Name: the bioconjugation and radiosynthesis of 89zr-dfo-labeled antibodies
Uploaded: 2015-02-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
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Gli autori ringraziano il Prof. Thomas Reiner, il Dr. Jacob Houghton, e il Dr. Serge Lyaschenko per utili conversazioni.

Tutti gli esperimenti sugli animali in vivo descritti sono stati eseguiti secondo un protocollo approvato e alle linee guida etiche del Memorial Sloan Kettering Cancer Center Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). 1. Coniugazione DFO-NCS a J591 <ol><li> In una provetta da microcentrifuga 1,7 ml, preparare una soluzione di 2-5 mg / ml di J591 in 1 ml di soluzione salina 1x tampone fosfato (pH 7,4) o 0,5 M tampone HEPES (pH 7,4). </li><li> Sciogliere DFO-NCS in DMSO secco in concentrazione compresa tra 5-10 mM (3,8-7,6 mg / ml). Sonicare o vortex la soluzione accuratamente per facilitare la completa dissoluzione. </li><li> Regolare il pH della soluzione a 8,8-9,0 J591 aggiungendo piccole aliquote (&lt;10 microlitri) di 0,1 M Na 2 CO 3. </li><li> Una volta che la soluzione di anticorpo è alla giusta pH, aggiungere un volume della soluzione DFO-NCS corrispondente a 3-4 volte eccesso molare del chelante bifunzionale. <ol><li> Per l&#39;esamepio, aggiungere 4-5 ml di un 10 mm (7,6 mg / ml) soluzione di DFO-NCS (40,4 nmol DFO-NCS) a 1 ml di una / soluzione di anticorpi J591 ml 2 mg (13.3 nmol J591). La quantità di DMSO nella miscela di reazione acquosa finale non deve superare il 2% v / v. </li></ol></li><li> Incubare la reazione per 30 minuti a 37 ° C su un blocco di riscaldamento agitazione a 350 rpm. </li><li> Dopo 1 ora a 37 ° C, purificare il immunoconiugato risultante utilizzando una dimensione monouso colonna di esclusione desalificazione preconfezionata con un peso molecolare di 50.000 cut-off utilizzando 0,5 M tampone HEPES (pH 7,4) come eluente. Questo passaggio produrrà una soluzione del costrutto completato J591-DFO 2 ml. </li><li> Misurare la concentrazione del J591-DFO di costruire su uno spettrofotometro UV-Vis. </li><li> Se si desidera una maggiore concentrazione del costrutto, concentrare la soluzione J591-DFO utilizzando un&#39;unità filtro centrifugo con un peso molecolare di 50.000 cut-off. </li><li> Conservare la soluzione del completamento immunoconiugato J591-DFO a -20 ° C al buio. </ol> 2. radiomarcatura J591-DFO con 89 Zr ATTENZIONE: Questo passaggio del protocollo comporta il trattamento e la manipolazione di radioattività. Prima di eseguire questa procedura o esecuzione di qualsiasi altro lavoro con i ricercatori di radioattività dovrebbe consultare con il Dipartimento di sicurezza di radiazione del proprio istituto. Tutte le possibili misure dovrebbero essere adottate per ridurre al minimo l&#39;esposizione alle radiazioni ionizzanti. NOTA: Ai fini di una corretta radiochimica nota-keeping, la quantità di radioattività nel campione deve essere misurata con un calibratore di dosi e registrato prima e dopo passaggi 2,2-2,13 nel protocollo di seguito. Ciò contribuirà con la determinazione precisa dei rendimenti radiochimica e attività specifiche. <ol><li> Preparare una soluzione di 0,5-2,0 mg di J591-DFO in 200 ml di 0,5 M tampone HEPES, pH 7.5. </li><li> Pipettare un volume del &lt;sup&gt; 89 soluzione Zr 4+ magazzino (di solito fornita in 1.0 M acido ossalico), corrispondenti a 1,0-6,0 mCi (37-222 MBq) in un 2 ml di plastica provetta con tappo a vite. Regolare il volume di questa soluzione per un totale di 300 ml con acido ossalico 1,0 M. </li><li> Regolare il pH della soluzione 89 Zr 4+ a 6,8-7,5 usando 1,0 M Na 2 CO 3. Iniziare aggiungendo 250 ml di 1,0 M Na 2 CO 3 al 89 Zr 4+ soluzione e successivamente aggiungere più piccolo (&lt;10 microlitri) aliquote di base per ottenere il pH desiderato. </li><li> Aggiungere la quantità desiderata di soluzione pH aggiustato 89 Zr 4+ alla soluzione J591-DFO preparata al punto 2.1. </li><li> Controllare il pH della miscela di reazione radiomarcatura per garantire che rientra nell&#39;intervallo desiderato di 6,8-7,5. </li><li> Incubare la reazione radiomarcatura per 60 min a RT su un blocco di riscaldamento agitazione a 350 rpm. </li><li> Dopo 60 min di incubazione, misurare la radiolabeling resa della reazione con la radio-TLC. <ol><li> A tal fine, individuare 1 pCi della miscela di reazione radiomarcatura su TLC strip silice impregnata. Lasciare l&#39;aliquota da asciugare, eseguire il TLC con un eluente di 50 DTPA mM (pH 5.5) e analizzare la striscia TLC utilizzando uno scanner radio TLC. 89 Zr 4+ legato al costrutto J591-DFO apparirà all&#39;origine (R f &lt;0.1), mentre i cationi liberi 