The authors thank the DFG (Hu 997/2-2) for financial support. FS acknowledges the Hanns-Seidel-Stiftung (HSS). SKr was supported by the Elitenetzwerk Bayern in the framework of the doctorate program Material Science of Complex Interfaces. SKi thanks the SFB 863 for financial support.

NOTA: Vedi figura 2 per una panoramica del flusso di processo che comprende la preparazione, i passaggi di acquisizione dati e di analisi dei dati. 1. reagente Setup NOTA: Tutte le sostanze chimiche devono essere maneggiati con cura, e quindi un camice da laboratorio, devono essere utilizzati guanti e occhiali protettivi. Tutte le operazioni devono essere eseguite in una cappa di laboratorio. In particolare, guanti speciali devono essere indossati in caso di uso di cloroformio. <ol><li> Utilizzare prodotti chimici a basso contenuto d&#39;acqua, come il cloroformio secca rapidamente e magazzino a secco, ma non più di una settimana. Conservare entrambe chimici a -20 ° C e sotto azoto o argon gas perché APTES ((3-amminopropil) triethoxysilan) (vedi Tabella 1) e PEG (polietilenglicole) sono igroscopici e PEG è soggetto ad ossidazione in aria. </li><li> Per evitare l&#39;esposizione frequente dello stock di ossigeno atmosferico e umidità, preparare aliquote più piccoli, idealmente all&#39;interno di un sistema vano portaoggetti con una cucina de azotori. </li></ol> 2. apparecchiature Setup NOTA: Per evitare possibili contaminazioni, utilizzare vasi fresca e pulita per ogni passo. <ol><li> Pulire vetro e pinzette in soluzione detergente per 30 min in un bagno ad ultrasuoni a 60 ° C. </li><li> Sciacquare e attrezzature sonicare dal punto 2.1 per due volte con acqua ultrapura. </li><li> Apparecchiature calore dal punto 2.1 in soluzione RCA (acqua ultrapura, acqua ossigenata e ammoniaca (5: 1: 1)) a 75 ° C in un forno per 45 minuti e successivamente risciacquare con acqua ultrapura. </li><li> Infine, asciugare il vetro e pinzette sotto flusso di azoto secco o in un forno (100 ° C, 3 h). </li></ol> 3. Tip Funzionalizzazione NOTA: Utilizzare pinzette, navi, ecc in acciaio inox, PTFE, vetro o qualsiasi altro materiale che sia chimicamente stabile in soluzioni organiche se applicabile. Se non diversamente specificato, eseguire tutti i passaggi a RT. La quantità di soluzione di incubazione necessaria dipende dal numero di chip a sbalzo. Assicurarsi che i cantilever sono immersi nelle rispettive soluzioni a tutti i tempi. NOTA: Utilizzare un cappuccio per evitare l&#39;inalazione dei vapori organici. <ol><li> Formazione di gruppi-OH sulla superficie a sbalzo (&#39;attivazione&#39;) (circa 0,5 ore): <ol><li> Utilizzare le pinzette per posizionare i chip freschi sbalzo (materiale: peccato, costanti primavera: 10-100 PN / nm) su un vetrino pulito e metterli in una camera di plasma (100 W). </li><li> Evacuare camera (~ 0,1 mbar). </li><li> Camera a Flood con ossigeno gassoso e evacuare di nuovo. </li><li> Attivare il processo al plasma (potenza: 20%, durata: 15 min, pressione di processo: 0.25 mbar). </li></ol></li><li> Amino-silanizzazione di cantilever (circa 1 ora): <ol><li> Preparare 2,5 ml di soluzione APTES (vedi Tabella 1) in una piastra di Petri di vetro - do questa posizione durante il processo al plasma. </li><li> Immediately dopo il processo al plasma, immergere ogni cantilever per 1 sec in acetone e metterli subito dopo nella soluzione APTES. </li><li> Incubare per 15 minuti a RT. </li><li> Sciacquare con cura i chip cantilever per due volte in 10 ml di acetone e una volta in 10 ml di cloroformio. </li><li> Finali opzionali passo: chip posto a sbalzo dal passo precedente su un vetrino pulito e cuocere per 30 minuti a 70 ° C. Si noti che ci sono anche strategie alternative per l&#39;attivazione di superficie, ad esempio, il trattamento UV 12. </li></ol></li><li> PEGylation (circa 2 ore): NOTA: Eseguire i punti 3.3.1-3.3.4 durante amino-silanizzazione. NHS e gruppi maleimmide sono soggetti a idrolisi in ambienti acquosi e PEG stesso è soggetto ad ossidazione in aria. Pertanto temporizzazione (soprattutto tra i passaggi) è un parametro critico. Vedere 13 per ulteriori informazioni. <ol><li> Preparare la soluzione cloroformio (vedi Tabella 1). </li><li> Per evitare la formazione di condensa, Warm PEG polveri fino a RT prima di aprire il un&#39;aliquota pesata e la giusta quantità. </li><li> Per l&#39;accoppiamento di polimeri o lipidi con gruppi amminici, separatamente risolvere NHS-PEG-NHS (6 kDa) e metil-PEG-NHS (5 kDa) nella soluzione cloroformica vortexando fino a che non sono completamente risolti. Fare riferimento alla Tabella 1 per le concentrazioni. <ol><li> In alternativa. per l&#39;accoppiamento di polimeri con gruppi tiolici separatamente risolvere Mal-NHS- PEG e metil-PEG-NHS in soluzione di cloroformio. </li></ol></li><li> Mescolare le soluzioni come richiesto per regolare un certo rapporto fra il numero di NHS- o maleimide- e le molecole di PEG metil-terminato (tipicamente 1: 500). Si noti che il rapporto ideale deve essere determinato iterativamente in una serie di cicli di preparazione-esperimento. </li><li> Incubare chip sbalzo nella soluzione di PEG per 1 ora in un ambiente saturo cloroformio per evitare l&#39;evaporazione del cloroformio. </li></ol></li><li> Sonda coniugazione molecola(&gt; 1 ora): NOTA: Nel seguente 3.4.1-3.4.3, tre esempi per l&#39;accoppiamento covalente di diverse molecole sonda fino alla punta AFM sono descritti. Per ogni molecola il protocollo deve essere regolata. Ulteriore nota, che nell&#39;esempio 1 e 3 NHS-chimica utilizzata mentre nell&#39;esempio 2 del tiolo funzionalizzato polimero PI- g -PS è accoppiato al PEG-maleimmide via chimica. Per i dettagli, vedere 14. <ol><li> Per poli (amminoacido) poli-D-tirosina (40-100 kDa) <ol><li> Sciogliere il polytyrosine coniugato sonda molecola in 1 M NaOH. Regolare la concentrazione di 1 mg / ml. </li><li> Sostituire il NaOH per tampone borato di sodio (pH 8.1) con colonne di spin dissalazione (7 kDa MWCO) immediatamente prima della funzionalizzazione </li><li> Risciacquare cantilever prima con 5 ml di cloroformio, poi con 5 ml di etanolo e infine con 5 ml di tampone borato. </li><li> Incubare i chip a sbalzo per 1 ora nella soluzione tampone polytyrosine borato e poi risciacquare con tampone boratoe acqua ultrapura. Conservare in acqua ultrapura fino alla misura. </li></ol></li><li> Per polimeri con un backbone lineare (poliisoprene, 119 kDa) con catene laterali innestate (polistirolo, 88 kDa) 14 <ol><li> Sciogliere il PI- g -PS in cloroformio asciutta. Regolare la concentrazione della soluzione coniugazione a 4 mg / ml. </li><li> Risciacquare le cantilever con 5 ml di cloroformio e incubare per almeno 1 ora in soluzione coniugazione. </li><li> Risciacquare nuovamente in 5 ml di cloroformio e memorizzare in cloroformio in un ambiente saturo cloroformio (per evitare l&#39;evaporazione cloroformio) fino alla misura. </li></ol></li><li> Per la lipidi PAPA <ol><li> Sciogliere PAPA in cloroformio asciutta. Regolare la concentrazione di 20 mm. </li><li> Risciacquare le cantilever con 5 ml di etanolo e 5 ml di acqua ultrapura prima incubazione delle cantilever per 1 hr nella soluzione lipidica. </li><li> Dopo l&#39;incubazione, risciacquare cantilever con 5 ml di cloroformio, 5 ml di ethanol e 5 ml di acqua calda e ultrapura (in questo ordine) per rimuovere molecole sonda non legato e di sbarazzarsi di residui di cloroformio. Utilizzare immediatamente punte funzionalizzate. In alternativa, memorizzarli in cloroformio fino al momento. </li></ol></li></ol></li></ol><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52456/52456fig1.jpg" /> Figura 1. (A) Schema che mostra il processo di funzionalizzazione punta utilizzando l&#39;esempio di NHS chimica. Bonding (B) Chemical impiegato per collegare una molecola sonda punta tramite un gruppo amminico. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52456/52456fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> Preparazione 4. Surface <ol><li> Self-assemblati monostrato (SAM) NOTA: Come superficie per il primo esempio, un monostrato auto-assemblato è stata scelta. Fare riferimento alla letteratura 15 </sup&gt; per i dettagli. <ol><li> Vetrini pulite con soluzione detergente e poi due volte in acqua ultrapura in un bagno ad ultrasuoni per 30 min ciascuno. Poi, come un passo ulteriore pulizia, metterli nella soluzione RCA (vedi punto 2.3) a 75 ° C per 15 min. </li><li> Rivestire le diapositive con 10 nm nichel cromo e oro 100 nm in una trafila sottovuoto. Poi conservare in frigorifero e pulito di nuovo nella soluzione RCA direttamente prima della fase successiva. </li><li> Incubare i vetrini del passo precedente in 2 mM soluzione 1-dodecantiolo / etanolo per 12 ore. I gruppi tiolo si legano alla superficie d&#39;oro e un monostrato auto idrofobica assembla. Risciacquare i vetrini con etanolo e acqua ultrapura e poi a secco da una corrente di gas di azoto. Confermare l&#39;idrofobicità della superficie preparata con misure di angolo di contatto statico in un goniometro con una telecamera CCD 10. </li></ol></li><li> Hydrogen diamante terminato NOTA: Come una superficie per il secondo esempio, è stato scelto un idrogeno diamante terminato. La preparazione della superficie è stata eseguita come descritto in precedenza 16. </li><li> Doppio strato lipidico supportati NOTA: Nell&#39;ultimo esempio, una superficie supportato doppio strato lipidico (SLB) è stato utilizzato come superficie. Per ottenere una tale superficie, una soluzione (0,1 mg / ml) di grandi vescicole unilamellari (Luvs) costituiti dalla POPC fosfolipidi sono formati con il metodo di estrusione. Quindi 50 ml di soluzione LUV sono stati messi su un foglio di mica appena spaccati (A = 1 cm²) e incubate per 30 min. Infine la soluzione è stata lavata con 20 ml di acqua ultrapura. Vedere 17,18 per una descrizione dettagliata della preparazione di SLB. </li></ol> 5. Acquisizione Dati NOTA: Per gli esperimenti, utilizzare un AFM, che fornisce la capacità di misurare in liquidi. Le procedure di acquisizione dati e di analisi dei dati sono applicabili a prescindere dal modello di AFM utilizzato. Inoltre, in alcuni esperimenti è vantaggioso avere la possibilità di controllare la temperature all&#39;interno della cellula liquido. Cantilever deflessione stata rilevata tramite il metodo di deflessione del fascio laser 19. Costanti primavera sono stati determinati con il metodo del rumore termico 20. <ol><li> Inserire il cantilever funzionalizzata in un supporto cantilever AFM che è adatto per la misura in fluidi. </li><li> Mettere la superficie (preparazione vedi sopra) per campionare in AFM e coprire con del liquido. Entrambi, a sbalzo e la superficie dovrebbe ora essere immerso nel liquido con la punta a sbalzo che punta verso la superficie. Si noti che in molti casi una goccia di liquido è sufficiente. In ogni caso l&#39;evaporazione del fluido dovrebbe essere evitato, per esempio, utilizzando una cella chiusa di fluido. </li><li> Se del caso, regolare la temperatura desiderata sul controller. </li><li> Lasciate che il sistema di stabilizzare almeno mezz&#39;ora. </li><li> Registrare uno spettro di rumore termico del cantilever con il cantilever lontano dalla superficie in modo da escludere qualsiasi superficie effetti di smorzamento. Si noti che in genere 10 o più spettri devono essere accumulati per ottenere un sufficiente rapporto segnale-rumore. </li><li> Avvicinarsi alla superficie. Si noti che al fine di conservare geometria della punta e punta funzionalizzazione processo approccio deve essere effettuata con attenzione. Ciò può essere realizzato, ad esempio, si avvicina in modo contatto intermittente. </li><li> Determinare la sensibilità inversa ottica leva (InvOLS) misurato in nm / volt. A tale scopo, spingendo la punta cantilever contro una superficie dura. <ol><li> Determinare i InvOLS misurando la pendenza della distanza da percorrere piezo contro la variazione di tensione fotodiodo. Montare una linea alla parte della curva di forza-distanza in cui la punta cantilever è in contatto con la superficie. In esperimenti su una superficie morbida come doppi strati lipidici, eseguire questo passaggio in aree che non sono coperte da un doppio strato lipidico (&quot;punti di errori&quot;). </li></ol></li><li> Determinare la costante della molla (pN / nm) montando un oscillatore armonico allo spettro del rumore termico. UsoFunzione software automatico per la primavera costante determinazione; altrimenti consultare la letteratura 20. </li><li> Avviare l&#39;esperimento. <ol><li> Registra curve numerosi forza-distanza per ogni condizione sperimentale. In genere, utilizzare i seguenti valori per i parametri sperimentali: La frequenza di campionamento di 5 kHz, velocità di punta di 1 micron / sec, ritrattare distanza di 1 micron. NOTA: A volte, a seconda della dinamica dell&#39;esperimento studiata, potrebbe essere necessario attendere un certo periodo di tempo con la punta in contatto con la superficie (&#39;tempo di sosta&#39;). NOTA: L&#39;esperimento parametri specifici può discostarsi nettamente dai valori di cui sopra. </li><li> Durante le misurazioni a lungo termine, azzerare la posizione laser sul fotodiodo di volta in volta riposizionando il fotodiodo. </li><li> Optional: Dopo ogni curva di forza, riposizionare l&#39;AFM-punta in un&#39;altra posizione xy. </li><li> Alla fine dell&#39;esperimento, determinare la sensibilità e la molla constant nuovamente per verificare la coerenza e stabilità del sistema. NOTA: Confrontando la costante della molla e la sensibilità prima e dopo l&#39;esperimento è anche un mezzo per assicurare che le proprietà del sistema e le proprietà della punta rimaste invariate nel corso dell&#39;esperimento. Se la differenza delle costanti a molla non è troppo grande (&lt;= 15%), possono essere mediati, poiché l&#39;incertezza intrinseca della costante della molla determinazione è anche circa il 15%. Per le differenze più grandi, si consiglia di trovare la prima ed eliminare la causa per il cambiamento costante della molla apparente prima di proseguire con ulteriori esperimenti. </li></ol></li></ol> 6. Preparazione dati NOTA: In questa sezione generale fasi di preparazione dei dati che sono tipicamente effettuati indipendentemente dal tipo specifico di esperimento per convertire le unità di Newton e nanometri, nonché di correggere i dati sono descritti. Le analisi di dati specifici esperimento sono briefly descritto più avanti nella rispettiva sezione rappresentante esempio. <ol><li> Tipicamente, effettuare tutti preparazione dei dati e l&#39;analisi passi automaticamente da un algoritmo-home scritta, ad esempio, sulla base del software IGOR Pro 6. </li><li> Convertire il segnale di deflessione grezzo (DEFL) [V] in vigore moltiplicando con le InvOLS [nm / V] e la costante della molla [nN / nm]. </li><li> Offset la forza in modo tale che la forza sul cantilever sufficiente distanza dalla superficie (cantilever carico) diventa 0 nN. </li><li> Calcolare la posizione della punta effettiva (chiamato anche separazione, misurata rispetto alla superficie) z *, che prende la flessione del cantilever in considerazione: <img alt="Equazione 1" fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/52456/52456eq1.jpg" /></li><li> Offset z * in modo tale che z * = 0 corrisponde alla posizione z della superficie. NOTA: Qui, F è la forza che agisce sulla punta e quindi piegatos cantilever (determinata nella fase 6.2.), z è la posizione z-sensore misurata (dato direttamente dallo strumento) e k rappresenta la costante della molla (determinato nel passo 5.8). </li></ol><img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52456/52456fig2.jpg" /> Figura diagramma di flusso 2. Processo che mostra la preparazione del campione, l&#39;acquisizione dei dati e l&#39;analisi dei dati. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52456/52456fig2large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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<li>Geisler, M., Balzer, B. N., Hugel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymer+Adhesion+at+the+Solid-Liquid+Interface+Probed+by+a+Single-Molecule+Force+Sensor%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Polymer Adhesion at the Solid-Liquid Interface Probed by a Single-Molecule Force Sensor.</a> Small. 5 (24), 2864-2869 (2009).</li>
<li>Morfill, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Affinity-matured+recombinant+antibody+fragments+analyzed+by+single-molecule+force+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Affinity-matured recombinant antibody fragments analyzed by single-molecule force spectroscopy.</a> Biophysical journal. 93 (10), 3583-3590 (2007).</li>
</ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Nel corso degli ultimi decenni, gli esperimenti di singola molecola hanno fornito intuizioni senza precedenti nei meccanismi molecolari e si è rivelato essere un approccio inestimabile nella vita della scienza e non solo. Per ottenere buone statistiche e significative da esperimenti SMF, idealmente una stessa molecola viene utilizzato su tutto il corso dell&#39;esperimento. In contrasto con esperimenti con insiemi di molecole, esperimenti SMFS sono in grado di rilevare eventi rari e stati molecolari nascosti. Un altro ...

