Questo protocollo consente l'etichettatura specifica e il successivo arricchimento e identificazione di substrati CK2 endogeni da un campione biologico complesso come una cellula o un lisce di tessuto. Questo metodo può essere applicato a qualsiasi tipo di cellula o tessuto. Facilitando così lo studio della CK2 in vari contesti biologici.
A dimostrare la procedura sarà John Chojnowski, uno studente laureato del mio laboratorio. Per cominciare, lisciviare meccanicamente il campione di tessuto o le cellule coltivate come delineato nel protocollo di testo per raccogliere un totale di 900 microlitri di campione. Centrifuga a 17.500 volte la gravità e a quattro gradi Celsius per tre minuti.
Quindi, trasferire 270 microlitri del supernatante in ciascuno dei tre nuovi tubi a microcentrifugo da 1,7 millilitri. Rimuovere 40 microlitri del supernatante rimanente da utilizzare come controllo di ingresso e trasferirlo su un nuovo tubo. Metti tutti i campioni sul ghiaccio.
In primo luogo, etichettare ciascuno dei tre tubi campione come mostrato qui. Al tubo di reazione della Chinasi aggiungere 2,7 microlitri di CK2 e 2,7 microlitri di GTPgammaS da 2,5 millimolare. Scorrere il tubo per mescolare e posizionarlo immediatamente sul ghiaccio.
All'unico tubo GTPgammaS, aggiungere 2,7 microlitri di GTPgammaS da 2,5 millimolari e 2,7 microlitri di Lysis Buffer. Sfoglia questo tubo per mescolare e posizionalo immediatamente sul ghiaccio. Al tubo solo PNBM aggiungere 5,4 microlitri di Lysis Buffer.
Scorrere il tubo per mescolare e posizionarlo immediatamente sul ghiaccio. Incubare tutti e tre i tubi in un bagno d'acqua a 30 gradi Celsius per un minuto. Successivamente, aggiungere 13,5 microlitri di PNBM a 12 milligrammi per millilitro a ciascun tubo.
Invertire i tubi per mescolare i campioni e incubare i campioni a temperatura ambiente per un'ora. Durante l'incubazione dei campioni, etichettare ciascuna delle colonne per il campione da caricare, come mostrato qui. Preparare le colonne invertendo ogni colonna più volte per rimescolare la resina Sephadex G-25 nel tampone di stoccaggio.
Attaccare ogni colonna a un supporto del morsetto e lasciarla riposare indisturbata per circa cinque minuti per lasciare depositare la resina. Quindi, posizionare un tubo sotto l'apertura inferiore di ogni colonna. Rimuovere i tappi sia dalla parte superiore che inferiore di ogni colonna, per consentire al buffer di stoccaggio di drenare nei tubi per gravità.
Una volta esaurito il buffer di archiviazione, aggiungere circa 2,7 millilitri di Lysis Buffer a ogni colonna per equilibrarli, assicurandosi di raccogliere e scartare il flusso attraverso. Ripetere questo processo di aggiunta del buffer di lisi e di eliminazione del flusso, tre volte. Per iniziare, caricare ogni campione nella rispettiva colonna.
Raccogliere e scartare il flusso. Aggiungere 420 microlitri di Lysis Buffer a ogni colonna per lavare i campioni. Lasciare che il buffer di lisi filtri attraverso la colonna e raccogliere ed eliminare il flusso.
Quindi, posizionare i tubi in posizione sotto ogni colonna per la raccolta del campione. Aggiungere 500 microlitri di Lysis Buffer a ogni colonna per elutere i campioni. Raccogliere il flusso attraverso, che ora contiene una popolazione arricchita di substrati CK2 tiofosforati e alchilati nella reazione della chinasi.
L'unica reazione di GTPgammaS conterrà substrati tiofosforati e alchilati da qualsiasi CK2 endogeno presente. L'unica reazione del PNMB conterrà proteine alchilate di fondo. Rimuovere 80 microlitri da ogni eluizione come campione di controllo dell'input di eluizione.
Successivamente, dividere ogni campione in due tubi che contengono ciascuno 200 microlitri. Etichettare ciascuno dei tubi come estere anti-tiofosfato o immunoglobulina G, come mostrato qui. Aggiungere 2,8 microgrammi di anticorpo estere anti-tiofosfato a ciascuno dei tubi di estere anti-tiofosfato.
Aggiungere 2,8 microgrammi di anticorpo di controllo dell'isotipo a ciascuno dei tubi IGG. Quindi posizionare i tubi su un rotatore a quattro gradi Celsius per due ore. Durante gli ultimi 15 minuti dell'incubazione del campione, utilizzare una lama di rasoio pulita per tagliare l'estremità di una punta della pipetta P200 per aumentare le dimensioni del misuratore.