89 Zr 4+ saranno chelato con DTPA e si eluire con il fronte del solvente (R f&gt; 0.9). </li><li> Calcolare la resa della reazione radiomarcatura integrando il cromotogramma radioattivo, dividendo l&#39;area sotto la curva da R f 0.0-0.1 per l&#39;area totale sotto la curva, e moltiplicando per 100. </li></ol></li><li> Se la resa radiomarcatura è sufficiente (tipicamente una attività specifica teorica&gt; 2 mCi / mg), spegnere la reazione con 5 ml di 50 DTPA mM, pH 5,5. </li><li> Purificare la risultante immunoconiugato using dimensioni getta colonna esclusione dissalazione pre-compresso con un peso molecolare di 50.000 cut-off con un eluente del 0,9% soluzione salina sterile con 5 mg / acido gentisico ml o 0,25 M di acetato di sodio (pH 5.5) con 5 mg / acido gentisico ml . Questo passaggio produrrà una soluzione del completamento radioimmunoconjugate 89 Zr-DFO-J591 2 ml. </li><li> Dopo la purificazione, di verificare la purezza radiochimica del 89 Zr-DFO-J591 utilizzando radio-TLC come descritto al punto 2.7. </li><li> Calcolare la resa complessiva radiomarcatura della reazione dividendo la quantità di attività inizialmente aggiunto alla soluzione di anticorpi per la quantità di radioattività isolato con il purificato 89 Zr-DFO-J591 radioimmunoconjugate. </li><li> Calcolare l&#39;attività specifica finale dividendo la quantità di attività isolato con il purificato 89 Zr-DFO-J591 radioimmunoconjugate dalla massa iniziale di DFO-J591 nella reazione radiomarcatura. </li><li> Se una concentrazione maggiore si desidera, concentrarsi the 89 soluzione Zr-DFO-J591 utilizzando un&#39;unità filtro centrifugo con un peso molecolare di 50.000 cut-off. NOTA: L&#39;acido gentisico usato nella fase di purificazione finale è una radio-protettivo impiegato per minimizzare la degradazione dell&#39;anticorpo causa radiolisi 46 Mentre la memorizzazione del 89 Zr-DFO-J591 radioimmunoconjugate fino a 48 ore a 4 ° C. è possibile, non è consigliabile. Se il radioimmunoconjugate deve essere memorizzato, utilizzare 0,25 M di acetato di sodio (pH 5,5) con 5 mg / ml di acido gentisico come tampone di stoccaggio per minimizzare il rischio di radiolisi ipoclorito-mediata. 47 </li></ol> 3. In Vivo PET Imaging con 89 Zr-DFO-J591 ATTENZIONE: I Sezione protocollo 2, questa fase del protocollo comporta la gestione e la manipolazione della radioattività. Prima di effettuare questa procedura i ricercatori dovrebbero consultarsi con il Dipartimento di sicurezza di radiazione del proprio istituto. Tutti possibLe misure dovrebbero essere prese per ridurre al minimo l&#39;esposizione alle radiazioni ionizzanti. <ol><li> In maschi topi nudi atimici, impianto sottocute 5 x 10 6 LNCaP cellule tumorali della prostata e permettere a questi di crescere a un xenotrapianto 100-150 mm 3 (3-4 settimane dopo l&#39;inoculazione). 44 </li><li> Diluire il radioimmunoconjugate 89 Zr-DFO-J591 ad una concentrazione di 1,0 mCi / ml in 0,9% soluzione salina sterile. </li><li> Iniettare 200 ml di soluzione di 89 Zr-DFO-J591 (200 uCi; 7,4 MBq). Nella vena della coda laterale dei topi xenotrapianto portanti 48 </li><li> Al punto di tempo di imaging desiderato (ad esempio, 12, 24, 48, 72, 96, o 120 hr post-iniezione), anestetizzare il mouse con isoflurano 2%: miscela di gas ossigeno. </li><li> Posizionare il mouse sul letto del piccolo scanner PET animali, e mantenere l&#39;anestesia durante la scansione utilizzando una isoflurane 1%: miscela di ossigeno. Prima di mettere l&#39;animale sul piatto dello scanner, verificare l&#39;anestesia con il metodo punta pinch e apply pomata oftalmica agli occhi del mouse per evitare l&#39;essiccazione durante l&#39;anestesia. 49 </li><li> Acquisire i dati PET per il mouse tramite una scansione statico con un minimo di 40 milioni di eventi coincidenti utilizzando una finestra di energia di 350-700 keV ed una finestra di temporizzazione coincidenza di 6 nsec. 50 </li><li> Dopo aver completato l&#39;acquisizione delle immagini, non lasciare incustodito il mouse e non metterlo in una gabbia con altri topi fino a quando non ha ripreso conoscenza. </li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Mentre la costruzione, radioimmunoconjugates radiomarcatura, e l&#39;imaging di 89 Zr-DFO-etichettati è generalmente una procedura piuttosto semplice, è importante mantenere un paio di considerazioni fondamentali in mente durante ogni fase del processo. Per esempio, forse la causa più probabile di preoccupazione durante la fase coniugazione del procedimento è l&#39;aggregazione dell&#39;anticorpo durante la reazione di coniugazione. Questo problema è spesso un prodotto di scarsa miscelazione della reazio...