Negli ultimi 30 anni, microscopia a forza atomica (AFM) è risultato essere una tecnica di imaging prezioso per studiare biologici 1,2 e 3 sintetici materiali e superfici in quanto fornisce una risoluzione spaziale molecolare in tre dimensioni e può essere azionato in vari solventi ambienti. Inoltre, la spettroscopia di forza molecola AFM-single (SMFS) permette di misurare le forze che vanno dal PN μN regime e ha dato una visibilità senza precedenti, ad esempio in proteine ​​pieghevole 4,5, polimero fisica 6-8, e singola interazione molecola-superficie 9 - 12 .La logica studiare singole molecole, piuttosto che un insieme di molecole è quello di evitare gli effetti che spesso mascherano rari eventi o stati molecolari nascosti media. Inoltre, un gran numero di parametri molecolari, quali la lunghezza del profilo, la lunghezza Kuhn, l&#39;energia libera di adesione, ecc può essereottenuto. Questa procedura è descritta negli esempi che seguono. In un tipico esperimento AFM-SMFS, la molecola sonda è accoppiato ad una punta molto affilata tramite una molecola linker. La punta sé è situato alla fine di un cantilever pieghevole. Se la punta viene portato a contatto con la superficie della molecola sonda interagire con questa superficie. Osservando la deflessione del cantilever su retrazione della punta, la forza, e quindi l&#39;energia libera, per staccare la molecola dalla superficie può essere determinato. Per ottenere statistiche significative, un gran numero di cosiddetti curve forza-distanza devono essere acquisiti. Inoltre, per avere veri esperimenti singola molecola (cioè, utilizzando una stessa molecola di sonda per la durata di tutto l&#39;esperimento) la molecola sonda deve essere accoppiato covalentemente alla punta AFM. Qui, un protocollo sperimentale per cantilever funzionalizzazione con una singola molecola mediante un legame covalente è presentato. La singola molecola può o essere accoppiato tramite un amino o tioGruppo L alla punta AFM. Il processo di coniugazione può essere effettuata in una grande varietà di solventi (organici e acquosi) per spiegare le proprietà di solvatazione dei polimeri utilizzati. Nella prima parte, un protocollo generale per attaccare covalentemente una singola molecola (&quot;probe molecola&quot;) tramite una molecola linker di una punta AFM descritto. A tal fine, NHS- organico o maleimmide-chimica viene utilizzato 13. Insieme con il protocollo per tre molecole esempio, i processi di acquisizione dati e di analisi dei dati sono descritti e sono forniti i riferimenti per ulteriori letture. Le molecole di esempio sono: il (lineare) tirosina polimero, il polimero trapianto PI- g -PS e il papa lipidi. Questo include lievi variazioni del protocollo, per esempio per collegare covalentemente cisteine. Inoltre, una sezione dedicata alla preparazione di superfici differenti come superficie diamantata, un CH 3 -self-assemblato monostrato e bistrati lipidici. Queste interfacce hanno provit di essere buone referenze ed esempi.

