La microscopia a forza atomica, o nanoindentazione a sbalzo AFM, può essere utilizzata per determinare le proprietà meccaniche su scala nanometrica di materiali che vanno dal modulo kilopascal ai gigapascal sia nell'aria che nel fluido. La nanoindentazione basata su sbalzo AFM consente l'imaging topografico colocalizzato e misurazioni quantitative delle proprietà meccaniche in situ con precisione e risoluzione su scala nanometrica su un'ampia gamma di materiali e ambienti pertinenti. La nanoindentazione basata su sbalzo AFM può essere utilizzata per distinguere tra strutture sane e malate, tessuti o cellule che presentano proprietà meccaniche divergenti.
Determinare con precisione l'area di contatto del campione di punta e la forza applicata durante la nanoindentazione basata su cantilever richiede un'attenta calibrazione della sonda AFM, che è impegnativa ma essenziale per le misurazioni quantitative delle proprietà meccaniche su scala nanometrica. Per iniziare, selezionare una microscopia a forza atomica appropriata o una sonda AFM per la nanoindentazione del campione previsto in base al mezzo, al modulo previsto, alla topografia del campione e alle dimensioni delle caratteristiche pertinenti. Caricare la sonda sul supporto della sonda e collegare il supporto della sonda alla testa di scansione AFM.
Selezionare una modalità di nanoindentazione appropriata nel software AFM che consente all'utente di controllare le singole rampe. Allineare il laser sul retro del cantilever della sonda di fronte alla posizione della punta della sonda e nel rilevatore sensibile alla posizione, o PSD. Centrare il punto del raggio laser sul retro del cantilever massimizzando la tensione di somma.
Successivamente, centrare il punto del raggio laser riflesso sul PSD regolando i segnali di deflessione verticale e orizzontale in modo che siano il più vicino possibile allo zero, fornendo così il massimo intervallo di deflessione rilevabile per produrre una tensione di uscita proporzionale alla deflessione a sbalzo. Calibrare la sensibilità di deflessione, o DS, del sistema AFM della sonda. Per fare ciò, impostare ed eseguire i rientri di calibrazione DS su Sapphire per ottenere approssimativamente la stessa deflessione della sonda dei rientri del campione pianificati poiché lo spostamento misurato è una funzione dell'angolo di deflessione della punta e diventa non lineare per grandi deflessioni.
Ripeti la rampa cinque volte. Determinare il DS in nanometri per volt o la sensibilità della leva ottica inversa e i volt per nanometri dalla pendenza della porzione lineare del regime di contatto dopo il punto di contatto iniziale nella curva di spostamento della forza risultante o FD. Utilizzare la media dei valori per la massima precisione.
Se la deviazione standard relativa supera l'1%, rimisurare il DS, poiché a volte le prime curve FD non sono ideali a causa dell'introduzione iniziale di forze di attrazione. Se la costante della molla K della sonda non è calibrata in fabbrica, calibrare la costante della molla. Se la sonda non dispone di una misurazione del raggio della punta calibrata in fabbrica, misurare il raggio effettivo della punta R.Se si utilizza il metodo di ricostruzione della punta cieca, visualizzare l'immagine della caratterizzazione della punta o del campione di rugosità utilizzando una velocità di scansione lenta e guadagni di feedback elevati per ottimizzare il tracciamento delle caratteristiche molto nitide.
Scegli le dimensioni e la densità di pixel dell'immagine in base al raggio di punta previsto. Successivamente, utilizzare il software di analisi delle immagini AFM per modellare la punta della sonda e stimarne il raggio finale e il diametro effettivo della punta alla profondità di rientro del campione prevista. Dopo aver completato la calibrazione della sonda, immettere i valori DS, K e R nel software.
Infine, immettere una stima del rapporto di Poisson del campione per convertire il modulo ridotto misurato nel modulo del campione effettivo. Se si utilizza un modello di meccanica di contatto conica o conosferica basato sulla forma della punta e sulla profondità di indentazione, è necessario inserire il semiangolo della punta. Naviga il campione sotto la testa AFM e interagisci sulla regione di interesse desiderata.