A causa della loro notevole sensibilità, affinità e selettività, anticorpi sono stati a lungo considerati vettori promettenti per la fornitura di radioisotopi a cellule tumorali. Tuttavia, la loro applicazione in tomografia a emissione di positroni (PET) è stato ostacolato dalla mancanza di un adeguato radioisotopi ad emissione di positroni per la loro etichettatura. 1-3 Una delle considerazioni più critici nella progettazione di radioimmunoconjugates è corrispondente al decadimento fisico mezza vita del radioisotopo alla farmacocinetica in vivo dell&#39;anticorpo. Più in particolare, gli anticorpi hanno spesso relativamente lunghi, più giorni di dimezzamento biologico e quindi devono essere etichettati con radioisotopi con emivita fisiche comparabili. Per le applicazioni di imaging PET, gli anticorpi sono stati tradizionalmente radiomarcato con 64 Cu (t 1/2 = 12,7 ore), 86 Y (t 1/2 = 14,7 ore), o 124 I (t 1/2 = 4.18 d). 4, 5 Tuttavia, ciascuno diquesti radioisotopi possiede significative limitazioni che ostacolano la loro idoneità per l&#39;imaging clinico. Mentre radioimmunoconjugates etichettati con 86 Y e 64 Cu sono dimostrati promettenti in studi preclinici, entrambi isotopi possedere emivite fisiche che sono troppo breve per essere efficace per l&#39;imaging nell&#39;uomo. 124 I, invece, ha una emivita fisica quasi ideale per l&#39;imaging con anticorpi, ma è costoso e presenta caratteristiche di decadimento subottimali che portano alla risoluzione relativamente bassa immagini cliniche. Inoltre, 124 radioimmunoconjugates I marcati possono essere soggetti a dealogenazione in vivo, un processo che può abbassare rapporti attività tumorale-a-background. 6,7 La spinta a trovare un radioisotopo che emette positroni-a soppiantare 64 Cu, 86 Y, e 124 sono in radioimmunoconjugates ha alimentato il recente aumento di ricerche sulla 89 anticorpi Zr-etichettati. 8-12 Tha ragione per l&#39;avvento di 89 Zr è semplice: il radiometalli possiede caratteristiche chimico-fisiche quasi ideale e per l&#39;uso in radioimmunoconjugates PET diagnostici 13 89 Zr viene prodotto tramite l&#39;89 Y (p, n) 89 reazione Zr su un ciclotrone con un. commercialmente disponibili e il 100% naturalmente abbondante 89 porta Y. 14,15 Il radiometalli ha un rendimento del 23% di positroni, decade con un&#39;emivita di 78,4 ore, ed emette positroni con relativamente bassa energia di 395,5 keV (Figura 1). 13,16,17 E &#39;importante notare che Zr 89 emette anche un alta energia, 909 keV γ-ray con efficienza del 99%. Mentre questa emissione non interferisce energicamente con le emessi 511 fotoni keV, richiede considerazione in più per quanto riguarda i trasporti, la gestione, e dosimetria. Nonostante questo avvertimento, queste caratteristiche di decadimento in ultima analisi significa che 89 Zr non solo ha un h più favorevolealf-vita per l&#39;imaging con anticorpi di 86 Y e 64 Cu, ma può anche produrre immagini ad alta risoluzione di 124 I, che emette positroni con energie superiori di 687 e 975 keV, nonché un numero di fotoni con energie dentro 100-150 keV di i fotoni positroni creati 511 keV. 13 Inoltre, Zr 89 è anche più sicuro da maneggiare, meno costosi da produrre, e residualizes nei tumori più efficacemente rispetto al suo omologo iodio radioattivo. 18,19 Una potenziale limitazione di 89 Zr è che non ha un isotopologue terapeutica, ad esempio, 86 Y (PET) vs. 90 Y (terapia). Ciò preclude la costruzione di chimicamente identici, agenti di imaging surrogati che possono essere impiegati come esploratori dosimetrici per i loro omologhi terapeutici. Detto questo, le indagini indicano che 89 anticorpi Zr-marcati hanno potenziale come surrogati di imaging per 90 Y e 177 immunoconiugati Lu-etichettati.20,21 Dal punto di vista chimico, come un metallo del gruppo IV, 89 Zr +4 esiste come cationi in soluzione acquosa. Ion Il Zr 4+ è altamente caricata, relativamente grande (efficace raggio ionico = 0,84 Å), e può essere classificato come un catione &quot;hard&quot;. Come tale, essa presenta una preferenza per ligandi recanti fino a otto dure, donatori di ossigeno anionici. Facilmente il chelante più comune utilizzato in 89 radioimmunoconjugates Zr-etichettati è deferoxamina (DFO), un sideroforo-derivato, chelante aciclico recanti tre gruppi idrossammato. Il legante coordina stabilmente il catione Zr 4+ rapido e pulito a RT a livelli di pH biologicamente rilevanti, e il risultante complesso Zr-DFO rimane stabile nel corso di diversi giorni in soluzione salina, siero di sangue, e sangue intero. 22 studi computazionali suggeriscono fortemente che DFO forma un complesso con hexacoordinate Zr 4+ in cui il centro metallico è coordinata ai tre neutral e tre donatori di ossigeno anionici del ligando e due leganti acqua esogeni (Figura 2). 23,24 Il comportamento in vivo della radioimmunoconjugates impiegano la coniugazione scaffold 89 Zr-deferoxamina stata generalmente eccellenti. Tuttavia, in alcuni casi, imaging e studi di biodistribuzione acuti hanno rivelato elevati livelli di attività nelle ossa di topi iniettati con 89 Zr-anticorpi marcati, dati che suggeriscono che il osteophilic 89 Zr 4+ catione viene rilasciato dal chelante in vivo e successivamente mineralizza nell&#39;osso. 25 Di recente, una serie di indagini lo sviluppo di nuovi 89 Zr 4+ chelanti ligandi particolare con otto donatori di ossigeno sono apparsi in letteratura. 24,26,27 Tuttavia, allo stato attuale, DFO è il chelante più ampiamente impiegato in 89 radioimmunoconjugates Zr-etichettato con un ampio margine. Una varietà di differentistrategie bioconjugation sono stati impiegati per collegare DFO ad anticorpi, inclusi bioorthogonal click chemistry, la reazione di tiolo reattivo DFO costruisce con cisteine ​​in l&#39;anticorpo, e la reazione dell&#39;estere attivato fruttiferi DFO costruisce con lisine nella anticorpi. 4,28- 30 Facilmente la strategia più comune, tuttavia, è stato l&#39;uso di un derivato isotiocianato-cuscinetto di DFO, DFO-NCS (Figura 2). 22 Questo chelante bifunzionale disponibile in commercio robusto e affidabile forma stabile, legami covalenti tiourea con lisine della anticorpo (Figura 3). Negli ultimi anni, una grande varietà di 89 radioimmunoconjugates Zr-DFO-marcati sono stati riportati in letteratura. Indagini preclinici sono stati particolarmente abbondanti, con anticorpi che vanno dal più noto cetuximab, bevacizumab, trastuzumab e di anticorpi più esoteriche come il-CD105 di targeting TRC105 e fPSA-targeting 5A10. 30-36 Più recentemente, un piccolo numero di studi clinici di fase precoce con 89 anticorpi Zr-DFO-marcati sono emerse in letteratura. Trials particolare, i gruppi in Olanda hanno pubblicato impiegano 89 Zr-DFO-cmAb U36, 89 Zr-DFO-ibritumomab tiuxetano, e 89 Zr-DFO-trastuzumab. 21,32,37 Inoltre, una serie di altri studi clinici con 89 radioimmunoconjugates Zr-marcati sono attualmente in corso, comprese le indagini qui al Memorial Sloan Kettering Cancer Center utilizzando la PSMA-targeting 89 Zr-DFO-J591 per l&#39;imaging del cancro alla prostata e il 89 Zr-DFO-trastuzumab-HER2 di targeting per l&#39;imaging del cancro al seno. 23, 30 Inoltre, mentre gli anticorpi radioattivi restano i più comuni 89 radiofarmaci Zr-etichettati, il radiometalli ha sempre stato impiegato con altri vettori, tra cui peptidi, proteine ​​e nanomateriali. 38-43 </sup&gt; La modularità di questo 89 Zr-DFO metodologia di etichettatura è una risorsa enorme. Il repertorio di anticorpi-biomarker di targeting è in continua espansione, e l&#39;interesse per l&#39;esecuzione in PET vivo utilizzando questi costrutti sta crescendo rapidamente. Di conseguenza, riteniamo che lo sviluppo di pratiche più standardizzate e protocolli potrebbe beneficiare il campo. Un protocollo sperimentale eccellente scritto per deferoxamina-NCS coniugazione e 89 Zr radiomarcatura è già stato pubblicato da Vosjan, et al. 22 Riteniamo che la dimostrazione visiva fornita da questo lavoro potrebbe aiutare ulteriormente gli investigatori nuovi a queste tecniche. Nel protocollo a mano, l&#39;antigene di membrana rivolti anticorpi J591 prostatico specifico sarà utilizzato come sistema modello per illustrare (1) la bioconjugation del chelante bifunzionale DFO-isotiocianato di un anticorpo, (2) la radiosintesi e purificazione del 89 Zr-DFO-mAb radioimmunoconjugate,e (3) in vivo PET con 89 Zr-DFO-mAb radioimmunoconjugate in un modello murino di cancro. 23,44,45