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Materials&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Hellmanex III alkaline liquid concentrate (detergent solution)</td><td>Hellma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RCA (ultrapure water, hydrogen peroxide (35%), ammonia (32%); 5:1:1(v/v/v))</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vectabond reagent / APTES (3-Aminopropyl)triethoxysilane</td><td>Vectorlabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dry acetone (&amp;lt; 50 ppm H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O)</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dry chloroform (&gt; 99.9%)</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triethylamine</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultrapure water</td><td>Biochrom, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Di-sodium tetraborate (&gt;&amp;nbsp;99.5%)</td><td>Biochrom, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Boric Acid</td><td>Biochrom, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Monofunctional &amp;alpha;-methoxy-&amp;omega;-NHS PEG, 5 kDa, &amp;ldquo;methyl-PEG-NHS&amp;rdquo;</td><td>Rapp, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heterobifunctional &amp;alpha;,&amp;omega;-bis-NHS PEG, 6&amp;nbsp;kDa, &amp;ldquo;NHS-PEG-NHS&amp;rdquo;</td><td>Rapp, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heterobifunctional &amp;alpha;-maleimidohexanoic- &amp;omega;-NHS PEG, 5 kDa, &amp;ldquo;Mal-PEG-NHS&amp;rdquo;</td><td>Rapp, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Probe molecule (polymer, lipid, &lt;em&gt;etc.&lt;/em&gt;)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Sufficient amount of glass crystallising dishes with spout (10&amp;nbsp;ml), glass Petri dishes (500 &amp;micro;l) and glass lids</td><td>VWR International GmbH, Germany</td><td></td><td>&lt;br /&gt;&amp;nbsp;&lt;br /&gt;&amp;nbsp;&lt;br /&gt;&amp;nbsp;&lt;br /&gt;&amp;nbsp;&lt;br /&gt;&amp;nbsp;&lt;br /&gt;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>Laboratory oven model UF30</td><td>Memmert, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Temperature controlled sonicator</td><td>VWR International GmbH, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plasma system &quot;Femto&quot;, 100 W</td><td>Diener, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>One separate glass syringe for each organic solvent</td><td>VWR International GmbH, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortex mixer</td><td>VWR International GmbH, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge tubes (0.5 ml or 1.5 ml)</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipettes: 10-100 &amp;micro;l, 50-200 &amp;micro;l and 100-1,000&amp;nbsp;&amp;micro;l</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AFM with temperature controlled fluid cell (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; MFP-3D with BioHeater)</td><td>Asylulm Research, Santa Barbara</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soft SiN cantilevers cantilever, typically made from silicon nitride (SiN) (spring constant less than 100 pN/nm, &lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; MLCT)</td><td>Bruker AXS, Santa Barbara</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