Immediatamente prima dell'uso, vortice brevemente il tubo di stoccaggio contenente le perline di agarosio. Utilizzando la punta della pipetta tagliata, trasferire 100 microlitri del liquame delle perline per immunoprecipitazione in un nuovo tubo di microcentrifugo da 1,7 millilitri. È importante vortice delle perline prima di ogni trasferimento per evitare che le perline si assestano.
Centrifuga i tubi a 17.500 volte la gravità e a quattro gradi Celsius per un minuto. Rimuovere e scartare il supernatante. Rimescolare le perline aggiungendo 200 microlitri di Lysis Buffer e brevemente vortice da mescolare.
Ripetere questo processo di centrifugazione e lavaggio delle perline tre volte. Dopo il lavaggio finale, posizionare le perline sul ghiaccio fino a quando non sono pronte a procedere. Quando i campioni hanno finito di incubare, centrifugarli a 17.500 volte la gravità e a quattro gradi Celsius per tre minuti.
Quindi, trasferire 200 microlitri di ciascun campione ai tubi contenenti le perline lavate. Posizionare i tubi su un rotatore a quattro gradi Celsius per un'ora. Quindi, centrifuga i tubi a 17.500 volte la gravità e a quattro gradi Celsius per un minuto.
Rimuovere 40 microlitri da ogni supernatante per salvarli come controllo dell'esaurimento. Rimuovere e scartare il resto del supernatante, facendo attenzione a non disturbare le perline. Lavare i campioni aggiungendo 200 microlitri di Lysis Buffer a ciascuno e vortice brevemente.
Centrifuga a 17.500 volte la gravità e a quattro gradi Celsius per un minuto, scartando il supernatante. Ripetere questo processo di lavaggio e centrifugazione tre volte facendo attenzione a non disturbare le perline. Successivamente, aggiungere 50 microlitri di tampone campione 2X a ciascun campione contenente perline.
Per tutti gli altri campioni, tra cui il controllo di input, i controlli di input di eluizione e i controlli di esaurimento, aggiungere 8 microlitri di 6X Sample Buffer. Pipettare ogni tubo su e giù per mescolare ad eccezione dei tubi contenenti perline e riscaldare tutti i campioni a 95 gradi Celsius per cinque minuti prima di procedere con SDS-PAGE. Per valutare se l'immunoprecipitazione ha avuto successo, eseguire da 25 a 30 microlitri di ciascun campione che è stato eluso dalle perline su un gel di poliacrilammide separato al 12,5%.
Macchiare ogni gel con Coomassie Blue per visualizzare proteine arricchite da varie fasi del protocollo sperimentale. Utilizzando nuove lamette pulite, asportare con cura tutte le bande uniche presenti nella reazione chinasi anti-tiofosfato estere IP Lane prendendo nota dei loro pesi molecolari approssimativi. Una nuova lama di rasoio dovrebbe essere utilizzata per ogni fascia unica.
La base alla base di questa tecnica è questa tecnica è l'insolita capacità di CK2 di usare GTP per il trasferimento di gruppi fosforilici. L'aggiunta di oloenzima CK2 esogeno insieme all'analogo GTP, GTPgammaS, a un llysato cellulare, si traduce in una tiofosforilazione di substrati CK2 endogeni. Il successivo trattamento del lisato con il reagente alchilante p-Nitrobenzyl mesylato genera moietà estere tiofosfato su queste specifiche proteine del substrato, che possono quindi essere immunoprecipitate utilizzando un anticorpo estere anti-tiofosfato e infine identificate dalla spettrometria di massa.
Nei risultati positivi rappresentativi qui riportati, CK2 dipendente, tiofosforilazione e successiva alchilazione hanno avuto successo. Come previsto, un segnale di estere anti-tiofosfato potenziato da western blotting si osserva solo nella corsia contenente la reazione completa della chinasi, e non solo nel GTPgammaS e nei campioni trattati solo con PNMB. Anche un gel macchiato Coomassie Blue delle proteine immunoprecipitate e alluse, dimostra un risultato positivo.
Poiché più bande uniche sono evidenti solo nell'estere anti-tiofosfato IP Lane, in cui il lisato è stato incubato con CK2 e GTPgammaS esogeni. La banda marcata viene quindi asportata dal gel e sottoposta all'identificazione proteica mediante spettrometria di massa. Seguendo questa procedura, i substrati putativi CK2 identificati da una spettrometria di massa devono essere convalidati utilizzando un approccio aggiuntivo, come ad esempio dalla fosforilazione dipendente da CK2 in un saggio standard in vitro sulla chinasi.