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;p&lt;/em&gt;-SCN-Bn-DFO</td><td>Macrocyclics</td><td>B-705</td><td>Store at -80 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>[&lt;sup&gt;89&lt;/sup&gt;Zr]Zr-oxalate</td><td>Various, including Perkin-Elmer</td><td></td><td>Caution: Radioactive material</td></tr><tr><td>PD-10 Desalting Columns</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0851-01&amp;nbsp;</td><td>Store at room temperature</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC805024</td><td>Store at room temperature</td></tr><tr><td>Silica Gel Impregnated RadioTLC Paper</td><td>Agilent Technologies</td><td>SGI0001</td><td>Cut into strips 0.5 cm wide</td></tr></tbody></table>

the bioconjugation and radiosynthesis of 89zr-dfo-labeled antibodies

L&#39;eccezionale affinità, specificità e selettività degli anticorpi li rendono vettori straordinariamente interessanti per i radiofarmaci PET tumorali mirati. Grazie alla loro più giorni biologica emivita, anticorpi devono essere etichettati con radionuclidi ad emissione di positroni con decadimento fisico emivita relativamente lunghi. Tradizionalmente, i-positroni emettitori isotopi 124 I (t 1/2 = 4.18 d), 86 Y (t 1/2 = 14,7 ore), e 64 Cu (t 1/2 = 12,7 ore) sono stati utilizzati per etichettare anticorpi per l&#39;imaging PET. Più recentemente, tuttavia, il campo è assistito ad un drammatico aumento dell&#39;uso della ad emissione di positroni radiometalli 89 Zr in agenti di imaging PET a base di anticorpi. 89 Zr è un radioisotopo quasi ideale per l&#39;imaging PET con immunoconiugati, in quanto possiede un mezzo fisico -Life (t 1/2 = 78,4 ore) che è compatibile con la farmacocinetica in vivo di anticorpi ed emette un relativamente basso enepositroni rgy che produce immagini ad alta risoluzione. Inoltre, gli anticorpi possono essere semplicemente etichettati con 89 Zr con il chelante deferoxamina sideroforo-derivato (DFO). In questo protocollo, l&#39;antigene di membrana rivolti anticorpi J591 prostatico specifico sarà utilizzato come sistema modello per illustrare (1) la bioconjugation del chelante bifunzionale DFO-isotiocianato di un anticorpo, (2) la radiosintesi e purificazione di un 89 ZR- DFO-mAb radioimmunoconjugate, e (3) in vivo di imaging PET con 89 Zr-DFO-mAb radioimmunoconjugate in un modello murino di cancro.