investigating single molecule adhesion by atomic force spectroscopy

Spettroscopia a forza atomica è uno strumento ideale per lo studio di molecole a superfici e interfacce. Un protocollo sperimentale per accoppiare una grande varietà di singole molecole covalentemente su una punta AFM è presentato. Allo stesso tempo, la punta AFM viene passivato per evitare interazioni aspecifiche tra la punta e il substrato, che è un prerequisito per studiare singole molecole allegate alla punta AFM. Le analisi per determinare la forza di adesione, la lunghezza di adesione, e l&#39;energia libera di queste molecole su superfici solide e bio-interfacce sono poco presentati e sono forniti riferimenti esterni per ulteriori letture. Molecole esempio sono le polytyrosine poli (aminoacidi), il polimero trapianto PI- g -PS e fosfolipidi PAPA (1-palmitoil-2-oleoyl- sn -glycero-3-fosfoetanolamina). Queste molecole sono desorbiti da superfici diverse come CH 3 -SAMs, idrogeno terminato diamante e supportati doppi strati lipidici in varie condizioni di solvente. Infine, lavantaggi di forza spettroscopiche esperimenti di singola molecola sono discussi tra cui mezzi per decidere se veramente una singola molecola è stato studiato nell&#39;esperimento.

Nel seguito, i risultati sopra descritti esempio molecole, cioè la polytyrosine polimeri poli (amminoacido), il polimero graft PI- g -PS e PAPA fosfolipide, sono presentati. Primo per ogni esempio, sperimentare dettagli specifici per l&#39;acquisizione dei dati e la preparazione dei dati sono forniti. Poi, vengono visualizzati i risultati esemplari per esperimenti in cui queste molecole sono state desorbita da superfici diverse (CH 3 -SAMs, idrogeno terminato diamanti e doppi strati lipidici). Deter...

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Investigating Single Molecule Adhesion by Atomic Force Spectroscopy

A protocol to couple a large variety of single molecules covalently onto an AFM tip is presented. Procedures and examples to determine the adhesion force and free energy of these molecules on solid supports and bio-interfaces are provided.

Indagare singola molecola di adesione da Atomic Spectroscopy Forza

Atomic force spectroscopy is an ideal tool to study molecules at surfaces and interfaces. An experimental protocol to couple a large variety of single ...

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Research

JoVE Journal

Engineering

10.3K Views.  Technische Universität München. A protocol to couple a large variety of single molecules covalently onto an AFM tip is presented. Procedures and examples to determine the adhesion force and free energy of these molecules on solid supports and bio-interfaces are provided.

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Quantitative and Qualitative Examination of Particle-particle Interactions Using Colloidal Probe Nanoscopy

Colloidal Probe Nanoscopy (CPN), the study of the nano-scale interactive forces between a specifically prepared colloidal probe and any chosen substrate using the Atomic Force Microscope (AFM), can provide key insights into physical interactions present within colloidal systems. Colloidal systems are widely existent in several applications including, pharmaceuticals, foods, paints, paper, soil and minerals, detergents, printing and much more.1-3 Furthermore, colloids can exist in many states such as emulsions, foams and suspensions. Using colloidal probe nanoscopy one can obtain key information on the adhesive properties, binding energies and even gain insight into the physical stability and coagulation kinetics of the colloids present within. Additionally, colloidal probe nanoscopy can be used with biological cells to aid in drug discovery and formulation development. In this paper we describe a method for conducting colloidal probe nanoscopy, discuss key factors that are important to consider during the measurement, and show that both quantitative and qualitative data that can be obtained from such measurements.

