipment. The method for creating and testing the data analysis protocol is described. However to understand and influence the design of adsorbed aptamer assays, the interactions associated with the aptamer, target, and AuNPs require further study. The knowledge gained could lead to tailoring aptamers for improved functionality.

The design and development of an aptamer&#8211;gold nanoparticle colorimetric assay for the detection of small molecules for in-the-field applications was examined. Additionally, a smart-device colorimetric application (app) was validated and long-term storage of the assay was established for use in the field.

Progettazione e sviluppo di aptameri delle nanoparticelle d&#39;oro Based colorimetriche saggi per applicazioni in-the-field

The design and development of an aptamer&#8211;gold nanoparticle (AuNP) colorimetric assay for the detection of small molecules for in-the-field ...

Removal of Exogenous Materials from the Outer Portion of Frozen Cores to Investigate the Ancient Biological Communities Harbored Inside

The cryosphere offers access to preserved organisms that persisted under past environmental conditions. In fact, these frozen materials could reflect conditions over vast time periods and investigation of biological materials harbored inside could provide insight of ancient environments. To appropriately analyze these ecosystems and extract meaningful biological information from frozen soils and ice, proper collection and processing of the frozen samples is necessary. This is especially critical for microbial and DNA analyses since the communities present may be so uniquely different from modern ones. Here, a protocol is presented to successfully collect and decontaminate frozen cores. Both the absence of the colonies used to dope the outer surface and exogenous DNA suggest that we successfully decontaminated the frozen cores and that the microorganisms detected were from the material, rather than contamination from drilling or processing the cores.

The cryosphere offers access to preserved organisms that persisted under past environmental conditions. A protocol is presented to collect and decontaminate permafrost cores of soils and ice. The absence of exogenous colonies and DNA suggest that microorganisms detected represent the material, rather than contamination from drilling or processing.

Rimozione di materiali esogene dalla parte esterna della congelati core per Indagare sulla antica comunità biologiche ospitava Dentro

The cryosphere offers access to preserved organisms that persisted under past environmental conditions. In fact, these frozen materials could reflect ...

Study of Protein-protein Interactions in Autophagy Research

Protein-protein interactions are important for understanding cellular signaling cascades and identifying novel pathway components and protein dynamics. The majority of cellular activities require physical interactions between proteins. To analyze and map these interactions, various experimental techniques as well as bioinformatics tools were developed. Autophagy is a cellular recycling mechanism that allows the cells to cope with different stressors, including nutrient deprivation, chemicals, and hypoxia. In order to better understand autophagy-related signaling events and to discover novel factors that regulate protein complexes in autophagy, we performed protein-protein interaction screens. Validation of these screening results requires the use of immunofluorescence and immunoprecipitation techniques. In this system, specific autophagy-related protein-protein interactions that we discovered were tested in Neuro2A (N2A) and HEK293T cell lines. Details of the technical procedures used are explained in this visualized experiment paper.

Presented here are two antibody-based protein-protein interaction research techniques: immunofluorescence and immunoprecipitation. These techniques are suitable for studying physical interactions between proteins for the discovery of novel components of cellular signaling pathways and for understanding protein dynamics.

Studio delle interazioni proteina-proteina nella ricerca di autofagia

Protein-protein interactions are important for understanding cellular signaling cascades and identifying novel pathway components and protein dynamics. ...

Advanced Confocal Microscopy Techniques to Study Protein-protein Interactions and Kinetics at DNA Lesions

Local microirradiation with lasers represents a useful tool for studies of DNA-repair-related processes in live cells. Here, we describe a methodological approach to analyzing protein kinetics at DNA lesions over time or protein-protein interactions on locally microirradiated chromatin. We also show how to recognize individual phases of the cell cycle using the Fucci cellular system to study cell-cycle-dependent protein kinetics at DNA lesions. A methodological description of the use of two UV lasers (355 nm and 405 nm) to induce different types of DNA damage is also presented. Only the cells microirradiated by the 405-nm diode laser proceeded through mitosis normally and were devoid of cyclobutane pyrimidine dimers (CPDs). We also show how microirradiated cells can be fixed at a given time point to perform immunodetection of the endogenous proteins of interest. For the DNA repair studies, we additionally describe the use of biophysical methods including FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) and FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy) in cells with spontaneously occurring DNA damage foci. We also show an application of FLIM-FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) in experimental studies of protein-protein interactions.

Laser microirradiation is a useful tool for studies of DNA repair in living cells. A methodological approach for the use of UVA lasers to induce various DNA lesions is shown. We have optimized a method for local microirradiation that maintains the normal cell cycle; thus, irradiated cells proceed through mitosis.

Avanzate tecniche di microscopia confocale per studiare le interazioni proteina-proteina e cinetica alle lesioni del DNA

Local microirradiation with lasers represents a useful tool for studies of DNA-repair-related processes in live cells. Here, we describe a methodological ...

Application of Ultrasound and Shear Wave Elastography Imaging in a Rat Model of NAFLD/NASH

Nonalcoholic Steatohepatitis (NASH) is a condition within the spectrum of Non-Alcoholic Fatty Liver Disease (NAFLD), which is characterized by liver fat accumulation (steatosis) and inflammation leading to fibrosis. Preclinical models closely recapitulating human NASH/NAFLD are essential in drug development. While liver biopsy is currently the gold standard for measuring NAFLD/NASH progression and diagnosis in the clinic, in the preclinical space, either collection of whole liver samples at multiple timepoints during a study or biopsy of liver is needed for histological analysis to assess the disease stage.
Conducting a liver biopsy mid-study is an invasive and labor-intensive procedure, and collecting liver samples to assess disease level increases the number of research animals needed for a study. Thus, there is a need for a reliable, translatable, non-invasive imaging biomarker to detect NASH/NAFLD in these preclinical models. Non-invasive ultrasound-based B-mode images and Shear Wave Elastography (SWE) can be used to measure steatosis as well as liver fibrosis. To assess the utility of SWE in preclinical rodent models of NASH, animals were placed on a pro-NASH diet&#160;and underwent non-invasive ultrasound B-mode and shear wave elastography imaging to measure hepatorenal (HR) index and liver elasticity, measuring progression of both liver fat accumulation and tissue stiffness, respectively, at multiple time points over the course of a given NAFLD/NASH study.
The HR index and elasticity numbers were compared to histological markers of steatosis and fibrosis. The results showed strong correlation between the HR index and percentage of Oil Red O (ORO) staining, as well as between elasticity and Picro-Sirius Red (PSR) staining of livers. The strong correlation between classic ex vivo methods and in vivo imaging results provides evidence that shear wave elastography/ultrasound-based imaging can be used to assess disease phenotype and progression in a preclinical model of NAFLD/NASH.

This protocol describes the use of an enhanced ultrasound technique to non-invasively observe and quantify liver tissue changes in rodent models of nonalcoholic fatty liver disease.

Applicazione dell'imaging ecografico a ultrasuoni e dell'elastografia a onde di taglio in un modello di ratto di NAFLD / NASH

Nonalcoholic Steatohepatitis (NASH) is a condition within the spectrum of Non-Alcoholic Fatty Liver Disease (NAFLD), which is characterized by liver fat ...