Monitorare il segnale di deflessione verticale o eseguire una piccola rampa iniziale per verificare che la punta e il campione siano in contatto. Regolare leggermente la posizione della testa AFM verso l'alto e rampare di nuovo. Ripetere l'operazione fino a quando la punta e il campione non sono appena fuori contatto, come evidenziato da una rampa quasi piatta e da una minima deflessione verticale del cantilever.
Una volta che non è presente alcuna interazione evidente del campione della punta, abbassare la testa AFM di una quantità corrispondente a circa il 50% della dimensione della rampa per garantire che la punta della sonda non si schianti contro il campione mentre si sposta manualmente la testa AFM. Rampa di nuovo, ripetendo fino a quando non si osserva una buona curva. Regolare i parametri della rampa.
Selezionare una dimensione della rampa appropriata in base al campione e alla profondità di rientro desiderata. Quindi, selezionare una velocità di rampa appropriata. Un hertz è un buon punto di partenza per la maggior parte dei campioni.
Impostare il numero di campioni per rampa per ottenere la risoluzione desiderata della misurazione. Impostare la rotazione X per ridurre le forze di taglio sul campione e sulla punta spostando simultaneamente leggermente la sonda nella direzione X mentre si rientra nella direzione Z. Utilizzate un valore per la rotazione X uguale all'angolo di offset del portasonda rispetto alla normale alla superficie.
Quindi, scegli se utilizzare una rampa attivata o non attivata. Se viene scelta una rampa attivata, impostare la soglia di trigger per ottenere il rientro desiderato nel campione. Eseguire un rientro nella posizione scelta.
Selezionare e caricare i dati da analizzare nel software. Valori calibrati di input per la costante della molla, DS o sensibilità della leva ottica inversa e raggio della punta della sonda, insieme a una stima del rapporto di Poisson del campione. Scegli un modello di meccanica a contatto di nanoindentazione appropriato per la punta e il campione.
Eseguire l'algoritmo di raccordo. Verificare il corretto adattamento delle curve FD. Un basso errore residuo corrispondente a una quasi unità quadrata media indica una buona aderenza al modello scelto.
Se lo si desidera, controllare a campione le singole curve per ispezionare visivamente la curva, l'adattamento del modello e i punti di contatto calcolati. Sono mostrate curve FD quasi ideali ottenute nell'aria su un campione di pino loblolly incorporato in resina e in soluzione salina tamponata con fosfato su un nucleo di cellule staminali mesenchimali. Con la sonda al silicio, la punta ha subito un'usura significativa rispetto al suo stato incontaminato iniziale durante l'imaging.
Con ogni immagine successiva, la punta diventa progressivamente più arrotondata. A differenza della sonda diamantata, il raggio della punta non è cambiato entro i limiti del metodo di ricostruzione della punta cieca, evidenziando l'estrema resistenza all'usura del diamante. Un'immagine topografica AFM che copre più celle con una pseudo rappresentazione 3D e una mappa del modulo corrispondente di un campione di pino loblolly è mostrata qui.
La mappa del modulo derivata dall'AFM generata durante l'ottenimento di un'immagine AFM mostra che l'inclusione del minerale al centro delle immagini è significativamente più difficile della matrice organica circostante. Viene mostrato l'effetto del raggio e della forma della punta della sonda sull'aspetto delle caratteristiche ad alto rapporto di aspetto di un campione di scisto di Bakken. La nanoindentazione a sbalzo su cellule staminali mesenchimali e nuclei isolati non ha mostrato alcuna differenza statistica nel modulo elastico.
La morfologia e le proprietà meccaniche dei doppi strati lipidici contenenti colesterolo studiati da AFM sono dimostrate qui. Una corretta calibrazione della sonda e la selezione dei parametri di rampa appropriati nei modelli di meccanica a contatto sono essenziali per misurazioni nanomeccaniche accurate. Oltre a consentire misurazioni modulari elastiche, la nanoindentazione basata su sbalzo AFM può essere utilizzata per sondare la resistenza alla rottura o la forza di rottura dei doppi strati fosfolipidi in condizioni fisiologiche rilevanti.
La nanoindentazione basata su sbalzo AFM ha permesso di studiare gli effetti di knockout strutturali, trattamenti farmaceutici e vibrazioni a bassa intensità per simulare l'esercizio sulle proprietà meccaniche dei nuclei delle cellule staminali mesenchimali.