Colloidal probe nanoscopy can be used within a variety of fields to gain insight into the physical stability and coagulation kinetics of colloidal systems and aid in drug discovery and formulation sciences using biological systems. The method described within provides a quantitative and qualitative means to study such systems.

Esame quantitativa e qualitativa delle interazioni particella-particella colloidale Uso Probe Nanoscopia

Colloidal Probe Nanoscopy (CPN), the study of the nano-scale interactive forces between a specifically prepared colloidal probe and any chosen substrate ...

Ricerca

Chimica

Adhesion Frequency Assay for In Situ Kinetics Analysis of Cross-Junctional Molecular Interactions at the Cell-Cell Interface

The micropipette adhesion assay was developed in 1998 to measure two-dimensional (2D) receptor-ligand binding kinetics1. The assay uses a human red blood cell (RBC) as adhesion sensor and presenting cell for one of the interacting molecules. It employs micromanipulation to bring the RBC into contact with another cell that expresses the other interacting molecule with precisely controlled area and time to enable bond formation. The adhesion event is detected as RBC elongation upon pulling the two cells apart. By controlling the density of the ligands immobilized on the RBC surface, the probability of adhesion is kept in mid-range between 0 and 1. The adhesion probability is estimated from the frequency of adhesion events in a sequence of repeated contact cycles between the two cells for a given contact time. Varying the contact time generates a binding curve. Fitting a probabilistic model for receptor-ligand reaction kinetics1 to the binding curve returns the 2D affinity and off-rate.
The assay has been validated using interactions of Fc&gamma; receptors with IgG Fc1-6, selectins with glycoconjugate ligands6-9, integrins with ligands10-13, homotypical cadherin binding14, T cell receptor and coreceptor with peptide-major histocompatibility complexes15-19.
The method has been used to quantify regulations of 2D kinetics by biophysical factors, such as the membrane microtopology5, membrane anchor2, molecular orientation and length6, carrier stiffness9, curvature20, and impingement force20, as well as biochemical factors, such as modulators of the cytoskeleton and membrane microenvironment where the interacting molecules reside and the surface organization of these molecules15,17,19.
The method has also been used to study the concurrent binding of dual receptor-ligand species3,4, and trimolecular interactions19 using a modified model21.
The major advantage of the method is that it allows study of receptors in their native membrane environment. The results could be very different from those obtained using purified receptors17. It also allows study of the receptor-ligand interactions in a sub-second timescale with temporal resolution well beyond the typical biochemical methods.
To illustrate the micropipette adhesion frequency method, we show kinetics measurement of intercellular adhesion molecule 1 (ICAM-1) functionalized on RBCs binding to integrin &alpha;L&beta;2 on neutrophils with dimeric E-selectin in the solution to activate &alpha;L&beta;2.

Adhesion Frequency Assay for In Situ Kinetics Analysis of Cross-Junctional Molecular Interactions at the Cell-Cell Interface

An adhesion frequency assay for measuring receptor-ligand interaction kinetics when both molecules are anchored on the surfaces of the interacting cells is described. This mechanically-based assay is exemplified using a micropipette-pressurized human red blood cell as adhesion sensor and integrin &alpha;L&beta;2 and intercellular adhesion molecule-1 as interacting receptors and ligands.

Adesione saggio di frequenza per In Situ Analisi cinetica delle interazioni molecolari incrociati giunzionale alla cellula-cellula di interfaccia

The micropipette adhesion assay was developed in 1998 to measure two-dimensional (2D) receptor-ligand binding kinetics1. The assay uses a human red blood ...

Bioingegneria

Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. Atomic force microscopy (AFM) can address this problem by enabling stretching and relaxation of single protein molecules, which gives direct evidence of specific unfolding and refolding characteristics. AFM-based single-molecule force-spectroscopy (AFM-SMFS) provides a means to consistently measure high-energy conformations in proteins that are not possible in traditional bulk (biochemical) measurements. Although numerous papers were published to show principles of AFM-SMFS, it is not easy to conduct SMFS experiments due to a lack of an exhaustively complete protocol. In this study, we briefly illustrate the principles of AFM and extensively detail the protocols, procedures, and data analysis as a guideline to achieve good results from SMFS experiments. We demonstrate representative SMFS results of single protein mechanical unfolding measurements and we provide troubleshooting strategies for some commonly encountered problems.

We describe the detailed procedures and strategies to measure the mechanical properties and mechanical unfolding pathways of single protein molecules using an atomic force microscope. We also show representative results as a reference for selection and justification of good single protein molecule recordings.

Spettroscopia della forza delle singole molecole proteiche utilizzando un microscopio a forza atomica

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

Biochimica

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and functions. It gave us the opportunity to explore a multiplicity of biophysical mechanisms, e.g., how bacterial adhesins bind to host surface receptors in more detail. Among other factors, the success of SMFS experiments depends on the functional and native immobilization of the biomolecules of interest on solid surfaces and AFM tips. Here, we describe a straightforward protocol for the covalent coupling of proteins to silicon surfaces using silane-PEG-carboxyls and the well-established N-hydroxysuccinimid/1-ethyl-3-(3-dimethyl-aminopropyl)carbodiimid (EDC/NHS) chemistry in order to explore the interaction of pilus-1 adhesin RrgA from the Gram-positive bacterium Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae) with the extracellular matrix protein fibronectin (Fn). Our results show that the surface functionalization leads to a homogenous distribution of Fn on the glass surface and to an appropriate concentration of RrgA on the AFM cantilever tip, apparent by the target value of up to 20% of interaction events during SMFS measurements and revealed that RrgA binds to Fn with a mean force of 52 pN. The protocol can be adjusted to couple via site specific free thiol groups. This results in a predefined protein or molecule orientation and is suitable for other biophysical applications besides the SMFS.