Il primo passo in questo protocollo la coniugazione del DFO-NCS per l&#39;anticorpo è in genere abbastanza robusto e affidabile. Generalmente, purificato, immunoconiugato chelante modificato può essere ottenuta in&gt; 90% di resa, e con 3 equivalenti molari di DFO-NCS nella reazione iniziale coniugazione produrrà un gradi di etichettatura del chelante di circa 1,0-1,5 DFO / mAb. Le 89 Zr radiomarcatura e purificazione fasi della procedura sono altrettanto semplici. Alle concentrazioni indicate nel protocol...

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The Bioconjugation and Radiosynthesis of 89Zr-DFO-labeled Antibodies

Due to its multi-day radioactive half-life and favorable decay properties, the positron-emitting radiometal 89Zr is extremely well-suited for use in antibody-based radiopharmaceuticals for PET imaging. In this protocol, the bioconjugation, radiosynthesis, and preclinical application of 89Zr-labeled antibodies will be described.

Il bioconjugation e radiosintesi di<sup&gt; 89</sup&gt; Anticorpi Zr-DFO-etichettati

The exceptional affinity, specificity, and selectivity of antibodies make them extraordinarily attractive vectors for tumor-targeted PET ...

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17.1K Views.  Memorial Sloan Kettering Cancer Center. Due to its multi-day radioactive half-life and favorable decay properties, the positron-emitting radiometal 89Zr is extremely well-suited for use in antibody-based radiopharmaceuticals for PET imaging. In this protocol, the bioconjugation, radiosynthesis, and preclinical application of 89Zr-labeled antibodies will be described. 

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An Optimized Protocol for the Efficient Radiolabeling of Gold Nanoparticles by Using a 125I-labeled Azide Prosthetic Group

Here, we demonstrate a detailed protocol for the radiosynthesis of a 125I-labeled azide prosthetic group and its application to the efficient radiolabeling of DBCO-group-functionalized gold nanoparticles using a copper-free click reaction. Radioiodination of the stannylated precursor (2) was carried out by using [125I]NaI and chloramine T as an oxidant at room temperature for 15 min. After HPLC purification of the crude product, the purified 125I-labeled azide (1) was obtained with high radiochemical yield (75 &plusmn; 10%, n = 8) and excellent radiochemical purity (&gt;99%). For the synthesis of radiolabeled 13-nm-sized gold nanoparticles, the DBCO-functionalized gold nanoparticles (3) were prepared by using a thiolated polyethylene glycol polymer. A copper-free click reaction between 1 and 3 gave the 125I-labeled gold nanoparticles (4) with more than 95% of radiochemical yield as determined by radio-thin-layer chromatography (radio-TLC). These results clearly indicate that the present radiolabeling method using a strain-promoted copper-free click reaction will be useful for the efficient and convenient radiolabeling of DBCO-group-containing nanomaterials.

An Optimized Protocol for the Efficient Radiolabeling of Gold Nanoparticles by Using a 125I-labeled Azide Prosthetic Group

A detailed procedure for the synthesis of a 125I-labeled azide and the radiolabeling of dibenzocyclooctyne (DBCO)-group-conjugated, 13-nm-sized gold nanoparticles using a copper-free click reaction is described.

Un protocollo ottimizzato per la radiomarcatura efficiente di oro nanoparticelle utilizzando un<sup&gt; 125</sup&gt; Azide gruppo I-etichettati protesico

Here, we demonstrate a detailed protocol for the radiosynthesis of a 125I-labeled azide prosthetic group and its application to the efficient ...

Ricerca

Chimica

Preparation and Evaluation of 99mTc-labeled Tridentate Chelates for Pre-targeting Using Bioorthogonal Chemistry

Pre-targeting combined with bioorthogonal chemistry is emerging as an effective way to create new radiopharmaceuticals. Of the methods available, the inverse electron demand Diels-Alder (IEDDA) cycloaddition between a radiolabeled tetrazines and trans-cyclooctene (TCO) linked to a biomolecule has proven to be a highly effective bioorthogonal approach to imaging specific biological targets. Despite the fact that technetium-99m remains the most widely used isotope in diagnostic nuclear medicine, there is a scarcity of methods for preparing 99mTc-labeled tetrazines. Herein we report the preparation of a family of tridentate-chelate-tetrazine derivatives and their Tc(I) complexes. These hitherto unknown compounds were radiolabeled with 99mTc using a microwave-assisted method in 31% to 83% radiochemical yield. The products are stable in saline and PBS and react rapidly with TCO derivatives in vitro. Their in vivo pre-targeting abilities were demonstrated using a TCO-bisphosphonate (TCO-BP) derivative that localizes to regions of active bone metabolism or injury. In murine studies, the 99mTc-tetrazines showed high activity concentrations in knees and shoulder joints, which was not observed when experiments were performed in the absence of TCO-BP. The overall uptake in non-target organs and pharmacokinetics varied greatly depending on the nature of the linker and polarity of the chelate.

Preparation and Evaluation of 99mTc-labeled Tridentate Chelates for Pre-targeting Using Bioorthogonal Chemistry

Here, we describe a protocol for radiolabeling and in vivo testing of tridentate 99mTc(I) chelate-tetrazine derivatives for pre-targeting and bioorthogonal chemistry.

Preparazione e valutazione di<sup&gt; 99m</sup&gt; Tc marcato tridentate chelati di pre-targeting Utilizzando Bioorthogonal Chimica

Pre-targeting combined with bioorthogonal chemistry is emerging as an effective way to create new radiopharmaceuticals. Of the methods available, the ...