This protocol describes the covalent immobilization of proteins with a heterobifunctional silane coupling agent to silicon-oxide surfaces designed for the atomic force microscopy based single molecule force spectroscopy which is exemplified by the interaction of RrgA (pilus-1 tip adhesin of S. pneumoniae) with fibronectin.

Immobilizzazione covalente di proteine per la spettroscopia di forza di singola molecola

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Insights into the Interactions of Amino Acids and Peptides with Inorganic Materials Using Single-Molecule Force Spectroscopy

The interactions between proteins or peptides and inorganic materials lead to several interesting processes. For example, combining proteins with minerals leads to the formation of composite materials with unique properties. In addition, the undesirable process of biofouling is initiated by the adsorption of biomolecules, mainly proteins, on surfaces. This organic layer is an adhesion layer for bacteria and allows them to interact with the surface. Understanding the fundamental forces that govern the interactions at the organic-inorganic interface is therefore important for many areas of research and could lead to the design of new materials for optical, mechanical and biomedical applications. This paper demonstrates a single-molecule force spectroscopy technique that utilizes an AFM to measure the adhesion force between either peptides or amino acids and well-defined inorganic surfaces. This technique involves a protocol for attaching the biomolecule to the AFM tip through a covalent flexible linker and single-molecule force spectroscopy measurements by atomic force microscope. In addition, an analysis of these measurements is included.

Here we present a protocol to measure the force of interactions between a well-defined inorganic surface and either peptides or amino acids by single-molecule force spectroscopy measurements using an atomic force microscope (AFM). The information obtained from the measurement is important to better understand the peptide-inorganic material interphase.

Intuizioni le interazioni di aminoacidi e peptidi con materiali inorganici Uso singola molecola Forza Spettroscopia

The interactions between proteins or peptides and inorganic materials lead to several interesting processes. For example, combining proteins with minerals ...

Sub-nanometer Resolution Imaging with Amplitude-modulation Atomic Force Microscopy in Liquid

Atomic force microscopy (AFM) has become a well-established technique for nanoscale imaging of samples in air and in liquid. Recent studies have shown that when operated in amplitude-modulation (tapping) mode, atomic or molecular-level resolution images can be achieved over a wide range of soft and hard samples in liquid. In these situations, small oscillation amplitudes (SAM-AFM) enhance the resolution by exploiting the solvated liquid at the surface of the sample. Although the technique has been successfully applied across fields as diverse as materials science, biology and biophysics and surface chemistry, obtaining high-resolution images in liquid can still remain challenging for novice users. This is partly due to the large number of variables to control and optimize such as the choice of cantilever, the sample preparation, and the correct manipulation of the imaging parameters. Here, we present a protocol for achieving high-resolution images of hard and soft samples in fluid using SAM-AFM on a commercial instrument. Our goal is to provide a step-by-step practical guide to achieving high-resolution images, including the cleaning and preparation of the apparatus and the sample, the choice of cantilever and optimization of the imaging parameters. For each step, we explain the scientific rationale behind our choices to facilitate the adaptation of the methodology to every user's specific system.

We present a method for achieving sub-nanometer resolution images with amplitude-modulation (tapping mode) atomic force microscopy in liquid. The method is demonstrated on commercial atomic force microscopes. We explain the rationale behind our choices of parameters and suggest strategies for resolution optimization.

Sub-nanometrica Resolution Imaging con modulazione di ampiezza in microscopia a forza atomica in Liquid

Atomic force microscopy (AFM) has become a well-established technique for nanoscale imaging of samples in air and in liquid. Recent studies have shown ...

Ingegneria

Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the enzymes onto the noncatalytic scaffold protein is directed by interactions among a family of related receptor-ligand pairs comprising interacting cohesin and dockerin modules. The extremely strong binding between cohesin and dockerin modules results in dissociation constants in the low picomolar to nanomolar range, which may hamper accurate off-rate measurements with conventional bulk methods. Single-molecule force spectroscopy (SMFS) with the atomic force microscope measures the response of individual biomolecules to force, and in contrast to other single-molecule manipulation methods (i.e.&#160;optical tweezers), is optimal for studying high-affinity receptor-ligand interactions because of its ability to probe the high-force regime (&#62;120 pN). Here we present our complete protocol for studying cellulosomal protein assemblies at the single-molecule level. Using a protein topology derived from the native cellulosome, we worked with enzyme-dockerin and carbohydrate binding module-cohesin (CBM-cohesin) fusion proteins, each with an accessible free thiol group at an engineered cysteine residue. We present our site-specific surface immobilization protocol, along with our measurement and data analysis procedure for obtaining detailed binding parameters for the high-affinity complex. We demonstrate how to quantify single subdomain unfolding forces, complex rupture forces, kinetic off-rates, and potential widths of the binding well. The successful application of these methods in characterizing the cohesin-dockerin interaction responsible for assembly of multidomain cellulolytic complexes is further described.

Cellulosomes are multienzyme complexes designed for digesting cellulose. AFM-based SMFS was used to study the mechanical properties and folding configuration of cellulosome-associated protein assemblies. We present a complete workflow for protein immobilization, data acquisition, and data analysis to study the interactions of individual receptor-ligand complexes involved in cellulosome assembly.