Harnessing the Bioorthogonal Inverse Electron Demand Diels-Alder Cycloaddition for Pretargeted PET Imaging

Due to their exquisite affinity and specificity, antibodies have become extremely promising vectors for the delivery of radioisotopes to cancer cells for PET imaging. However, the necessity of labeling antibodies with radionuclides with long physical half-lives often results in high background radiation dose rates to non-target tissues. In order to circumvent this issue, we have employed a pretargeted PET imaging strategy based on the inverse electron demand Diels-Alder cycloaddition reaction. The methodology decouples the antibody from the radioactivity and thus exploits the positive characteristics of antibodies, while eschewing their pharmacokinetic drawbacks. The system is composed of four steps: (1) the injection of a mAb-trans-cyclooctene (TCO) conjugate; (2) a localization time period during which the antibody accumulates in the tumor and clears from the blood; (3) the injection of the radiolabeled tetrazine; and (4) the in vivo click ligation of the components followed by the clearance of excess radioligand. In the example presented in the work at hand, a 64Cu-NOTA-labeled tetrazine radioligand and a trans-cyclooctene-conjugated humanized antibody (huA33) were successfully used to delineate SW1222 colorectal cancer tumors with high tumor-to-background contrast. Further, the pretargeting methodology produces high quality images at only a fraction of the radiation dose to non-target tissue created by radioimmunoconjugates directly labeled with 64Cu or 89Zr. Ultimately, the modularity of this protocol is one of its greatest assets, as the trans-cyclooctene moiety can be appended to any non-internalizing antibody, and the tetrazine can be attached to a wide variety of radioisotopes.

The bioorthogonal inverse electron demand Diels-Alder cycloaddition has been harnessed to create an effective and modular pretargeted PET imaging strategy for cancer. In this protocol, the steps of this methodology are described in the context of a model system employing the colorectal cancer targeted antibody huA33 and a 64Cu-labeled radioligand.

Sfruttando la domanda Bioorthogonal Inverse Electron Diels-Alder cicloaddizione per Pretargeted PET Imaging

Due to their exquisite affinity and specificity, antibodies have become extremely promising vectors for the delivery of radioisotopes to cancer cells for ...

Bioingegneria

Pretargeted Radioimmunotherapy Based on the Inverse Electron Demand Diels-Alder Reaction

While radioimmunotherapy (RIT) is a promising approach for the treatment of cancer, the long pharmacokinetic half-life of radiolabeled antibodies can result in high radiation doses to healthy tissues. Perhaps not surprisingly, several different strategies have been developed to circumvent this troubling limitation. One of the most promising of these approaches is pretargeted radioimmunotherapy (PRIT). PRIT is predicated on decoupling the radionuclide from the immunoglobulin, injecting them separately, and then allowing them to combine in vivo at the target tissue. This approach harnesses the exceptional tumor-targeting properties of antibodies while skirting their pharmacokinetic drawbacks, thereby lowering radiation doses to non-target tissues and facilitating the use of radionuclides with half-lives that are considered too short for use in traditional radioimmunoconjugates. Over the last five years, our laboratory and others have developed an approach to in vivo pretargeting based on the inverse electron-demand Diels-Alder (IEDDA) reaction between trans-cyclooctene (TCO) and tetrazine (Tz). This strategy has been successfully applied to pretargeted positron emission tomography (PET) and single-photon emission computed tomography (SPECT) imaging with a variety of antibody-antigen systems. In a pair of recent publications, we have demonstrated the efficacy of IEDDA-based PRIT in murine models of pancreatic ductal adenocarcinoma and colorectal carcinoma. In this protocol, we describe protocols for PRIT using a 177Lu-DOTA-labeled tetrazine radioligand ([177Lu]Lu-DOTA-PEG7-Tz) and a TCO-modified variant of the colorectal cancer targeting huA33 antibody (huA33-TCO). More specifically, we will describe the construction of huA33-TCO, the synthesis and radiolabeling of [177Lu]Lu-DOTA-PEG7-Tz, and the performance of in vivo biodistribution and longitudinal therapy studies in murine models of colorectal carcinoma.

This protocol describes the synthesis and characterization of a trans-cyclooctene (TCO)-modified antibody and a 177Lu-labeled tetrazine (Tz) radioligand for pretargeted radioimmunotherapy (PRIT). In addition, it details the use of these two constructs for in vivo biodistribution and longitudinal therapy studies in a murine model of colorectal cancer.

Pretargeted Radioimmunotherapy basato sulla reazione di Diels-Alder domanda inversa Electron

While radioimmunotherapy (RIT) is a promising approach for the treatment of cancer, the long pharmacokinetic half-life of radiolabeled antibodies can ...

Synthesis and Bioconjugation of Thiol-Reactive Reagents for the Creation of Site-Selectively Modified Immunoconjugates

Maleimide-bearing bifunctional probes have been employed for decades for the site-selective modification of thiols in biomolecules, especially antibodies. Yet maleimide-based conjugates display limited stability in vivo because the succinimidyl thioether linkage can undergo a retro-Michael reaction. This, of course, can lead to the release of the radioactive payload or its exchange with thiol-bearing biomolecules in circulation. Both of these processes can produce elevated activity concentrations in healthy organs as well as decreased activity concentrations in target tissues, resulting in reduced imaging contrast and lower therapeutic ratios. In 2018, we reported the creation of a modular, stable, and easily accessible phenyloxadiazolyl methyl sulfone reagent &#8212; dubbed &#8216;PODS&#8217; &#8212; as a platform for thiol-based bioconjugations. We have clearly demonstrated that PODS-based site-selective bioconjugations reproducibly and robustly create homogenous, well-defined, highly immunoreactive, and highly stable radioimmunoconjugates. Furthermore, preclinical experiments in murine models of colorectal cancer have shown that these site-selectively labeled radioimmunoconjugates exhibit far superior in vivo performance compared to radiolabeled antibodies synthesized via maleimide-based conjugations. In this protocol, we will describe the four-step synthesis of PODS, the creation of a bifunctional PODS-bearing variant of the ubiquitous chelator DOTA (PODS-DOTA), and the conjugation of PODS-DOTA to the HER2-targeting antibody trastuzumab.