Indagare Sistemi recettore-ligando del Cellulosome con sede a AFM singola molecola di Forza Spettroscopia

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the ...

Covalent Attachment of Single Molecules for AFM-based Force Spectroscopy

Atomic force microscopy (AFM)-based single molecule force spectroscopy is an ideal tool for investigating the interactions between a single polymer and surfaces. For a true single molecule experiment, covalent attachment of the probe molecule is essential because only then can hundreds of force-extension traces with one and the same single molecule be obtained. Many traces are in turn necessary to prove that a single molecule alone is probed. Additionally, passivation is crucial for preventing unwanted interactions between the single probe molecule and the AFM cantilever tip as well as between the AFM cantilever tip and the underlying surface. The functionalization protocol presented here is reliable and can easily be applied to a variety of polymers. Characteristic single molecule events (i.e., stretches and plateaus) are detected in the force-extension traces. From these events, physical parameters such as stretching force, desorption force and desorption length can be obtained. This is particularly important for the precise investigation of stimuli-responsive systems at the single molecule level. As exemplary systems poly(ethylene glycol) (PEG), poly(N-isopropylacrylamide) (PNiPAM) and polystyrene (PS) are stretched and desorbed from SiOx (for PEG and PNiPAM) and from hydrophobic self-assembled monolayer surfaces (for PS) in aqueous environment.

Covalent attachment of probe molecules to atomic force microscopy (AFM) cantilever tips is an essential technique for the investigation of their physical properties. This allows us to determine the stretching force, desorption force and length of polymers via AFM-based single molecule force spectroscopy with high reproducibility.

Attacco covalente di singole molecole per la spettroscopia della forza basata su AFM

Atomic force microscopy (AFM)-based single molecule force spectroscopy is an ideal tool for investigating the interactions between a single polymer and ...

Atomic Force Microscopy Cantilever-Based Nanoindentation: Mechanical Property Measurements at the Nanoscale in Air and Fluid

An atomic force microscope (AFM) fundamentally measures the interaction between a nanoscale AFM probe tip and the sample surface. If the force applied by the probe tip and its contact area with the sample can be quantified, it is possible to determine the nanoscale mechanical properties (e.g., elastic or Young&#39;s modulus) of the surface being probed. A detailed procedure for performing quantitative AFM cantilever-based nanoindentation experiments is provided here, with representative examples of how the technique can be applied to determine the elastic moduli of a wide variety of sample types, ranging from kPa to GPa. These include live mesenchymal stem cells (MSCs) and nuclei in physiological buffer, resin-embedded dehydrated loblolly pine cross-sections, and Bakken shales of varying composition.
Additionally, AFM cantilever-based nanoindentation is used to probe the rupture strength (i.e., breakthrough force) of phospholipid bilayers. Important practical considerations such as method choice and development, probe selection and calibration, region of interest identification, sample heterogeneity, feature size and aspect ratio, tip wear, surface roughness, and data analysis and measurement statistics are discussed to aid proper implementation of the technique. Finally, co-localization of AFM-derived nanomechanical maps with electron microscopy techniques that provide additional information regarding elemental composition is demonstrated.

Quantifying the contact area and force applied by an atomic force microscope (AFM) probe tip to a sample surface enables nanoscale mechanical property determination. Best practices to implement AFM cantilever-based nanoindentation in air or fluid on soft and hard samples to measure elastic modulus or other nanomechanical properties are discussed.

Microscopia a forza atomica Nanoindentazione basata su sbalzo: misure di proprietà meccaniche su scala nanometrica in aria e fluido

An atomic force microscope (AFM) fundamentally measures the interaction between a nanoscale AFM probe tip and the sample surface. If the force applied by ...

Functionalization of Atomic Force Microscope Cantilevers with Single-T Cells or Single-Particle for Immunological Single-Cell Force Spectroscopy

Atomic force microscopy based single cell force spectroscopy (AFM-SCFS) is a powerful tool for studying biophysical properties of living cells. This technique allows for probing interaction strengths and dynamics on a live cell membrane, including those between cells, receptor and ligands, and alongside many other variations. It also works as a mechanism to deliver a physical or biochemical stimulus on single cells in a spatiotemporally controlled manner, thus allowing specific cell activation and subsequent cellular events to be monitored in real-time when combined with live-cell fluorescence imaging. The key step in those AFM-SCFS measurements is AFM-cantilever functionalization, or in other words, attaching a subject of interest to the cantilever. Here, we present methods to modify AFM cantilevers with a single T cell and a single polystyrene bead respectively for immunological studies. The former involves a biocompatible glue that couples single T cells to the tip of a flat cantilever in a solution, while the latter relies on an epoxy glue for single bead adhesion in the air environment. Two immunological applications associated with each cantilever modification are provided as well. The methods described here can be easily adapted to different cell types and solid particles.

We present a protocol to functionalize atomic force microscope (AFM) cantilevers with a single T cell and bead particle for immunological studies. Procedures to probe single-pair T cell-dendritic cell binding by AFM and to monitor the real-time cellular response of macrophages to a single solid particle by AFM with fluorescence imaging are shown.

Funzionalizzazione dei cantilever a microscopio a forza atomica con cellule A T singole o a particella singola per la spettroscopia immunologica a forza a cella singola

Atomic force microscopy based single cell force spectroscopy (AFM-SCFS) is a powerful tool for studying biophysical properties of living cells. This ...