In this protocol, we will describe the synthesis of PODS, a phenyoxadiazolyl methyl sulfone-based reagent for the site-selective attachment of cargos to the thiols of biomolecules, particularly antibodies. In addition, we will describe the synthesis and characterization of a PODS-bearing bifunctional chelator and its conjugation to a model antibody.

Sintesi e Bioconjugation di tiolo-reattive reagenti per la creazione del sito-selettivamente per volta efattori

Maleimide-bearing bifunctional probes have been employed for decades for the site-selective modification of thiols in biomolecules, especially antibodies. ...

Positron Emission Tomography Imaging of Cell Trafficking: A Method of Cell Radiolabeling

Stem cell and chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapies are emerging as promising therapeutics for organ regeneration and as immunotherapy for various cancers. Despite significant progress having been made in these areas, there is still more to be learned to better understand the pharmacokinetics and pharmacodynamics of the administered therapeutic cells in the living system. For noninvasive, in vivo tracking of cells with positron emission tomography (PET), a novel [89Zr]Zr-p-isothiocyanatobenzyl-desferrioxamine ([89Zr]Zr-DBN)-mediated cell radiolabeling method has been developed utilizing 89Zr (t1/2 78.4 h). The present protocol describes a [89Zr]Zr-DBN-mediated, ready-to-use, radiolabeling synthon for direct radiolabeling of variety of cells, including mesenchymal stem cells, lineage-guided cardiopoietic stem cells, liver regenerating hepatocytes, white blood cells, melanoma cells, and dendritic cells. The developed methodology enables noninvasive PET imaging of cell trafficking for up to 7 days post-administration without affecting the nature or the function of the radiolabeled cells. Additionally, this protocol describes a stepwise method for the radiosynthesis of [89Zr]Zr-DBN, biocompatible formulation of [89Zr]Zr-DBN, preparation of cells for radiolabeling, and finally the radiolabeling of cells with [89Zr]Zr-DBN, including all the intricate details needed for the successful radiolabeling of cells.

Presented here is a protocol to radiolabel cells with a positron emission tomography (PET) radioisotope, 89Zr (t1/2 78.4 h), using a ready-to-use radiolabeling synthon, [89Zr]Zr-p-isothiocyanatobenzyl-desferrioxamine ([89Zr]Zr-DBN). Radiolabeling cells with [89Zr]Zr-DBN allows noninvasive tracking and imaging of administered radiolabeled cells in the body with PET for up to 7 days post-administration.

Tomografia a emissione di positroni Imaging del traffico cellulare: un metodo di radiomarcatura cellulare

Stem cell and chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapies are emerging as promising therapeutics for organ regeneration and as immunotherapy for ...

Ricerca sul cancro

Initial Evaluation of Antibody-conjugates Modified with Viral-derived Peptides for Increasing Cellular Accumulation and Improving Tumor Targeting

Antibody-conjugates (ACs) modified with virus-derived peptides are a potentially powerful class of tumor cell delivery agents for molecular payloads used in cancer treatment and imaging due to increased cellular accumulation over current ACs. During early AC in vitro development, fluorescence techniques and radioimmunoassays are sufficient for determining intracellular localization, accumulation efficiency, and target cell specificity. Currently, there is no consensus on standardized methods for preparing cells for evaluating AC intracellular accumulation and localization. The initial testing of ACs modified with virus-derived peptides is critical especially if several candidates have been constructed. Determining intracellular accumulation by fluorescence can be affected by background signal from ACs at the cell surface and complicate the interpretation of accumulation. For radioimmunoassays, typically treated cells are fractionated and the radioactivity in different cell compartments measured. However, cell lysis varies from cell to cell and often nuclear and cytoplasmic compartments are not adequately isolated. This can produce misleading data on payload delivery properties. The intravenous injection of radiolabeled virus-derived peptide-modified ACs in tumor bearing mice followed by radionuclide imaging is a powerful method for determining tumor targeting and payload delivery properties at the in vivo phase of development. However, this is a relatively recent advancement and few groups have evaluated virus-derived peptide-modified ACs in this manner. We describe the processing of treated cells to more accurately evaluate virus-derived peptide-modified AC accumulation when using confocal microscopy and radioimmunoassays. Specifically, a method for trypsinizing cells to remove cell surface bound ACs. We also provide a method for improving cellular fractionation. Lastly, this protocol provides an in vivo method using positron emission tomography (PET) for evaluating initial tumor targeting properties in tumor-bearing mice. We use the radioisotope 64Cu (t1/2 = 12.7 h) as an example payload in this protocol.

Viral-derived peptides coupled to antibody-conjugates (ACs) is an approach gaining momentum due to the potential of delivering molecular payloads with increased tumor cell accumulation. Utilizing common methods to evaluate peptide conjugation, AC and payload intracellular accumulation, and tumor targeting, this protocol helps researchers during the key initial development phases.

Valutazione iniziale di anticorpo-coniugati modificate con peptidi virali-derivati per accumulo cellulare di aumentare e migliorare il Targeting tumorale

Antibody-conjugates (ACs) modified with virus-derived peptides are a potentially powerful class of tumor cell delivery agents for molecular payloads used ...

Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo Cell Trafficking by PET/CT

This protocol illustrates the production of 64Cu and the chelator conjugation/radiolabeling of a monoclonal antibody (mAb) followed by murine lymphocyte cell culture and 64Cu-antibody receptor targeting of the cells. In vitro evaluation of the radiolabel and non-invasive in vivo cell tracking in an animal model of an airway delayed-type hypersensitivity reaction (DTHR) by PET/CT are described.
In detail, the conjugation of a mAb with the chelator 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid (DOTA) is shown. Following the production of radioactive 64Cu, radiolabeling of the DOTA-conjugated mAb is described. Next, the expansion of chicken ovalbumin (cOVA)-specific CD4+ interferon (IFN)-&#947;-producing T helper cells (cOVA-TH1) and the subsequent radiolabeling of the cOVA-TH1 cells are depicted. Various in vitro techniques are presented to evaluate the effects of 64Cu-radiolabeling on the cells, such as the determination of cell viability by trypan blue exclusion, the staining for apoptosis with Annexin V for flow cytometry, and the assessment of functionality by IFN-&#947; enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Furthermore, the determination of the radioactive uptake into the cells and the labeling stability are described in detail. This protocol further describes how to perform cell tracking studies in an animal model for an airway DTHR and, therefore, the induction of cOVA-induced acute airway DHTR in BALB/c mice is included. Finally, a robust PET/CT workflow including image acquisition, reconstruction, and analysis is presented.
The 64Cu-antibody receptor targeting approach with subsequent receptor internalization provides high specificity and stability, reduced cellular toxicity, and low efflux rates compared to common PET-tracers for cell labeling, e.g.64Cu-pyruvaldehyde bis(N4-methylthiosemicarbazone) (64Cu-PTSM). Finally, our approach enables non-invasive in vivo cell tracking by PET/CT with an optimal signal-to-background ratio for 48 h. This experimental approach can be transferred to different animal models and cell types with membrane-bound receptors that are internalized.

Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo  Cell Trafficking by PET/CT

Following the preparation of a 64Cu-modified monoclonal antibody binding to a transgenic murine T cell receptor, T cells are radiolabeled in vivo, analyzed for viability, functionality, labeling stability and apoptosis, and adoptively transferred into mice with an airway delayed-type hypersensitivity reaction for non-invasive imaging by positron emission tomography/computed tomography (PET/CT).

Murino linfociti Etichettatura da<sup&gt; 64</sup&gt; Cu-anticorpo recettore Targeting per<em&gt; In Vivo</em&gt; Cell Traffico da PET / CT

This protocol illustrates the production of 64Cu and the chelator conjugation/radiolabeling of a monoclonal antibody (mAb) followed by murine lymphocyte ...

Immunologia e infezioni

Determining Binding Affinity (KD) of Radiolabeled Antibodies to Immobilized Antigens

Determining binding affinity (KD) is an important aspect of the characterization of radiolabeled antibodies (rAb). Typically, binding affinity is represented by the equilibrium dissociation constant, KD, and can be calculated as the concentration of antibody at which half the antibody binding sites are occupied at equilibrium. This method can be generalized to any radiolabeled antibody or other protein and peptide scaffolds. In contrast to cell-based methods, the choice of immobilized antigens is particularly useful for validating binding affinities after long-term storage of antibodies, distinguishing binding affinities of fragment antigen-binding region (Fab) arms in bispecific antibody constructs, and determining if there is variability in antigen expression between different cell lines. This method involves immobilizing a fixed amount of antigen to specified wells on a breakable 96-well plate. Then, nonspecific binding was blocked in all wells with bovine serum albumin (BSA). Subsequently, the rAb was added in a concentration gradient to all wells. A range of concentrations was chosen to allow the rAb to reach saturation, i.e., a concentration of antibody at which all antigens are continuously bound by the rAb. In designated wells without immobilized antigen, nonspecific binding of the rAb can be determined. By subtracting nonspecific binding from total binding in the wells with immobilized antigen, specific binding of the rAb to the antigen can be determined. The KD of the rAb was calculated from the resulting saturation binding curve. As an example, binding affinity was determined using radiolabeled amivantamab, a bispecific antibody for epidermal growth factor receptor (EGFR) and cytoplasmic mesenchymal-epithelial transition (cMET) proteins.

Determining Binding Affinity KD of Radiolabeled Antibodies to Immobilized Antigens

Here, a method is described to determine the binding affinity (KD) of radiolabeled antibodies to immobilized antigens. KD is the equilibrium dissociation constant that can be determined from a saturation binding experiment by measuring the total, specific, and nonspecific binding of a radiolabeled antibody at various concentrations to its antigen.

Determinazione dell'affinità di legame (KD) degli anticorpi radiomarcati contro gli antigeni immobilizzati

Determining binding affinity (KD) is an important aspect of the characterization of radiolabeled antibodies (rAb). Typically, binding affinity is ...

Medicina

Pretargeted Radioimmunotherapy: A Method for Targeted Delivery of Therapeutic Radionuclides to Tumors

Source: Membreno, R., et al. <a href="https://www.jove.com/v/59041"> Pretargeted Radioimmunotherapy Based on the Inverse Electron Demand Diels-Alder Reaction.</a> J. Vis. Exp. (2019).
This video describes the technique of pretargeted radioimmunotherapy or PRIT, in which immunoconjugates followed by radioligands are administered for treating tumors. This radioimmunotherapy reduces radiation doses to healthy tissues and utilizes radionuclides with very low half-lives incompatible with antibody-based vectors.

Radioimmunoterapia premirata: un metodo per la somministrazione mirata di radionuclidi terapeutici ai tumori

Source: Membreno, R., et al.  Pretargeted Radioimmunotherapy Based on the Inverse Electron Demand Diels-Alder Reaction. J. Vis. Exp. (2019).
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